TILIA CORDATA MILL. LAPŲ IR ŽIEDŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

AUŠRA ZONYTĖ

TILIA CORDATA MILL. LAPŲ IR ŽIEDŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ

IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Lekt. Dr. Lina Raudonė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof., dr. Vitalis Briedis 2015 m. birželio

TILIA CORDATA MILL. LAPŲ IR ŽIEDŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ

IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Lekt. Dr. Lina Raudonė 2015 m.

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė Aušra Zonytė

2015 m.

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Mažalapė liepa (Tilia cordata Mill.), paplitimas ir morfologiniai požymiai. ... 10

1.2. Mažalapės liepos augalinės žaliavos fitocheminė sudėtis ... 10

1.3. Mažalapės liepos farmakologinės savybės ir panaudojimas ... 11

1.4. Fenolinių junginių apžvalga ... 12

1.5. Flavonoidai – didžiausia fenolinių junginių klasė ... 13

1.6. Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai ... 16

1.7. Laisvieji radikalai, antioksidantai, antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai. .... 18

2. TYRIMO METODIKA ... 21

2.1. Tyrimo objektas ... 21

2.2. Naudoti reagentai ir aparatūra ... 21

2.3. Duomenų statistinis įvertinimas ... 22

2.4. Tyrimo metodai ... 22

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1.Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 27

3.2.Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu. ... 28

3.3.Bendro flavonoidų kiekio nustatymas mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu. ... 31

3.4.Antioksidantinio aktyvumo nustatymas mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose.... 34

3.6.Fenolinių junginių nustatymas mažalapių liepų augalinėje žaliavoje ESC metodu... 40

3.7.Tyrimo rezultatų aptarimas ... 47

IŠVADOS ... 49

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 50

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 51

SANTRAUKA

A. Zonytė. Magistro baigiamasis darbas. Mokslinis vadovas lekt. dr. Lina Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Kaunas.

Pavadinimas: Tilia cordata Mill. lapų ir žiedų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai.

Raktiniai žodžiai: Tilia cordata, mažalapė liepa, Folin-Ciocalteu, flavonoidai, antioksidantinis aktyvumas, ABTS, CuPRAC.

Tyrimo tikslas: Nustatyti mažalapių liepų kaupiamų fenolinių junginių ir flavonoidų bendrą kiekį lapų ir žiedų ekstraktuose bei įvertinti lapų ir žiedų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.

Tyrimo objektas ir metodika: Tyrimų objektas – natūraliai augančių mažalapių liepų lapai ir žiedai. Suminis fenolinių junginių kiekis augalinėje žaliavoje nustatytas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. Bendras flavonoidų kiekis nustatytas aliuminio chlorido kolorimetriniu metodu. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas dviem metodais: ABTS metodu laisvųjų radikalų surišimo įvertinimui ir CuPRAC metodu redukcinio aktyvumo nustatymui. ESC metodu identifikuoti fenoliniai junginiai ir nustatytas jų kiekis.

Rezultatai: Vegetacijos laikotarpiu nustatytas reikšmingas (p<0,05) fenolinių junginių kiekio įvairavimas mažalapių liepų lapuose ir žieduose. Didžiausias (p<0,05) fenolinių junginių kiekis

lapuose visais tyrimo metais nustatytas rugpjūčio pradžioje, masinio žydėjimo pabaigoje, 2013 m. – 77,87 ± 2,94 mg/g, 2014 m. – 89,18 ± 4,04 mg/g. Mažalapių liepų žiedų didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti masinio žydėjimo metu (2013 m. 81,58 ± 3,07 mg/g) ir masinio žydėjimo pabaigoje (2014 m. 87,72 ± 4,25 mg/g). Didžiausias liepų lapų flavonoidų kiekis nustatytas lapų skleidimosi tarpsnyje gegužės pradžioje – 3,68 ± 0,12 mg/g (2013 m.) ir 3,37 ± 0,15 mg/g (2014 m.). Žieduose didžiausi (p<0,05) flavonoidų kiekiai nustatyti butonizacijos ir masinio žydėjimo metu, atitinkamai 6,93 ± 0,34 mg/g ir 5,93 ± 0,26 mg/g. Nustatyta, kad 2014 tyrimo metais rinktos žaliavos pasižymėjo didesniu (p<0,05) antiradikaliniu ir redukciniu aktyvumu. Lapų antioksidantinis aktyvumas

maksimalias reikšmes pasiekia rugpjūčio pradžioje, kuomet fiksuojamas didžiausias fenolinių junginių kiekis (vidutinis antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas atitinkamai, 455,80 ± 14,97 µmol/g ir 760,05 ± 11,91µmol/g). Žiedų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas reikšmingai padidėja masinio žydėjimo metu ir masinio žydėjimo pabaigoje. ESC metodu identifikuotų junginių bendras kiekis didžiausias buvo 2014 metais mažalapių liepų lapuose vegetacijos pradžioje (17,60 mg/g) ir žieduose

SUMMARY

A. Zonytė. Master thesis. Supervisor lect. dr. Lina Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, Faculty of pharmacy, Department of Pharmacognosy. Kaunas.

Title: Evaluation of phenolic compounds and antioxidant activity in Tilia coradata Mill. leaves and flowers.

Key words: Tilia cordata, little-leaf linden, Folin-Ciocalteu, flavonoids, antioxidant activity, ABTS, CuPRAC.

The aim: To estimate total content of phenolic compounds, total content of flavonoids and antioxidant activity in extracts of leaves and flowers of little-leaf linden.

Object and methods: Research object – leaves and flowers of naturally growing little-leaf linden. Spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used for the determination of total content of phenolic compounds in plant material. Specific reaction with AlCl3 was used to determine total content

of flavonoids. Two spectrophotometric methods ABTS and CuPRAC were used to determine total antioxidant activity. Phenolic compounds were identified and quantified by HPLC method.

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)

CuPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Cupric ion reducing antioxidant

capacity)

DNR – deoksiribonukleorūgštis

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) GAE – galo rūgšties ekvivalentas (angl. Gallic acid equivalent)

LHMT - Lietuvos hidrometeorologijos tarnyba prie Aplinkos ministerijos QE - kvercetino ekvivalentas (angl. Quercetin equivalent)

ĮVADAS

Vaistiniai augalai medicinoje vartojami nuo senovės laikų ir iki šiol išlieka populiarūs. Dažniausiai vaistiniai augalai vartojami ligų profilaktikai ar nesunkių negalavimų gydymui[1]. Tačiau tyrimais nustatyta, kad vaistiniai augalai gali padėti gydant ir infekcinius susirgimus[2], odos ligas[3]. Dažnai klaidingai manoma, kad augaliniai preparatai yra visiškai saugūs žmogaus organizmui dėl savo natūralios prigimties, tačiau vaistiniai augalai gali kaupti medžiagas, kurios sukelia nepageidaujamą poveikį, pasižymi hepatotoksiniu, kancerogeniniu poveikiu ar kitaip neigiamai veikia organizmo ląsteles. Taip pat augaluose esančios medžiagos gali sąveikauti su kitais vartojamais preparatais. Dėl šių priežasčių vaistiniai augalai ir iš jų gaminami preparatai turi būti tiriami, siekiant užtikrinti jų saugumą ir veiksmingumą[4].

Mažalapės liepos (Tilia cordata Mill.) augalinė žaliava liaudies medicinoje dažnai vartojama gydyti peršalimą, bronchitą, karščiavimui bei uždegimui mažinti, išoriškai liepų žiedų preparatai vartojami nudegimams, žaizdoms gydyti[5,6]. Liepų žiedai kaupia fenolinius junginius, polisacharidus, raugines medžiagas, eterinius aliejus, vitaminus C ir E[5,6], gleives[7], mineralines medžiagas[8]. Tačiau svarbiausi biologiškai aktyvūs junginiai, lemiantys liepų augalinės žaliavos farmakologinį poveikį, yra fenoliniai junginiai, kurie pasižymi antioksidantiniu veikimu[9,10].

Antioksidantai – medžiagos, kurios suriša laisvuosius radikalus bei apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso. Laisvieji radikalai dėl didelio cheminio aktyvumo gali sąveikauti su daugybe organizmo molekulių (DNR, nukleininėmis, amino rūgštimis, angliavandeniais, lipidais, baltymais ir kt.), gali sukelti ląstelių pažeidimus, dėl šios priežasties gali išsivystyti daugybė lėtinių ir

degeneracinių ligų – aterosklerozė, širdies ir kraujagyslių ligos, parkinsono liga[11]. Antioksidantai palaiko optimalų laisvųjų radikalų kiekį organizme ir gali apsaugoti organizmą nuo ligų[12].

Fenoliniai junginiai pasiskirstę visuose mažalapių liepų organuose ir jų kiekis vegetacijos metu kinta. Natūraliai augančių Tilia cordata Mill. žiedų ir lapų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas svarbus vertinant žaliavų kokybę ir parenkant optimalų žaliavos rinkimo laiką.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Nustatyti mažalapių liepų kaupiamų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį lapų ir žiedų ekstraktuose bei įvertinti lapų ir žiedų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose. 2. Nustatyti flavonoidų kiekį mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose.

3. ESC metodu nustatyti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose.

4. Įvertinti mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą. 5. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp antioksidantinio aktyvumo ir suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Mažalapė liepa (Tilia cordata Mill.), paplitimas ir morfologiniai

požymiai.

Mažalapė liepa – Tilia cordata Mill. (sinonimai: Tilia sylvestris Desf., Tilia sylvatica Haller,

Tilia microphylla Vent., Tilia parvifolia Ehrh. ir kt.; priklauso liepinių (Tiliaceae Juss.) šeimai),

vasaržalis medis, plačiai paplitęs Europoje, dalyje Azijos, auginamas Šiaurės Amerikoje. Viduriniame Pavolgyje, Baškirijoje, Kamos upės baseine galima aptikti didžiulius liepos miškų masyvus. Kaukaze, Užkaukazėje ir Krymo pusiasalyje liepos taip pat plačiai aptinkamos. Mažalapė liepa paplitusi visoje Lietuvos teritorijoje. Auga miškuose, ežerų, upių pakrantėse. Labai dažnai kaip dekoratyvinis augalas auginamas pakelėse, parkuose, miestuose, sodybose[5,7].

Mažalapė liepa gali užaugti iki 30 m aukščio. Lajos skersmuo gali siekti 20 m., ji kiaušiniškos ar ovalios formos. Šis medis gyvuoja iki 600 ar daugiau metų. Po 130-150 metų nustoja augti aukštyn. Gerai auga tiek saulėtose vietovėse, tiek pavėsyje. Šaknų sistemai būdinga gerai išsivysčiusi

pagrindinė šaknis su gausiomis šoninėmis šaknimis. Lapai 5-9 cm ilgio ir 5-8 cm pločio, tamsiai žali, širdišku pamatu ir smailia viršūne, lapo kraštas dantytas. Žiedai kvapnūs, geltonos spalvos, skėtiškame ar kekiškame žiedyne išsidėstę po 3-7. Pažiedlapiai žaliai gelsvi, pailgai lancetiški, 6-8 cm ilgio ir 1-2 cm pločio. Žydi birželio pabaigoje, liepos mėnesį. Vaisius – riešutėlis, subręsta rugpjūčio mėnesį[5,7].

1 pav. Mažalapė liepa – Tilia cordata Mill. [13]

1.2. Mažalapės liepos augalinės žaliavos fitocheminė sudėtis

Kaip vaistinė augalinė žaliava gali būti vartojami žiedai, lapai ir žievė[5]. Svarbiausi iš jų yra liepų žiedai. Žiedai kaupia:

Būtent flavonoidai ir p-kumaro rūgštis lemia žiedų preparatų prakaitavimą skatinančias ir antispazmines savybes[7,14],

 0,02-0,1% eterinio aliejaus - žiedų aliejuje aptikta hidrokarbonatų (60,4%), iš kurių didžiausią dalį sudaro trikozanas (31,3%), heneikozanas (16,0%), taip pat rasta oksiduotų monoterpenų – hotrienolio (11,5%), linaloolio (1,5%), p-cimeneno (0,9%), borneolio (0,8%)[15],

 hidroksicinamono rūgštis – kavos, p-kumaro, chlorogeno rūgštis,  10% gleivių[7],  raugines medžiagas,  organines rūgštis,  polisacharidus,  21 mg% karotino,  iki 580 mg% vitamino C,  vitaminą E[5,6],

 mineralines medžiagas – kalcį, kalį, magnį, šiek tiek geležies[8].

Mažalapių liepų lapai kaupia flavonoidus – kvercetino glikozidus, kempferolio glikozidus bei miricetino glikozidus, chlorogeno rūgštį, askorbo rūgštį, alkoholį β-amiriną, pigmentą ksantofilą, gleives, kurių sudėtyje yra urono rūgšties, heksozės, metil-pentozės[16,17]. Pagrindiniai junginiai, kuriuos kaupia mažalapių liepų žievė – flavonoidai, oleino, linoleno, palmitino rūgštys, terpenas tarakserolas, fitosteroliai, taninai[6,17,18].

1.3. Mažalapės liepos farmakologinės savybės ir panaudojimas

Liepų žiedų preparatai pasižymi prakaitavimą skatinančiu, raminančiu, priešuždegiminiu, antibakteriniu poveikiu. Žiedų užpilas ar nuoviras vartojamas sergant viršutinių kvėpavimo takų ligomis, peršalus kaip prakaitavimą skatinanti, temperatūrą mažinanti priemonė, taip pat ji skatina šlapimo ir tulžies išsiskyrimą, mažina nosies gleivinės paburkimą, slopina kosulį, uždegimą. Nuoviro košele galima gydyti spuogus, votis, nudegimus[5,6].

Mokslinių tyrimų duomenimis mažalapių liepų ekstraktai pasižymi citotoksiniu poveikiu navikinėms ląstelėms. Tokiomis savybėmis pasižymi ekstraktuose nustatyti junginiai –

kvercitrinas, kempferolis, kvercetinas[20]. Dėl šios priežasties liepų augalinė žaliava gali būti naudojama kaip pagalbinė priemonė gydant neurologinius ir psichikos sutrikimus.

Mokslinių tyrimų su žiurkėmis metu patvirtintas liepų žiedų ekstraktų skausmą malšinantis bei priešuždegiminis poveikis. Ekstraktus galima vartoti ne tik peršalus, bet ir esant galvos skausmui, menstruaciniams skausmams, skausmui, susijusiam su artritu, enterokolitu, gastroenteritu, inkstų ir kepenų spazmais. Chromatografiniais metodais nustatyta, kad svarbiausi junginiai pasižymintys skausmą malšinančiu poveikiu yra kvercetino ir kempferolio glikozidai[21].

Liaudies medicinoje liepų žiedų nuovirai, užpilai, ekstraktai nuo seno vartojami: į vidų gydant kosulį, inkstų ir šlapimo pūslės ligas, mažakraujystę; išoriškai slopinti reumatinius skausmus, gydyti žaizdoms, nudegimams, stiprinti plaukams bei odos gražinimui[7].

1.4. Fenolinių junginių apžvalga

Fenoliniai junginiai – tai augaluose susidarantys antriniai metabolitai. Augaluose jie sintetinami dviem pagrindiniais keliais – šikimato keliu ir acetato keliu. Fenolinių junginių grupei priklauso paprastieji fenoliai, fenolinės rūgštys, kumarinai, flavonoidai, stilbenai, hidrolizuoti ir kondensuoti taninai, lignanai ir ligninai[22]. Fenoliniai junginiai turi gana platų poveikio spektrą, jie pasižymi antialerginiu, priešuždegiminiu, antimikrobiniu, prieštromboziniu, kardioprotekciniu, kraujagysles plečiančiu ir antioksidantiniu poveikiais[23].

Fenolinių junginių struktūrą sudaro aromatinis žiedas, turintis vieną ar daugiau hidroksilo grupių. Fenoliai gali sudaryti junginius su kitomis cheminėmis struktūromis, pavyzdžiui

polisacharidais ar kitais junginiais. Dėl šios priežasties gamtoje susidaro labai daug skirtingų fenolinių junginių, kurie skirstomi į keletą klasių (1 lentelė). Svarbiausios klasės – flavonoidai, fenolinės rūgštys ir taninai[23].

1 lentelė Fenolinių junginių klasės

Klasė Pagrindinė grandinė Pagrindinė struktūra

Paprastieji fenoliai C6

Benzochinonai C6

Fenolinės rūgštys C6-C1

Acetofenonai C6-C2

Hidroksicinamono rūgštys C6-C3 Fenilpropenai C6-C3 Kumarinai, izokumarinai C6-C3 Chromonai C6-C3 Naftochinonai C6-C4 Ksantonai C6-C1-C6 Stilbenai C6-C2-C6 Antrachinonai C6-C2-C6 Flavonoidai C6-C3-C6 Lignanai, neolignanai (C6-C3)2 Ligninai (C6-C3)n .

1.5. Flavonoidai – didžiausia fenolinių junginių klasė

hidroksilines grupes 5 ir 7 padėtyse. B žiedas sintezuojamas šikimato keliu ir paprastai hidroksilines grupes turi 4', 3'4' arba 3'4'5' padėtyse. Kartais augaluose flavonoidai aptinkami aglikonų pavidalu, tačiau dažniausiai jie egzistuoja kaip glikozidų dariniai[24,25].

2 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas – 2-fenil-1,4-benzopironas

Pagal struktūros ypatybes flavonoidai klasifikuojami į keletą grupių: chalkonai, dihidrochalkonai, auronai, flavonai, flavonoliai, dihidroflavonoliai, flavanonai, flavanoliai (katechinai), flavandioliai (leukoantocianidinai), antocianinai, izoflavonoidai, biflavonoidai,

proantocianidinai (kondensuoti taninai). Tačiau pagrindinės iš jų yra flavonai, flavonoliai, flavanonai, katechinai, antocianinai ir izoflavonai[24-26].

Flavonoidai plačiai paplitę augalų karalystėje, jų yra visose fotosintetinančiose ląstelėse. Šių junginių randama vaisiuose, daržovėse, sėklose, vaistažolėse, prieskoniuose, riešutuose, žieduose, stiebuose, arbatoje, kakavoje, vyne, propolyje, meduje[25,27]. Dėl šios priežasties šių junginių yra suvartojama labai daug, be to flavonoidai yra termiškai stabilūs[27]. Flavonoidų grupių struktūra ir pagrindiniai maisto šaltiniai pavaizduoti 3 paveiksle[24].

Flavonoidai – labai svarbūs augalams junginiai, jie dalyvauja daugelyje augaluose vykstančių procesų. Ši fenolinių junginių klasė dalyvauja fotosintezės, energijos perdavimo procesuose,

kontroliuoja kvėpavimo ir fotosintezės procesus, dalyvauja augimo hormonų ir augimo reguliatorių veikloje, morfogenezėje ir augalo lyties formavimosi procese[25].

Žiedams flavonoidai suteikia spalvą, dėl šios priežasties augalai labiau traukia vabzdžius, paukščius, kurie apdulkina augalus. Šia savybe pasižymi flavonoidų grupė – antocianinai[25,28]. Be to antocianinai spalvą suteikia ir vaisiams[29]. Lapuose flavonoidai atlieka apsauginę funkciją: saugo juos nuo grybelinių, bakterinių patogenų, nuo UV spindulių. Nustatyta, kad flavonai, flavononai, izoflavonoidai saugo nuo UV spindulių, o flavonoliai ir auronai saugo nuo įvairių patogenų[25,29].

Be šių, aukščiau išvardintų, augalams svarbių savybių flavonoidai pasižymi ir farmakologiniu veikimu. Flavonoidams būdingas antioksidantinis, priešuždegiminis, antimikrobinis, estrogeninis, antialerginis, kardioprotekcinis, citotoksinis[25], antidiabetinis[30], skausmą malšinantis,

priešreumatinis[21,31], priešvirusinis, antitrombozinis[32], anksiolitinis[20], antiproliferacinis[33] poveikis.

Svarbiausia ir labiausiai pritaikoma medicinoje flavonoidų savybė – antioksidantinis veikimas. Struktūros ir aktyvumo ryšio tyrimai parodė, kad antioksidantiniam veikimui būtina o-dihidroksi struktūra B žiede ir 2,3 dviguba jungtis konjugacijoje su 4-okso grupe C žiede. Taip pat nustatyta, kad antioksidantinį poveikį padidina 3-hidroksil grupės buvimas heterocikliniame žiede[34]. Dėl šios savybės šiuos junginius galima vartoti gydant aterosklerozę, įvairias širdies ir kraujagyslių sistemos ligas, vėžį. Manoma, kad stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymi kvercetinas, šiek tiek mažesniu aktyvumu pasižymi kempferolis, miricetinas, hesperitinas, naringeninas[35].

Tyrimais su pelėmis nustatyta, kad izokvercetinas pasižymi sedaciniu poveikiu[30]. Kitų tyrimų duomenimis flavonoidai veikia kaip mono amino oksidazių A ir B inhibitoriai. Jie moduliuoja mono aminų kiekius smegenyse, tokiu būdu sukelia graužikų elgesio pokyčius ir sukelia anksiolitinį efektą. Tilirozidas, rutinas, kvercetinas, kempferolis, kvercitrinas – pagrindiniai amerikinės liepos (Tilia americana) junginiai pasižymintis anksiolitiniu veikimu[20].

Priešuždegiminį flavonoidų poveikį galima paaiškinti keliais mechanizmais. Viena iš priežasčių – antioksidantinis aktyvumas, tačiau jie dar slopina eikazanoidų sintezę bei tam tikri flavonoidai moduliuoja prouždegiminių molekulių išraišką. Jų veikimo mechanizmas priklauso nuo cheminės struktūros. C žiedo 2,3 dviguba jungtis ir B žiedo 4' arba 3',4'-hidroksilo grupė reikalinga priešuždegiminiam veikimui. Flavonai ar flavonoliai, turintys pakaitus C-6 ar C-8 padėtyse (pvz., baikaleinas, vogoninas) taip pat pasižymi uždegimą slopinančiu poveikiu, jie netinka ūmiais atvejais, tačiau gydo lėtinius uždegiminius sutrikimus[32]. Flavonoidai sumažina arachidono rūgšties

morinas ar galanginas slopina ciklooksigenazę. Epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad flavonoidų priešuždegiminis efektas sumažina riziką susirgti vėžiu bei širdies ir kraujagyslių ligomis[26].

1.6. Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai

Norint augalinėje žaliavoje nustatyti fenolinius junginius pirmiausia reikia juos išskirti. Fenoliniai junginiai gali būti ekstrahuojami iš šviežios, šaldytos ar džiovintos augalinės žaliavos[36]. Ekstrakcijos metodų yra įvairių, tačiau labiausiai paplitusi ekstrakcija tirpikliais. Tai paprastas, veiksmingas, plačiai pritaikomas metodas. Ekstrahuotų junginių kiekis priklauso nuo tirpiklio tipo, ekstrakcijos laiko, temperatūros, mėginio-tirpiklio santykio, mėginio fizikocheminių savybių. Naudojami tirpikliai – organiniai, neorganiniai, vanduo, organinių tirpiklių mišiniai. Dažniausiai fenolinių junginių ekstrakcijai naudojami tirpikliai: metanolis, etanolis, acetonas, etilacetatas, jų mišiniai ar įvairių proporcijų mišiniai su vandeniu. Metanolis labiau efektyvus ekstrahuojant mažos molekulinės masės fenolinius junginius, o vandens ir acetono mišinys efektyvesnis didesnės

molekulinės masės flavanolių ekstrakcijai. Etanolis taip pat efektyviai ekstrahuoja fenolinius junginius, be to yra saugus vartoti žmonėms[37].

Sukurta ir išvystyta nemažai ekstrakcijos metodų. Ekstrakcijai galima naudoti mikrobangas, ultragarsą, subkritinį vandenį, superkritinius skysčius, suslėgtus skysčius, taip pat naudojama

ekstrakcija Soksleto aparate bei maceracija. Nustatyta, kad maceracija ir ekstrakcija Soksleto aparatu mažai efektyvi, reikalingas ilgas ekstrakcijos laikas ir naudojami dideli kiekiai organinių tirpiklių. Dažniausiai naudojama ekstrakcija ultragarsu dėl savo veiksmingumo, pakankamai pigios ir paprastos aparatūros. Be to pastarasis metodas gali būti pritaikomas tiek mažos, tiek didelės apimties tyrimams bei farmacijos pramonėje[36].

Fenolinių junginių kiekį išvalytuose ekstraktuose galima nustatyti įvairiais

spektrofotometriniais ir chromatografiniais metodais, taip pat galima pritaikyti kapiliarinės elektroforezės metodus. Naudojami Folin-Denis, Folin-Ciocalteu, vanilino, 4-(dimetilamino)-cinamaldehido spektrofotometriniai metodai, kolorimetriniai metodai su geležies druskomis ir kiti įvairūs spektrofotometriniai metodai. Iš chromatografinių metodų dažniausiai pritaikoma dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), ESC-masių spektrometrija[36,37].

askorbo rūgšties kiekį kitais būdais ar prieš pridedant į reakcijos mišinį šarmo, o tuomet nustatytą kiekį atimti iš galutinio rezultato[38]. Be to reagentas nėra specifinis, negalima nustatyti visų fenolinių grupių esančių ekstraktuose[37]. Nepaisant šių trūkumų metodas plačiai naudojamas fenolinių junginių nustatymui dėl savo paprastumo ir atkuriamumo[36,38].

Flavonoidų kiekį augalinėje žaliavoje tiksliausiai nustatyti galima naudojant

chromatografinius metodus[39]. Spektrofotometriniai metodai pakankamai tikslūs, patikimi, greičiau atliekami, nors jais negalime nustatyti visų flavonoidų grupių. Tačiau spektrofotometriniai metodai (AlCl3 metodas ir 2,4-dinitrofenilhidrazino metodas) tinka rutininei analizei[39,40].

Spektrofotometrinis metodas paremtas reakcija su AlCl3. Su aliuminio chloridu geriau

reaguoja flavonai ir flavonoliai[39]. Reakcija pagrįsta tuo, kad AlCl3 rūgščioje aplinkoje suformuoja

stabilius kompleksus su flavonų ir flavonolių C-4 keto grupe ir C-3 ar C-5 hidroksilo grupe. Be to rūgščioje aplinkoje AlCl3 suformuoja ir nestabilius kompleksus su orto-dihidroksilo grupėmis

flavonoidų A ir B žieduose[40]. Absorbcija matuojama po 30 min 395-425 nm bangų ilgio intervale. Flavonoidų kiekį galima išreikšti pagal rutino, kvercetino, apigenino, katechino, galangino

ekvivalentą[39,40].

Spektrofotometrinis metodas paremtas reakcija su 2,4-dinitrofenilhidrazinu pagrįstas tuo, kad 2,4-dinitrofenilhidrazinui reaguojant su ketoninėmis ar aldehidinėmis grupėmis susidaro spalvoti 2,4-dinitrofenilhidrazonai. Su šiuo reagentu geriau reaguoja flavanonai ir flavanonoliai[40]. Reakcija vykdoma metanolio aplinkoje šildant mėginį vandens vonioje 50 ºC temperatūroje 50 min. Tirpalą atvėsinus iki kambario temperatūros absorbcija išmatuojama prie 495 nm bangos ilgio. Flavonoidų kiekis išreiškiamas pinocembrino ar (±)-naringenino ekvivalentais[39,40].

Vanilino metodas plačiai naudojamas proantocianidinų kiekybiniam nustatymui augalinėje žaliavoje. Šis testas specifinis flavan-3-oliams, dihidrochalkonams, proantocianidinams, turintiems viengubą jungtį 2,3 padėtyje ir laisvas meta-hidroksi grupes B žiede. Kaip standartas dažniausiai naudojamas katechinas. Tai paprastas, specifiškas, jautrus metodas proantocianidinų nustatymui[37].

Chromatografinių metodų pritaikymas fenolinių junginių atskyrimui ir kiekybiniam nustatymui leido efektyviau įvertinti fenolinius junginius augalinėje žaliavoje[37]. Dujų

1.7. Laisvieji radikalai, antioksidantai, antioksidantinio aktyvumo

nustatymo metodai.

Laisvieji radikalai tai nestabilios ir labai reaktyvios molekulės. Jos savo išorinėje orbitalėje turi nesuporuotą elektroną – gali „atiduoti“ elektroną arba „paimti“ jį iš kitos molekulės (gali būti ir oksidatoriais, ir reduktoriais). Dėl šios savybės laisvieji radikalai pasižymi dideliu cheminiu

aktyvumu[41]. Šie junginiai visų gyvų organizmų neatsiejama dalis, jie susidaro kvėpavimo reakcijų metu mitochondrijose, fotosintezės proceso metu chloroplastuose, endoplazminiame tinkle

ksenobiotikų metabolizmo metu, biologinių molekulių autooksidacijos metu, taip pat leukocitams kovojant prieš svetimus mikroorganizmus[42,43]. Nepaisant šių vidinių laisvųjų radikalų šaltinių, išoriniai veiksniai, tokie kaip radiacija, rūkymas, oro teršalai, pramoniniai chemikalai, ozonas taip pat gali paskatinti laisvųjų radikalų susidarymą[41].

Laisvieji radikalai reikalingi organizmo gynybinėms, dauginimosi funkcijoms, šie junginiai dalyvauja įvairiuose organizmo metabolizmo procesuose, perduodant signalus, veikia kraujagyslių tonusą, tačiau taip pat gali būti labai kenksmingi organizmui. Dėl didelio cheminio aktyvumo jie gali sąveikauti su daugybe organizmo molekulių (DNR, nukleininėmis, amino rūgštimis, angliavandeniais, lipidais, baltymais ir kt.), gali sukelti ląstelių pažeidimus bei sutrikdyti organizmo homeostazę[11,44]. Svarbiausi junginiai, sukeliantys pažeidimus, yra hidroksilo (OH•), superoksido (O2•-), alkoksilo (RO•),

peroksilo (RO2•) , hidroperoksilo (HO2•), azoto oksido (NO•) , azoto dioksido (NO2•) radikalai bei

vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl), singletinis deguonis (1O2), kurie nėra

radikalai, tačiau taip pat labai reaktyvūs junginiai[41-43].

Fiziologinėmis sąlygomis organizmo fermentinės sistemos palaiko optimalų laisvųjų radikalų kiekį organizme, bet esant nepalankioms sąlygoms susidaro laisvųjų radikalų perteklius, kuris sukelia oksidacinį stresą. Užsitęsusi oksidacinio streso būsena sukelia ląstelių pažeidimus ar net ląstelių žūtį[42,43]. Todėl oksidacinis stresas pagrindinis veiksnys, sukeliantis lėtines ir degeneracines ligas – autoimuninius sutrikimus, vėžį, širdies ir kraujagyslių ligas, neurodegeneracines ligas, aterosklerozę, artritą, vaskulitą ir kitas uždegimines ligas, bei dalyvaujantis senėjimo procese[41,42].

Antioksidantai apibrėžiami kaip molekulės sustabdančios ar sumažinančios biologinių ląstelių oksidacinį pažeidimą[42], nes geba surišti laisvuosius radikalus atiduodami elektroną arba vandenilį[41]. Jie gali būti skirstomi į endogeninius ir egzogeninius antioksidantus. Endogeniniai antioksidantai – glutationas, alfa-lipoinė rūgštis, kofermentas Q, feritinas, šlapimo rūgštis, bilirubinas, L-karnitinas, katalazė, melatoninas, glutationo peroksidazės, fermento superoksido dismutazė,

Antioksidacinė ląstelės apsauga skirstoma į tris tipus:

1. Fermentai, kurie saugo ląstelę nuo laisvųjų radikalų pertekliaus. Vykstant įvairioms fermentų katalizuojamoms organizmo reakcijoms laisvieji radikalai sintezuojami į chemiškai neaktyvius junginius.

2. Pereinamųjų metalų jonus prisijungiantys baltymai.

3. Mažos molekulinės masės laisvųjų radikalų surišėjai. Jie suriša laisvuosius radikalus ir tokiu būdu juos neutralizuoja. Taip veikia fenoliniai junginiai, šlapimo rūgštis, vitaminai A, E, C, karotenoidai[42,43,46].

Organizmo papildymas natūraliais antioksidantais gali padėti apsisaugoti nuo ligų[12,45], todėl būtina subalansuota, antioksidantais praturtinta mityba. Šių junginių ypač gausu vaisiuose, daržovėse, arbatoje, vaistiniuose ir prieskoniniuose augaluose[41].

Antioksidantiniam aktyvumui nustatyti sukurta daugybė metodų. Populiariausi spektrofotometriniai metodai – ABTS ir DPPH laisvųjų radikalų surišimo įvertinimo metodai bei FRAP ir CuPRAC redukcinio aktyvumo nustatymo metodai. Jie remiasi antioksidanto gebėjimu perduoti elektroną spalvotam radikalui ar reaktyviam junginiui (oksidantui) – oksidantas gavęs elektroną iš antioksidanto redukuojasi ir pakeičia spalvą. Daugumos antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų principas vienodas: pagaminamas sintetinis spalvotas radikalas ar reaktyvus

junginys, spektrofotometru išmatuojamas biologinio mėginio gebėjimas surišti radikalą arba redukuoti reaktyvųjį junginį, antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas atitinkamo standarto ekvivalentais[41,46-48].

ABTS laisvųjų radikalų surišimo metodas – šis metodas pagrįstas antioksidantų gebėjimu redukuoti pagamintą mėlynai žalios spalvos ABTS•+ _radikalą.

2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) (ABTS), veikiant peroksilo radikalais ar kitais oksidantais, oksiduojama į intensyvios spalvos ABTS•+ radikalą, kuris gali būti spektrofotometriškai nustatomas 600-750 nm bangos ilgio intervale. Antioksidantinis aktyvumas išmatuojamas kaip tiriamųjų junginių gebėjimas redukuoti radikalą bei tokiu būdu sumažinti spalvos intensyvumą ir išreiškiamas Trolokso ekvivalentais[48,49]. Tai patogus, paprastas metodas, tyrimais nustatyta, kad lyginant su DPPH metodu jis geriau nustato antioksidantinį aktyvumą maiste, ypatingai vaisiuose, daržovėse ir gėrimuose[48]. Tačiau jis turi ribotas galimybes, nes naudojamas radikalas nėra fiziologinis[48,49].

naudojamas pH artimas fiziologiniam. Šiuo metodu galima įvertinti tiolio tipo antioksidantų aktyvumą, ko negalima atlikti FRAP metodu. Priešingai nei ABTS metodas, CuPRAC nėra jautrus tirpalų

skiedimui[46,50]. Šio metodo pagrindinis trūkumas – sunkumai pasirenkant tinkamą reakcijos trukmę, kadangi dalies antioksidantų reakcija su reagentu įvyksta per minutę, tačiau kompleksiniams

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimams naudota augalinė žaliava – mažalapių liepų (Tilia cordata Mill.) žiedai ir lapai. Mažalapių liepų žiedai ir lapai rinkti 2013 ir 2014 metais nuo gegužės iki spalio mėnesio Radviliškio raj. Sklioriškių kaime bei 2014 metais žiedai masinio žydėjimo metu ir lapai rugsėjo mėnesio viduryje rinkti 5 skirtingose Šiaulių apskrities vietose: Radviliškio raj. Burbiškio dvare, Radviliškio raj.

Lenartuvos kaime, Šiaulių raj. Kužių miške, Šiaulių raj. Girkautų kaime, Kelmės raj. Aukštiškių kaime (4 pav.).

4 Pav. Teritorinis augalinių žaliavų rinkimo vietų pasiskirstymas (http://www.gpsvisualizer.com)

2.2. Naudoti reagentai ir aparatūra

Reagentai. Aliuminio chlorido heksahidratas įsigytas iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Steinheim, Vokietija), natrio karbonatas, kvercetino dihidratas, vario (II) chlorido dihidratas iš „Carl Roth GmbH + Co“ (Karlsruhe, Vokietija), kalio persulfatas iš „Alfa Aesar GmbH & Co“ (Karlsruhe, Vokietija), ABTS (2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis) iš ,,Alfa Aesar‘‘

((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis), Folin & Ciocalteu reagentas ir galo rūgšties monohidratas iš ,,Sigma-Aldrich‘‘ (St. Louis, JAV), 96,3 proc. V/V etanolis iš AB ,,Stumbras‘‘ (Kaunas, Lietuva).

Aparatūra. Augalinė žaliava sverta elektroninėmis svarstyklėmis ,,Sartorius AG“ (Götingen, Vokietija), nuodžiūvis tirtas naudojant drėgmės matuoklį „Precisa HA 300“ (Dietikon, Šveicarija), ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje „Elma Elmasonic P“ (Singen, Vokietija). Bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis ir antioksidantinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą BECKMAN DU® -70 (California, JAV). Fitocheminė analizė atlikta atvirkščių fazių efektyviąja skysčių chromatografija. Naudotas chromatografas Waters 2695 Alliance su diodų matricos detektoriumi Waters 2998 (Milford, USA).

2.3. Duomenų statistinis įvertinimas

Duomenų statistinis įvertinimas atliktas programomis „MS Exel 2013“ (Microsoft, JAV) ir “SPSS 20” (IBM, JAV). Tiesinis regresijos modelis buvo panaudotas priklausomybės ryšiui tarp kintamųjų nustatyti. Koreliacinio ryšio stiprumas įvertintas Spirmeno koreliacijos koeficientu (R). Duomenų statistiniam įvertinimui apskaičiuotos sklaidos ir padėties aprašomosios statistikos charakteristikos. Hierarchinės klasterinės analizės metodas buvo panaudotas Euklidiniu atstumu paremtų dendrogramų sudarymui. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant dispersinę analizę (ANOVA). Atskirom grupėm įvertinti taikytas aposteriorinis Tukey kriterijus. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jei p<0,05.

2.4. Tyrimo metodai

Augalinės žaliavos ekstraktų paruošimas. Mažalapės liepos lapai ir žiedai džiovinti kambario temperatūroje, tamsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Sausa žaliava susmulkinama elektriniu smulkintuvu. Atsveriama 0,25 g (0,0001 g tikslumu) žaliavos, užpilama 25 ml 70% (v/v) etanoliu ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje kambario temperatūroje: žiedai – 15 min, lapai – 30 min. Ultragarso dažnis 37000 Hz. Ekstrakcijos parametrai – ekstrakcijos būdas, laikas, ekstrahentas ir ekstrahento koncentracija pasirinkti, atlikus ekstrakcijos sąlygų optimizavimą

(ekstrakcijos sąlygų parinkimas) ir atsižvelgus į gautus rezultatus. Gautas ekstraktas filtruojamas per vatą į tamsaus stiklo buteliukus. Prieš atliekant analizę ESC metodu, gauti ekstraktai dar kartą

filtruojami per 0,22 μm dydžio porų membraninius filtrus.

reagentas ruošiamas 10 kartų praskiedžiant motininį tirpalą distiliuotu vandeniu. Rezultatai įvertinami, naudojant galo rūgšties kalibracinę kreivę.

Tiriamieji tirpalai ruošiami: 0,4 ml ekstrakto sumaišoma su 2 ml darbinio Folin-Ciocalteu reagento ir su 1,6 ml 7,5% natrio karbonato tirpalu. Gautas mišinys laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 60 min. Po 60 min spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 765 nm bangos ilgiui. Kaip palyginimas tirpalas naudojamas tuščias mėginys. Jis ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis tirpalas, tačiau vietoje 0,4 ml skiesto ekstrakto pilama 0,4 ml 70% (v/v) etanolio.

Galo rūgšties kalibracinei kreivei gauti buvo ruošiami etaloniniai galo rūgšties tirpalai. Jie buvo ruošiami tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tik vietoje 0,4 ml ekstrakto pilami 0,4 ml 5-ių žinomų koncentracijų (0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,00625 mg/ml) galo rūgšties tirpalai.

Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui absoliučiai sausos žaliavos pagal kalibracinę kreivę. Apskaičiuojama pagal formulę:

𝐺𝐴𝐸 = 𝑐 ×_𝑚𝑉 (mg/g)

c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);

g – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).

Galo rūgšties kalibracinė kreivė pavaizduota 5 paveiksle.

5 Pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė

Bendras flavonoidų kiekio nustatymas. Bendras flavonoidų kiekis nustatomas aliuminio chlorido spektrofotometriniu metodu. Rezultatai įvertinami, naudojant kvercetino kalibracinę kreivę.

mišinys laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 30 min. Po 30 min pilama 0,4 ml 5% heksametilentetramino tirpalo ir kolbutės turinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu ik žymės, gerai sumaišoma. Matuojamas tirpalo absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu, esant 407 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml tiriamo

ekstrakto, 2 ml 96% (v/v) etanolio, 0,1 ml 30% acto rūgšties tirpalo ir kolbutės turinį praskiedus distiliuotu vandeniu iki žymės.

Kvercetino kalibracinei kreivei gauti buvo ruošiami etaloniniai galo rūgšties tirpalai. Jie buvo ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 0,2 ml tiriamo ekstrakto, pilami 0,2 ml 6-ių žinomų koncentracijų (0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,03125 mg/ml, 0,015625 mg/ml) kvercetino tirpalai.

Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais (QE) gramui absoliučiai sausos žaliavos pagal kalibracinę kreivę. Apskaičiuojama pagal formulę:

𝑄𝐸 = 𝑐 ×_𝑚𝑉 (mg/g)

c – kvercetino koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);

g – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g). Kalibracinė kreivė pavaizduota 6 paveiksle.

6 Pav. Kvercetino kalibracinė kreivė

distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų, esant 734 nm bangos ilgiui, palyginamuoju tirpalu naudojant distiliuotą vandenį.

Tiriamajam tirpalui gauti imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir pridedama 20 µl tiriamo ekstrakto. Mišinys laikomas tamsioje vietoje kambario temperatūroj 60 min. Po 60 min išmatuojamas mišinio absorbcijos pokytis, esant 734 nm bangos ilgiui.

Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) vienam gramui absoliučiai sausos žaliavos. TE apskaičiuojama pagal formulę:

𝑇𝐸_{𝐴𝐵𝑇𝑆} = 𝑐 ×_𝑚𝑉 (µmol/g)

c – trolokso koncentracija (µmol/L) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (L);

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).

Trolokso kalibracinė kreivė gaunama tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoj tiriamo ekstrakto pilami 20 µl 6-ių žinomų koncentracijų (800 µmol/L, 600 µmol/L, 400 µmol/L, 200 µmol/L, 100 µmol/L, 50 µmol/L) trolokso tirpalai. Trolokso kalibracinė kreivė

pavaizduota 7 paveiksle.

7 Pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS metodu

CuPRAC metodas redukcinio aktyvumo nustatymui. Darbinis CuPRAC reagentas ruošiamas sumaišant 1 M amonio acetato buferį, 7,5 mM neokuproino tirpalą ir 10 mM vario (II) chlorido tirpalą santykiu 1:1:1.

Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui absoliučiai sausos žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:

𝑇𝐸_{𝐶𝑈𝑃𝑅𝐴𝐶} = 𝑐 ×_𝑚𝑉 (µmol/g)

c – trolokso koncentracija (µmol/L) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (L);

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).

Trolokso kalibracinė kreivė gaunama tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoj tiriamo ekstrakto pilami 20 µl 6-ių žinomų koncentracijų (800 µmol/L, 600 µmol/L, 400 µmol/L, 200 µmol/L, 100 µmol/L, 50 µmol/L) trolokso tirpalai. Trolokso kalibracinė kreivė

pavaizduota 8 paveiksle.

8 Pav. Trolokso kalibracinė kreivė CuPRAC metodu

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Ekstrahento koncentracijos nustatymas. Augalinė žaliava ekstrahuojama vandeniu ir įvairios koncentracijos etanoliu, siekiant nustatyti optimalų ekstrahentą ir jo koncentraciją. Optimali ekstrahento koncentracija pasirinkta, įvertinus vandeniniame ir įvairios koncentracijos etanoliniuose ekstraktuose esantį bendrą fenolinių junginių kiekį Folin-Ciocalteu metodu. Lyginant gautus

rezultatus (9 pav.), nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis iš mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstrahuojasi veikiant augalinę žaliavą 70% (v/v) etanoliu (p<0,05). Todėl tolimesniems ekstraktams ruošti buvo naudojamas 70% (v/v) etanolis.

9 Pav. Ekstrahento koncentracijos nustatymas (n=3)

10 Pav. Mažalapių liepų lapų ekstrakcijos metodo ir trukmės nustatymas (n=3)

11 Pav. Mažalapių liepų žiedų ekstrakcijos metodo ir trukmės nustatymas (n=3)

3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas mažalapių liepų lapų ir

žiedų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu.

12 Pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas mažalapių liepų lapų ekstraktuose vegetacijos eigoje (gegužės – rugsėjo mėn.) (n=3).

13 Pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas mažalapių liepų žiedų ekstraktuose vegetacijos eigoje (liepos – rugpjūčio mėn.) (n=3).

Suminis fenolinių junginių kiekis 2014 metais nustatytas mažalapių liepų žieduose ir lapuose, surinktuose iš 6 skirtingų augimviečių Šiaulių apskrityje. Rezultatai pateikti 14 pav. Didžiausias (p<0,05) fenolinių junginių kiekis mažalapių liepų lapuose nustatytas Šiaulių raj., Kužių miške – 93,08 ± 3,24 mg/g, žieduose – 95,65 ± 2,94 mg/g Radviliškio raj., Lenartuvos kaime.

Vidutinės oro temperatūros ir kritulių kiekio skirtumai galėjo turėti įtakos sukauptų fenolinių junginių kiekiui. Reikšmingų vidutinės oro temperatūros ir kritulių kiekio skirtumų tarp skirtingų augimviečių nenustatyta, todėl fenolinių junginių kiekio įvairavimui įtakos galėjo turėti kiti veiksniai, pvz., dirvožemio sudėtis, augalo amžius, gaunamų tiesioginių saulės spindulių kiekis ir kiti veiksniai.

14 Pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas mažalapių liepų augalinėje žaliavoje, surinktoje Šiaulių regione (žiedai – liepos mėn., lapai – rugsėjo mėn.) (n=3)

15 Pav. Suminio fenolinių junginių kiekio mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrograma

Tyrimų su mažalapėmis liepomis Lietuvoje nėra atlikta. Užsienio mokslininkai yra atlikę tyrimų su įvairiomis liepų rūšimis. Pavyzdžiui, Argentinoje mokslininkams ištyrus Buenos Airių provincijoje augančių Tilia x viridis (tai sidabrinės ir amerikinės liepos hibridas) žiedų (surinktų 2011 m. sausio mėn.) etanolinius ekstraktus nustatytas 150 ± 10 mg/g suminis fenolinių junginių kiekis[33], o 2009 m. spalio mėn. taip pat Buenos Airėse rinktoje žiedų žaliavoje nustatyta – 30,0 mg/g fenolinių junginių[52]. Šiaurės Portugalijoje augančių mažalapių liepų etanoliniuose ekstraktuose nustatytas 28,74 ± 4,03 mg/g bendras fenolinių junginių kiekis[9]. Plačialapių liepų žiedų arbatoje (žaliava rinkta Ekvadore) nustatyta 48 ± 2 mg/g fenolinių junginių[53]. Sidabrinės liepos lapų vandeniniuose

ekstraktuose Turkijoje nustatytas 18,3 mg/g fenolinių junginių kiekis[54]. Iš šių pavyzdžių galime matyti, kad fenolinių junginių kiekis įvairuoja ne tik tarp skirtingų liepų rūšių, bet ir tarp tos pačios rūšies skirtingu laikotarpiu rinktos žaliavos.

3.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas mažalapių liepų lapų ir žiedų

ekstraktuose spektrofotometriniu metodu.

16 Pav. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas mažalapių liepų lapų ekstraktuose vegetacijos eigoje (gegužės – rugsėjo mėn.) (n=3)

17 Pav. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas mažalapių liepų žiedų ekstraktuose vegetacijos eigoje (liepos – rugpjūčio mėn.) (n=3)

18 paveiksle pavaizduoti rezultatai, ištyrus Šiaulių regione surinktus liepų lapų ir žiedų pavyzdžius. Didžiausias (p<0,05) flavonoidų kiekis nustatytas Šiaulių raj., Kužių miške augančių mažalapių liepų žieduose bei Kelmės raj., Aukštiškių kaime augančių liepų lapuose, atitinkamai 8,49 ± 0,41 mg/g ir 4,24 ± 0,10 mg/g.

flavonoidų, o 2014 m. fenolinių junginių kiekis. Įvertinus LHMT duomenis apie vidutinę oro temperatūrą ir kritulių kiekį, galima teigti, kad esant aukštesnei oro temperatūrai žaliava sukaupia didesnį (p<0,05) flavonoidų kiekį, o didesnis (p<0,05) fenolinių junginių kiekis sukaupiamas esant didesniam kritulių kiekiui.

18 Pav. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas mažalapių liepų augalinėje žaliavoje, surinktoje Šiaulių regione (žiedai – liepos mėn., lapai – rugsėjo mėn.) (n=3)

Euklidinio atstumo dendrograma. Sudaryta suminio flavonoidų kiekio mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrograma. Ji pavaizduota 19 paveiksle. Dendrogramoje matyti dvi pagrindinės grupės – pirmajai priklauso Radviliškio raj., Lenartuvos k., Kelmės raj., Aukštiškių k., Šiaulių raj., Kužių miške rinktos žiedų žaliavos, antrajai – Kelmės raj. Girkautų k., Radviliškio raj., Sklioriškių k. ir Burbiškio dvare rinktos žaliavos. Pirmajai grupei priklausančiose žaliavose nustatytas didžiausias suminis flavonoidų kiekis. Ši grupė padalyta į du pogrupius. Pirmajam pogrupiui priklauso Kužių miške rinkta žaliava, kurioje nustatytas didžiausias bendras flavonoidų kiekis. Antrajam – Lenartuvos ir Aukštiškių kaimuose rinktos žaliavos – jose bendras flavonoidų kiekis mažesnis, tačiau ne toks mažas, kad patektų į antrąją grupę. Antrajai grupei priklausančiose žaliavose nustatytas mažiausias suminis flavonoidų kiekis. Ši grupė taip pat padalyta į du pogrupius: pirmajam priklauso Burbiškio dvare rinkta žiedų žaliava, antrajam – Girkautų ir

Sklioriškių kaimuose rinkta žaliava. Antrajam pogrupiui priklausančiose žaliavose nustatytas

mažiausias suminis flavonoidų kiekis, o pirmajam pogrupiui priklausančioje žaliavoje nustatytas šiek tiek didesnis junginių kiekis, tačiau nepakankamas, kad patektų į pirmąją grupę.

kaupiančias augalines žaliavas. Skiriasi tik šių grupių pogrupių išsidėstymas. Į tą pačią grupę, daugausiai junginių sukaupusių augalinių žaliavų, patenka Radviliškio raj., Lenartuvos kaime esanti augimvietė. Į tą patį antrosios grupės pogrupį, mažiausiai junginių sukaupusių augalinių žaliavų, patenka Kelmės raj., Girkautų kaime esanti augimvietė. Kitos augimvietės tarp pogrupių

pasiskirsčiusios nevienodai.

19 Pav. Suminio flavonoidų kiekio mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrograma

Mokslininkai Kroatijoje atlikto tyrimo metu nustatė 19,166 mg/g flavonoidų liepų

(nenurodyta rūšis) žiedų arbatoje[55]. Sidabrinės liepos lapų vandeniniuose ekstraktuose Turkijoje nustatyta 5,4 mg/g flavonoidų[54]. Vengrijoje mokslininkai ištyrė plačialapės liepos lapus augančius saulės atokaitoje ir pavėsyje, gautas flavonoidų kiekis atitinkamai 21,5 ± 5,9 mg/g ir 5,1 ± 1,3 mg/g[16]. Argentinoje mokslininkams ištyrus Buenos Airių provincijoje augančių Tilia x viridis (tai sidabrinės ir amerikinės liepos hibridas) žiedų (surinktų 2011 m. sausio mėn.) etanolinius ekstraktus nustatytas 12,45 ± 1 mg/g flavonoidų kiekis[33], o 2009 m. spalio mėn. taip pat Buenos Airėse rinktoje žiedų žaliavoje nustatyta 2,49 mg/g flavonoidų[52]. Šiaurės Portugalijoje augančių mažalapių liepų žiedų etanoliniuose ekstraktuose nustatytas 22,01 ± 3,74 mg/g flavonoidų kiekis[9]. Flavonoidų kiekis, kaip ir fenolinių junginių kiekis, įvairuoja tarp skirtingų liepų rūšių, tarp skirtingose teritorijose

augančių liepų bei tarp tos pačios rūšies liepų žaliavos, surinktos skirtingu laikotarpiu.

3.4. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas mažalapių liepų lapų ir žiedų

ekstraktuose.

aktyvumo nustatymui. Rezultatai pateikti 20-23 paveiksluose. Nustatyta, kad 2014 tyrimo metais rinktos žaliavos pasižymėjo didesniu (p<0,05) antiradikaliniu ir redukciniu aktyvumu. Lapų

antioksidantinis aktyvumas maksimalias reikšmes pasiekia rugpjūčio pradžioje, kuomet fiksuojamas didžiausias fenolinių junginių kiekis (vidutinis antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas atitinkamai, 455,80 ± 14,97 µmol/g ir 760,05 ± 11,91µmol/g). Žiedų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas reikšmingai padidėja masinio žydėjimo pabaigoje, tuo metu nustatytas antiradikalinis aktyvumas 450,74 ± 17,75 µmol/g, redukcinis aktyvumas 789,28 ± 30,06 µmol/g.

20 Pav. Antiradikalinio aktyvumo (TE, µmol/g) įvairavimas mažalapių liepų lapų ekstraktuose vegetacijos eigoje (gegužės – rugsėjo mėn.) (n=3)

22 Pav. Antiradikalinio aktyvumo (TE, µmol/g) įvairavimas mažalapių liepų žiedų ekstraktuose vegetacijos eigoje (liepos – rugpjūčio mėn.) (n=3)

23 Pav. Redukcinio aktyvumo (TE, µmol/g) įvairavimas mažalapių liepų žiedų ekstraktuose, vegetacijos eigoje (liepos – rugpjūčio mėn.) (n=3)

Antioksidantinis aktyvumas nustatytas žaliavose, surinktose iš skirtingų Šiaulių apskrities vietų, pavaizduotas 24, 25 paveiksluose. Didžiausias (p<0,05) antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas Šiaulių raj., Kužių miške augančių liepų lapuose – atitinkamai 224,91 ± 1,61 µmol/g ir 726,15 ± 9,54 µmol/g. Šioje vietoje augančių liepų lapuose užfiksuotas ir didžiausias (p<0,05)

fenolinių junginių kiekis. Radviliškio raj., Lenartuvos kaime augančių liepų žieduose nustatytas ne tik didžiausias fenolinių junginių kiekis, bet ir didžiausias (p<0,05) antiradikalinis ir redukcinis

24 Pav. Antiradikalinio aktyvumo (TE, µmol/g) įvairavimas mažalapių liepų augalinėje žaliavoje, surinktoje Šiaulių regione (žiedai – liepos mėn., lapai – rugsėjo mėn.) (n=3)

25 Pav. Redukcinio aktyvumo (TE, µmol/g) įvairavimas mažalapių liepų augalinėje žaliavoje, surinktoje Šiaulių regione (žiedai – liepos mėn., lapai – rugsėjo mėn.) (n=3)

Euklidinio atstumo dendrograma. Sudarytos antioksidantinio aktyvumo mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrogramos. 26 paveiksle

pavaizduota antiradikalinio aktyvumo pasiskirstymo pagal augimvietes dendrograma. Pirmajai grupei priklauso Radviliškio raj., Lenartuvos kaime rinkta žiedų žaliava, joje nustatytas didžiausias

26 Pav. Antiradikalinio aktyvumo mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrograma

27 paveiksle pavaizduota redukcinio aktyvumo pasiskirstymo pagal augimvietes

dendrograma. Pirmajai grupei priklauso Radviliškio raj., Lenartuvos k. ir Burbiškio dvare bei Šiaulių raj., Kužių miške rinktos liepų žiedų žaliavos, antrajai – Radviliškio raj., Sklioriškių k., Kelmės raj., Aukštiškių ir Girkautų kaimuose rinktos žaliavos. Pirmajai grupei priklausančiose žaliavose nustatytas didžiausias redukcinis aktyvumas. Ši grupė padalinta į du pogrupius: pirmajam priklausančiose

žaliavose nustatytas didžiausias redukcinis aktyvumas – Lenartuvos kaime ir Burbiškio dvare rinktos žaliavos; antrajam priklausančioje žaliavoje, rinktoje Kužių miške, nustatytas mažesnis redukcinis aktyvumas, tačiau nepakankamai mažas, jog žaliava patektų į antrą grupę. Antrajai grupei

27 Pav. Redukcinio aktyvumo mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrograma

Mokslininkų atlikti tyrimai su įvairių liepų rūšių augaline žaliava parodė, kad liepų

antioksidantinis aktyvumas įvairuoja tarp skirtingų liepų rūšių, skirtingose regionuose augančių tos pačios rūšies liepų ir priklauso nuo daugelio aplinkos veiksnių. Pavyzdžiui, Kroatijoje mokslininkai ištyrė parduotuvėje įsigytos liepų (nenurodyta rūšis) arbatos antiradikalinį aktyvumą ABTS metodu ir nustatė 580 ± 20 µmol/g aktyvumą[55]. Turkijoje ištyrus sidabrinės liepos žiedų etanolinių ekstraktų redukcinį aktyvumą CuPRAC metodu nustatytas 618 ± 16 µmol/g antioksidantinis aktyvumas[56]. Mažalapių liepų, surinktų Krokuvoje, Lenkijoje, žiedų vandeniniuose ekstraktuose nustatytas 812,5 ± 32,2 µmol/g antiradikalinis aktyvumas ABTS metodu, o metanoliniuose – 493 ± 16,4 µmol/g[57]. Vengrijoje mokslininkai ištyrė plačialapės liepos lapų augančių saulės atokaitoje ir pavėsyje antioksidantinį aktyvumą, pavėsyje nustatytas tik 98,3 ± 4,2 µmol/g singletinį deguonį surišantis aktyvumas, o saulės atokaitoje – 437,6 ± 32,8 µmol/g aktyvumas[16]. Tyrimas buvo atliktas su mažalapių liepų žiedų arbatomis, įsigytomis Turkijoje, įvertintas šių arbatų antiradikalinis aktyvumas ABTS metodu ir redukcinis aktyvumas CuPRAC metodu, gauti rezultatai atitinkamai 110 µmol/g ir 180 µmol/g[50].

3.5. Suminio fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių koreliacinių ryšių

įvertinimas su antioksidantiniu aktyvumu mažalapių liepų žiedų ir lapų

ekstraktuose

Koreliacijos ryšio stiprumui įvertinti pasirinktas Spirmeno koreliacijos koeficientas.

(0,818 – 0,999) koreliacijos ryšys tarp suminio fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo mažalapių liepų augalinėje žaliavoje. Stiprus (0,900) koreliacijos ryšys nustatytas ir tarp mažalapių liepų žieduose esančio suminio flavonoidų kiekio bei antioksidantinio aktyvumo, tačiau statistiškai patikimas koreliacijos ryšys tarp liepų lapuose esančio bendro flavonoidų kiekio ir antioksidantinio aktyvumo nenustatytas (0,030-0,200). Apibendrinus, galima teigti, kad antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo suminio fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje – didėjant fenolinių junginių kiekiui, didėja antioksidantinis aktyvumas.

2 Lentelė. Mažalapių liepų lapų ekstraktuose 2013 tyrimo metais nustatytų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio (mg/g) ir antioksidantinio aktyvumo (TE, μmol/g) koreliacijos koeficientai

TE, μmol/g Suminis fenolinių junginių kiekis

(mg/g)

Suminis flavonoidų kiekis (mg/g)

ABTS 0,818 0,200

CuPRAC 0,964 0,030

3 Lentelė. Mažalapių liepų lapų ekstraktuose 2014 tyrimo metais nustatytų fenolinių junginių ir

flavonoidų kiekio (mg/g) ir antioksidantinio aktyvumo (TEAC, μmol/g) koreliacijos koeficientai TE, μmol/g Suminis fenolinių junginių

kiekis (mg/g)

Suminis flavonoidų kiekis (mg/g)

ABTS 0,891 0,182

CuPRAC 0,982 0,155

4 Lentelė. Mažalapių liepų žiedų ekstraktuose 2014 tyrimo metais nustatytų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio (mg/g) ir antioksidantinio aktyvumo (TEAC, μmol/g) koreliacijos koeficientai

TEAC, μmol/g Suminis fenolinių junginių kiekis

(mg/g)

Suminis flavonoidų kiekis (mg/g)

ABTS 0,999 0,900

CuPRAC 0,999 0,900

3.6. Fenolinių junginių nustatymas mažalapių liepų augalinėje žaliavoje ESC

metodu

Atlikus ESC analizę mažalapių liepų žiedų ir lapų ekstraktuose nustatytos fenolinės rūgštys (galo rūgštis ir protokatecho rūgštis), katechinai ((+)-katechinas ir (–)-epikatechinas), kvercetino glikozidai (rutinas, izokvercitrinas, hiperozidas, kvercetin-3-O-malonil-gliukozidas), flavonolis kempferolis ir jo glikozidai astragalinas bei tilirozidas. Mažalapių liepų žiedų ekstraktų

chromatogramos pateiktos 28 paveiksle.

Visų nustatytų junginių kiekis įvairavo viso vegetacijos periodo metu, tačiau galima išskirti žaliavas, kuriose atitinkamų junginių buvo sukaupta daugiausiai. Fenolinių rūgščių – galo ir

protokatecho rūgščių didžiausias kiekis aptiktas 2013 metais surinktoje liepų žiedų žaliavoje,

atitinkamai 0,041 mg/g ir 1,02 mg/g. Liepų lapai lapų skleidimosi periode sukaupia didžiausią bendrą flavonoidų kiekį, šiuo laikotarpiu taip pat nustatytas didžiausias kiekis flavonoido katechino: 2013 m. – 7,99 mg/g, 2014 m. – 12,39 mg/g. O kvercetino glikozido – rutino didžiausi kiekiai buvo užfiksuoti vegetacijos periodo pabaigoje, lapams pageltus. Daugiausiai rutino nustatyta Radviliškio raj.,

Aukštiškių kaime surinktoje liepų lapų žaliavoje – 3,04 mg/g. Šiame kaime surinktoje liepų žiedų žaliavoje užfiksuotas didžiausias kiekis kito kvercetino glikozido – izokvercitrino (0,432 mg/g). Įdomu tai, kad kito katechinų grupės atstovo – (-)-epikatechino didesni kiekiai buvo nustatyti ne lapuose, o žieduose, masinio žydėjimo pabaigoje, bei didžiausias kiekis (8,85 mg/g) aptiktas Radviliškio raj, Burbiškio dvare augančių liepų žiedų žaliavoje. 2013 metais vegetacijos laikotarpio pabaigoje liepų lapuose nustatytas didžiausias kempferolio kiekis – 0,036 mg/g. Kitų junginių didžiausi kiekiai buvo užfiksuoti liepų žiedų augalinėje žaliavoje – 1,75 mg/g astragalino Kelmės raj., Girkautų kaime rinktoje žaliavoje, 0,457 mg/g hiperozido masinio žydėjimo pabaigoje 2014 metais rinktoje žaliavoje, 1,07 mg/g kvercetin-3-O-malonil-gliukozido 2014 metais surinktuose žiedų butonuose ir Šiaulių raj., Kužių miške rinktoje žaliavoje, 0,573 mg/g tilirozido Radviliškio raj., Burbiškio dvare rinktoje žaliavoje.

Bendras didžiausias šių junginių kiekis nustatytas 2014 m. lapų skleidimosi tarpsnyje lapuose – 17,60 mg/g bei Radviliškio raj., Burbiškio dvare augančių mažalapių liepų žieduose – 14,47 mg/g.

Identifikuotų junginių kiekis vegetacijos metu visais tyrimo metais kito nevienodai, pvz., tilirozido kiekis visais tyrimo metais nuo vegetacijos pradžios iki birželio mėn. pradžios mažėjo ir birželio pradžioje pasiekė mažiausią reikšmę, tolesnis kitimas tarp tyrimo metų nesutapo: 2013 metais nuo birželio pradžios tilirozido kiekis didėjo iki liepos mėn. pradžios, liepos pabaigoje sumažėjo bei vėl padidėjo rugpjūčio viduryje, kai pasiekė didžiausią reikšmę, vėliau tilirozido kiekis mažėjo; 2014 metais tilirozido kiekis didėjo tik iki birželio pabaigos, nuo tada mažėjo iki rugpjūčio pradžios, rugpjūčio pradžioje ėmė didėti ir didžiausią reikšmę pasiekė rugsėjo pradžioje, vėliau tilirozido kiekis mažėjo. Bendro nustatyto šių junginių kiekio įvairavimas mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose vegetacijos periodo metu pavaizduotas 29 ir 30 paveiksluose. Didžiausias identifikuotų junginių kiekis 2014 metais nustatytas vegetacijos pradžioje lapuose ir butonizacijos fazėje žiedų butonuose

29 Pav. ESC metodu identifikuotų junginių bendro kiekio įvairavimas mažalapių liepų lapų ekstraktuose, vegetacijos eigoje (gegužės – rugsėjo mėn.)

30 Pav. ESC metodu identifikuotų junginių bendro kiekio įvairavimas mažalapių liepų žiedų ekstraktuose, vegetacijos eigoje (liepos – rugpjūčio mėn.)

Koreliacijos ryšio stiprumui nustatyti tarp antioksidantinio aktyvumo ir identifikuotų junginių kiekio pasirinktas Spirmeno koreliacijos koeficientas. Nustatytas stiprus (0,709-0,736) koreliacijos ryšys tarp mažalapių liepų lapų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo ir hiperozido. Tarp mažalapių liepų lapų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo ir kitų identifikuotų junginių nustatytas silpnas koreliacijos ryšys. Stiprus (0,800-0,900) koreliacijos ryšys nustatytas tarp liepų žiedų ekstraktų

antioksidantinio aktyvumo ir (+)-katechino bei kvercetin-3-O-malonil-gliukozido. Silpnas koreliacijos ryšys nustatytas tarp liepų žiedų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo ir kitų identifikuotų junginių.

5 Lentelė. Mažalapių liepų lapų ir žiedų kokybinė ir kiekybinė sudėtis masinio žydėjimo pabaigoje Kiekis, mg/g Protokate-cho rūgštis (+)- Kate-chinas (–)- Epikate-chinas Ruti-nas Astraga-linas Izokver-citrinas Hipero-zidas Kvercetin-3- O-malonil-gliukozidas Tiliro-zidas Lapai 0,32 1,82 2,85 0,30 0,14 0,30 0,33 0,32 0,32 Žiedai 0,24 1,44 3,61 1,24 0,49 0,29 0,46 0,82 0,31

Euklidinio atstumo dendrograma. Pritaikius klasterinę analizę, nubraižytos dendrogramos, parodančios identifikuotų junginių pasiskirstymą mažalapių liepų lapų ir žiedų ekstraktuose pagal augimvietes. 31 paveiksle pavaizduota identifikuotų junginių liepų lapuose pasiskirstymo pagal augimvietes dendrograma. Pirmajai grupei priklauso Kelmės raj., Aukštiškių k. rinkta žaliava – joje nustatyti didžiausi kiekiai (+)-katechino, rutino, izokvercitrino, kempferolio, tilirozido. Antrajai grupei priklauso likusiose augimvietėse surinkti mažalapių liepų lapai. Antroji grupė padalinta į du pogrupius. Pirmajam pogrupiui priklauso Radviliškio raj., Sklioriškių k. ir Šiaulių raj., Kužių miške rinktos

žaliavos – jose nustatyti mažiausi kiekiai protokatecho rūgšties, (-)-epikatechino, Sklioriškių kaime nustatyti mažiausi kiekiai astragalino, hiperozido ir kvercetin-3-O-malonil-gliukozido, Kužių miške mažiausiai kempferolio. Antrajam pogrupiui priklauso žaliavos rinktos Radviliškio raj., Lenartuvos kaime bei Burbiškio dvare ir Kelmės raj., Girkautų kaime. Kelmės raj., Girkautų kaime rinktuose lapuose nustatyti mažiausi kiekiai izokvercitrino, kempferolio, kvercetin-3-O-malonil-gliukozido, Radviliškio raj., Lenartuvos kaime nustatyta mažiausiai tilirozido, Burbiškio dvare – hiperozido.

32 paveiksle pavaizduota identifikuotų junginių liepų žieduose pasiskirstymo pagal

augimvietes dendrograma. Pirmajai grupei priklauso Radviliškio raj., Lenartuvos k., Burbiškio dvare, Kelmės raj., Aukštiškių k., Girkautų k. rinkti mažalapių liepų žiedai. Ji padalinta į du pogrupius: pirmajam priklauso Radviliškio raj., Burbiškio dvare rinkta žaliava; antrajam – Radviliškio raj., Lenartuvos k., Kelmės raj., Aukštiškių bei Girkautų kaimuose rinkta žaliava. Pirmajam pogrupiui priklausančioje žiedų žaliavoje nustatyti didžiausi kiekiai (+)-katechino, (-)-epikatechino ir tilirozido. Antrajam pogrupiui priklausančioje žaliavoje, rinktoje Radviliškio raj., Lenartuvos k., nustatytas didžiausias rutino kiekis, Kelmės raj., Girkautų k. rinktoje žaliavoje didžiausi kiekiai protokatecho rūgšties ir astragalino, Aukštiškių k. – izokvercitrino ir hiperozido. Antrajai grupei priklausančioje žiedų žaliavoje nustatyti mažiausi kiekiai (+)-katechino, (-)-epikatechino, Radviliškio raj., Sklioriškių kaime rinktuose žieduose mažiausiai astragalino ir kvercetin-3-O-malonil-gliukozido.

Radviliškio raj., Sklioriškių kaime ir Šiaulių raj., Kužių miške rinktuose mažalapių liepų lapuose ir žieduose nustatyti mažiausiai kiekiai (-)-epikatechino, astragalino ir kvercetin-3-O-malonil-gliukozido. Kitų identifikuotų junginių kiekis tose pačiose augimvietėse įvairiai pasiskirstęs liepų lapuose ir žieduose.

32 Pav. ESC metodu identifikuotų junginių mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrograma

mažiausias; antrajam pogrupiui priklauso likusios augimvietės – jose junginio kiekis didesnis, tačiau nepakankamas, kad augimvietės patektų į pirmąją grupę. Įdomu tai, kad Kužių miške surinktuose žieduose nustatytas didžiausias suminis flavonoidų kiekis, tačiau (-)-epikatechino šioje žaliavoje sukaupta mažiausiai.

33 Pav. (-)-Epikatechino kiekio mažalapių liepų žieduose pasiskirstymo pagal augimvietes klasterinės analizės dendrograma

lapuose identifikuoti junginiai – galo (0,31 mg/g), protokatecho (1,71 mg/g), p-hidroksibenzoinė (0,02 mg/g), chlorogeno (0,34 mg/g), ferulinė (0,06 mg/g), kavos (0,05 mg/g) rūgštys, (+)-katechinas (0,35 mg/g), rutinas (0,07 mg/g), kvercetinas (0,01 mg/g), žieduose – galo (0,35 mg/g), protokatecho (1,37 mg/g), p-hidroksibenzoinė (0,09 mg/g), chlorogeno (0,01 mg/g), p-kumaro (0,02 mg/g)), ferulinė (0,09 mg/g) rūgštys, (+)-katechinas (0,35 mg/g), kvercetinas (0,13 mg/g)[60]. Italijoje ištirta komercinė mažalapių liepų žiedų žaliava. Joje nustatyti pagrindiniai junginiai – kvercetin-3-O-gliukozidas (0,38 ± 0,01 mg/g), kempferol-3-O-gliukozidas (0,16 ± 0,01 mg/g), kvercetin-3-O-ramnozidas (0,24 ± 0,01 mg/g), rutinas (1,04 ± 0,01 mg/g), (+)-katechinas (0,53 ± 0,01 mg/g), (-)-epikatechinas (1,54 ± 0,01 mg/g), tilirozidas (0,26 ± 0,01 mg/g)[61]. O Brazilijoje atliktas tyrimas su mažalapių liepų lapais, identifikuoti junginiai – kvercetin-3-O-ramnozido-7-O-gliukozidas, kvercetin-3,7-diramnozidas, kvercetin-3-O-gliukozidas, kempferol-3,7-diramnozidas, kvercitrinas, kempferol-3-O-ramnozidas, tilirozidas[62]. Apibendrinus, galima teigti, kad fenoliniai junginiai įvairiai pasiskirstę tarp skirtingų liepų rūšių, tačiau praktiškai visose liepų augalinėse žaliavose aptinkami junginiai yra kvercitrinas, tilirozidas, rutinas.

3.7. Tyrimo rezultatų aptarimas

Tyrimui naudota augalinė žaliava buvo surinkta 2013 ir 2014 metais iš natūraliai augančių mažalapių liepų augimviečių. Visais tyrimo metais liepų lapai ir žiedai rinkti viso vegetacijos periodo metu, pradedant lapų skleidimųsi ir baigiant lapų pageltimu. 2014 metais mažalapės liepos lapus pradėjo skleisti anksčiau, todėl žaliava pradėta rinkti savaite anksčiau lyginant su 2013 m. Taip atsitiko dėl vidutinės oro temperatūros skirtumų. Lietuvos hidrometeorologijos tarnybos prie Aplinkos

ministerijos (LHMT) duomenimis 2013 m. vidutinė balandžio mėn. oro temperatūra buvo 5,7 ºC, o 2014 m. – 8,4 ºC, t.y. 2,7 ºC aukštesnė.

didesnė nei 2014 m., todėl 2013 m. liepų žiedai masiškai pražydo liepos 7 d., kai 2014 m. masinis žydėjimas prasidėjo tik liepos 17 d.

Didžiausias (p<0,05) flavonoidų kiekis lapuose nustatytas lapų skleidimosi tarpsnyje gegužės pradžioje – 3,68 ± 0,12 mg/g (2013 m.) ir 3,37 ± 0,15 mg/g (2014 m.); žieduose butonizacijos fazėje liepos pradžioje – 6,93 ± 0,34 mg/g. Ir skirtingai nei fenolinių junginių, flavonoidų kiekis mažalapių liepų lapuose 2014 tyrimo metais buvo mažesnis nei 2013-aisiais. Flavonoidų kiekiui didesnę reikšmę turi ne drėgmės kiekis, o oro temperatūra.

Mažalapių liepų lapų antioksidantinis aktyvumas maksimalias reikšmes pasiekia rugpjūčio pradžioje, kuomet fiksuojamas didžiausias fenolinių junginių kiekis (vidutinis antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas atitinkamai, 455,80 ± 14,97 µmol/g ir 760,05 ± 11,91µmol/g). Žiedų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas reikšmingai padidėja masinio žydėjimo pabaigoje, tuo metu nustatytas antiradikalinis aktyvumas 450,74 ± 17,75 µmol/g, redukcinis aktyvumas 789,28 ± 30,06 µmol/g. Nustatytas stiprus koreliacijos ryšys tarp bendro fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo. Todėl galima teigti, kad antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo suminio fenolinių junginių kiekio

augalinėje žaliavoje – didėjant fenolinių junginių kiekiui, didėja antioksidantinis aktyvumas. Suminis fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis 2014 metais taip pat nustatytas mažalapių liepų žieduose ir lapuose, surinktuose iš 5 skirtingų augimviečių Šiaulių apskrityje. Didžiausias

(p<0,05) fenolinių junginių kiekis mažalapių liepų lapuose nustatytas Šiaulių raj., Kužių miške – 93,08 ± 3,24 mg/g, žieduose – 95,65 ± 2,94 mg/g Radviliškio raj., Lenartuvos kaime. Didžiausias (p<0,05) flavonoidų kiekis nustatytas Šiaulių raj., Kužių miške augančių mažalapių liepų žieduose bei Kelmės raj., Aukštiškių kaime augančių liepų lapuose, atitinkamai 8,49 ± 0,41 mg/g ir 4,24 ± 0,10 mg/g. Nagrinėjant vidutinės oro temperatūros ir kritulių kiekio duomenis šiose vietovėse reikšmingų skirtumų nepastebėta, todėl galima teigti, jog užfiksuotas skirtingas junginių kiekis šiose vietovėse priklauso nuo kitų veiksnių, pvz., dirvožemio, augalo amžiaus, gaunamų tiesioginių saulės spindulių kiekio ir pan.

Atlikus ESC analizę mažalapių liepų žiedų ir lapų ekstraktuose nustatytos fenolinės rūgštys (galo rūgštis ir protokatecho rūgštis), katechinai ((+)-katechinas ir (–)-epikatechinas), kvercetino glikozidai (rutinas, izokvercitrinas, hiperozidas, kvercetin-3-O-malonil-gliukozidas), flavonolis kempferolis ir jo glikozidai astragalinas bei tilirozidas. Bendras didžiausias šių junginių kiekis nustatytas 2014 m. lapų skleidimosi tarpsnyje lapuose – 17,60 mg/g bei Radviliškio raj., Burbiškio dvare augančių mažalapių liepų žieduose – 14,47 mg/g. Masinio žydėjimo pabaigoje mažalapių liepų lapai ir žiedai daugiausiai (p<0,05) kaupia (-)-epikatechino – lapuose 2,85 mg/g, žieduose 3,61 mg/g. Įvertinus koreliacijos ryšio stiprumą, nustatytas stiprus (0,736-0,900) koreliacijos ryšys tarp mažalapių liepų lapų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo ir hiperozido bei tarp liepų žiedų ekstraktų