LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Laura Dmitrijeva
Defoliacijos proceso poveikis Aglianico vynuogių ir vyno
charakteristikai
Effect of defoliation process on Aglianico grapes and wine
characteristic
Maisto mokslo nuolatinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof., dr. Vaidas Oberauskas Anatomijos ir fiziologijos katedra
2
DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas “Defoliacijos proceso poveikis Aglianico
vynuogių ir vyno charakteristikai”.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. 2020.05.13 Laura Dmitrijeva
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2020.04.28 Laima Klovienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Prof., dr. Vaidas Oberauskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (INSTITUTE)
(aprobacijos data) (katedros (instito) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) 2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 111.1. ‘Aglianico‘ vynuogių ir vyno charakteristika ... 11
1.2. Defoliacija ... 12
1.3. Organinės rūgštys ... 12
1.4. Polifenoliai ... 13
1.4.1. Polifenolių klasifikavimas ...14
1.4.2. Polifenolių biologinės savybės ...17
1.4.3. Oksidacinis stresas ir antioksidantų aktyvumas ...18
1.5. Lakūs junginiai ... 19
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
2.1. Tyrimų atlikimo vieta ir laikas ...20
2.2. Tyrimo objektas ...20
2.3. Vyno gamyba ...21
2.4. Atliktos analizės ir tyrimo metodai ...21
2.4.1. Spalvos intensyvumas ir tonalumas vyne ...21
2.4.2. Organinių rūgščių nustatymas vyne ...22
2.4.3. Polifenolių kiekio nustatymas vyne ...22
2.4.4. Antocianinų ir flavonoidų kiekio nustatymas ...23
2.4.5. Antioksidantų aktyvumo analizė ...23
2.4.6. Kiekybinis ir kokybinis antocianinų identifikavimas ...24
2.4.7. Lakiųjų junginių identifikavimas ...24
2.5. Statistinė analizė...26
3. TYRIMO REZULTATAI ... 27
4
3.2. Fenolinių junginių sudėtis, antioksidantų aktyvumas ir spalvos indeksai ...28
3.3. Kokybinė ir kiekybinė antocianinų analizė vynuogėse ir vyne ...29
3.4. Lakiųjų junginių analizė vynuogėse ir vyne ...32
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36
IŠVADOS ... 38
5
SANTRAUKA
Defoliacijos proceso poveikis Aglianico vynuogių ir vyno charakteristikai Laura Dmitrijeva
Magistro baigiamasis darbas
Pagrindinis šio baigiamojo darbo tikslas buvo nustatyti ir įvertinti ankstyvosios defoliacijos įtaką polifenolių ir lakiųjų junginių koncentracijai vynuogėse ir vyne, kuriems buvo pašalinti lapai skirtinguose taškuose: pietų (D-S) , šiaurės (D-N), šiaurės-pietų (D-NS).
Defoliacija padidino visų klasių polifenolių koncentraciją, antioksidantų aktyvumą ir spalvos intensyvumą, ypač D-NS mėginyje, kur buvo atlikta abiejų pusių defoliacija. Bendras polifenolių kiekis D-NS mėginyje buvo 2755±11 mg l-1, o antioksidantų aktyvumas –
18595±108 TEAC μmol l-1.
Tirtuose vynuogių ir vyno mėginiuose identifikuota 14 skirtingų antocianinų. Didžiausios koncentracijos antocianinas tiek vynuogėse, tiek vyne buvo nustatytas Malvidin-3-O-gliukozidas (Mv). Kontroliniame vynuogių mėginyje Mv sudarė 70 proc. bendro antocianinų kiekio, D-S mėginyje – 60 proc., o D-N ir D-NS – 56 proc. bendro antocianinų kiekio. C ir D-N vyno mėginiuose Mv sudarė 69 proc. bendro antocianinų kiekio, D-S vyno mėginyje – 65 proc., o D-NS – 68 proc. bendro antocianinų kiekio. Antocianinų rezultatai vynuogėse ir vyne parodė, kad efektyviausia defoliacija buvo pašalinus lapus iš pietinės pusės (D-S).
Tiek vynuogėse, tiek vyne nustatytas stiprus bendros lakiųjų junginių koncentracijos sumažėjimas defolijuotuose mėginiuose palyginti su kontrole. Nustatyta, kad didžiausia lakiųjų junginių grupė vynuogėse buvo aldehidai. Kontroliniame mėginyje aldehidai sudarė 90 proc. bendro lakiųjų junginių kiekio, D-S ir D-N mėginiuose – 60 proc., o D-NS mėginyje sudarė 69 proc. bendro lakiųjų junginių kiekio. Kontroliniame mėginyje nustatyta didžiausia aldehidų koncentracija (1420,76±423,46 ng ml-1). Didžiausios koncentracijos aldehidas vynuogėse buvo 2-heksanalis, o didžiausias jo kiekis nustatytas kontroliniame mėginyje (1282,57±1476,37 ng ml-1).
Esteriai buvo didžiausia lakiųjų junginių klasė vyne. Didžiausias esterių kiekis nustatytas D-NS (505,9±68,9 ng ml-1) vyno mėginyje ir buvo 15 proc. didesnis nei kontroliniame mėginyje. Alkoholiai buvo didžiausios koncentracijos junginiai vyne ir sudarė apie 90 proc. bendro lakiųjų junginių kiekio visuose mėginiuose (C- 93 proc., D-S – 90 proc., D-N – 90 proc., D-NS – 88 proc.). Taip pat rezultatai parodė stiprų etanolio, 1-butanol-3 metilo ir feniletilo sumažėjimą, defolijuotuose mėginiuose, lyginant su kontrole. Kontroliniame mėginyje nustatyta didžiausia suminė alkoholių koncentracija (6536,0±1386,5 ng ml-1
6
Raktiniai žodžiai: vynas, defoliacija, fenoliai, antocianinai, antioksidantai, lakieji junginiai.
7
SUMMARY
Effect of defoliation process on Aglianico grapes and wine characteristic Laura Dmitrijeva
Master’s Thesis
The main of master thesis was to identify and evaluate the influence of early defoliation on the concentrate of polyphenols and volatile compounds in grapes and wine from which leaves were removed at different points: south (D-S), north (D-N), north-south (D-NS).
Defoliation increased the concentration of polyphenols, antioxidant activity and colour intensity, especially in D-NS sample where defoliation was performed on both sides. In D-NS sample the total of polyphenols was 2755±11 mg l-1 and the antioxidant activity was 18595±108 TEAC μmol l-1.
14 different anthocyanins were identified in grapes and wine samples. The highest concentration anthocyanin in both grapes and wine were found Malvidin-3-O-glucoside (Mv). In control sample of grapes Mv was 70% of total anthocyanins, 60% in D-S sample and 56% in D-N and D-NS samples. In control and D-N wine samples Mv was 69% of the total anthocyanins 65% in D-S wine sample and 68% in D-NS wine sample. The results of anthocyanins in grapes and wine showed that the most effective defoliation was after removal of leaves from the southern side (D-S).
The largest group of volatile compounds in grapes was aldehydes. In control sample aldehydes accounted for 90% of the total volatile compounds, 60% in D-S and D-N samples and 69% in D-NS sample. Control sample had the highest concentration of aldehydes (1420.76±423.46 ng ml-1). The highest concentration of aldehyde in grapes was 2-hexanal, and the highest content was found in control sample (1282.57±1476.37 ng ml-1).
Esters were the largest class of volatile compound in wine. The highest content of esters was found in D-NS wine sample (505.9±68.9 ng ml-1) and was 15% higher than control wine. Alcohols were the highest concentration of compounds in wine and accounted for 90% of the total amount of volatile compounds in all samples: C (93%), D-S (90%, D-N (90%), D-NS (88%). The results also showed a strong decrease in ethanol, 1-butanol-3 methyl, and phenylethyl in defoliated samples compared to the control. Control sample showed the highest amount of total alcohols (6536.0±1386.5 ng ml-1)
8
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2’-azino-bis(3-ethilbenzotiazolinas-6-sulfoninė rūgštis) (2,2`-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)).
ABTS•+ – ABTS katijoninis radikalas.
DC-MS – dujų chromatografas masių spektrometras (angl. gas chromatography – mass spectrometry (GC-MS.)
DNR – deoksiribonukleorūgštis (angl. DNA – Deoxyribonucleic acid).
DVB-CAR-PDMS – divinilbenzeno/karbokseno/polidimetilsiloksano (angl. Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane).
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. (HPLC) High-performance liquid chromatography).
KFME – kietafazė mikroekstrakcija (angl. Head Space Solid Phase Micro-Extraction (HS – SPME).
ROS – aktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species)
TEAC – trolokso ekvivalento lygiavertė antioksidantinė talpa (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity).
UV – ultravioletinė spinduliuotė. CNS – centrinė nervų sistema NO – endotelio azoto oksidas
9
ĮVADAS
Alkoholinių gėrimų vartojimo kultūra augo nuo pat atsiradimo pradžios, o fermentuoti produktai, įskaitant vaisius ir grūdus, buvo naudojami alkoholiniams gėrimams gaminti. Be to, nuo XX amžiaus atsirado mokslinis susidomėjimas dėl alkoholio, kai prasidėjo tarpkultūriniai tyrimai, pagrindžiantys neigiamos koreliacijos su saikingu alkoholio vartojimu ir išeminės širdies ligos hipotezę (1). Tokia koreliacija buvo užregistruota atskirai raudonajam vynui (2).
Vynas, vienas populiariausių gėrimų pasaulyje, turi tūkstančių metų istoriją. Vynmedžius žmonės augino nuo seniausių laikų. Pirmieji duomenys apie jų auginimą datuojami 4000 m. pr. m. e. Vynmedžiai buvo gerai žinomi senovės Egipte ir Izraelyje (minima Senajame Testamente). Egipto ir Mesopotamijos civilizacijos pirmosios pradėjo gaminti vyną.
Cheminiu požiūriu raudonieji vynai yra švelnūs, rūgštiniai, vandeniniai tirpalai (pH 3,2– 3,8), sudaryti iš įvairių cheminių junginių. Šiuo metu vyno vynuogių kokybę daugiausiai lemia jų „Terroir“ (kilmės terpė), vynuogių veislė ir vynuogininkystės praktika (3). Vynuogių uogų auginimas apima sudėtingus fizikinius ir biocheminius pokyčius. Juos galima suskirstyti į tris pagrindinius etapus: žaliasis augimas (I etapas), atsilikimo fazė (II etapas) ir nokimo fazė (III etapas). Per šias tris fazes yra sintetinami pirminiai ir antriniai metabolitai. Pagrindiniai metabolitai, tokie kaip cukrūs, aminorūgštys ir organinės rūgštys, dalyvauja vynuogių augimo ir vystymosi procesuose. Antriniai metabolitai, tokie kaip polifenoliai ir stilbenoidai, atlieka ekologines funkcijas (gynybą nuo plėšrūnų, parazitų ir ligų (4). Vyno kvapo savybės priklauso nuo lakiųjų junginių, o vyno skonio (sutraukimą ir kartumą) ir spalvines savybes paprastai suteikia vyne esantys fenolio junginiai (5). Organoleptinės vyno savybės (tokios kaip kvapas, skonis ir spalva) labai priklauso nuo naudojamų vyno gamybos ir brandinimo būdų (6,7).
Vynuogių defoliacija yra agronominė baldakimų valdymo praktika, tiksliau sakant, defoliaciją sudaro lapų, apimančių kekes, pašalinimas. Defoliacijos tikslas yra padidinti fotosintezės aktyvumą, siekiant sudaryti stresines sąlygas augalams, todėl gaunamos mažesnės kekės (su mažesnėmis ir mažesnio skersmens uogomis), dėl ko yra geresnis odos ir minkštimo santykis. Šio darbo tikslas buvo įvertinti, kaip agronominė ankstyvosios defoliacijos praktika, prieš žydėjimą, gali paveikti polifenolių ir lakiųjų junginių savybes ‘Aglianico’ veislių vynuogėse ir vyne.
Tyrimo tikslui pasiekti buvo numatyti šie uždaviniai:
1. Nustatyti defoliacijos proceso įtaką vyno cheminėms savybėms (alkoholio koncentracijai, pH, organinėms rūgštims).
10
2. Nustatyti defoliacijos įtaką polifenolių koncentracijai, antioksidantiniam aktyvumui ir spalvos indeksams vyne.
3. Įvertinti defoliacijos įtaką antocianinų kiekybinei ir kokybinei sudėčiai vynuogėse ir vyne.
4. Įvertinti defoliacijos proceso įtaką vynuogių ir vyno lakiųjų junginių sudėčiai ir vyno kvapui.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. ‘Aglianico‘ vynuogių ir vyno charakteristika
Vynuogės (Vitis vinifera L.) yra auginamos visame pasaulyje (8) ir tai yra didžiausias pasaulyje vaisių derlius, kurio metinė produkcija viršija 75 milijonus tonų, iš kurių 21 milijonas tonų stalo vynuogių (9).
Italija visame pasaulyje išsiskiria kaip vynuogių augintoja, pasižyminti didele (kartais labai senų) veislių įvairove (10). Per pastaruosius 30 metų pastebėtas didelis vyno kokybės augimas Apulijos regione. Šio regiono vynai yra labai struktūruoti, stiprios spalvos ir aukštu alkoholio kiekiu. Daugiausia šiame regione yra auginamos ‘Aglianico’, ‘Negromaro‘, ‘Primitivo‘, ‘Bombino bianco‘, ‘Bombino nero‘, ‘Trebiano toscano‘, ir ‘Uva di Troia‘ vynuogių veislės.
‘Aglianico‘ yra viena iš svarbiausių ir seniausių raudonųjų vynuogių veislių, auginama Pietų Italijos regionuose, Kampanijoje, Bazilikatoje ir Apulijoje. Tikėtina, kad graikai atvežė šią veislę į Italiją prieš Romos laikus. Remiantis šia hipoteze, vardas „Aglianico“ galėjo kilti iš žodžio „Hellenica“ (11). ‘Aglianico’ yra vėlyvojo brendimo vynuogės, pasižyminčios dideliu bendrųjų flavonolių, antocianinų ir resveratrolio kiekiu (12). ‘Aglianico’ biotipai yra pavadinti pagal geografinę auginimo vietą ir vyno gamybos sritį. Dažniausiai pasitaikantys yra ‘Taurasi‘, ‘Sannio‘, ‘Cilento‘, ‘Taburno‘ ir ‘Vulture‘.
Iš ‘Aglianico’ vynuogių veislių gaminami vieni geriausių raudonųjų vynų Pietų Italijoje, kurie yra gerai žinomi ir vertinami visame pasaulyje. Vynmedžių tankis plantacijoje negali būti žemesnis nei 3000 medžių hektarui (13), vidutinė plantacija yra 5000 medžių hektarui, o derlingumas sumažėja retinant vynuoges. Vynuogynai yra užgesusio „Vulture“ ugnikalnio teritorijoje, todėl ypatingo grunto sudėtis ir klimato sąlygos suteikia išskirtinių savybių galutiniam produktui. Ši vynuogių veislė yra žinoma ne tik dėl to, koks puikus vynas yra gaminamas, bet ir dėl savo fenotipo plastiškumo ir gebėjimo prisitaikyti prie skirtingų aplinkos sąlygų. ‘Aglianico’ vynuogės auginamos tiek dolomitiniuose kalkakmenio dirvožemiuose, esančiuose Pjemonto kalnų masyvuose, tiek molinguose gruntuose, aliuviniame ir vulkaniniame dirvožemyje. Iš ‘Aglianico’ vynuogių pagamintas vynas pasižymi gilia raudona spalva, intensyviu kvapu, vaisių ir gėlių aromatu (tokiu kaip raudonųjų vaisių aromatai), kurie vyno brandinimo metu virsta į aštrius ir sudėtingesnius kvapus. Taip pat dėl vyne esančių taninų vynas gali būti griežto ir sutraukiančio skonio.
12
1.2. Defoliacija
Daugybė augalininkystės praktikų yra atliekama norint pagerinti vynuogių kokybę, kuri daro tiesioginę įtaką vyno kokybei ir cheminei sudėčiai. Vyno kokybė priklauso nuo bendro rūgštingumo, cukraus kiekio, alkoholio koncentracijos, spalvos (14), lakiųjų junginių sudėties, kurie atsakingi už vyno skonį ir aromatą (15).
Vynuogių defoliacija yra agronominė baldakimų valdymo praktika, tiksliau sakant, defoliaciją sudaro lapų, apimančių kekes, pašalinimas. Šis metodas yra plačiai naudojamas vėsiose ir drėgnose klimato zonose, taip pagerinant kekių apšvietimą bei saulės spindulių pasisavinimą, oro cirkuliaciją, uogų temperatūrą (16–18), gerinant klasterio mikroklimatą, kuris lemia klasterinių grybelinių ligų mažėjimą (19). Dėl netinkamo saulės spindulių poveikio, vynuogės gali būti prastos kokybės (16). Be to, temperatūra daro įtaką vynuogių augimo procesui ir įvairių biocheminių junginių praradimui, įskaitant cukraus, rūgščių praradimą kvėpuojant, spalvos intensyvumui ir skoniui (20). Įrodyta, kad ankstyvoji defoliacija padeda pagerinti vynuogių ir vyno kokybę (18). Ji atliekama, kai yra nuo 5 iki 10 proc. atvirų žiedų ir nukreipiama į pirmuosius 5-6 pumpurų lapus, kurie aprūpina žiedynus angliavandeniais. Defoliacijos tikslas yra padidinti fotosintezės aktyvumą, siekiant sudaryti stresines sąlygas augalams, todėl gaunamos mažesnės kekės (su mažesnėmis ir mažesnio skersmens uogomis), dėl ko yra geresnis odos ir minkštimo santykis. Defoliacijos metu taip pat gali būti pašalinami šešėliniai lapai, kurie vartoja angliavandenius iš lapų, veikiamų saulės spindulių (21). Be viso to, lapų šalinimas gali pagerinti vynmedžių atsparumą ligoms (16,17,22). Taigi, norint gauti aukštos kokybės pasėlius, svarbu nustatyti optimalius lapų šalinimo būdus ir atsižvelgti į klimato sąlygas (16).
1.3. Organinės rūgštys
Viena iš svarbiausių vyno juslinių savybių - rūgštumas. Šią juslinę savybę lemia organinių rūgščių mišinys, kuris į vyną patenka iš vynuogių minkštimo vyno gamybos metu. Didžiausios koncentracijos yra vyno, obuolių ir citrinų rūgštys (23). Organinės rūgštys yra svarbios vyno stabilumui ir turi įtakos vyno organoleptinėms savybėms (skoniui, spalvai ir aromatui) (24). Organinių rūgščių pusiausvyrai didelę įtaką daro klimato sąlygos, kurios lemia vynuogių biochemijos pokyčius. Vyno ir obuolių rūgščių santykis esant palankioms oro sąlygoms nesikeičia. Šiltesnė temperatūra gali sutrikdyti vynuogių fiziologinį gyvenimo ciklą, dėl to vynuogė sunoksta per anksti ir yra mažo rūgštingumo (ypač sumažėja obuolių rūgšties koncentracija). Kai oro sąlygos yra per šaltos, obuolių ir vyno rūgščių santykis yra didesnis ir juntamas rūgštingumas ir sutraukiantis skonis (25). Vyno rūgštis yra stipresnė rūgštis negu
13
citrinos ar obuolių, taip pat vyno rūgštis mažiau jautri klimato sąlygoms nokimo metu (26). Taigi veislės, turinčios didesnę vyno rūgšties koncentraciją, yra atsparesnės klimato pokyčiams (27).
1.4. Polifenoliai
Terminas polifenoliai arba fenoliai apibūdina junginių šeimą, plačiai paplitusią augalų karalystėje. Tai antriniai augalų metabolitai, turintys daugiau nei vieną fenolio hidroksilo grupę, prijungtą prie vieno ar daugiau benzeno žiedų (28). Iki šiol buvo nustatyta 8000 skirtingų polifenolių su labai įvairiomis cheminėmis struktūromis (29). Polifenoliai atlieka daug naudingų funkcijų augaluose. Jie susidaro augalų biotinio ir abiotinio streso metu, taip pat šie junginiai apsaugo augalus nuo ultravioletinių spindulių ar patogenų.
Vynuogės (Vitis vinifera L.) yra svarbus polifenolių šaltinis, pagrindiniai jų randami šiose vynuogėse yra hidroksibenzeno rūgštys, hidroksicinaminės rūgštys, flavonoliai, flavanoliai ir antocianinai (30). Dauguma vynuogių fenolių pasiskirsto vynuogių odelėse, sėklose ir stiebuose (31). Pavyzdžiui resveratrolis, antocianinai ir katechinai yra išsidėstę vynuogių odelėje, o procianidinai – vynuogių sėklose (32). Taip pat polifenolių pasiskirstymas uogose nėra vienodas. Apie 60–70 proc. polifenolių randama sėklose, nuo 25 iki 35 proc. – stiebuose, o minkštime tik 10 proc. (33). Uogų sėklose yra gausu flavan-3-ol monomerų ir oligomerų bei galo rūgšties darinių (34). Sėklų skaičius uogoje taip pat gali turėti įtakos vyno cheminei sudėčiai. Puikiai suformuotoje vynuogėje yra keturios sėklos (35), tačiau tikrasis skaičius yra mažesnis dėl aplinkos sąlygų žydėjimo metu (36).
Vynas yra sudėtingos sudėties alkoholinis gėrimas, gaunamas fermentuojant vynuogių misą, todėl vynuogių kokybė ir genotipas daro didelę įtaką vyno sudėčiai (37). Vyno polifenolių sudėtis priklauso nuo daugelio veiksnių, tokių kaip vynuogių veislė ir brandumas, aplinkos veiksniai vynuogynuose (klimatas, dirvožemis), agronominė praktika, vyno gamybos technologija, fermentacijos ir senėjimo sąlygos (38). Raudonąjį vyną sudaro daugiau nei 500 junginių, iš kurių svarbiausi yra vanduo, alkoholis (etanolis) ir polifenoliai (39). Polifenoliai vaidina svarbų vaidmenį vynuogių ir vyno juslinėse charakteristikose, nes yra atsakingi už organoleptines savybes: aromatą, spalvą, skonį, kartumą ir sutraukimą (40). Raudonojo vyno polifenoliai yra sudėtingesni nei vynuogių, taip yra dėl to, kad alkoholio fermentacijos metu yra ekstrahuojami vynuogių polifenoliai, o vyno fermentacijos ir brandinimo metu susidaro nauji sudėtingi fenolio junginiai (41). Polifenoliai yra atsakingi už vyno kokybę. Jie dalyvauja formuojant vyno struktūrą, spalvą, skaidrumą ir stabilumą (42), vaidina svarbų vaidmenį jutiminėse vyno savybėse, tokiose kaip sutraukimas ir kartumas (43). Raudonuosiuose vynuose gali būti iki 3000 mg l-1
14
1.4.1. Polifenolių klasifikavimas
Polifenoliai klasifikuojami pagal fenolinių grupių, kuriose jie yra, skaičių ir prie šių žiedų pritvirtintus konstrukcinius elementus. Polifenoliai gali būti klasifikuojami į dvi grupes, remiantis jų chemine struktūra (45) (1 pav.).
1 pav. Pagrindinių polifenolių, dalyvaujančių NADPH oksidazės aktyvumo reguliavime,
struktūra. (A) parodo nemodifikuoto katechino struktūrą; (B–E) rodo hidroksilintus ir O-metilintus junginius, turinčius įtakos NADPH oksidazės aktyvumui kelių tipų ląstelėse ir gydymo sąlygoms; (F) parodo dviejų fenolio junginių, rastų gervuogių polifenolių ekstrakte, struktūra (46).
Flavonoidai – turintys du C6 fenolio žiedus (A žiedas ir B žiedas, 1A pav.), A žiedas jungiasi su chromano žiedu. Flavonoidų grupė gali būti suskirstyta pagal C žiedo pakeitimus,
15
tokius kaip dvigubų jungčių pridėjimas izoflavonuose; hidroksilo grupių pridėjimas prie žiedo B pavyzdžiui flavonolių, kvercetino ir kaemferolio; C žiede nėra dvigubų jungčių – katechinai ir epikatechinai, B žiedo hidroksilinimas ir metoksilinimas: antocianidinai, tokie kaip malvidinas ir cianidinas.
Ne flavonoidai – fenolinės rūgštys, kurios yra ne flavonoidiniai junginiai, įskaitant galo rūgštį, kavos rūgštį ir ferulino rūgštis (1 pav. E, F). Šioje grupėje yra vienas C6 anglies fenolio žiedas, taip pat stilbenai (įskaitant resveratrolį).
Flavonoidai
Didžiausia ir plačiausiai ištirta polifenolių grupė yra flavonoidai. Tai mažos molekulinės masės fenolio junginiai, antriniai metabolitai, randami daugiau nei 4000 rūšių įvairiuose vaisiuose, daržovėse, riešutuose, sėklose, žolelėse, prieskoniuose, stiebuose ir žieduose, taip pat arbatoje ir vyne (47). Šie junginiai paprastai būna geltonos, oranžinės ar raudonos spalvos ir daugiausiai lokalizuoti vaisių ar daržovių žievelėse ar minkštime. Raudonuosiuose vynuose flavonoidai sudaro daugiau nei 85 proc. bendro fenolių kiekio (apie 1000 mg l-1). Baltuosiuose vynuose flavonoidai paprastai sudaro mažiau kaip 20 proc. bendro fenolių kiekio (apie 50 mg l
-1
).
Dažniausiai flavonoidai turi bendrinę struktūrą, kuri sudaryta iš dviejų aromatinių žiedų (A ir B žiedai) sujungtų su trimis anglies atomais, kurie yra oksiduoto heterociklo žiede (C žiedas), todėl jie turi C6-C3-C6 skeletą (2 pav). Heterociklinis žiedas daugumoje flavonoidų uždarytas, bet lieka atviras chalkonuose ir dihidrochalkonuose. Gamtoje flavonoidai dažniausiai randami kaip glikozilintų arba esterintų formų konjugatai, tačiau gali pasitaikyti ir aglikonai (48).
Flavonoidai yra suskirstyti į septynis poklasius, remiantis jų molekulinėmis struktūromis: flavonai (apigeninas ir liuteolinas), flavanonai (hesperidinas, naringeninas ir eriodiktiolis), flavonoliai (kaempferolis, kvercetinas, mikricetinas), izoflavonai (daidzeinas, antisteidinas, antocianinas, glicitinas), flavanoliai (katechinai ir procianidinai) ir chalkonai (49).
Flavan-3-oliai yra gausiausia flavonoidų klasė vynuogių uogose (51). Flavan-3-oliai apima monomerus (katechinai), oligomerus ir polimerus. Jie taip pat vadinami proantocianidinais arba kondensuotais taninais. Kondensuoti taninai susidaro per polimerizacijos procesą. Proantocianidinai arba kondensuoti taninai daugiausia išsidėstę kietosiose klasterio dalyse (odelėse, sėklose ir stiebuose), taip pat randama ir minkštime, tačiau daug mažesnėmis koncentracijomis (52). Iš visų paminėtų vynuogių dalių, sėklose proantocianidinų randama daugiausiai (53).
16
2 pav. Pagrindinių flavonoidų cheminė struktūra (50).
Antocianinai ir antocianidinai
Antocianinai (išvertus iš graikų kalbos anthos = gėlė, kianos = mėlyna) yra pagrindinė flavonoidų grupė, kurią sudaro vandenyje tirpūs junginiai, dažniausiai randami augaluose violetinės ar mėlynos spalvos, ypač uogose, tokiose kaip mėlynės, spanguolės, aronijos ar šeivamedžio uogos (54).
Antocianidinai (arba aglikonai) yra pagrindinės antocianinų struktūros (3 Pav.), kurias sudaro aromatinis žiedas (A), sujungtas su heterocikliniu žiedu (C), prisotintu deguonies atomais, kuris sujungtas anglies jungtimi su trečiuoju aromatiniu žiedu (B). Kai antocianidinai randami jų glikozidų formoje (sujungti su cukraus liekana), jie yra žinomi kaip antocianinai (55). Iki šiol yra nustatyti daugiau nei 500 skirtingų antocianinų (56) ir 23 antocianidinai, iš kurių tik šeši yra labiausiai paplitę augaluose (3 Pav.) (57). Antocianinai yra labai nestabilūs junginiai ir jautrūs oksidaciniam skilimui vykstant įvairiems procesams, tokiems kaip pH ir temperatūros pokyčiams, UV spinduliams, metalams (58).
Raudonųjų vynų spalva yra viena iš pirmųjų savybių, daranti didelę įtaką vartotojui. Iš raudonųjų vynuogių išgaunami monomeriniai antocianinai lemia jauno raudonojo vyno spalvą (59), tačiau vyno brandinimo metu vynuose susidariusių monomerinių antocianinų koncentracija nuolat mažėja, ypač acilintų antocianinų (60). Raudonosiose vynuogėse antocianinai yra pagrindinė flavonoidų grupė (61). Vynuogėse randami 3-O-gliukozidinės formos penki skirtingi antocianidinai (delfindinas, cianidinas, petunidinas, peonidinas ir malvidinas) (3 pav.).
17
3 pav. Pagrindiniai antocianidinai, randami vynuogėse (lot. Vitis vinifera L.).
Iš pradžių antocianinai buvo žinomi tik dėl savo spalvinių požymių, darančių įtaką produktų juslinėms savybėms. Šiuo metu dėmesys sutelkiamas į šių junginių naudą sveikatai dėl jų biologinio aktyvumo. Tyrimai parodė, kad antocianinų biologinis aktyvumas susijęs su jų antioksidantinėmis savybėmis (62). Atsižvelgiant į tai, kad laisvųjų radikalų pažeidimas yra daugelio lėtinių ligų etiologija, galimas antocianinų antioksidantinis aktyvumas gali sulėtinti tokių ligų progresavimą (63).
1.4.2. Polifenolių biologinės savybės
Teigiamas vynuogių, ar iš vynuogių pagamintų maisto produktų, poveikis yra susijęs su bioaktyvių komponentų įvairove (64–66). Viena pagrindinių šių komponentų grupių yra polifenoliai (67). Polifenolių vartojimas turi prevencinį poveikį nuo širdies ir kraujagyslių ligų bei senėjimo procesui (68), taip pat sumažina nutukimo ir diabeto riziką (69), pagerina žmogaus smegenų galimybes (70).
Pirmuosius flavonoidų biologinio aktyvumo įrodymus pristatė vengrų fiziologas Albertas Szent-Gyorgyii 1938 m. (Nobelio fiziologijos ir medicinos premija 1937 m.), kuris pristatė citrusinių vaisių žievelių flavonoidų efektyvumą, susijusį su skorbuto liga (71). Be daugybės vaidmenų augalų biologijoje, jau seniai buvo nustatyta, kad flavonoidai yra biologiškai aktyvūs junginiai, pasižymintys onkologinių, širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinių ligų prevencijai (72). Flavonoidai, be antioksidantinio aktyvumo, gali reguliuoti įvairių signalų kelius, susijusius su širdies ir kraujagyslių ligomis (73). Svarbu tai, kad flavonoidai padidina endotelio azoto oksido (NO) gamybą, sukeliant nuo endotelio priklausomą atsipalaidavimą tokioms būklėms kaip hipertenzija, insultas ar metabolinis sindromas (74). Epidemiologiniai tyrimai rodo, kad maisto, kuriame yra gausu flavonoidų, vartojimas gali sumažini krūties, storosios žarnos, plaučių, prostatos ir kasos navikus (75). Flavonoidai, veikiantys kaip
18
antioksidantai, apsaugo nuo žalingo hiperglikemijos poveikio ir pagerina gliukozės metabolizmą ir pasisavinimą (76–78).
Fenoliai sulaukė daugiau tyrėjų susidomėjimo tiek maisto, tiek medicinos pramonėje. Intensyvūs raudonųjų vynų tyrimai prasidėjo nuo 1991 m., kai tapo žinoma apie „Prancūzų paradoksą“. Prancūzijoje, nepaisant to, jog yra suvartojama daug sočiųjų riebalų ir cholesterolio, širdies ir kraujagyslių ligų yra nedaug, o gyvenimo trukmė – ilga, palyginus su kitomis valstybėmis,. Tyrimai įrodė, jog taip yra būtent dėl vyne esančių polifenolių (79).
1.4.3. Oksidacinis stresas ir antioksidantų aktyvumas
Sparti civilizacijos pažanga sudarė naujas galimybės atsirasti veiksniams su neigiamu poveikiu visuomenės sveikatai. Vakarų dieta su dideliu sočiųjų riebalų ir cukraus vartojimu, fizinio aktyvumo stoka, nepakankamas miegas, stiprus psichologinis stresas, mažai saulės, aplinkos tarša, rūkymas ar piktnaudžiavimas alkoholiu yra veiksniai, sukeliantys oksidacinį stresą organizme ir taip vadinamas „gyvenimo būdo“ ligas. Gyvenimo būdo ligos yra klasifikuojamos kaip ligos, atsirandančios dėl netinkamo ryšio tarp žmonių, jų aplinkos ir gyvenimo būdo (80). Egeris ir Diksonas (81) suskirstė lėtines ligas, susijusias su netinkamu gyvenimo būdu:
Širdies ir kraujagyslių ligos;
Onkologinės ligos;
Endokrininiai/metaboliniai sutrikimai;
Virškinimo trakto sutrikimai;
Inkstų ligos;
Centrinės nervų sistemos (CNS) ligos;
Raumenų ir kaulų sistemos sutrikimai;
Kvėpavimo takų ligos;
Reprodukciniai sutrikimai;
Dermatologiniai sutrikimai
Oksidacinis stresas – tai žala, kuri atsiranda padidėjus laisvųjų radikalų koncentracijai. Laisvasis radikalas yra bet koks atomas, kurio išoriniame sluoksnyje yra bent vienas nesuporuotas elektronas (82). Tai yra pagrindinis šalutinis produktas, susidarantis ląstelėms kvėpuojant. Lengvai atiduodami elektroną arba prisijungdami jį iš kitų molekulių, tokių kaip lipidai, baltymai ir angliavandeniai, laisvieji radikalai veikia kaip oksidatoriai ir reduktoriai, taip pažeisdami sveikas ląsteles grandinės principu. Šie nestabilūs junginiai gali sukelti ląstelių
19
pažeidimus, tokius kaip lipidų peroksidaciją (LPO), baltymų oksidaciją, pertraukti DNR grandinę (83). Dauguma laisvųjų radikalų, kurie žaloja biologines sistemas, yra deguonies neturintys radikalai. Jie plačiau žinomi kaip reaktyvios deguonies rūšys (ROS).
Žmogaus mitybos racione yra daug įvairių antioksidantų, įskaitant vitaminus (vitaminas C, E, β-karotenas), mikroelementus (varis, geležis, cinkas, selenas) ir augalų metabolitus (polifenoliai, karotinoidai) (84). Įrodyta, kad antioksidantai yra pagrindiniai junginiai, galintys sumažinti žalingą aktyvių deguonies formų (ROS) poveikį jas neutralizuodami ir užkirsdami kelią degeneraciniams procesams, tokiems kaip onkologinės, širdies ir kraujagyslių ligos, diabetas ir kt. (85). Augaliniame maiste randama daugybe polifenolių, kurie yra vieni svarbiausių fitochemikalų (86). Įrodyta, kad šie junginiai yra stipresni antioksidantai nei vitaminai C, E ir karotinoidai.
1.5. Lakūs junginiai
Vynas yra labai sudėtingas alkoholinis gėrimas ir jo kvapą lemia daugybė cheminių junginių (87). Yra nustatyta daugiau nei 1000 lakiųjų junginių, kurie klasifikuojami į esterius, rūgštis, alkoholius, terpenus, ketonus, aldehidus, angliavandenilius ir kt. (88). Lakiųjų junginių poveikis vyne priklauso tiek nuo koncentracijos, tiek nuo paties junginio. Tam tikrų junginių pėdsakai gali turėti didelį poveikį vyno aromatui, o tuo pat metu esantys junginiai, kurių koncentracija yra daug didesnė, gali turėti tik nedidelį poveikį kvapui
Vynuogėse identifikuota apie 40 terpenų, kurie gali atsirasti kaip angliavandeniliai, alkoholiai, aldehidai, ketonai ar esteriai, o jų uoslės poveikis yra sinergetinis. Šios šeimos junginiai didžiąja dalimi atsakingi už vaisių ir gėlių aromatus. Trys dalykai yra labai svarbūs vynuogių nokimo metu, kurie veikia tiesiogiai vynuoges: šviesa, temperatūra ir vandens prieinamumas. Vynuogių ekosistema (dirvožemis, mikroklimatas ir makroklimatas) ir jos valdymas yra labai svarbūs vynuogių ir vyno savybėms. Tyrimai nustatė ryšį tarp vynuogininkystės ir vyno sudėties (89,90).
Lakieji vyno junginiai gali būti klasifikuojami į tris kategorijas: pirminė (lakieji junginiai gaunami iš vynuogių odelių), antrinė (gaunami vyno fermentacijos metu) ir tretinė (susidaro brandinant vyną) (91). Todėl vyno aromatą veikia skirtingi veiksniai, tokie kaip aplinka, vynuogių veislė ir sunokimas, vynininkystės technologija ir brandinimas (92).
20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimų atlikimo vieta ir laikas
Tyrimas vykdytas 2019 metų birželio – lapkričio mėnesiais Italijoje, Bario mieste, Bari Aldo Moro universitete, Dirvožemio, augalinių medžiagų ir maisto mokslų laboratorijoje.
2.2. Tyrimo objektas
Šiame tyrime “Torrevento” vyno bendrovės ‘Aglianico‘ vynuogių (clone VCR 14/SO4 ISV-VCR 4 pagrindinė kategorija) vynuogynas, esantis DOCG Castel del Monte rajone, Korato kaime (BA). Korato teritorija yra viena iš labiausiai dominančių stalo ir vyno vynuogių auginimu.
Vynuogyne buvo pasirinktos eilutės nuo 8 (dešinėje) iki 13 (kairėje) ir atlikti defoliacijos testai. Kiekvienoje eilėje buvo atlikti 4 defoliacijos testai; (4 pav.).
- Kontrolė (C) – eilutės dalis, kuriai nebuvo taikomas defoliacijos testas, ji liko nepakitusi;
- Pietinė dalis (D-S) –dalinė ankstyva defoliacija pietinėje pusėje, šioje eilės dalyje lapai buvo pašalinti iš pietinės pusės;
- Šiaurinė dalis (D-N) – dalinė ankstyva defoliacija šiaurinėje pusėje, šioje dalyje lapų šalinimas buvo atliktas šiaurinėje pusėje;
- Dalinė ankstyva defoliacija šiaurinėje ir pietinėje pusėse (D-NS), šioje dalyje lapai buvo pašalinti iš abiejų pusių.
21
2.3. Vyno gamyba
Vynuogių, skirtų vynui gaminti, derlių rankiniu būdu nuėmė “Torrevento” įmonės operatoriai. Vynuogių technologinis brandumas buvo 2018 m. Spalio 10 d. Kiekvienam iš 4 tiriamųjų buvo surinkta apie 100 kg vynuogių, kurios buvo perkeltos į Bari Aldo Moro Universiteto, dirvožemio, augalinių medžiagų ir maisto mokslų (DiSSPA) vynininkystės laboratoriją vynui gaminti.
Vyno gamyba: Uogos sutraiškytos ir misa fermentacijai supilta į 20 hl nerūdijančio plieno talpas. Pridėta 15 g hl-1 kalio metabisulfito, siekiant užkirsti kelią vietinėms mielėms nuo nepageidaujamos fermentacijos. Alkoholio fermentacija aktyvuota pridėjus 25 g hl-1 mielių (Saccharomyces cerevisiae var.) Bayanus della Mycoferm Selezione CRU05 ir 20 g hl-1 maistinių medžiagų mielėms aktyvuoti. Misa dešimt dienų buvo palikta maceracijai kartu su luobelėmis ir sėklomis, atliekant du maišymus per dieną, kad būtų lengviau išgauti junginius iš odelių, palengvinti misos aeravimą ir skatinti mielių veiklą. Vėliau pašalintos vynuogių žievelės, sėklos ir vynas baigtas fermentuoti. Po fermentacijos vynas supiltas į butelius be papildomo apdorojimo (5 pav.).
5 pav. „Aglianico“ vynas supilstytas į butelius.
2.4. Atliktos analizės ir tyrimo metodai
2.4.1. Spalvos intensyvumas ir tonalumas vyne
Vyno spalvos intensyvumo ir tonalumo analizė spektrofotometru: vyno mėginių absorbcija buvo matuojama 420, 520 ir 620 nm bangos ilgyje, naudojant kvarcinę kiuvetę, kurios optinis kelias yra 1 mm. Kiekvienam mėginiui buvo atlikti 3 pakartojimai.
22
Spalvos intensyvumas reiškia sugerties (arba optinio tankio D.O) sumą trijuose nagrinėjamuose bangos ilgiuose:
Spalvos intensyvumas = D.O. 420 + D.O. 520 + D.O. 620 Tonalumas = D.O. 420 / D.O. 520
Pageidautinos raudonojo vyno vertės: spalvos intensyvumas 4–5; tonalumas 0,5–0,6.
2.4.2. Organinių rūgščių nustatymas vyne
Organinės rūgštys vyne nustatytos efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Organinių rūgščių identifikavimui ir kokybiniam įvertinimui buvo naudota 2 eliuentų sistema, sudaryta iš fosforo rūgšties (85%) (eliuentas A) ir acetonitrilo (70%) (eliuentas B).
Vyno mėginys: 500 μl vyno + 500 μl (eliuento A)
2.4.3. Polifenolių kiekio nustatymas vyne
Bendras polifenolių (BP) kiekis nustatytas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą ir apskaičiuojamas pagal R. Di Stefano ir M. C. Cravero metodą (93).
Na2CO3 10 proc. tirpalo paruošimas: matavimo kolbutėje sumaišoma 20g Na2CO3 su 180
ml ir maišoma magnetinėje maišyklėje, kol ištirps druska.
Tirpalo paruošimas: 0,25 ml vyno tirpalo sumaišoma su 6,25 ml distiliuoto vandens ir 1,25 ml Folin-Ciocalteu reagent. Po 4 minučių pridedama 5 ml 10 proc. Na2Co3 ir laikoma 90
min. tamsioje vietoje.
Tirpalo absorbcija matuojama spektrofotometru 700 nm bangos ilgyje.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas tokiomis pačiomis sąlygomis, bet vietoj ekstrakto naudojant 0,25 ml distiliuoto vandens.
Rezultatai apskaičiuojami pagal formulę: 𝐵P= 𝐸700𝑉∗186,5;
čia BF – bendras polifenolių kiekis vyne, mg l-1
; E700 – absorbacija esant 700 nm bangos ilgiui; V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;
186,5 – vertė nustatoma atsižvelgiant į santykį tarp koncentracijos ( išreikšta mg l-1 ) ir atitinkamo E700 gryno (+)- katechino ekvivalento.
23
2.4.4. Antocianinų ir flavonoidų kiekio nustatymas
Antocianinų ir flavonoidų kiekis vyne nustatytas pagal R. Di Stefano ir M.C. Cravero (96) metodą, naudojant UV regimojo spektro spektrofotometrijos metodą (Beckman Coulter DU 800, JAV).
Tiriamojo tirpalo paruošimas: 9,6 ml etaloninis tirpalas (etanolis: distiliuotas vanduo: druskos rūgštis (70:30:1) + 0,4 ml ekstrakto (25 kartus skiestas vyno mėginys)
Bendras antocianinų (BA) ir bendras flavonoidų (BF) kiekis matuojamas tarp 230 ir 700 nm bangos ilgio šviesos absorbcijos.
Bendras flavonoidų (BF) kiekis apskaičiuotas pagal formulę. 𝐵𝐹𝑙𝑎𝑣=𝐸280∗𝑝𝑓∗82,4;
čia BF – bendras flavonoidų kiekis vyne, mg l-1
; 19
E280 – specifinis ekstinkcijos koeficientas (280 nm bangos ilgyje, kuris nustatomas grafiniu metodu (absorbcija, atitinkanti segmentą lygiagreti y ašiai, pradedant maksimaliu kreivės tašku ir baigiant mažiausiais taškais kairėje ir dešinėje pusėse);
pf – praskiedimo faktorius;
82,4 – vertė nustatoma, atsižvelgiant į santykį tarp koncentracijos (išreikšta mg l-1) ir atitinkamo E280 gryno (+)- katechino ekvivalento.
Bendras antocianinų kiekis apskaičiuojamas pagal formulę: 𝐵𝐴=𝐸𝑚𝑎𝑥𝑣𝑖𝑠∗𝑝𝑓∗26,6;
čia BA – bendras antocianų kiekis vyne, mg l-1
;
Emaxvis – specifinis ekstinkcijos koeficientas, didžiausioje matomoje srityje (~ 520 nm), įvertintas pagal anksčiau aprašytą metodą;
pf – praskiedimo faktorius;
26,6 – vertė nustatoma, atsižvelgiant į antocianinų mišinio, gauto iš vynuogių, molinį ekstinkcijos koeficientą (ε = 18.800, PM medium = 500) (Glories 1978).
BA palygintas su kalibravimo kreive malvidin-3-gliukozidu ir tokiu būdu išreikštas mg l-1 malvidin-3-gliukozido ekvivalentu.
2.4.5. Antioksidantų aktyvumo analizė
Antioksidantų aktyvumas įvertintas ABTS radikalo katijono sujungimo metodu. Antioksidantinis aktyvumas matuojamas per antioksidantų gebėjimą išgryninti ABTS radikalų katijoną (ABTS•+, mėlynas / žalias chromoforius), slopindamas jo absorbciją 734 nm bangos ilgyje. ABTS antioksidantų aktyvumas atliktas pagal metodiką, aprašytą Re et al., (95) su pakeitimais.
24
Motininio ABTS•+ tirpalo paruošimas: matavimo kolboje sumaišyta 7 mmol l-1
ABTS•+ ir 2,45 mmol l-1 kalio persulfato mišinio ir palikta tamsoje 16 valandų, kol kalio persulfatas suoksiduoja ABTS. Reakcijos metu susidaro stabilus ABTS•+ katijonas. Motininis ABTS•+ tirpalas, apsaugotas nuo šviesos poveikio, kambario temperatūroje yra stabilus daugiau nei 2 paras.
Darbinio ABTS•+ tirpalo paruošimas: ABTS•+ tirpalas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu, kad 734 nm bangos ilgyje absorbcija būtų 0,80 ±01.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: 950 цl ABTS•+ tirpalo sumaišoma su 50 μl ekstraktu (skiestu su distiliuotu vandeniu, santykiu 1:20). Kaip lyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo. Po penkių minučių spektrofotometru matuojamas absorbcijos sumažėjimas 734 nm bangos ilgiui.
Rezultatas išreiškiamas μmol l-1
TEAC (Trolokso ekvivalento lygiavertė antioksidantinė talpa). Standartiniai tirpalai buvo pagaminti, kai koncentracija svyravo nuo 10 iki 800 μmol l-1.
2.4.6. Kiekybinis ir kokybinis antocianinų identifikavimas
Antocianinų analizė parengta pagal efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodą, parengtą E. Revilla ir J.M. Ryan (94), naudojant „Waters, 600 E aparatus“ (Waters, PA, USA), siurblį, diodų matricos detektorių (DAD) ir įpurškimo vožtuvą su 20 lL kilpa. Antocianidinų identifikavimui ir kokybiniam įvertinimui buvo naudota 2 eliuentų sistema, sudaryta iš 10 proc. skruzdžių rūgšties (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Mėginiai filtruojami 0.45 lm nailono membranoje, įpurškiami į Nova-Pack C18 kolonėlę, palaikoma 30 °C temperatūroje ir išplaunama srautu 1 ml min-1
su 10 proc. skruzdžių rūgštimi (eliuentas A) ir acetonitrilu (eliuentas B).
A tirpiklio gradiento programa : 0-10 min 95 proc., 10-20 min 87 proc., 20–30 min 85 proc., 30–40 min 75 proc., 45–50 min 95 proc. Chromatografinės smailės nustatytos 520 nm bangos ilgyje, o kiekybinė analizė atlikta remiantis kalibracine kreive, gaunama tirpalų su skirtingomis malvidin-3-gliukozido koncentracijos (0,9991) injekcijomis. Antocianino junginių identifikavimas pasiektas derinant eliuavimo modelį ir E. Revilla ir J.M. Ryan (94) nustatytus duomenis. Rezultatai išreiškiami mg l-1
.
2.4.7. Lakiųjų junginių identifikavimas
Lakūs junginiai buvo išskirti naudojant KFME (kietafazė mikroekstrakcija) ir atskirti dujų chromatografijos masių spektrometrijos (DC-MS) metodu remiantis Trani et al., (108). Tai chromatografinis atskyrimo metodas, kuriame judri fazė yra dujos. Bandiniui tirti buvo
25
naudojama 2 cm ilgio 50/30 μm apimties injektoriaus adatėlė, sudaryta iš divinilbenzeno/karbokseno/ polidimetilsiloksano (DVB-CAR-PDMS) (angl. Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane) (Supelco, Bellefonte, Pa., U.S.A.). Lakiųjų junginių atskyrimas buvo atliekamas Agilent 6890 dujų chromatografu (DC), sujungtu su Aglient 5975 masių spektrometruu (MS) (Aglient, Wilmington, Del., JAV). Lakiųjų junginių identifikavimas truko 15.55 min kiekvienam pakartojimui.
6 pav. Dujų chromatografas–masių spektrometras.
Etaloninio tirpalo paruošimas: 2-oktanolis skiestas hidroalkoholiniame tirpale (85/15, v/v) 10,25 μg l-1
.
Tiriamojo vynuogių tirpalo paruošimas: matavimo kolbutėje sumaišoma 10 μl etaloninio tirpalo su 200 mg NaCl ir 1 ml vynuogių tirpalo.
Tiriamojo vyno tirpalo paruošimas: matavimo kolbutėje sumaišoma 10 μl etaloninio tirpalo su 200 mg NaCl ir 1 ml vyno.
Vėliau bandinys supilamas į 12 ml buteliuką, sandariai uždengtą PTFE – silikono dangteliu ir kondensuojamas 10 minučių 37°C temperatūroje, maišant magnetine maišymo juosta.
Analizės sąlygos: injektoriaus temperatūra – 220° C, temperatūra dujų chromatografe programuojant keliama palaipsniui: nuo 40°C (0,7 min) iki 180 °C, 18 °C min-1 min greičiu, nuo 180°C iki 220°C keliama 20 °C min-1 greičiu. Detektoriaus temperatūra 250°C, perdavimo linijos temperatūra 250°C. Nešančios dujos – helis, esant pastoviam 0,7 ml min-1
srautui. Poveikio energija 70 eV.
26
Duomenys gauti naudojant pilną nuskaitymo režimą 34-200 m z-1
diapazone, kai dažnis 7,2 Hz. Lakieji junginiai nustatyti palyginus eksperimentinius spektrus su tais, kurie pateikti NIST bibliotekoje.
2.5. Statistinė analizė
Visi tyrimai buvo atlikti trimis pakartojimais, o rezultatai išreikšti vidurkis±SD (standatrtinis nuokrypis). Statistinė analizė buvo atliekama naudojant naudojant SPSS v. 19 (IBM Corporation, NY, USA) programinę įrangą, prie 95 proc. tikimybės lygio. Reikšmingi skirtumai tarp kiekvieno mėginio buvo įvertinti dispersinės analizės metodu ANOVA su post-hoc analize, naudojant LSD testą. Koeficientu (P) išreiškiamas statistinis reikšmingumas.
27
3.
TYRIMO REZULTATAI
3.1. Pagrindinės cheminės vyno analizės rezultatai
Pagrindinės cheminės analizės rezultatai skirtinguose „Aglianico“ vyno mėginiuose (C, D-S, D-N, D-NS ) yra pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Pagrindinės cheminės analizės ir spalvų indeksai vyne (reikšmė ± SD).
Parametrai C D-S D-N D-NS
Alkoholio koncentracija 13,42±0,03c 13,55±0,05c 13,76±0,03b 14,17±0,02a
pH 3,43±0,01 3,43±0,02 3,40±0,02 3,41±0,02
Vyno rūgštis 5,17±0,18b 5,03±0,14c 5,56±0,22a 5,18±0,18b Obuolių rūgštis 1,00±0,01c 1,00±0,05c 1,16±0,04a 1,12±0,03b Pieno rūgštis 0,16±0,00a 0,15±0,01a 0,16±0,00a 0,13±0,00b Citrinos rūgštis 0,99±0,02c 1,04±0,03b 1,10±0,06a 1,04±0,03b
Pastaba: tarp vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide (a, b) yra esminiai skirtumai (P<0,05). Alkoholio koncentracija matuojama tūrio %; rūgštys - g l-1 .
Vynams, gautiems iš vynuogių, kurioms buvo atlikta defoliacija, nustatytas didesnis alkoholio kiekis nei kontroliniame vyne, kuriam defoliacija nebuvo atlikta. D-NS vyno mėginyje alkoholio koncentracija padidėjo 5,6 proc., D-N vyno mėginyje padidėjo 2,5 proc., o D-S mėginyje padidėjo 1 proc. palyginti su kontrole. Tarp jų D-NS mėginyje nustatyta didžiausia vertė (14,17±0,02 tūrio %), po kurio seka D-N (13,76±0,03 tūrio %) ir D-S (13,55±0,05 tūrio %) (P<0.05).
Kaip parodyta 1 lentelėje, lapų pašalinimas neturėjo įtakos (P=0.106) vynų pH vertėms. pH vertės svyravo 3,40 – 3,43 ribose.
Rūgštys yra svarbūs komponentai vyne, darantys įtaką fizinėms, cheminėms ir juslinėms vyno savybėms. Organinės rūgštys vyne buvo nustatytos naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Rezultatai vaizduojami 1 lentelėje. Pagrindinės vyne esančios rūgštys: vyno, obuolių, pieno ir citrinos.
Didžiausia vyno rūgšties koncentracija (5,56±0,22 g l-1
) buvo nustatyta D-N vyno mėginyje, o mažiausia koncentracija (5,03±0,14 g l-1
) nustatyta D-S mėginyje, kuriam defoliacija atlikta iš pietinės pusės. Palyginus su kontroliniu vyno mėginiu D-N mėginyje vyno rūgšties koncentracija padidėjo 7,5 proc., o D-S mėginyje vyno rūgšties koncentracija sumažėjo 2,7 proc. (P<0,05).
Didžiausia obuolių rūgšties koncentracija (5,56±0,22 g l-1
) nustatyta D-N mėginyje ir padidėjo 16 proc. palyginti su kontrole. D-NS mėginyje obuolių rūgšties koncentracija padidėjo 12 proc. palyginti su kontroliniu vyno mėginiu (P<0,05).
28
Didžiausia pieno rūgšties koncentracija (0,16±0,00 g l-1
) nustatyta C ir D-N mėginiuose, o D-NS mėginyje nustatyta beveik 19 proc. mažesnė (P<0,05) koncentracija.
Didžiausią citrinos rūgšties koncentraciją parodė taip pat D-N vyno mėginys (1,10±0,06 g l-1), kuriam defoliacija atlikta iš šiaurinės pusės, o mažiausią (P<0,05) koncentraciją parodė kontrolinis vynas C, kuriam defoliacija nebuvo atlikta. Skirtumai tarp rūgščių buvo statistiškai reikšmingi.
3.2.
Fenolinių junginių sudėtis, antioksidantų aktyvumas ir spalvos indeksai
Raudonajame vyne randami dideli kiekiai polifenolių, kurie yra stiprūs antioksidantai. Bendras polifenolių, antocianinų ir flavonoidų kiekis, spalvos intensyvumas bei tonalumas vyne nustatyti naudojant UV regimojo spektro spektrofotometrijos metodą. Gauti duomenys pateikti 2 lentelėje.2 lentelė. Vyno fenolinių junginių sudėtis, antioksidantinis aktyvumas ir spalvos indeksai
(reikšmė ± SD). Parametrai C D-S D-N D-NS BP 2336±25b 2389±6b 2435±5b 2755 ± 11a BF 1389±38c 1480±163b 1512±50b 1578±23a BA 181±6c 172±11c 235±1b 282±1a AA 17312±196c 17936±259b 18042±315b 18595±108a SI 1,09±0,01c 1,19±0,06c 1,31±0,01b 1,59±0,00a T 0,63±0,00 0,69±0,02 0,68±0,01 0,63±0,00
BP – bendrasis polifenolių kiekis (mg l-1); BF – bendrasis flavonoidų kiekis (mg l-1); BA – bendrasis antocianinų kiekis (mg l-1); AA – antioksidantų aktyvumas (TEAC μmol l-1); SI – spalvos intensyvumas; T- tonalumas. Pastaba. Tarp vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide (a, b) yra esminiai skirtumai (P<0,05).
Polifenolių kiekis tirtuose vynuose varijuoja 2336 – 2755 (mg l-1
) ribose. Vyno mėginiuose (D-S, D-N, D-NS), kuriuose buvo atliktas lapų šalinimas, polifenolių kiekis nustatytas didesnis nei kontroliniame mėginyje (C) (2336±25 mg l-1), kuriam lapų šalinimas
nebuvo atliktas. Kaip parodyta 2 lentelėje didžiausias polifenolių kiekis nustatytas mėginyje, kuriame defoliacija atlikta iš abiejų pusių (D-NS) (2755 ± 11 mg l-1
). D-NS mėginyje polifenolių koncentracija 18 proc. didesnė (P<0,001), D-N mėginyje 4 proc. didesnė, o D-S mėginyje 2,2 proc. didesnė nei kontroliniame mėginyje.
Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas taip pat D-NS mėginiui, kuriam defoliacija atlikta iš abiejų pusių (1578±23 mg l-1
), o mažiausias flavonoidų kiekis (1389±38 mg l-1) nustatytas kontroliniame mėginyje. D-NS mėginyje nustatyta 14 proc. didesnė flavonoidų
29
koncentracija, D-N nustatyta 9 proc. didesnė, o D-S – 7 proc. didesnė koncentracija nei kontrolėje (P<0,03).
Išanalizavus bendrą antocianinų kiekį, didžiausia koncentracija nustatyta D-NS mėginyje, kuriam defoliacija atlikta iš abiejų pusių (282±1 mg l-1), o mažiausia koncentracija nustatyta D-S mėginyje, kuriam defoliacija atlikta iš pietinės pusės (172±11 mg l-1
). Iš gautų duomenų nustatytas didelis skirtumas (+56 proc.) tarp mėginio, kuriam atliktas lapų šalinimas iš abiejų pusių, ir kontrolės (P<0,05). D-N mėginyje nustatyta 30 proc. didesnė antocianinų koncentracija palyginti su kontroliniu mėginiu (P<0,05), o D-S mėginyje nustatyta 5 proc. mažesnė koncentracija nei kontroliniame mėginyje.
Antioksidantų aktyvumas įvertintas ABTS radikalo katijono sujungimo metodu. Didžiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas D-NS vyne ir siekė net 18595±108 (TEAC μmol l-1), o mažiausias – kontroliniame mėginyje (17312±196 TEAC μmol l-1
). D-NS mėginyje antioksidantų aktyvumas nustatytas 7 proc. didesnis, D-N mėginyje – 4,2 proc. didesnis, o D-S mėginyje 3,6 proc. didesnis nei kontrolėje (P<0,05).
Spalva yra vienas iš pagrindinių rodiklių nusakantis vyno kokybę. Spalva suteikia naudingos informacijos apie polifenolių koncentraciją vyne ir oksidacijos proceso tendencijas (97). Iš 2 lentelės duomenų matyti, kad mažiausias spalvos intensyvumas nustatytas kontroliniame mėginyje (C) (1,09±0,01), o didžiausias spalvos intensyvumas nustatytas (D-NS) vyne, kuriam defoliacija atlikta iš abiejų pusių (1,59±0,00) ir buvo 46 proc. didesnis nei kontrolėje. Skirtumai tarp mėginių yra statistiškai reikšmingi (P<0,001).
Vyno tonalumui lapų šalinimas statistiškai reikšmingos įtakos neturėjo (P>0,05). Tonalumo vertės svyravo 0,63 – 0,69 ribose.
3.3. Kokybinė ir kiekybinė antocianinų analizė vynuogėse ir vyne
Kokybinė ir kiekybinė antocianinų analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu, kuris pasižymi labai geru atkartojamumu ir aukšta skiriamąja geba.
ESC metodu tirtų keturių vynuogių (C, D-S, D-N, D-NS) mėginių rezultatai pateikti 3 lentelėje. Tirtuose vynuogių mėginiuose identifikuota 14 skirtingų antocianinų. Iš visų kiekybiškai įvertintų antocianinų vynuogėse malvidin-3-gliukozido (Mv) buvo nustatytos didžiausios koncentracijos. C mėginyje Mv sudarė 70 proc. bendro antocianinų kiekio, D-S mėginyje – 60 proc., o D-N ir D-NS – 56 proc. bendro antocianinų kiekio.
30
3 lentelė. Antocianinų sudėtis ‘Aglianico‘ vynuogėse (mg kg-1; reikšmė ± DS).
Antocianinai C D-S D-N D-NS Dp 86.6±13.1 b 197,3±35,8 a 190,6±13,78 a 235,4±24,8 a Cy 6,9±0,6 c 11,5±0,7 b 13,0±2,2 ab 15,9±1,6 a Pt 123,2±14,1 b 211,9±3,7 a 204,5±17,5 a 222,9±17,2 a Pn 50,7±2,2 c 73,4±5,0 b 70,3±20,9 abc 96,6±4,8 a Mv 1165,8±119,1 b 1346,1±112,6 ab 992,5±46,0 c 1329,8±18,3 a Dp-Ac 6,7±0,7 c 7,8±0,2 b 7,8±0,4 b 8,9±0,3 a Pt-Ac 12,7±1,4 ab 14,8±1,4 a 12,0±0,4 b 15,0±0,3 a Pn-Ac 16,0±1,9 b 29,0±1,9 a 30,2±3,4 a 32,6±2,5 a Mv-Ac 50,3±7,1 b 65,9±4,2 a 51,1±4,5 b 65,8±3,9 a cis-Mv-Cm 1,2±0,1 c 1,5±0,1 b 1,5±0,3 b 2,3±0,1 a Mv-Cf 22,4±6,1 b 35,6±3,0 a 25,0±2,4 b 33,7±1,2 a Pt-Cm 11,7±1,2 a 11,0±0,6 a 10,7±0,9 a 11,0±0,1 a Pn-Cm 15,4±0,6 b 18,5±0,8 a 19,8±1,6 a 20,5±2,1 a trans-Mv-Cm 260,1±36,4 b 320,2±16,8 a 234,1±27,0 b 312,1±1,4 a
Bendras Antocianinų kiekis 1667,2±188,0 b 2260,9±32,0 a 1769,8±144,3 b 2378,0±58,9 a
Dp, delfindin-3-O-gliukozidas; Cy, cianidin-3-O-gliukozidas; Pt, petunidin-3-O-gliukozidas; Pn, peonidin-3-O-gliukozidas; Mv, malvidin-3-O-gliukozidas; Dp-Ac, delfindin-3-O-acetilgliukozidas; Pt-Ac, petunidin-3-O-acetilgliukozidas; Pn-Ac, peonidin-3-O-acetilgliukozidas; Mv-Ac, acetilgliukozidas; cis-Mv-Cm, cis-kumarilgliukozidas; Mv-Cf, malvidin-3-O-cafelgliukozidas; Pt-Cm, petunidin-3-O-kumarilgliukozidas; Pn-Cm, peonidin-3-O-kumarilgliukozidas; trans-Mv-Cm, trans-malvidin-3-O-kumarilgliukozidas. Pastaba: tarp vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide (a, b) yra esminiai skirtumai (P<0,05).
D-S mėginys, kuriam defoliacija atlikta iš pietinės pusės, parodė didžiausią Mv koncentraciją (1346,1±112,6 mg kg-1
) ir buvo 15,5 proc. didesnė nei kontrolėje (992,5±46,0 mg kg-1). Mažiausia Mv koncentracija nustatyta D-N mėginyje (992,5±46,0 mg kg-1) ir buvo 15 proc. mažesnė nei kontrolėje (P<0,05).
Vynuogių sudėtyje buvo santykinai daug acilinto malvidino (trans-Mv-Cm), kurio didžiausias kiekis nustatytas D-S vynuogių mėginyje (320,2±16,8 mg l-1
) ir sudarė 14 proc. bendro antocianinų kiekio mėginyje. Taip pat santykinai daug buvo petunidnino (Pt), kurio didžiausias kiekis nustatytas D-NS mėginyje (222,9±17,2 mg kg-1) ir sudarė 9 proc. bendro
antocianinų kiekio.
Vynuogių mėginiai, kuriems buvo atlikta defoliacija, parodė didesnį antocianinų kiekį nei kontrolinis, ypač šiaurės–pietų (D-NS mėginyje), kuriam nustatytas didžiausias suminis antocianinų kiekis (2378,0±58,9 mg kg-1
). D-NS mėginyje nustatytas 43 proc. didesnis antocianinų kiekis, D-S mėginyje – 36 proc. didesnis kiekis, o D-N mėginyje – 6 proc. didesnis antocianinų kiekis palyginti su kontroliniu mėginiu. Skirtumai tarp mėginių yra statistiškai reikšmingi (P<0,05).
31
4 lentelėje parodyta skirtingų „Aglianico“ vyno mėginių (C, D-S, D-N, D-NS) antocianinų sudėtis.
4 lentelė. Antocianinų sudėtis „Aglianico“ vyne (mg l-1; reikšmė ± DS).
Antocianinai C D-S D-N D-NS Dp 22,38±0,31 b 29,61±2,93 a 23,83±2,48 abc 19,60±1,24 c Cy 1,48±0,11 a 3,02±1,40 a 2,43±1,08 a 1,84±0,09 a Pt 32,62±3,42 bc 45,01±5,64 a 36,64±0,99 b 30,68±3,05 c Pn 10,02±4,24 a 17,80±2,35 a 15,44±0,42 a 12,27±4,91 a Mv 241,46±18,96 c 313,95±26,63 a 271,83±10,12 b 232,86±6,65 c Dp-Ac 5,28±0,01 a 4,04±0,40 b 5,39±0,72 a 5,21±0,05 a Pt-Ac 0,86±0,01 a - 0,95±0,17 a 1,04±0,08 a Pn-Ac 2,38±0,03 b 9,51±0,83 a 2,33±0,15 b 1,88±0,12 b Mv-Ac 10,40±0,10 b 21,08±1,78 a 11,09±0,74 b 9,27±0,37 c cis-Mv-Cm 0,28±0,02 b 2,45±0,02 a 0,22±0,05 b 0,20±0,01 b Mv-Cf 2,20±0,03 b 5,37±0,27 a 2,48±0,23 b 1,90±0,01 b Pt-Cm 2,33±0,01 b 3,86±1,30 a 1,95±0,44 b 2,95±0,12 a Pn-Cm 1,30±0,04 a 1,82±0,35 a 1,56±0,13 a 1,18±0,05 a trans-Mv-Cm 17,81±0,01 c 23,56±1,72 a 20,66±1,46 ab 19,65±0,18 b
Bendras Antocianinų kiekis 350,81±27,03 c 481,09±42,98 a 396,78±12,65 b 340,52±13,54 c
Dp, delfindin-3-O-gliukozidas; Cy, cianidin-3-O-gliukozidas; Pt, petunidin-3-O-gliukozidas; Pn, peonidin-3-O-gliukozidas; Mv, malvidin-3-O-gliukozidas; Dp-Ac, delfindin-3-O-acetilgliukozidas; Pt-Ac, petunidin-3-O-acetilgliukozidas; Pn-Pt-Ac, peonidin-3-O-acetilgliukozidas; Mv-Pt-Ac, malvidin-3-O-acetilgliukozidas; cis-Mv-Cm, cis-malvidin-3-O-kumarilgliukozidas; Mv-Cf, malvidin-3-O-cafelgliukozidas; Pt-Cm, petunidin-3-O-kumarilgliukozidas; Pn-Cm, peonidin-3-O-kumarilgliukozidas; trans-Mv-Cm, trans-malvidin-3-O-kumarilgliukozidas. Pastaba: tarp vidurkių, pažymėtų ne ta pačia raide (a, b) yra esminiai skirtumai (P<0,05).
Atlikus efektyviosios skysčių chromotografijos analizę vyne, buvo atskirti antocianinai. Kaip ir tikėtasi didžiausios koncentracijos antocianinas buvo malvidin-3-gliukozidas (Mv). C ir N mėginiuose Mv sudarė 69 proc. bendro antocianinų kiekio, S mėginyje – 65 proc., o D-NS – 68 proc. bendro antocianinų kiekio.
Didžiausia Mv koncentracija nustatyta D-S vyno mėginyje (313,95±26,63 mg l-1
), o mažiausia – D-NS mėginyje (232,86±6,65 mg l-1
) (P<0,05). D-S vyno mėginyje nustatyta 30 proc. didesnė Mv koncentracija, D-N mėginyje 23 proc. didesnė Mv koncentracija, o D-NS mėginyje – 3,6 proc. mažesnė Mv koncentracija palyginti su kontrole (P<0,05).
Vyno sudėtyje buvo santykinai daug petunidino (Pt), kurio didžiausias kiekis nustatytas D-S mėginyje (45,01±5,64 mg l-1) ir sudarė 9 proc. bendro antocianinų kiekio šiame mėginyje.
Didžiausias suminis antocianinų kiekis (481,09±42,98 mg l-1
) nustatytas D-S vyno mėginyje ir buvo 37 proc. didesnis palyginti su kontrole (P<0,05). Mažiausias bendras antocianinų kiekis nustatytas D-NS mėginyje ir buvo 3 proc. mažesnis nei kontroliniame mėginyje (P<0,05).
32
3.4. Lakiųjų junginių analizė vynuogėse ir vyne
Lakūs junginiai buvo išskirti naudojant KFME (kietafazė mikroekstrakcija) ir atskirti dujų chromatografijos masių spektrometrijos (DC-MS) metodu.
Cheminiai junginiai vynuogėse, sugrupuoti į chemines klases, pateikti 5 lentelėje. Iš viso vynuogėse identifikuotos 7 skirtingos lakiųjų junginių klasės (9 aldehidai, 6 alkoholiai, 3 esteriai, 2 organinės rūgštys, 4 ketonai, 2 organiniai junginiai ir 1 halogenalkanas).
5 lentelė. Lakiųjų junginių koncentracija vynuogėse (ng ml-1; reikšmė ± SD).
Klasė Lakūs junginiai C D-S D-N D-NS Kvapas
Aldehidai Butanal, 3-metilas 10,61±1,80 7,52±6,24 16,23±10,25 12,99±5,95 Vaisių, skiedžiant -persikų 2-Heptenal, (Z)- 2,06±0,81 5,33±4,88 2,87±1,16 2,95±0,44 Žolės, riebus,
vaisių 2-Heksanalis 1282,57±1476,37 140,11±116,96 169,40±16,75 195,47±8,39 Saldus, vaisių, migdolų, obuolių, lapų Oktanalis 0,71±0,18 2,24±2,09 1,03±0,12 0,94±0,25 Vaško, citrusinis, riebus Nonanalis 3,65±0,42 3,12±2,04 3,97±0,31 5,37±0,45 Vaško, citrusinis, rožių, riebus Benzaldehidas 1,33±0,23 1,40±1,03 1,77±0,57 2,02±0,25 Aštrus, saldus, kartus, migdolų, vyšnių 2-Nonenal, (Z)- 1,03±0,05 1,27±0,93 1,67±0,31 1,25±0,21 Riebus, vaško,
agurko Heptanalis 1,73±0,06 0,67±0,47 1,83±0,25 1,95±0,34 Šviežias, riebus, žaliųjų žolelių, konjako Heksanalis 117,10±10,08 128,65±115,78 133,20±16,31 161,88±21,05 Šviežias, aldehido, riebus, lapų, žolės, vaisių, prakaito
Iš viso aldehidų 1420,76±423,46 290,3±58,01 331,97±65,66 384,83±77,60
Alkoholiai
Etanolis 2,88±0,34 75,14±59,18 6,97±0,84 3,94±0,61 Saldus
1-Heksanolis 29,43±3,93 8,20±5,83 48,20±7,50 32,72±11,65 Aštrus, eterinis, vaisių, saldus 2-Heksen-1-olis 4,94±0,23 3,78±2,78 23,30±7,65 16,45±5,59 Vaisių, žalių
lapų 2-Oktanolis 81,90±0,00 81,90±0,00 81,90±0,00 81,90±0,00 Gaivus, aštrus,
žolelių, medžio 1-Okten-3-olis 2,59±1,40 3,38±3,26 3,23±1,97 2,91±0,46 Grybų, žemių, riebus, žalios vištienos Feniletilo
alkoholis 0.63 0.54 1.47 1.28 Gėlių, rožių
33
5 lentelės tęsinys.
Klasė Lakūs junginiai C D-S D-N D-NS Kvapas
Esteriai
Heksano rūgštis,
etilo esteris 3,64±0,64 5,54±4,03 13,53±9,93 6,21±0,81
Saldus, vaisių, ananasų, bananų Etilo acetatas 0,78±0,01 1,82±1,44 2,17±0,47 - Vaisių, saldus,
žolių Etilo oktanoatas 8,09±0,75 6,00±4,38 14,37±2,03 10,70±1,36 Vaisių, vyno, saldus, abrikosų, bananų, brendžio
Iš viso esterių 12,51±3,68 13,36±2,29 30,07±6,82 16,90±3,17
Karboksi rūgštys
Nonano rūgštis 0,58±0,19 0,42±0,34 1,03±0,71 1,40±0,28 Vaško, purvo, pieno, sūrio Pentano rūgštis 5,21±2,16 3,41±3,95 6,27±3,84 4,64±3,52 Saldus, aštrus,
žolelių
Iš viso karboksi rūgščių 5,79±3,3 3,83±2,1 7,30±3,7 6,04±2,3
Ketonai Acetonas 6,48±0,66 3,93±2,72 10,17±2,03 - Obuolių, kriaušių 2-Heptanonas 2,22±0,06 1,37±0,96 3,10±0,53 3,34±0,13 Vaisių, aštrus, saldus, žolelių, kokosų, medžio 2-Oktanonas 0,64±0,08 0,45±0,36 0,80±0,20 0,83±0,04 Žemių, žolelių,
medžio 5-Hepten-2-one,
6-metilas 1,58±0,04 1,46±1,08 3,90±0,26 2,72±0,66 Vaisių, obuolių
Iš viso ketonų 10,91±2,59 7,21±1,49 17,97±4,01 6,89±1,31
Organiniai junginiai 2,6-Nonadienalis 0,52±0,01 0,30±0,22 0,67±0,06 0,55±0,11 Riebus, lapų, agurkų 2,4-Heptadienalis 0,77±0,08 0,44±0,35 1,37±0,42 1,17±0,29 Riebus, saldus, citrusinis
Iš viso organinių junginių 1,29±0,18 0,74±0,10 2,03±0,49 1,73±0,44
Halogenal kanai
Trichlorometana
s 2,12±0,21 1,45±1,15 2,30±1,15 2,81±1,12 Saldus
Iš rezultatų matyti, kad defolijuoti mėginiai parodė didesnį daugumos lakiųjų junginių kiekį palyginti su kontrole. Akivaizdus padidėjimas nustatytas heksanalio mėginiuose, kur D-S mėginyje nustatytas 10 proc. padidėjimas, D-N mėginyje – 14 proc., o D-NS – 38 proc. padidėjimas palyginti su kontrole (P<0,05).
Iš 5 lentelės duomenų matyti, kad didžiausia lakiųjų junginių grupė vynuogėse buvo aldehidai. Kontroliniame mėginyje aldehidai sudarė 90 proc. bendro lakiųjų junginių kiekio, D-S ir D-N mėginiuose – 60 proc., o D-ND-S mėginyje sudarė 69 proc. bendro lakiųjų junginių kiekio. Kontroliniame mėginyje nustatyta didžiausia aldehidų koncentracija (1420,76±423,46 ng ml-1), o mažiausia koncentracija nustatyta D-S mėginyje ir buvo 80 proc. mažesnė nei kontrolėje (P<0,05).
Didžiausios koncentracijos aldehidas vynuogėse buvo 2-heksanalis, o didžiausias jo kiekis nustatytas kontroliniame mėginyje (1282,57±1476,37 ng ml-1
2-34
heksanalio buvo nustatyta 90 proc. mažesnė koncentracija palyginus su kontroliniu mėginiu (P<0,05).
Cheminiai junginiai vyne, sugrupuoti į chemines klases, pateikti 6 lentelėje. Iš viso vyne identifikuotos 3 skirtingos lakiųjų junginių klasės (alkoholiai, esterių ir karboksi rūgštys). Iš viso vyne nustatyti 6 alkoholio junginiai, 11 aldehidų ir 2 karboksi rūgštys.
6 lentelė. Lakiųjų junginių koncentracija vyne (ng ml-1; reikšmė ± SD).
Klasė Lakūs junginiai C D-S D-N D-NS Kvapas
Alkoholi ai
Etanolis 3520,5±807,2 834,0±729,4 1336,1±97,7 1375,4±45,2 Saldus 1-Propanol,
2-metilas 24,7±6,8 16,6±14,5 21,4±1,5 29,6±0,6 Vyno, kartus
1-Butano, 3-metlas 1687,6±1116,9 1149,3±23,5 1200,5±61,8 1200,7±48,5
Viskio, salyklos,
degimo 2-Oktanolis 81,9±0,0 81±9±0,0 81±9±0,0 81±9±0,0 žolelių, medžio Gaivus, aštrus, Metionolis 3,7±0,3 2,5±2,0 2,4±1,9 3,2±0,4 Svogūnų, saldus Feniletilo alkoholis 1217,6±218,6 670,7±580,8 1090,0±94,1 1001,9±7,0 Medaus, aštrus,
rožių, alyvinis
Iš viso alkoholių: 6536,0±1386,5 2755,0±491, 6 3732,4±648, 1 3692,6±643, 8 Esteriai Etilacetatas 55,8±10,5 34,6±29,9 45,9±6,0 88,6±3,2 Ananasų Butano rūgštis, etilo
esteris 3,2±0,7 2,7±0,9 3,6±0,4 4,8±0,2
Nemalonus, riebus Butano rūgštis,
2-metil-, etilo esteris 3,2±0,3 1,6±1,2 3,1±0,7 3,0±0,1
Nemalonus, riebus Butano rūgštis,
3-metil-, etilo esteris 3,6±0,5 2,3±1,8 3,8±0,7 4,0±0,3
Nemalonus, riebus 1-Butanolio,
3-metilo-, acetatas 10,9±0,4 6,3±5,3 9,1±1,2 15,3±0,6 Salyklos Heksano rūgštis,
etilo esteris 49,5±6,0 32,8±26,4 51,0±7,6 58,1±1,5
Sūrio, aliejaus, aštrus, sūrus Etilo laktatas 3,4±0,1 23,2±34,1 - - Saldus, rūgštus,
vaisių Etilo oktanoatas 85,8±21,5 52,4±46,7 102,2±16,2 92,3±3,8
abrikosų, bananų, brendžio Dietilo sukcinatas 205,7±8,7 125,6±108,2 161,2±134,8 219,2±8,0 Tropinių vaisių,
gėlių Feniletilo acetatas 10,6±0,9 6,8±4,6 10,6±0,6 16,5±0,8 Gėlių, rožių,
saldus Etilizopentil
sukcinatas 7,6±2,4 3,5±2,8 5,4±0,5 4,1±0,5
Vaisių, obuolių, saldus
Iš viso esterių: 439,3±61,7 291,7±37,0 395,9±53,5 505,9±68,9
Karboksi rūgštys
Heksano rūgštis 6,9±0,0 - 3,4±0,4 3,2±0,1 Saldus Oktano rūgštis 20,8±12,4 10,5±9,1 13,5±1,7 9,7±0,8 Saldus, sūrio
Iš viso karboksi rūgščių 27,7±9,8 10,5±9,1 16,9±7,1 12,9±4,6
Iš rezultatų matyti, kad esteriai buvo didžiausia lakiųjų junginių klasė vyne. Didžiausias jų kiekis nustatytas D-NS (505,9±68,9 ng ml-1
35
kontrolėje (P<0,05). Mažiausias esterių kiekis (291,7±37,0 ng ml-1
) nustatytas D-S mėginyje ir buvo 34 proc. mažesnis (P<0,05) nei kontrolėje.
Alkoholiai buvo didžiausios koncentracijos junginiai vyne ir sudarė apie 90 proc. bendro lakiųjų junginių kiekio visuose mėginiuose (C – 93 proc., S – 90 proc., N – 90 proc., D-NS – 88 proc.). Iš rezultatų matomas stiprus etanolio, 1-butanol-3 metilo ir feniletilo sumažėjimas, defolijuotuose mėginiuose, lyginant su kontrole. C mėginyje nustatyta didžiausia suminė alkoholių koncentracija (6536,0±1386,5 ng ml-1
). D-S mėginyje nustatyta mažiausia alkoholių koncentracija ir buvo 58 proc. mažesnė (P<0,05) nei kontrolėje.
Organinės rūgštys buvo mažiausia lakiųjų junginių klasė vyne. Didžiausia jų koncentracija nustatyta C vyno mėginyje (27,7±9,8 ng ml-1
). D-S mėginyje nustatyta 62 proc. mažesnis kiekis palyginti su kontroliniu vyno mėginiu (P<0,05).
7 pav. Bendra lakiųjų junginių koncentracija vynuogėse ir vyne (ng ml-1).
Bendra lakiųjų junginių koncentracija vynuogėse ir vyne pateikta 7 pav. Tiek vynuogėse, tiek vyne matomas stiprus lakiųjų junginių sumažėjimas palyginti su kontrole (P<0,05). Kontroliniame mėginyje nustatyta didžiausia lakiųjų junginių koncentracija – 1576±79 ng ml-1 vynuogėse ir 7004±350 ng ml-1
vyne. Mažiausia lakiųjų junginių koncentracija nustatyta D-S mėginiuose. D-S vynuogių mėginyje nustatytas 69 proc. mažesnis lakiųjų junginių kiekis palyginti su kontrole, o D-S vyno mėginyje – 56 proc. mažesnis lakiųjų junginių kiekis palyginti su kontrole (P<0,05). 1576a 490b 557b 558b 7003a 3057b 4145b 4211b 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 C D-S D-N D-NS ng ml-1 Vynuogės Vynas
