Deimantė Lukošiūtė MIOKARDO PUTLIŲJŲ LĄSTELIŲ, IŠSKIRIANČIŲ CHIMAZĘ, RAIŠKOS DINAMIKA PROGRESUOJANT IŠEMINĖS KILMĖS ŠIRDIES NEPAKANKAMUMUI

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTO KARDIALINĖS PATOLOGIJOS LABORATORIJA

Deimantė Lukošiūtė

MIOKARDO PUTLIŲJŲ LĄSTELIŲ, IŠSKIRIANČIŲ CHIMAZĘ,

RAIŠKOS DINAMIKA PROGRESUOJANT IŠEMINĖS KILMĖS

ŠIRDIES NEPAKANKAMUMUI

Darbo vadovas: prof. habil. dr. Dalia Pangonytė

2

TURINYS

6. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 10

7. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

7.1 Putliųjų ląstelių struktūra, fenotipai ir paplitimas organizme ... 11

7.2 Putliųjų ląstelių mediatoriai ... 13

7.3 Putliųjų ląstelių chimazė ir miokardo persitvarkymas ... 14

7.4 Išeminis reperfuzinis pažeidimas ir chimazė ... 16

8. TIRTASIS KONTINGENTAS IR METODAI ... 17

8.1 Tirtasis kontingentas ... 17

8.2 Tyrimo metodai ... 17

8.2.1 Makroskopinis ir histologinis miokardo tyrimas ... 18

8.2.2 Imunohistocheminis tyrimas ... 18 8.2.3 Histomorfometrinis tyrimas ... 19 8.2.4 Statistinė analizė ... 21 9. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 22 10. IŠVADOS ... 27 11. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 28

3

1. SANTRAUKA

Autorius: Deimantė Lukošiūtė

Darbo pavadinimas: Miokardo putliųjų ląstelių, išskiriančių chimazę, raiškos dinamika progresuojant išeminės kilmės širdies nepakankamumui.

Darbo tikslas: nustatyti širdies KS putliųjų ląstelių chimazės raiškos pokyčius, esant įvairios funkcinės klasės išeminės kilmės ŠN.

Darbo uždaviniai: 1) Nustatyti chimazei pozityvių ląstelių skaičiaus pokyčius, kai nebuvo širdies

nepakankamumo (ŠN – A stadija); 2) Nustatyti chimazei pozityvių ląstelių skaičiaus pokyčius, kai buvo B klasės ŠN; 3) Nustatyti chimazei pozityvių ląstelių skaičiaus pokyčius, kai buvo C-D klasės ŠN; 4) Įvertinti putliųjų ląstelių chimazės raiškos sąsajas su suminiu stenozuojančiu vainikinių arterijų pažeidimu (stenozės indeksu).

Metodika: Ištirti 60 sirgusių IŠL vyrų miokardo mėginiai. Tiriamieji suskirstyti į tris grupes. Pirmoji –

IŠL grupė, kai nebuvo ŠN simptomų (n=25), antroji – IŠL grupė, kai buvo B stadijos ŠN (n=24), trečioji – IŠL grupė, kai buvo C-D stadijos (n=11). Kontrolinę grupę sudarė 21 tiriamųjų, kurie mirė nuo išorinių priežasčių bei ūminių ligų, nesusijusių su širdies patologija. Specialus morfologinis (makroskopinis ir mikroskopinis) mirusiųjų nuo IŠL širdies, vainikinių arterijų ir miokardo tyrimas atliktas remiantis modifikuota Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) rekomenduota fatalinės IŠL tyrimo metodika. atliktas putliųjų ląstelių kiekybinis įvertinimas naudojant imunohistocheminį miokardo tyrimą monokloniniais antikūnais prieš putliųjų ląstelių chimazę (klonas CC1 Novocastra, 1:200) bei triptazę (klonas 10D11, Novocastra 1:300) ir DAKO Real Envision vizualizavimo sistemą. Statistinė analizė. Histomorfometriniams parametrams palyginti tarp dviejų ir daugiau grupių naudojome dispersinės analizės (ANOVA) dviejų faktorių metodą. Ryšius tarp tirtųjų parametrų nustatėme regresinės analizės metodu. Skirtumus statistiškai reikšmingais laikėme, kai p<0,05.

Tyrimo rezultatai: Sergančiųjų IŠL, kai nebuvo širdies nepakankamumo ir buvo B stadijos širdies

nepakankamumas, miokardo putliųjų ląstelių, pozityvių chimazei, kiekis nesiskyrė (p>0,05) ir šių abiejų grupių buvo didesnis lyginant su kontrolinės grupės analogišku rodikliu (p<0,01). Kai buvo C-D stadijos nepakankamumas, miokardo chimazei pozityvių ląstelių kiekis buvo didesnis už kontrolinės grupės (p<0,01) ir už IŠL grupės, kai nebuvo širdies nepakankamumo ir buvo B stadijos širdies nepakankamumas (p<0,05). Koreliacinis ryšys tarp suminio stenozinio vainikinių arterijų pažeidimo ir putliųjų ląstelių kiekio buvo silpnas (r=0,23, p<0,05).

Išvados: 1) Sergančiųjų išemine širdies liga miokardo putliųjų ląstelių, pozityvių chimazei ir triptazei,

kiekis buvo panašus ir padidėjęs jau esant chroninei miokardo išemijai, kai nebuvo širdies nepakankamumo; 2) Kai buvo B stadijos nepakankamumas, putliųjų ląstelių kiekis buvo panašus į tokį, kai širdies nepakankamumo nebuvo; 3) Esant C-D stadijos širdies nepakankamumui, putliųjų

4 ląstelių kiekis buvo pats didžiausias; 4) Koreliacinis ryšys tarp suminio stenozinio vainikinių arterijų pažeidimo (stenozės indekso) ir putliųjų ląstelių kiekio buvo silpnas (r=0,23, p<0,05).

5

2. SUMMARY

Author: Deimantė Lukošiūtė

Title: The dynamic of chymase-secreting cardiac mast cells expression in progression of ischemic heart failure.

Purpose: To identify the changes of left ventricle mast cells expression in different functional classes of ischemic heart failure.

Objectives: 1. To evaluate the number of chymase-positive cells in group without heart failure (HF-

stage A); 2) To evaluate the number of chymase-positive cells in group with heart failure (stage B); 3) To evaluate the number of chymase-positive cells in group with heart failure (stage C-D); 4) To evaluate the connection between the expression of mast cell chymase and total stenotic injury of coronary arteries (stenosis index).

Methods: There were examined 60 myocardial samples of males who had ischemic heart disease. The

subjects were classified into 3 groups. First group – ischemic heart disease without HF symptoms (n=25), second – ischemic heart disease with HF (stage B) (n=24), third – ischemic heart disease with HF (stage C-D) (n=11). There also was a control group. This group contained of 21 subjects who died from outside factors and acute diseases (no relation with heart pathology). Special morphological (microscopic and macroscopic) examination of the heart, coronary arteries and myocardium was performed based on methodics modified by WHO. A quantitative evaluation of left ventricular mast cells was performed by immunohistochemical myocardium examination with monoclonal antibodies against mast cell chymase (clone CC1 Novocastra, 1:200) using visual imaging system DAKO Real Envision.

Statistics analysis. For comparison of hystomorphometric parameters between two or more groups there was used two way ANOVA method. The relationship between analysed parameters were determined by the regression analysis method.

Results: There was no statistically significant differences between quantity of myocardial mast cells

positive to chymase in subjects with ishemic heart disease but without HF and with HF (stage B) (p>0,05), but in both of these groups quantity of myocardial mast cells positive to chymase was bigger than in control group (p<0,01). In third group the quantity of myocardial mast cells positive to chymase was bigger than in control group (p<0,01) and in first and second group also (p<0,05). The correlation between the total stenotic injury of coronary arteries and the quantity of mast cells was significant but frail (r=0,23, p<0,05).

Conclusions: 1) The quantity of mast cells positive to chymase and tryptase was similar and increased

even in subjects with ischemic heart disease but without heart failure; 2) The quantity of mast cells in subjects with heart failure (stage B) was similar to subjects without heart failure; 3) The quantity of

6 mast cells in subjects with heart failure (stage C-D) was the highest; 4) The correlation between the total stenotic injury of coronary arteries and the quantity of mast cells was significant but frail (r=0,23, p<0,05).

7

3. INTERSŲ KONFLIKTAS

8

4. SANTRUMPOS

ŠN – širdies nepakankamumas IŠL – išeminė širdies liga KS – kairysis skilvelis

AKF – angiotenziną konvertuojantis fermentas

MMP – matrikso metaloproteinazė (angl. matrix metalloproteinase) c-Kit – kamieninių ląstelių faktorius

MCTC – chimazei ir triptazei pozityvios putliosios ląstelėss (angl.tryptase- and cgymase-positive mast cells)

MCT – triptazei pozityvios putliosios ląstelės (angl. tryptase-positive mast cells) TNF-α – tumoro nekrozės faktorius

IL – interleukinas IFN – interferonas

ANG I ir ANG II – angiotenzinas I ir angiotenzinas II TGF – transformuojamas augimo faktorius

9

5. ĮVADAS

Kardiovaskulinės ligos užima pirmąją vietą pagal mirčių skaičių pasaulyje. 2016 m. apie 17,9 milijonai žmonių mirė nuo kardiovaskulinių ligų, tai sudaro 31 proc. visų mirčių pasaulyje [1]. Viena iš pagrindinių kardiovaskulinių ligų yra išeminė širdies liga (IŠL). Nors mirštamumas nuo šios ligos per pastaruosius keturis dešimtmečius sumažėjo, tačiau vis tiek išlieka viena pagrindinių mirties priežasčių [2]. Vien Europoje mirštamumas nuo IŠL siekia 20 proc. visų mirties atvejų [3].

Dėl IŠL sukelto pažeidimo prasideda remodeliavimosi procesas, dėl kurio dažniausiai vystosi kairiojo skilvelio (KS) sistolinė disfunkcija, kuri progresuoja į širdies nepakankamumą (ŠN) [4]. Kardialinė remodeliacija pasižymi dviem procesais. Vienas iš jų – adaptacinis, kurio dėka išlaikoma širdies funkcija tūrio ar slėgio perkrovos ūminio širdies audinio pažeidimo metu. Antrasis – progresuojanti remodeliacija, kuri yra žalinga ir prisideda prie progresavimo į širdies nepakankamumą [4,5].

Esant širdies remodeliavimuisi ir nepakankamumui, nustatomas padidėjęs putliųjų ląstelių skaičius. Širdies putliosios ląstelės pastaruoju metu susilaukė daug dėmesio, nes jos ne tik dalyvauja vykstant įvairioms fiziologinėms funkcijos (angiogenezei, formuojantis natriureziniams peptidams, angiotenzinui II), patologiniams procesams (išemijos reperfuzijos pažeidimams, aritmijoms, dilatacinei kardiomiopatijai), tačiau nurodomas ir jų reikšmingas vaidmuo širdies remodeliavimosi ir širdies nepakankamumo patogenezėje.

Putliosios ląstelės yra svarbus citokinų, augimo faktorių ir chemokinų šaltinis, kurie išskiriami ląstelėms degranuliuojantis. Padidėjusi putliųjų ląstelių degranuliacija susijusi su didėjančiu šių ląstelių tankiu. Manoma, kad joms degranuliuojantis atsipalaiduoja β – TAF ir triptazė, kurie skatina likusių nesubrendusių ląstelių brendimą ir diferenciaciją. Putliosiose ląstelėse sukauptas proteolizinis fermentas chimazė, aktyvintai ląstelei degranuliuojantis, katalizuoja angiotenzino I virtimą angotenzinu II, nepriklausomai nuo angiotenziną konfertuojančio fermento (AKF). Nurodoma, kad KS 80 proc. angiotenzino II yra generuojama chimazės. Chimazės kilmės angiotenzinas II skatina β – TAF ekspresiją ir kardiomiocituose bei kartu su putliųjų ląstelių išskiriamu šiuo faktoriumi skatina miokardo hipertrofiją, fibroblastų proliferaciją ir kolageno sintezę.

Šio tyrimo tikslas yra nustatyti širdies KS putliųjų ląstelių chimazės raiškos pokyčius, esant įvairios funkcinės klasės išeminės kilmės ŠN.

10

6. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI

Tikslas: nustatyti širdies KS putliųjų ląstelių chimazės raiškos pokyčius, esant įvairios funkcinės klasės išeminės kilmės ŠN.

Uždaviniai:

1. Nustatyti chimazei pozityvių ląstelių skaičiaus pokyčius, kai nebuvo širdies nepakankamumo (ŠN – A stadija)

2. Nustatyti chimazei pozityvių ląstelių skaičiaus pokyčius, kai buvo B klasės ŠN. 3. Nustatyti chimazei pozityvių ląstelių skaičiaus pokyčius, kai buvo C-D klasės ŠN.

4. Įvertinti putliųjų ląstelių chimazės raiškos sąsajas su suminiu stenozuojančiu vainikinių arterijų pažeidimu (stenozės indeksu).

11

7. LITERATŪROS APŽVALGA

7.1 Putliųjų ląstelių struktūra, fenotipai ir paplitimas organizme

Putliosios ląstelės - branduolius turinčios ląstelės, kurios yra pasiskirsčiusios audiniuose po visą organizmą, jos yra svarbi įgyto ir įgimto imuniteto dalis, atlieka reikšmingą vaidmenį antigeno pristatyme, uždegime [6]. Daugelis tyrimų parodė, kad šios ląstelės taip pat dalyvauja įvairiuose procesuose, tokiuose kaip audinių remodeliacija, žaizdų gijimas, patologinė fibrozė ir daugelyje kitų [7].

Šiandien putliosios ląstelės yra laikomos daugiafunkcinėmis imuninėmis ląstelėmis, susijusiomis tiek su fiziologiniais, tiek su patologiniais procesais. Putliųjų ląstelių brendimas, fenotipas ir funkcija priklauso nuo lokalios mikroaplinkos, kuriose šios ląstelės yra. Taip pat nuo to priklauso ir jų galimybė atpažinti bei atitinkamai reaguoti (išskiriant biologiškai aktyvius mediatorius, dalyvaujančius fiziologiniuose bei imuninuose procesuose) į įvairius impulsus [8].

Putliosios ląstelės kyla iš CD34+ hemapoetinių ląstelių pirmtakų kaulų čiulpuose [9]. Jos migruoja į periferinius audinius su kraujo srove kaip pirmtakės ląstelės ir ten baigia bręsti (veikiant lokaliems citokinams), [10] skirtingai nei kitos hemapoetinės ląstelės, kurios diferencijuojasi ir subręsta kaulų čiulpuose prieš išsiskiriant į kraują [8].

Kamieninių ląstelių faktorius yra pagrindinis veiksnys putliųjų ląstelių išgyvenimui ir brendimui. Putliųjų ląstelių brendimą taip pat skatina nervų augimo faktorius ir neutrofinas-3 [11].

Subrendusios putliosios ląstelės necirkuliuoja kraujyje ir yra apribotos periferiniais audiniais, tačiau išlaiko galimybę proliferuoti [12]. Jos pasižymi ekspresuojamais didelio afiniškumo receptoriais imunoglobulinui E (IgE), (FcεRI) ir kamieninių ląstelių faktoriui (c-Kit) [11].

Atsižvelgiant į skirtingą vietą, funkcijas, struktūrą bei biochemines savybes buvo apibūdinti keli putliųjų ląstelių tipai. Graužikams priskiriami gleivinės putliųjų ląstelių ir jungiamojo audinio putliųjų ląstelių tipai. Subrendusios žmogaus putliosios ląstelės skirstomos remiantis jų turimomis proteazėmis: putliosios ląstelės, savo granulėse turinčios triptazės, chimazės, karboksipeptidazės bei katepsino G (angl. MCTC) ir putliosios ląstelės, turinčios tik triptazės (angl. MCT). Šie tipai tarpusavyje taip pat skiriasi ir ekspresuojamais C5aR (komplemento sistemos komponento C5 receptorius). Subrendusios MCTC ekspresuoja šį receptorių, o MCT – ne [8]. MCT paprastai randamos gleivinėje; MCTC dažniausiai randama jungiamajame audinyje. Subrendusios putliosios ląstelės yra sąlyginai didelės ir lengvai matomos šviesiniu mikroskopu, po audinio nudažymo toluidino mėlynuoju [13].

Naudojant Alcian Blue ir Safranin dažymo metodus, buvo nustatyti 4 putliųjų ląstelių subrendimo stadijos: I stadija – nesubrendusios putliosios ląstelės, visiškai mėlynos; II stadija –

12 putliosios ląstelės, kurios nusidažo daugiausiai mėlynai (>60 proc.) su mažesniu kiekiu raudonos spalvos (<40 proc.); III stadija – putliosios ląstelės, kurios nusidažo daugiausiai raudonai (>60 proc.) su mažesniu kiekiu mėlynos spalvos (<40 proc.); IV stadija – visiškai diferencijuotos, subrendusios putliosios ląstelės, kurios yra plytų raudonumo spalvos. Buvo nustatyta, kad I ir II stadijos putliosios ląstelės yra mitotiškai aktyvios, o III ir IV – ne [14].

Šios ląstelės sintetina, kaupia ir išskiria platų spektrą priešuždegiminių ir vazoaktyvių mediatorių, citokinų, proteazių [9]. Putliųjų ląstelių granulėse esantis turinys yra išskiriamas degranuliacijos būdu į aplinką. Šios ląstelės yra ypatingos tuo, kad jos gali regranuliuoti ir išlaikyti savo funkciją net ir įvykus degranuliacijai. Taip pat jos gali būti aktyvuotos įvairių dirgiklių, tokių kaip neuropeptidai, citokinai, augimo faktoriai, toksinai, komplemento komponentai, imuniniai kompleksai, tam tikri vaistai [6, 8].

Putliosios ląstelės yra lokalizuotos įvairiuose organuose, gausu jungiamajame audinyje, kardiovaskuliniuose audiniuose, virškinamajame trakte, odoje, gimdoje, prostatoje [12].

Graužikų, šunų ir žmonių širdyje putliosios ląstelės paprastai randamos intersticiniame tarpe tarp miocitų, šalia kraujagyslių ir nervų. Tai yra svarbu įvairių širdies ligų atsiradimui ir progresavimui [9].

1 pav. Miokardo infarktas: ankstyvoji jo fazė, stebimos putliosios ląstelės (orig. pad.x20,

13 Nors, sveikame širdies audinyje putliųjų ląstelių yra sąlyginai mažai, [9] priklausomai nuo rūšies: nuo 1,4 ląstelių/mm2 Wistar Kyoto žiurkėse iki 5,3 ląstelių pas žmogų [13, 14], jos siejamos su širdies audinio pažaida, kuri stebima miokardo išemijos (1 pav.), širdies audinio fibrozės, širdies hipertenzinės ligos bei dilatacinės kardiomiopatijos patogenezėse [7].

Žmogaus širdyje 90proc esančių putliųjų ląstelių yra triptazės/chimazės putliųjų ląstelių (angl. MCTC) tipo. Širdies putliosios ląstelės dalyvauja įvairiose fiziologinėse funkcijose, tokiose kaip angiogenezė, prieširdžių natriurezinio peptido bei angiotenzino II formavime [12].

7.2 Putliųjų ląstelių mediatoriai

Putliosios ląstelės kaupia ir išskiria gausią įvairovę biologiškai aktyvių mediatorių, tokių kaip proteazės (triptazė, chimazė, stromelizinas), histaminas, bei platų spektrą citokinų (TNF-α) ir augimo faktorių [14,15].

Priklausomai nuo dirgiklio ir aplinkos, putliosios ląstelės išskiria gausybę produktų, kurie gali moduliuoti įvairius biologinius procesus, įskaitant ir uždegimą bei kraujagyslių pralaidumą [11].

Putliųjų ląstelių aktyvacija lemia 3 skirtingų klasių mediatorių išsiskyrimą: 1) jau suformuoti mediatoriai, kurie kaupiami putliųjų ląstelių citoplazmos granulėse (histaminas, serotoninas, chimazė, triptazė, katepsinas G, karboksipeptidazė A, reninas, TNF-α, kamieninių ląstelių faktorius ir kiti); 2) lipidiniai mediatoriai, kurie kilę iš membranos lipidų (prostaglandinas D2, leukotrienai B4, C4 bei trombocitus aktyvuojantis faktorius ir kiti); 3) neosintezuoti mediatoriai, kurie produkuojami suaktyvėjusios transkripcijos metu ir jų reguliacija priklauso nuo dirgiklio ir receptoriaus rūšies (IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, kamieninių ląstelių faktorius, nervų augimo faktorius ir kiti) [8, 11, 12].

Chimazės, triptazės ir korboksipeptidazė A yra ekspresuojama išimtinai putliųjų ląstelių [8, 16].

Putliosios ląstelės gali būti aktyvuotos keletos skirtingų dirgiklių reaguojančių su gausybe skirtingų receptorių, esančių ant putliųjų ląstelių paviršiaus [8].

Putliųjų ląstelių išskiriami citokinai, tokie kaip IL-6 ir IFN-γ, aktyvuoja endotelines ląsteles, skatina kraujagyslių uždegimą, kuris gali progresuoti į plokštelės ar aneurizmos formavimąsi. Iš putliųjų ląstelių išsiskyręs TNF-α skatina dendritinių ląstelių aktyvaciją ir antigeno prezentaciją. Histaminas sukelia vazokonstrikciją, padidina kraujagyslių pralaidumą, skatina antigeno įsisavinimą ir kamieninių putliųjų ląstelių proliferaciją, kuri veda į plokštelės nestabilumą, neointimos formavimąsi. Putliųjų ląstelių proteazės (chimazės ir triptazės) per skirtingus mediatorius sukelia ekstraląstelinio matrikso degradaciją, kraujagyslinių ląstelių apoptozę ir putotųjų ląstelių formavimąsi, kas gali sukelti plokštelės nestabilumą, skatinti aneurizmos formavimąsi [11].

14 Kardiovaskulinėje sistemoje chimazė yra svarbus šaltinis angiotenzino I (ANG I) konvertavimui į angiotenziną II (ANG II), nepriklausomai nuo angiotenziną konvertojančio fermento (AKF) [9]. Taip pat ji gali sukelti ekstraląstelinio matrikso degradaciją, aktyvuoti transformuojamą augimo faktorių beta 1 (TGF- β1) ir IL- 1β. Chimazės inhibavimas in vitro gali paveikti žmogaus koronarinių arterijų vazokonstrikciją. Chimazė taip pat siejama su aterosklerotinės plokštelės nestabilumu. Šis efektas gali būti pasiekiamas padidėjus Ang II ir aktyvavus matrikso metalproteinazę [11].

Daugelyje atliktų tyrimų teigiama, kad širdies putliosios ląstelės taip pat yra ir papildomas renino šaltinis [9,12]. Degranaliacijos metu širdies putliosios ląstelės geba išskirti reniną, kuris toliau aktyvuoją vietinę renino angiotenzino sistemą širdyje [12]. Tuomet vyksta lokali ANG II produkcija širdyje, o ANG II poveikis apima koronarų vazokonstrikciją, aritmogenezę, fibrozę, apoptozę ir endotelino išskyrimo skatinimą (visi šie mechanizmai susiję su širdies ligomis, kuriose dalyvauja putliosios ląstelės). Širdies simpatinių nervų išskirtas norepinefrinas dar labiau sustiprina ANG II veikimą [9].

7.3 Putliųjų ląstelių chimazė ir miokardo persitvarkymas

Chimazė yra proteolitinis fermentas, kuris kaupiamas putliosiose ląstelėse ir yra aktyvuojamas šių ląstelių degranuliacijos metu [12].

Ang II formavimasis plazmoje priklauso nuo AKF, tuo tarpu Ang II formavimasis kardiovaskuliniame audinyje daugiausiai priklauso nuo chimazės. Chimazė konvertuoja ANG I į ANG II, perskeldama peptidinį ryšį tarp fenilalanino ir histidino ANG I molekulėje [9]. Tokiu būdu susiformavęs Ang II, atlieka tokias biologines funkcijas, kurios nėra būdingos klasikinei renino – angiotenzino sistemai (RAS) ir mini RAS (kuri reguliuojama audinių renino) (klasikinės RAS atliekamos funkcijos – kraujo spaudimo ir hemodinamikos reguliacija), bet dalyvauja miokardo persitvarkyme, susijusiame su kardiovaskulinėmis ligomis [17, 18].

Putliosiose ląstelėse yra sintetinama neaktyvi chimazės forma, tačiau įvykus kardiovaskulinio audinio pažaidai, chimazė yra aktyvinama įvykus putliųjų ląstelių degranuliacijai. Aktyvi chimazės forma verčia Ang I į Ang II. Šios sistemos veikimo metu susiformavęs Ang II skatina miocitų apoptozę, fibroblastų proliferaciją (dalyvauja miokardo persitvarkyme), aritmijas, angiogenezę, koronarinių kraujagyslių vazokonstrikciją [18]. Širdies nepakankamumų atvejais 75 proc. ryškiai fibrogeniško, specifiško širdžiai ANG II gaunama būtent chimazės dėka. Kadangi šis ANG I virtimo ANG II kelias neveikiamas AKF inhbitorių, juos vartojant nesustabdomas širdies fibrozės procesas [7]. Taip pat chimazė aktyvuoja transformuojantį augimo faktorių beta (TGF – β), taip sukeldama

15 fibroblastų proliferaciją. Tyrimų metu nustatyta, kad chimazės inhibitoriai visiškai nuslopina šią padidėjusią proliferaciją, o angiotenzino receptorių blokatoriai (ARB) – ne [18,19]. Taip pat buvo nustatyta, kad putliųjų ląstelių skaičius, chimazės ekspresija ir ANG II kiekis širdyje ryškiai padidėja esant estrogeno sumažėjimui (tyrimas atliktas su žiurkėmis, kurioms buvo atlikta ovariektomija) [16,20]. Taip pat verta paminėti, kad tam tikruose tyrimuose teigiama, jog ANG (1-12), o ne ANG I yra geresnis substratas ANG II formuotis, veikiant chimazei suaugusių žiurkių širdyse [19, 21].

Kad kompensuoti ilgą nenormalų miokardo stresą, kuris kyla dėl pažeidimo, ligos ar lėtinio skilvelių perkrovimu tūriu ar slėgiu, prasideda struktūrinis raumeninis, kraujagyslinis ir ekstraląstelinio matrikso komponentų miokarde persitvarkymas. Tačiau, sugebėjimas normalizuoti padidėjusį stresą yra ribotas, to pasekoje, skilveliai dilatuoja, sienelė storėja ir galiausiai pasireiškia klinikiniai širdies nepakankamumo simptomai [13].

Padidėjęs putliųjų ląstelių skaičius stebimas eksplantuotose žmonių širdyse su dilatacine kardiomiopatija, taip pat gyvūnų modeliuose, kuriuose buvo eksperimentiškai sukeliama hipertenzija, miokardo infarktas, lėtinis perkrovimas tūriu ar slėgiu [13, 14, 16]. Literatūroje teigiama, jog

subrendusių putliųjų ląstelių tankio padidėjimas (kartu stebimas ir nesubrendusių putliųjų ląstelių skaičiaus sumažėjimas) siejamas su kamieninių ląstelių faktoriaus (SCF) daroma įtaka nesubrendusių

2 pav. Miokardo ląstelių hipertrofijos ir fibrozės signaliniai mechanizmai [27].

Th – T ląstelės pagalbininkės, rhIL rekombinantinis žmogaus interleukinas, Ang II – angiotenzinas II,

kiti trumpinimai – tekste ir lentelėje

Makrofagas Fibroblastas Neutrofilinis granulocitas Putlioji ląstelė Aktyvavimas: spaudimas, tūris, neurohumoralinis Hipertrofija/Apoptozė MMPsDiferencijacija Matrikso produkcija TGF-β PAR-2 PDGF-A Ang-II TGF-β Citokinai Citokinai Citokinai Chemokinai TGF-β Augimo faktoriaiAng-II AT₁ AKF inhibitoriai AKF Chimazė Chimazė PDGF-A Triptazė Ang-I S100A B Ang-II AT₁ ROS MMPs IL-10 TGF-β IL-1β TNF IL-12 TGF-β MR MR antagonistai Aldosteronas DAMPs TLR MCP1 IL-4 IL-13 IFN rhIL-10 rhIL-10 T_reg T_h1 T_h2 ? ARBs

16

putliųjų ląstelių brendimui. Neatsiejamas ryšys tarp putliųjų ląstelių aktyvacijos ir putliųjų ląstelių tankio padidėjimo yra susijęs su putliųjų ląstelių išskiriama chimaze, kuri stimuliuoja SCF išskyrimą iš fibroblastų teigiamojo grįžtamojo ryšio principu [13, 15]. Širdies pažaidų metu stebimas širdies putliųjų ląstelių tankio padidėjimas siekia nuo 1,7 iki 6 kartų [13].

Literatūroje aprašyta, kad putliųjų ląstelių sekretuojama chimazė prie ekstraląstelinio matrikso persitvarkymo gali prisidėti tiesiogiai - sukeldama fibronektino ir nespiralinių kolagenų skilimą; netiesiogiai - aktyvuodma matrikso metalproteinazes (MMP), kurios yra atsakingos už fibrilinio kolageno degradaciją ekstraląsteliniame matrikse [13–15]. Kadangi, ekstraląstelinis kolageno matriksas yra atsakingas už skilvelių dydžio ir formos palaikymą, jo veiklos sutrikdymas sąlygoja netinkamą (žalingą) miokardo persitvarkymą [15, 20, 22]. Kad putliosios ląstelės dalyvauja šiame procese, įrodo tyrimuose aprašytas putliųjų ląstelių membraną stabilizuojančių medžiagų poveikis, pavyzdžiui, Cromolyn natrio druska, kuri neleidžia putliosioms ląstelėms degranuliuoti. Taip šie vaistai užkerta kelią MMP aktyvavimui, kolageno degradacijai, putliųjų ląstelių skaičiaus padidėjimui, žalingam skilvelių persitvarkymui bei kontraktiliškumo sumažėjimui, taip pat sumažina mirštamumą susijusį su lėtiniu perkrovimu tūriu [14].

Daugelis atliktų tyrimų rodo, kad putliosios ląstelės dalyvauja žalingame širdies audinio persitvarkyme (2 pav.) [10, 23]. Tačiau yra įrodymų, kad jos taip pat atlieka ir širdį saugantį vaidmenį (homocisteino indukuotas širdies audinio persitvarkymas) [9]. Literatūroje taip pat aprašomas ir putliųjų ląstelių antifibrozinis poveikis, kas leidžia manyti, kad putliosios ląstelės kaip ir makrofagai, reaguodami į juos supančius mikroaplinkos veiksnius, geba keisti savo augimo faktorių bei proteazių ekspresiją, taip transformuotis iš fibrotinio į antifibrotinį fenotipą [15].

7.4 Išeminis reperfuzinis pažeidimas ir chimazė

Ankstyva reperfuzija po miokardo išemijos padidina uždegiminių ląstelių infiltraciją, kurios prisideda prie kardiomiocitų žūties, širdies funkcijos susilpnėjimo, bei postišeminę miokardo remodeliaciją [24, 25]. Šis procesas vadinamas išeminiu reperfuziniu pažeidimu. Anksti po išeminės reperfuzijos putliosios ląstelės išskiria chimazę, kuri yra vienas pagrindinių mediatorių fibroblastų migracijoje ir diferenciacijoje, kurie sąlygoja netinkamą miokardo remodeliaciją. Nors sugrąžinta kraujotaka po ūmaus miokardo infarkto limituoja infarkto dydį bei sumažina mirštamumą, dažnai tai sukelia antrą streso bangą, kuri gali sukelti papildomą miokardo pažaidą. Tai pasireiškia per žalingą chimazės poveikį [25].

17

8. TIRTASIS KONTINGENTAS IR METODAI

8.1 Tirtasis kontingentas

Ištirti 60 sirgusių IŠL vyrų miokardo mėginiai. Tirtiesiems ligoniams nebuvo nustatyta jokių kitų, išskyrus išemiją, miokardo hipertrofiją lemiančių veiksnių (sisteminės arterinės hipertenzijos, reumatinių širdies ydų, kardiomiopatijų, įgimtų širdies ydų, cukrinio diabeto, plaučių ligų ir kt.). Tiriamieji suskirstyti į tris grupes. Pirmoji – IŠL grupė, kai nebuvo ŠN simptomų, kurią sudarė 24 vyrų, mirusieji staiga, t.y per 6 val. nuo ūminio širdies priepuolio simptomų pradžios, ne ligoninėje, kai autopsijos metu nenustatyta poinfarktinio rando(ų), o ūminiai išeminiai miokardo pažeidimai buvo ne daugiau kaip 12 val. trukmės, amžiaus vidurkis – 47,3±5,9 metų [26]. Antroji – IŠL grupė, kai buvo B stadijos ŠN, ją sudarė 25 mirusiųjų tokiomis pat aplinkybėmis kaip ir pirmosios grupės, amžiaus vidurkis – 48,3±6,2 metų. Autopsijos metu jiems buvo nustatytas poinfarktinis randas, bet nebuvo klinikinių ŠN simptomų. Tai leido tvirtinti, kad ikiinfarktinės ir poinfarktinės IŠL grupių tirtiesiems rasti chroniniai širdies pokyčiai jau buvo iki įvykstant pirmajai ar pakartotinei ūminei IŠL atakai. Trečioji – IŠL grupė, kai buvo C-D stadijos ŠN, ją sudarė 11 vyrų, jiems buvo nustatytas kongestinis širdies nepakankamumas ir atlikta širdies transplantacija, amžiaus vidurkis – 49,2±7,9 metų). Pirmosios ir antrosios tiriamosios grupių asmenys nebuvo gydyti miokardo fibrozę reguliuojamaisiais vaistais. Trečioji grupė buvo gydyta pagal išeminės kilmės širdies nepakankamumo gydymo algoritmą [27].

Kontrolinę grupę sudarė 21 tiriamųjų (amžiaus vidurkis 46,8 ± 5,9 metų), kurie mirė per pirmąją parą nuo išorinių priežasčių bei ūminių ligų, nesusijusių su širdies patologija.

Tiriamoji medžiaga atrinkta iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Kardialinės patologijos laboratorijoje daugiau negu 30 metų įvairiomis širdies ligomis sirgusiųjų kaupiamo audinių (įlietų į parafiną) banko.

8.2 Tyrimo metodai

Specialus morfologinis (makroskopinis ir mikroskopinis) mirusiųjų nuo IŠL širdies, vainikinių arterijų ir miokardo tyrimas atliktas remiantis modifikuota Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) rekomenduota fatalinės IŠL tyrimo metodika [28]. Ši metodika leidžia sukaupti informaciją apie visą vainikinių arterijų medį ir visą miokardą.

18 8.2.1 Makroskopinis ir histologinis miokardo tyrimas

Po fiksacijos 10 % buferinio formalino tirpale abu skilveliai ir tarpskilvelinė pertvara supjaustyti 5 mm storio skersiniais pjūviais nuo širdies bazės link viršūnės. Šie pjūviai, arba histotopogramos, tirti vizualiai įvertinant raumens spalvą, konsistenciją, jų pokyčius bei židininius ischeminius pažeidimus (nekrozę, jungiamojo audinio išvešėjimą ir kt.). Šviežios koaguliacinės nekrozės 0,5 cm ir didesnio skersmens židinys vertintas kaip miokardo infarktas (unifokalinis ir multifokalinis), o reparacinės, arba substitucinės, fibrozės – kaip poinfarktinis randas; mažesni kaip 0,5 cm skersmens židinėliai – atitinkamai kaip mikronekrozė ir smulkiažidininė fibrozė.

Po vertinimo tiriamoji medžiaga įliejama į parafiną vakuumo aplinkoje naudojant standartinę metodiką. Iš parafininių blokų rotaciniu mikrotomu Leica buvo rengiami standartiniai 3 m parafininiai pjūviai, tiesinami vandens vonelėje Sakura, uždedami ant SuperFrost plus objektinių stiklelių ir džiovinami ant histologinių pjūvių sausinimo stalo Thermo Electron Corporation. Dažymas atliktas pagal standartizuotas metodikas dažymo automatu Shandon Varistain Gemini.

Standartiniai miokardo pjūviai (histotopogramos) dažyti hematoksilinu-eozinu ir tirti optiniu mikroskopu Olympus BX61 įvertinant ūminius ir chroninius ischeminius pažeidimus bei jų trukmę (histologinį amžių). Pastarasis nustatytas remiantis PSO ekspertų rekomenduojamais ir visuotinai priimtais standartiniais miokardo infarkto morfologiniais kriterijais bei kontraktilinio miokardo pokyčiais [26, 28].

Standartiniai miokardo pjūviai (histotopogramos) dažyti hematoksilinu-eozinu ir tirti optiniu mikroskopu Olympus BX61 įvertinant ūminius ir chroninius ischeminius pažeidimus bei jų trukmę (histologinį amžių). Pastarasis nustatytas remiantis PSO ekspertų rekomenduojamais ir visuotinai priimtais standartiniais miokardo infarkto morfologiniais kriterijais bei kontraktilinio miokardo pokyčiais [26, 28].

8.2.2 Imunohistocheminis tyrimas

Po atlikto detalaus histologinio tyrimo, iš atokiosios („intaktinės“) miokardo srities parafininių blokų pagaminti 3 m pjūviai, uždėti ant Super Frost plus objektinių stiklelių. Stikleliai laikyti prieš dažant 3 val. 58oC temperatūros termostate. Deparafinavimas atliktas dažymo automatu Varistain Gemini naudojant ksileną bei etanolį (detaliau priede). Pjūviai praplauti distiliuotu vandeniu. Epitopas buvo išlaisvinamas mikrobangų įrenginiu RHS-1 (Milstone), inkubuojant preparatus TRIS/EDTA pH 9,0 buferyje, esant 110 oC temperatūrai (8 min.). Tolesnis imunohistocheminis dažymas buvo atliektas panaudojant Shandon Coverplate plokšteles. Blokavus endogeninę peroksidazę, 1 val. pjūviai buvo inkubuojami pirminio monokloninio (pelės) antikūno prieš putliųjų

19

3 pav. Putliųjų ląstelių, pozityvių chimazei, imunohistocheminis tyrimas, orig. padid. x10)

ląstelių chimazę (klonas CC1 Novocastra, 1:200) darbiniame tirpale. Po to preparatai apdorojami DAKO Real Envision vizualizavimo sistema pagal gamintojų rekomenduojamą protokolą. Papildomai buvo dažoma Majerio hematoksilinu ir dengiama stikleliais naudojant polistireno dengiamąją medžiagą (3 pav.).

Teigiamai imunohistocheminio tyrimo kontrolei naudoti rekomenduotini kontrolinio audinio (tonsilių) pjūviai, neigiama kontrolė atlikta tuose pačiuose pjūviuose, naudojant atitinkamos klasės imunoglobulinus vietoj pirminio antikūno.

8.2.3 Histomorfometrinis tyrimas

Imunohistochemiškai nudažius putliąsias ląsteles histologiniai preparatai dokumentuoti naudojant Pannoramic MIDI skanerį (3DHISTECH) (4 pav.). Pannoraramic Viewer pagalba išilginiuose miokardo pjūviuose pažymėjus tiriamą regėjimo lauką vizualiai analizuota ir pažymėta putliosios ląstelės naudojant 40x padidinimą (4 pav.). Kiekviename preparate buvo skaičiuojami keli regėjimo laukai, kurių bendras plotas buvo ≥1 cm². Apskaičiuotas putliųjų ląstelių kiekis viename kvadratiniame milimetre. Atlikta bandomoji studija, kurios metu vertinimą atliko du nepriklausomi tyrėjai (vienas jų darbo autorė), nežinodami pacientų identifikacijos ir klinikinių duomenų. Dviejų

20

4 pav. Histomorfometrinis putliųjų ląstelių įvertinimas

vertintojų ir to paties tyrėjo putliųjų ląstelių pozityvių chimazei vertinimo sutapimo palyginimui apskaičiuotas Cohen kappa koeficientas. buvo daugiau 0,9 – labai geras sutapimas (p<0,01). Tais atvejais, kai tyrėjų ar to paties tyrėjo putliųjų ląstelių kiekis skyrėsi daugiau 5 proc., histologiniai preparatai buvo peržiūrimi pakartotinai. Toliau histomorfometrinį tyrimą atliko šio darbo autorė.

Siekiant išvengti “tuščių tarpų” (intersticiumo ir iš dallies galinčių atsirasti dėl preparatų rengimo paklaidų) įtakos, anotuoti laukai buvo perkeliami į ImagePro programą ir apskaičiuotas jų plotas, o putliųjų ląstelių kiekis apskaičiuotas išmetus šių “tuščių tarpų” plotą (5 pav.).

Taip pat palyginti mūsų morfometrinio tyrimo duomenys su morfometrinės analizės tyrimo, kai naudojant mikroskopą Olympus BX51 (10x objektyvą) fotografuota po 50 regėjimo laukų (1 lauko

21

5 pav. Histomorfometrinis tuščių tarpų” įvertinimas (kairėje – antotuota sritis, dešinėje apskaičiuotas šios

srities tuščių tarpų užimamas šios srities procentinis plotas)

dydis 0,59 mm2 kiekvieno tiriamojo intaktinėje miokardo srityje (kitų Kardialinės patologijos laboratorijos tyrėjų duomenys).

8.2.4 Statistinė analizė

Išanalizavome kiekvieno tiriamojo pradinių morfometrinių duomenų skirstinį, tikrindami nulinę hipotezę 2 ir Kolmogorovo-Smirnovo kriterijais [29]. Nustatėme, kad atmesti nulinę hipotezę apie nagrinėtų duomenų normalųjį skirstinį neturime pagrindo, todėl toliau naudojome normaliojo skirstinio duomenų vidurkių ir dispersijų analizės standartinius metodus. Įvertinome tiriamųjų histomorfometrinių pametrų imties vidurkio ir dispersijos pasikliautinuosius intervalus. Nustatytas trumpas intervalo ilgis, mažas standartinės paklaidos ir parametro vidurkio santykis (visų parametrų <5 %) rodo pakankamai didelį imties tūrį ir tai, kad jis tiksliai rodo šių parametrų generalinę aibę.

Histomorfometriniams parametrams palyginti tarp dviejų ir daugiau grupių naudojome dispersinės analizės (ANOVA) dviejų faktorių metodą, įvertindami grupės ir kiekvieno tiriamojo morfometrinių parametrų dispersijas (lizdinės imties analizė, angl. – nested design). Ryšius tarp tirtųjų parametrų nustatėme regresinės analizės metodu. Skirtumus statistiškai reikšmingais laikėme, kai p<0,05.

22

9. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Mūsų atlikto morfometrinio tyrimo duomenimis, kai įvertinama didelis tiriamasisi plotas pasitelkiant histologinių preparatų skenavimo metodiką, sergančiųjų IŠL grupės miokardo viso anotuoto lauko putliųjų ląstelių pozityvių chimazei kiekis buvo vidutiniškai 3,6/1 mm2, lyginant su 3,0 analogišku kontrolinės grupės rodikliu (p<0,05). Skenuotų ir anotuotų laukų dydis buvo daugiau 1 cm2, todėl analizavome vadinamų „tuščių tarpų“ ploto įtaką. „Tuščių tarpų“ plotas kai kuriais atvejais siekė iki 20 proc. (6 pav.), tačiau koreliacinė analizė atskleidė glaudų putliųjų ląstelių ryšį (r=99, p<0,001), kai jos buvo skaičiuojamos visame anotuotame lauke ir atmetus „tuščių tarpų“ plotus (7 pav.), todėl tolimesnei analizei pateikiame viso anatuoto lauko rodiklius.

Histogram ( 10v*158c) 0,90 2,76 4,62 6,48 8,34 10,20 12,06 13,92 15,78 17,64 19,50 21,36 23,22 25,08 26,94 28,80 ' 0 5 10 15 20 25 30 35 40 n

6 pav. „Tuščių tarpų“ užimamo ploto (proc.) pasiskirstymas

Atlikome putliųjų ląstelių kiekio koreliacinę analizę mūsų morfometrinio tyrimo, kai buvo skenuota ir analizuota dideli anotuoti laukai (20 objektyvo didinimu) ir maži (50 laukų, bendras jų plotas 29,5 mm2), dokumentuoti kitų Kardialinės patologijos laboratorijos tyrėjų standartine skaitmenine kamera (10 objekto padidinimu) (8 pav.). Koreliacinis ryšys buvo stiprus (r=0,74, p<0,001), tačiau mes manome, kad mūsų didelio tyrimo lauko metodika yra tikslesnė, nes analizės metu mes galėjome naudotis virtualiosios mikroskopijos privalumais, t.y. virtualiai vaizdą pasididinti, kas yra neįmanoma standartinėse fotografijose.

Sergančiųjų IŠL, kai nebuvo širdies nepakankamumo ir buvo B stadijos širdies nepakankamumas, miokardo putliųjų ląstelių, pozityvių chimazei, kiekis nesiskyrė (p>0,05) ir šių abiejų grupių buvo didesnis lyginant su kontrolinės grupės analogišku rodikliu (p<0,01) (9 pav.). Kai

23

Scatterplot ( 543v*415c) daznis MCC = 1,3576+0,8644*x

0 1 2 3 4 5 6

Vidutiniškai 50 regėjimo laukų (1 mm2₎ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 V is a s a no tuo ta s l a u ka s ( 1 m m 2 ) MCC vid meile:daznis MCC: y = 1,3576 + 0,8644*x; r = 0,7443; p = 0.0000; r2 = 0,5540 Scatterplot ( 546v*405c) Include condition: v6<20 mcc visame foto = -0,0252+0,9292*x 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Plotas be "tuščių tarpų" (kiekis/1mm2₎

0 1 2 3 4 5 6 7 V is a s a n o tu o ta s p lo ta s (k ie k is /1 m m 2 )

daznis MCC materija:mcc visame foto: r = 0,9900; p = 0.0000; r2 = 0,9802

r=0,99, r2=0,98, p<0,001

7 pav. Viso anotuoto lauko ir lauko be „tuščių tarpų“ putliųjų ląstelių kiekio (1 mm2) koreliacinis ryšys

buvo C-D stadijos nepakankamumas, miokardo chimazei pozityvių ląstelių kiekis buvo didesnis už kontrolinės grupės (p<0,01) ir už IŠL grupės, kai nebuvo širdies nepakankamumo ir buvo B stadijos širdies nepakankamumas (p<0,05).

r=0,74, r2=0,55, p<0,001

8 pav. Viso anotuoto lauko ir morfometrinio tyrimo, kai buvo analizuota 50 atskirų laukų, putliųjų ląstelių

24 0 1 2 3 4 5 6

Subrendusios putliosios ląstelės yra palyginti didelės ir gerai išsiskiria netgi hematoksilinu ir eozinu dažytame preparate (žr. 1 pav.). Nustatyta, kad miokardo putliųjų ląstelių kiekis įvairuoja nuo 1,4 ląstelių/mm2

Wistr Kyoto žiurkėms iki 5,3 ląstelių/mm2 [30]. Mūsų tyrimo duomenimis, kontrolinės grupės asmenų 1 mm2

vidutiniškai buvo 2,9 putliosios ląstelės. Eksperimentinių tyrimų duomenimis, jų kiekis miokarde padidėja jau po 12 val. nuo kraujo tūriu pradžios [30]. Labiausiai tikėtina, kad šie pakitimai susiję su greitesniu ląstelių subrendimu, negu su jų proliferacija [31, 32]. Esant perkrovai spaudimu taip pat yra nustatyta padidėjęs miokardo putliųjų ląstelių kiekis [30]. Padaugėja šių ląstelių ir pradinėje miokardo infarkto fazėje bei esant miokardo išemijai reperfuzijai [33].

Mūsų tyrimo duomenimis, koreliacinis ryšys tarp suminio stenozinio vainikinių arterijų pažeidimo ir putliųjų ląstelių kiekio buvo silpnas (10 pav., r=0,23, p<0,05).

Taigi, mūsų tyrimo duomenys papildo putliųjų ląstelių tyrimo panoramą, kai yra chroninė miokardo išemija ir nėra širdies nepakankamumo, ar yra B stadijos širdies nepakankamumas. Jau šiuo laikotarpiu mes nustatėme padidėjusį putliųjų ląstelių kiekį.

Putliosios ląstelės yra svarbus citokinų, augimo faktorių ir chemokinų šaltinis. Tokie mediatoriai kaip histaminas, serotoninas, adenozinas, heparinas, triptazė, chimazė, elastazė, karboksipeptidazė A ir B, katepsinas, eozinofilų ir neutrofilų chemotaksiniai faktoriai yra sukaupti put-

ląstelių kiekis/mm2

* ** *** * *

9 pav. Kairiojo skilvelio miokardo putliųjų ląstelių, pozityvių chimazei, kiekis (vidurkis, standartinė

paklaida):

*p<0,01 – tarp tiriamosios ir kontrolinės grupių, **p<0,01 – tarp IŠL grupės, kai buvo ŠN C-D ir IŠL grupės, kai ŠN nebuvo, ***p<0,01 – tarp IŠL grupės, kai buvo ŠN C-D ir IŠL grupės, kai buvo ŠN B

Kontrolinė grupė

IŠL grupė, kai

25 Scatterplot ( 546v*405c) mcc visame foto = 2,9374+0,0226*x -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Stenozės indeksas 0 1 2 3 4 5 6 7 P u tl ių jų l ąs tel ių k iek is

DSTIN:mcc visame foto: r = 0,2273; p = 0,0584; r2 _{= 0,0517}

r=0,23, r2=0,05, p<0,05

10 pav. Koreliacinis ryšys tarp stenozės indekso ir putliųjų ląstelių pozityvių chimazei kiekio

11 pav. Putliųjų ląstelių degranuliavimasis (imunohistocheminė reakcija putliųjų ląstelių chimazei)

(orig.pad. x20)

liosiose ląstelėse ir išskiriami ląstelėms degranuliuojantis (10 pav.) [30, 34]. Jie yra svarbūs vykstant miokardo persitvarkymui, kuriam įtakos turi renino – angiotenzino sistemos pokyčiai [35]. Angiotenzino II produkcija didžiąja dalimi priklauso nuo renino aktyvumo. Reninas iš inkstų išsiskiria į kraują atsakant į sumažėjusį inkstų perfuzijos spaudimą (tūrio sumažėjimą). Cirkuliuojantis reninas

26 skaido angiotenzinogeną į neaktyvų dekapeptidą angiotenziną I, kuris AKF paverčiamas į aktyvų oktapeptidą angiotenziną II. Fiziologinėmis sąlygomis AKF širdies audinyje yra mažas kiekis, dešiniajame prieširdyje daugiau nei kairiajame ir skilveliuose. Didžioji audinių AKF dalis randama didžiųjų ir smulkiųjų vainikinių arterijų ir arteriolių endotelio ląstelėse. Imunohistocheminiais tyrimais nustatyta, kad tik pusė kapiliarų imunoreaktyvūs AKF, o vainikinės veninės kraujagyslės beveik visiškai jo neturi. AKF dar ekspresuoja endokarde ir vožtuvuose. Normoje jo labai mažai, arba visai nėra suaugusiojo kardiomiocituose in situ. Esant įvairiems širdies pažeidimams AKF neapsiriboja tik kraujagyslių endoteliu. AKF aktyvumas nustatomas kardiomiocituose, fibroblastuose ir infiltruojančiuose makrofaguose. Manoma, kad esminis AKF indukcijos skatintojas yra padidėjusi sienos įtampa [34, 36].

Taigi nors daugumą (apie 60 proc.) cirkuliuojančio angiotenzino II generuoja AKF, širdies audinyje yra ir kitas angiotenzino II produkcijos kelias. Nustatyta, kad vietiškai susidarant žmogaus (taip pat pelių ir šunų) angiotenzinas II įtraukiamos putliosiose ląstelėse sukauptos ir išsiskiriančios proteazės: chimazė ir katepsinas-D. Chimazė veikdama nepriklausomai nuo AKF suskaldant angiotenziną I fenilanino-histiolono peptido ryšį generuoja angiotenziną II. Katepsinas-D skaido angiotenzinogeną į angiotenziną I, nors 105 kartų lėčiau nei reninas. Katepsinas-D pagal amino rūgščių kiekį yra 60 proc. analogiškas reninui. Esama duomenų, kad putliosiose ląstelėse yra ir renino [37]. Nustatyta, kad mažiausiai 90 proc. angiotenzino II širdyje pasigamina veikiant iš putliųjų ląstelių išskiriamai chimazei [30]. Todėl dėsninga, kad ženklus putliųjų ląstelių kiekio padaugėjimas stebimas, kai yra C-D stadijos širdies nepakankamumas, t.y. kai aktyviai vyksta miokardo persitvarkymo procesas: hipertrofuoja kardiomiocitai ir formuojais fibrozė. Tačiau vertėtų prisiminti, kad chimazė dalyvauja ne tik kaupiantis kolagenui, bet ir jo skaidyme, aktyvuojant matrikso metaloproteinazes [30]. Taigi, mūsų tyrimo duomenimis, miokardo putliųjų ląstelių kiekis daugėja progresuojant širdies nepakankamumui ir su juo susijusiu miokardo persitvarkymo procesu.

27

10. IŠVADOS

1. Sergančiųjų išemine širdies liga miokardo putliųjų ląstelių, pozityvių chimazei, kiekis buvo panašus ir padidėjęs jau esant chroninei miokardo išemijai, kai nebuvo širdies nepakankamumo.

2. Kai buvo B stadijos nepakankamumas, putliųjų ląstelių kiekis buvo panašus į tokį, kai širdies nepakankamumo nebuvo.

3. Esant C-D stadijos širdies nepakankamumui, putliųjų ląstelių kiekis buvo pats didžiausias. 4. Koreliacinis ryšys tarp suminio stenozinio vainikinių arterijų pažeidimo (stenozės indekso) ir putliųjų ląstelių kiekio buvo silpnas (r=0,23, p<0,05).

28

11. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Cardiovascular diseases (CVDs) [Internet]. [cited 2019 May 12]. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds)

2. Benjamin EJ, Virani SS, Callaway CW, Chamberlain AM, Chang AR, Cheng S, et al. Heart disease and stroke statistics - 2018 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 2018; 137: 67–492.

3. Sousa P. Comment on “cardiovascular disease in Europe 2014: Epidemiological update.” Rev Port Cardiol. 2015; 34:381–2.

4. Norris RM. Progressive left ventricular dysfunction and remodeling after myocardial infarction. Circulation. 2018; 89:1905–15.

5. Azevedo PS, Polegato BF, Minicucci MF, Paiva SAR, Zornoff LAM. Cardiac Remodeling: Concepts, Clinical Impact, Pathophysiological Mechanisms and Pharmacologic Treatment. Arq Bras Cardiol [Internet]. 2016; 62–9.

6. Alevizos M, Karagkouni A, Panagiotidou S, Vasiadi M, Theoharides TC. Stress triggers coronary mast cells leading to cardiac events. Ann Allergy, Asthma Immunol [Internet]. 2014; 112: 309–16.

7. Facoetti A, Fallarini S, Miserere S, Bertolotti A, Ferrero I, Tozzi R, et al. Histochemical study of cardiac mast cells degranulation and collagen deposition: Interaction with the cathecolaminergic system in the rat. Eur J Histochem. 2006; 50:133–40.

8. da Silva EZM, Jamur MC, Oliver C. Mast Cell Function: A New Vision of an Old Cell. J Histochem and Cytochem. 2014; 62: 698–738.

9. Reid AC, Silver RB, Levi R. Renin: at the heart of the mast cell. Immunol Rev [Internet]. 2007; 217:123–40.

10. Ngkelo A, Richart A, Kirk JA, Bonnin P, Vilar J, Lemitre M, et al. Mast cells regulate myofilament calcium sensitization and heart function after myocardial infarction. J Exp Med. 2016; 213: 1353–74.

11. Kennedy S, Wu J, Wadsworth RM, Lawrence CE, Maffia P. Mast cells and vascular diseases. Pharmacol Ther. 2013; 138: 53–65.

29 12. Balakumar P, Singh AP, Ganti SS, Krishan P, Ramasamy S, Singh M. Resident cardiac mast cells: Are they the major culprit in the pathogenesis of cardiac hypertrophy? Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2008; 102: 5–9.

13. Hughes MR, McNagny KM. Mast cells: Methods and protocols. Mast Cells Methods Protoc. 2014; 1–540.

14. Janicki JS, Brower GL, Chancey AL, Forman MF, Jobe LJ. Cardiac Mast Cells as Mediators of Ventricular Remodeling. Interstitial Fibros Hear Fail. 2005;197–209.

15. Kong P, Christia P, Frangogiannis NG. The pathogenesis of cardiac fibrosis. Cell Mol Life Sci. 2014; 71: 549–74.

16. Wang H, Silva J, Alencar A, Zapata-sudo G, Lin MS, Sun X, et al. Mast Cell Inhibition Attenuates Cardiac Remodeling and Diastolic Dysfunction in Ovariectomized Bnf344 Female Rats. Gerontologist. 2017; 55(Suppl_2): 69–69.

17. Lorenz JN. Chymase: the other ACE? Am J Physiol Physiol. 2009; 298: F35–6.

18. Miyazaki M, Takai S, Jin D, Muramatsu M. Pathological roles of angiotensin II produced by mast cell chymase and the effects of chymase inhibition in animal models. Pharmacol Ther. England; 2006; 112: 668–76.

19. Ahmad S, Varagic J, VonCannon JL, Groban L, Collawn JF, Dell’Italia LJ, et al. Primacy of cardiac chymase over angiotensin converting enzyme as an angiotensin-(1-12) metabolizing enzyme. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2016; 478: 559–64.

20. Zhao Z, Wang H, Lin M, Groban L. GPR30 decreases cardiac chymase/angiotensin II by inhibiting local mast cell number. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. Elsevier Ltd; 2015;459(1):131–6.

21. Ahmad S, Simmons T, Varagic J, Moniwa N, Chappell MC, Ferrario CM. Chymase-dependent generation of angiotensin II from angiotensin-(1-12) in human atrial tissue. PLoS One. 2011;6(12). 22. Kamo T, Akazawa H, Komuro I. Cardiac Nonmyocytes in the Hub of Cardiac Hypertrophy. Circ Res. 2015;117(1):89–98.

23. Frieler RA, Mortensen RM. Immune Cell and Other Noncardiomyocyte Regulation of Cardiac Hypertrophy and Remodeling. Circulation [Internet]. 2015;131(11):1019–30. Available from: https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.114.008788

30 24. Ngkelo A, Richart A, Vilar J, Marck P, Heymes C, Rodewald H-R, et al. 0375: Re-evaluation of the role of mast cell in cardiac tissue following myocardial infarction. Arch Cardiovasc Dis Suppl. 2014;6:28.

25. Hooshdaran B, Kolpakov MA, Guo X, Miller SA, Wang T, Tilley DG, et al. Dual inhibition of cathepsin G and chymase reduces myocyte death and improves cardiac remodeling after myocardial ischemia reperfusion injury. Basic Res Cardiol. Springer Berlin Heidelberg; 2017; 112.

26. Stalioraitytė E, Pangonytė D. Pomirtinė širdies ir kraujagyslių ligų bei sindromų diagnostika. Tyrimo metodai ir duomenų įvertinimas. Kaunas; 1993.

27. McMurray JJV, Adamopoulos S, Anker SD, Auricchio A, Bohm M, Dickstein K et al. ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012. The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC. Eur Heart J. 2012; 33: 1787–847.

28. Bouchardy B, Majno G. Histopathology of early myocardial infarcts. Am J Pathol. 1974; 74: 301– 30.

29. Venclovienė J. Statistiniai metodai medicinoje. Kaunas: Vytauto Didžiojo universitetas; 2010. 30. Janicki JS, Brower GL, Levick SP. The emerging prominence of the cardiac mast cell as a potent mediator of adverse myocardial remodeling. Methods Mol Biol. 2015; 1220: 121–39.

31. Kennedy S, Wu J, Wadsworth RM, Lawrence CE, Maffia P. Mast cells and vascular diseases. PharmacolTherapeut. 2013; 138; 53–65.

32. Alevizos M, Karagkouni A, Panagiotidou S, Vasiadi M, Theoharides TC. Stress triggers coronary mast cells leading to cardiac events. Ann Allergy Asthma Immunol 2014; 112: 309–16.

33. Hooshdaran B, Kolpakov MA, Guo X, Miller SA, Wang T, Tilley DG, Rafiq K, Sabri A. Dual inhibition of cathepsin G and chymase reduces myocyte death and improves cardiac remodeling after myocardial ischemia reperfusion injury. Basic Res Cardiol. 2017; 112: 62.

34. Wang H, da Silva J, Alencar A, Zapata-Sudo G, Lin MS, Sun X, Ahmad S, Ferrario CM, Groban L. Mast cell inhibition attenuates cardiac remodeling and diastolic dysfunction in Mmddle-aged, ovariectomized Fischer344×brown Norway rats. Cardiovasc Pharmacol. 2016; 68: 49–57.

35. Ahmad S, Varagic J, VonCannon JL, Groban G, Collawn JF, Dell'Italia LJ, Ferrario CM. Primacy of cardiac chymase over angiotensin converting enzyme as an angiotensin-(1-12) metabolizing enzyme. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 478: 559–64.

31 36. Lorenz JN. Chymase: the other ACE? Am J Physiol Renal Physiol. 2010; 298: F35–F6.

37. Agrawal V, Gupta JK, Qureshi SS, Vishwakarma VK. Role of cardiac renin angiotensin system in ischemia reperfusion injury and preconditioning of heart. Indian Heart J. 2016; 68: 856–61.