PAPRASTŲJŲ KAŠTONŲ (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.) ŽIEDŲ, LAPŲ IR VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES TYRIMAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

GIEDRĖ BIČIULAITIENĖ

PAPRASTŲJŲ KAŠTONŲ (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)

ŽIEDŲ, LAPŲ IR VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR

KIEKYBINĖS SUDĖTIES TYRIMAS

Darbo vadovė

dr. Kristina Gaivelytė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

PAPRASTŲJŲ KAŠTONŲ (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)

ŽIEDŲ, LAPŲ IR VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR

KIEKYBINĖS SUDĖTIES TYRIMAS

Darbo vadovė: dr. Kristina Gaivelytė Recenzentas Darbą atliko:

Magistrantė Giedrė Bičiulaitienė

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 5

SANTRUMPOS ... 6

ĮVADAS ... 7

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Paprastųjų kaštonų paplitimas ir morfologija ... 10

1.2. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų cheminės sudėties tyrimai ... 11

1.3. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų biologinių poveikių tyrimai ... 14

2. TYRIMO METODIKA ... 17

2.1. Tyrimo objektas ... 17

2.2. Tyrime naudoti reagentai ... 17

2.3. Tyrime naudota aparatūra ... 17

2.4. Tyrimų metodai ... 18

2.4.1. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ėminių paruošimas fenolinių junginių sudėties tyrimui atlikti ... 18

2.4.2. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų paruošimo metodika ... 18

2.4.4. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas taikant Folin – Ciocalteu reagentą ... 19

2.4.5. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas naudojant metodą su aliuminio chloridu ... 19

2.4.6. Antiradikalinio aktyvumo tyrimas naudojant ABTS metodą ... 20

2.4.7. Antiradikalinio aktyvumo tyrimas naudojant DPPH metodą ... 21

2.4.8. Redukcinio aktyvumo tyrimas naudojant FRAP metodą ... 21

2.4.9. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika flavonoidų glikozidų sudėties tyrimui .. 22

2.4.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika flavonoidų aglikonų sudėties tyrimui . 22 2. 5. Duomenų analizės metodai. ... 23

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24

3.1. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstrakcijos salygų parinkimas ... 24

3.2. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų flavonoidų sudėties tyrimas ... 28

3.3. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimai ... 36

4. IŠVADOS ... 40

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41

SANTRAUKA

G. Bičiulaitienės magistro baigiamasis darbas „Paprastųjų kaštonų (Aesculus hippocastanum L.) žiedų, lapų ir vaisių fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės sudėties tyrimas“/ mokslinė vadovė dr. Kristina Gaivelytė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: A. hippocastanum L., Paprastasis kaštonas, fenoliniai junginiai,

antioksidacinis aktyvumas, spektrofotometrija.

Darbo tikslas: ištirti paprastųjų kaštonų (lot. Aesculus hippocastanum L.) lapų, žiedų bei

vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą bei nustatyti antioksidantinį aktyvumą. Darbo uždaviniai: parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas, užtikrinančias didžiausią fenolinių junginių kiekį Aesculus hippocastanum L. lapų, žiedų ir vaisių augalinių žaliavų ekstraktuose; nustatyti bendrą flavonoidų kiekį paprastųjų kaštonų lapų, žiedų ir vaisių augalinėse žaliavose; nustatyti flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį ir jų įvairavimą Aesculus hippocastanum L. lapuose, žieduose ir vaisiuose; įvertinti paprastųjų kaštonų lapų, žiedų ir vaisių augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą. Tyrimo objektas: paprastųjų kaštonų žiedai, vaisiai ir lapai.

Tyrimo metodai: Bendras fenolinių junginių ir bendras flavonoidų kiekis nustatytas naudojant

spektrofotometrinius metodus. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta kiekybinė ir kokybinė fenolinių junginių sudėtis. Antioksidacinis tyrimas atliktas spektrofotometriniu metodu, naudojant ABTS, FRAP, DPPH reagentus.

Išvados: Daugiausia fenolinių junginių išekstrahuojama lapų augalinės žaliavos ekstrakciją

vykdant 60 min ekstrahentu naudojant 60 proc. (v/v) etanolį, žiedų augalinės žaliavos – 40 min ekstrahentu naudojant 50 proc. (v/v) etanolį, vaisių augalinės žaliavos – 20 min esktrahentu naudojant 40 proc. (v/v) etanolį. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis (p<0,05) yra žieduose ir lapuose (atitinkamai, 16,23 ± 0,23 mg/g ir 16,02 ± 0,23 mg/g). ESC metodu Aesculus hippocastanum L. lapuose, žieduose ir vaisiuose identifikuoti 6 junginiai: rutinas, hiperozidas, izokvercetinas, avikularinas, astragalinas ir kvercitinas. Rutino daugiausiai nustatyta paprastųjų kaštonų vaisiuose (0,543 ± 0,40 mg/g). Paprastųjų kaštonų lapuose nustatytas didžiausias kiekis hiperozido (0,204 ± 0,009 mg/g), izokvercitrino (0,172 ± 0,007 mg/g), avikularino (1,508 ± 0,07 mg/g) ir kvercitrino (8,514 ± 0,40 mg/g). Astragalino didžiausias kiekis nustatytas Aesculus hippocastanum L. žieduose (12,564 ± 0,53 mg/g). Stipriausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi Aesculus hippocastanum L. žiedų (294,68 ± 2,13 µmol TEABTS/g) ir lapų (293,93 ± 0,85 µmol TEABTS/g) ekstraktai (p<0,05). Didžiausiu

redukciniu aktyvumu pasižymi Aesculus hippocastanum L. vaisių ekstraktai (492,84 ± 5,69 µmol TEFRAP/g).

SUMMARY

G.Bičiulaitienė master‘s thesis „The conventional chestnut flowers, leaves and seeds of phenolic compounds in quantitative and qualitative composition of research“/ research supervisor dr. Kristina Gaivelytė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. - Kaunas.

Key words: A. hippocastanum L., Horse chestnut, phenolic compounds, antioxidant activity,

spectrophotometry, HPLC.

The aim: to investigate ordinary chestnut (lat. Aesculus hippocastanum L.) leaves, flowers

and seeds of phenolic compounds qualitative and quantitative composition of variation and to determine antioxidant activity. The goals: to select the optimum extraction conditions to ensure the highest phenolic compounds Aesculus hippocastanum L. leaves, flowers and seeds of plant extracts raw materials; a common flavonoid ordinary chestnut leaves, flowers and seeds materials; determine the flavonoid qualitative and quantitative composition and variation Aesculus hippocastanum L. leaves, flowers and seeds; assess the ordinary chestnut leaves, flowers and seeds of vegetable raw extracts antioxidant activity. Object: horse chestnut flowers, seeds and leaves. Research methods: The total phenolic compounds and total flavonoids content as determined using spectrophotometric methods. High performance liquid chromatography of the quantitative and qualitative composition of phenolic compounds. Antioxidant research was carried out by spectrophotometry using ABTS, FRAP, DPPH reagents.

Conclusions: Most of phenolic compounds extracted left in Aesculus hippocastanum L.

leaves using an extraction in 60 minutes, using an extraction solvent 60 % (v / v) ethanol, flowers - 40 min using an extraction solvent 50 % (v / v) ethanol, the seeds of plant - 20 min using estraction solvent 40 % (v / v) ethanol. The maximum total amount of flavonoids (p <0.05) are in flowers and leaves (respectively, 16.23 ± 0.23 mg / g and 16.02 ± 0.23 mg / g). ESC method in Aesculus

hippocastanum L. leaves, flowers, and seeds was identifyied 6 compounds: rutin, hyperoside,

isoquercetin, avicularin, astragalin and quercitin. Rutin is mostly found common chestnut seeds (0,543 ± 0.40 mg / g). The conventional chestnut leaves a maximum amount of hyperoside (0.204 ± 0.009 mg / g ) isoquercitrin (0.172 ± 0.007 mg / g), avicularin (1,508 ± 0.07 mg / g) and quercitrin (8.514 ± 0.40 mg / g). Astragalin maximum level set i Aesculus hippocastanum L. flowers (12.564 ± 0, 53 mg / g). The strongest antioxidant activity has Aesculus hippocastanum L. flowers (294.68 ± 2.13 μmol TEABTS

/ g) and leaves (293.93 ± 0.85 μmol TEABTS / g) extracts (p <0.05 ). The highest reduction activity has Aesculus hippocastanum L. seeds extracts (492.84 ± 5.69 μmol TEFRAP / g).

SANTRUMPOS

ABTS –2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) DPPH – 2,2 – difenil–1–pikrilhidrazilas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FRAP – trivalentės geležies jonų redukcinė galia GRE – galo rūgšties ekvivalentai

HCSE – paprastojo kaštono sėklų ekstraktas (angl. Horse chestnut seed extract) PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

R2 – regresijos koeficientas TE – trolokso ekvivalentai

ĮVADAS

PSO duomenimis augalinės kilmės vaistiniai preparatai užima apie 40 proc. visų pagaminamų vaistų rinkos. [2]. Nustatyta, kad medicinoje vartojama 35 – 70 tūkstančių augalų rūšių. Pacientai dažnai renkasi augalinės kilmės vaistinius preparatus bei maisto papildus, nes augaliniai preparatai vertinami kur kas labiau teigiamai, nei sintetinės kilmės preparatai.

Paprastųjų kaštonų (Aesculus hippocastanum L.) augalinės žaliavos ir iš jų pagaminti preparatai yra plačiai naudojami medicinoje. Jau nuo senų laikų žmonės naudoja paprastųjų kaštonų preparatus gydant venų lėtines ligas, kurios pasireiškia atsiradusiu sunkumu kojose, sunkumo jausmu, iššokusiomis venomis. Paprastųjų kaštonų vaistinės augalinės žaliavos preparatai vartojami gydant blauzdų skausmą, hemorojų. Aesculus hippocastanum L. augalinių žaliavų preparatai taip pat gali būti naudojami gydant sąnarinius skausmus, tulžies pūslės susirgimus, sergant žarnyno uždegimais.

Aesculus hippocastanum L. lapai kai kuriose šalyse naudojami kosuliui gydyti, taip pat vartojami

gydant tuberkuliozę bei podagrą. Įvairiose šalyse (pvz. JAV), paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktai vartojami gydant pooperacines edemas [50;18].

Aesculus hippocastanum L. augalinėse žaliavose nustatyti dideli kiekiai saponinų. Saponinai

lemia paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų biologinį poveikį. Mokslinių tyrimų duomenimis paprastųjų kaštonų ekstraktų poveikį lemia ir kiti biologiškai aktyvūs junginiai. Atlikta paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų cheminės sudėties tyrimų, kurių metu paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktuose nustatyta fenolinių junginių. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad fenoliniai junginiai gali būti vartojami ligų gydymui ir profilaktikai. Fenoliniai junginiai pasižymi dideliu antioksidantiniu aktyvumu, todėl gali apsaugoti organizmą nuo įvairių lėtinių ligų atsiradimo. Visiškai išvengti laisvųjų radikalų poveikio yra neįmanoma, tačiau stiprinant organizmo antioksidantinę sistemą natūraliais antioksidantais, galima smarkiai sumažinti jų neigiamą poveikį organizmui [9;14;56;72]. Fenoliniai junginiai – svarbūs paprastųjų kaštonų ekstraktų poveikį lemiantys biologiškai aktyvūs junginiai, todėl svarbu nustatyti paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

Biologinį augalinių žaliavų ekstraktų poveikį lemia jose esančių biologiškai aktyvių junginių kompleksas. Skirtinga biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali lemti skirtingą biologinį poveikį. Augalinių žaliavų cheminei sudėčiai įtakos gali turėti genetiniai ir aplinkos (pavyzdžiui, temperatūriniai pokyčiai, augavietė, oro tarša, augalinių žaliavų rinkimo, apdorojimo ir laikymo sąlygos ir kt.) veiksniai. Biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali smarkiai skirtis ir to paties vaistinio augalo organuose. Svarbu nustatyti, kuriame vaistinio augalo organe kaupiasi didžiausias kiekis biologiškai aktyvių junginių, kokia yra augalinių žaliavų biologiškai aktyvių junginių kokybinė sudėtis. Mokslinių tyrimų, kurių metu būtų tirta paprastųjų kaštonų

augalinių žaliavų fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis, trūksta. Tyrimo metu nustačius, A.

hippocastanum L. fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, būtų galima spręsti, kuriame organe

kaupiasi didžiausias kiekis biologiškai aktyvių junginių, būtų galima gaminti užtikrintos sudėties vaistinius preparatus bei maisto papildus. Tokie preparatai galėtų kokybiškai užtikrinti geresnę sveikatos būklę, bei teigiamai veiktų gyvenimo kokybę.

Darbo tikslas - ištirti paprastųjų kaštonų (Aesculus hippocastanum L.) lapų, žiedų bei vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą bei nustatyti ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti paprastųjų kaštonų (Aesculus hippocastanum L.) lapų, žiedų bei vaisių

fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą bei nustatyti ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti ekstrakcijos sąlygas, užtikrinančias didžiausią fenolinių junginių kiekį Aesculus

hippocastanum L. lapų, žiedų ir vaisių augalinių žaliavų ekstraktuose.

2. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį paprastųjų kaštonų lapų, žiedų ir vaisių augalinėse žaliavose spektrofotometriniu metodu.

3. Ištirti Aesculus hippocastanum L. lapų, žiedų ir vaisių flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

4. Įvertinti paprastųjų kaštonų lapų, žiedų ir vaisių augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Paprastųjų kaštonų paplitimas ir morfologija

Aesculus hippocastanum L. priklauso augalų (Plantae) karalystei, magnolijūnų

(Magnoliophyta) skyriui, magnolijainių (Magnoliospsida) klasei, erškėčiažiedžių (Rosidae) poklasiui, kaštonainių (Hippocastanaceae) šeimai, kaštonų (Aesculus) genčiai. Rūšis – Paprastasis kaštonas (Aesculus hippocastanum L.) [6].

Aesculus L. genčiai priklauso medžiai ir krūmai, kurie turi taisyklingai susiformuojančią lają,

didelius ūglius bei stambius pumpurus. Lapai sudėtiniai, sudaryti iš 5 – 9 lapelių, pjūkliški. Žiedai susitelkę į stačias šluoteles. Taurelė sudaryta iš 4 – 5 žiedlapėlių. Vaisiai, priklausomai nuo rūšies, gali būti lygiu paviršiumi, su kuprelėmis arba dygliais. Juose dažniausiai bręsta viena sėkla (retais atvejais 2 ar 3 sėklos). Sėklos tamsiai rudos spalvos, žvilgančios. Aesculus genties mediena lengva, stambiaplaušė. Šiai genčiai priklauso 25 rūšys, kurios yra paplitusios Europoje, Azijoje bei Šiaurės Amerikoje. Lietuvoje auga 4 rūšys: paprastasis kaštonas (Aesculus hippocastanum), rausvažiedis kaštonas (Aesculus carnea Hayne), plikasis kaštonas (Aesculus glabra Willd.) ir geltonžiedis kaštonas (Aesculus octandra Marsh.). Paprastojo kaštono lapeliai bekočiai, žiedai balti arba raudoni. Rausvažiedis kaštonas turi mėsos raudonumo žiedus. Plikojo kaštono žiedai žalsvai gelsvos spalvos, o vaisiai dygliuoti. Geltonžiedžio kaštono žiedai geltoni, o vaisiai neturi dyglių [1].

Aesculus hippocastanum L. yra žydintis daugiametis medis, kuris užauga iki 30m aukščio,

turi tankią kupolišką arba rutulišką lają. Stiebo skersmuo gali siekti vieną metrą. Žievė tamsiai rudos spalvos, kuo medis senesnis tuo labiau atplaišiojanti stambiom plokštelėm. Pumpurai iki 25 mm ilgio, rudos spalvos, sakuoti. Lapai sudaryti iš 5 – 7 lapelių. Lapeliai yra bekočiai, apie 20 cm ilgio, smailėjantys. Viršutinė lapo pusė yra plika, o apatinė padengta plaukeliais. Žiedai susitelkę į 20 – 30 cm ilgio šluoteles. Vainikėlis apie 4 cm pločio, sudarytas iš 5 vainiklapių. Vainiklapiai balti su rožiniais taškeliais, prie pamato turi geltoną dėmelę, kuri vėliau tampa rožinė arba raudona. Kuokelių koteliai plaukuoti. Vaisiai rutuliški, 3 – 6 cm skersmens, turi stambius dyglius. Plyšus dėžutei išsiaižo viena, retais atvejais dvi ar trys stambios, rudos spalvos sėklos. Sėklos skersmuo siekia apie 3 cm, vidutinis svoris apie 15 g [1].

Pumpurai sprogsta balandžio mėn., sulapoja gegužės mėn. Sulapoję medžiai maždaug po savaitės pražysta, žydėjimas trunka apie 2 – 3 savaites. Rudenį lapai tampa gelsvai oranžiniai arba šviesiai bronziniai. Vaisiai šviesiai žali, prinoksta rugsėjo mėnesį, o nukrenta spalio mėnesį kartu, su lapais. Gamtoje sėklos sudygsta kuomet pakliūva po pūvančiais lapais, derėti pradeda apie 15 metus, gyvena iki 200 – 300 metų. Geriausiai auga drėgnuose, molėtuose dirvožemiuose. Augdami sausame

dirvožemyje per anksti numeta lapus, taip pat blogai auga ir užmirkusiame dirvožemyje. Mėgsta šviesias vietoves, nėra atsparūs sausam, užterštam orui. Gerai išgyvena žiemos šaltyje [1]. Paprastųjų kaštonų tėvynė yra Balkanų pusiasalis (Šiaurės Graikija, Albanija, Makedonijos Respublika, Serbija ir Bulgarija), tačiau šiandien paprastieji kaštonai yra paplitę viso Pasaulio vidutinėse platumose. Dėl didelio gebėjimo išgyventi įvairiomis oro sąlygomis ir gražios išvaizdos šie medžiai auginami soduose, parkuose bei kitos lauke esančios lankytinose vietose [6;7;30;73].

1.2. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų cheminės sudėties tyrimai

Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis tiriama pasaulio mokslininkų. Atliekant paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų biologiškai aktyvių junginių sudėties tyrimus identifikuota daugiau nei 200 junginių [28;36].

Paprastųjų kaštonų vaisiuose yra 3-10 proc. acilintų triterpeninių glikozidų. Paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktuose identifikuotų saponinų aglikonai yra protoescigeninas ir baringtogenolis C. Cukrinę dalį sudaro gliukurono rūgštis ir gliukozė, galaktozė arba ksilozė. Tiriant paprastojo kaštono cheminę sudėtį pirmiausiai identifikuotas escinas. 1960 m. Lorenz ir Marek nustatė, kad escinas lemia paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakto antioksidantinį ir vazoprotekcinį poveikius [35]. Literatūroje aprašytos 3 escino frakcijos: kripto-, α- ir β-escinas [42]. Tarpusavyje šie triterpeniniai saponinai skiriasi tirpumu vandenyje, turi skirtingą lydymosi temperatūrą. Paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakte daugiausia randama β escino. Escino Aesculus hippocastanum L. vaisių ekstrakte yra iki 10 proc. [31;46;67]. 2015 m. Jordanijos, Albanijos bei Ukrainos mokslininkai kartu atliko tyrimą, kurio metu tyrė escino kiekį paprastojo kaštono augalinėse žaliavose. Taikydami plonasluoksnės chromatografijos metodą nustatė, kad paprastojo kaštono sėklose escino kaupiasi 0.32 ± 0.012 g/kg ir 0.19 ± 0.009 g/kg, sėklos endosperme escino kiekis nustatytas 52.05 ± 0.67 g/kg ir 34.9 ± 0.51 g/kg [32]. Lenkijos mokslininkai paprastojo kaštono sėklose nustatė 31,37 mg/g escino [16].

Įvairių pasaulio šalių mokslininkai tyrė paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų fenolinių junginių sudėtį. Turkų mokslininkai tyrę paprastųjų kaštonų lapų, žiedų, vaisių ir žievės etanolinių ekstraktų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį nustatė, kad bendras fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 0,021 iki 0,075 mg GRE/mg. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas paprastųjų kaštonų lapų ir žievės ekstraktuose (atitinkamai, 0,075±0,016 mg GRE/mg ir 0,061±0,013 mg GRE/mg). Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis (0,021±0,004 mg GRE/mg) nustatytas

paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakte. Paprastųjų kaštonų žiedų ekstrakte nustatyta 0,045±0,008 mg GRE/mg fenolinių junginių [27].

Margina ir kt. (2015) tyrė hidrolizuotų paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktų fenolinių junginių sudėtį plonasluoksnės chromatografijos metodu. Ištyrę hidrolizuotų vandeninio ir etanolinių vaisių ekstraktų kiekybinę fenolinių junginių sudėtį nustatė, kad bendras fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 0,386 iki 1,358 µg/g. Didžiausias bendras fenolinių jugninių kiekis nustatytas paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakte, gamintame ekstrahentu naudojant 96 proc. (v/v) etanolį, mažiausias – vandeniniame ekstrakte [47]. Otajagic ir kt. (2012), tyrė bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą paprastųjų kaštonų vaisiuose. Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad vaisių luobelėje bendras fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 178,45 iki 216,97 mg GRE/g, [55]. Kukula-Koch ir kt. (2015) tyrė paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktų fenolinių junginių sudėtį ir nustatė, kad etanoliniuose ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 17,8 iki 21,2 mg GRE/g ekstrakto [44]. Lenkų mokslininkai [41] tyrė fenolinių junginių kiekio įvairavimą paprastųjų kaštonų vaisiuose vegetacijos periodo metu. Nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis kinta nuo 30,3 iki 88,0 mg GRE/ g paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakto. Didžiausias kiekis fenolinių junginių nustatytas 16 savaitę po žydėjimo pradžios [41].

Atlikus paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų biologiškai aktyvių junginių kokybinės sudėties analizę identifikuoti flavonoidai. Kaštonų augalinėse žaliavose ir jų ekstraktuose esantys flavonoidai sudaro svarbią antrinių metabolitų grupę vaisiuose, nes nulemia kaštonų preparatų spazmolitinį poveikį venoms [22].

Margina ir kt. (2015) tyrė hidrolizuotų paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktų fenolinių junginių kokybinę sudėtį plonasluoksnės chromatografijos metodu ir identifikavo kvercetiną ir kemferolį [47]. Atlikta mokslinių tyrimų, kurių metu paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktuose identifikuota flavonolių grupės glikozidų: kvercetino, kemferolio, tamariksetino triglikozdai, diglikozidai [37;40]. Identifikuotų flavonoidų komplekse dominuoja kvercetino ir kemferolio glikozidai: astragalinas (kemferolio gliukozidas), izokvercitrinas (kvercetino gliukozidas), rutinas (kvercetino rutinozidas) [13].

Paprastųjų kaštonų vaisiuose nustatyta 0,3 proc. (išreikšta rutino ekvivalentais) flavonoidų [37]. Kiti mokslininkai tyrę paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakto flavonoidų kiekybinę sudėtį nustatė 3,5 proc. flavonoidų [40]. Atlikus kemferolio kiekybinės sudėties įvairavimo tyrimus, nustatyta, kad kemferolio kiekis vegetacijos periodo metu įvairuoja nuo 0,0007 proc. iki 0,0764 proc. Didžiausias kiekis kemferolio nustatytas 16 savaitę po žydėjimo surinktų vaisių ekstrakte [41].

Paprastųjų kaštonų žieduose nustatyta kemferolio glikozidų: kemferolio 3–azabinozidas, kemferolio 3–gliukozidas ir kemferolio 3–ramnogliukozidas. Identifikuoti ir kvercetino glikozidai: 3– gliukozidas, 3–ramnogliukozidas. Lenkų mokslininkai [48] paprastųjų kaštonų žiedų ekstrakte identifikavo kemferolio arabinofuranozidą, gliukopiranozidą, ramnopiranozidą,

gliukopiranozidą bei kvercetino arabinofuranozidą, gliukopiranozidą ir ramnopiranozil-gliukopiranozidą.

Hleba ir kt. (2014) tyrė hidrolizuotų paprastųjų kaštonų žiedų ekstraktų biologiškai aktyvių junginių sudėtį ir identifikavo kemferolį, kvercetiną, liuteoliną ir apigeniną. Flavonoidų komplekse dominuojantis junginys yra kemferolis. Hidrolizuotame paprastųjų kaštonų žiedų ekstrakte nustatyta 2874,6 µg/g kemferolio. Kvercetino ir liuteolino hidrolizuotame paprastųjų kaštonų žiedų ekstrakte nustatyta mažesni kiekiai, atitinkamai 1447,4 ir 856,6 µg/g ekstrakto. Apigenino hidrolizuotame paprastųjų kaštonų žiedų ekstrakte nustatyta mažiausiai – 25,8 µg/g ekstrakto [31].

Lenkų mokslininkų atliktų tyrimų metu paprastųjų kaštonų lapų ekstraktuose identifikuota kvercetino galaktozidas, arabinozidas, ramnozidas, rutinozidas, kemferolio arabinozidas ir ramnozidas. Paprastųjų kaštonų lapuose nustatyta 0,20 mg/g kvercetino galaktozido, 2,48 mg/g kvercetino arabinozido, 8,22 mg/g kvercetino ramnozido, 0,39 mg/g kemferolio arabinozido ir 1,55 mg/g kemferolio ramnozido [54].

Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktuose identifikuota fenolinių rūgščių ir jų darinių. Hleba ir kt. (2014) tyrė hidrolizuotų paprastųjų kaštonų žiedų ekstraktų biologiškai aktyvių junginių sudėtį ir identifikavo p-hidroksibenzoinę, galo, ferulo, kavos rūgštis. Įvertinę kiekybinę fenolinių rūgščių sudėtį, mokslininkai nustatė, kad dominuojantis komponentas yra ferulo rūgštis. Paprastųjų kaštonų žiedų ekstraktuose nustatyta 547,3 µg/g ferulo rūgšties. Galo ir p-hidroksibenzoinės rūgščių kiekiai paprastųjų kaštonų žiedų ekstraktuose mažesni (atitinkamai 13,9 µg/g ir 158,8 µg/g) [31]. Lenkų mokslininkų atliktų tyrimų metu paprastųjų kaštonų lapų ekstraktuose identifikuota neochlorogeno rūgštis, kafeoil-heksozės ramnozidas, trihidroksicinamoilchino rūgšties izomeras [54]. Neochlorogeno rūgšties paprastųjų kaštonų lapuose nustatyta 1,26 mg/g [54].

Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų biologinį poveikį lemia ir kumarinai. Ištyrus paprastųjų kaštonų vaisių augalinėje žaliavoje esančių kumarinų kokybinę sudėtį identifikuoti umbeliferonas, eskuletinas, skopoletinas, izoskopoletinas, skiminas, fraksinas, eskulinas, skopolinas, izoskopolinas [25;43].

Remiantis literatūra, ekstraktų, pagamintų, iš skirtingų augalo organų ar augalinių žaliavų, surinktų skirtingu augalo vegetacijos periodo laiku, sudėtis reikšmingai skiriasi. Eskulino ar fraksino, esančių kaštonų žievėje, sudėtis įvertinta Kroatijos mokslininkų. Atlikus paprastųjų kaštonų žievės, kuri buvo surinkta skirtingais sezonais, biologiškai aktyvių junginių sudėties tyrimus, didžiausias kumarinų (eskulino) kiekis nustatytas vėliausiai rinktoje žaliavoje [70].

Paprastųjų kaštonų augalinėse žaliavose nustatyta ir kitų grupių biologiškai aktyvių junginių. Paprastųjų kaštonų pumpurų, žiedų ekstraktuose identifikuota karotenoidų: katotenas, β-kriptoksantinas, violaksantinas, 9-cis-violaksantinas, liuteinas, neoliuteinas, β-citraurinas,

eskulaksantinas, liuteoksantinas. Kaštono vaisiuose kaupiasi krakmolas (40 – 50 proc.), cukrai, baltymai, riebaliniai aliejai (oleino, linolo, lauro, miristo, stearino ir palmitino rūgštys), purinai (adenozinas, adeninas, guaninas), vitaminai C ir B, steroliai (sitosterolis, stigmasterlis, kampesterolis) [17;65].

1.3. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų biologinių poveikių tyrimai

Paprastųjų kaštonų augalinės žaliavos vartojamos liaudies medicinoje ligų gydymui ir profilaktikai. Kai kuriose šalyse (pvz. Lenkijoje), pardavinėjami kaštonų žiedai, tiek pavieniai, tiek mišiniuose kartu su kitomis vaistažolėmis. Liaudies medicinoje kaštonų žiedų preparatai vartojami tiek išoriškai, tiek į vidų. Jie vartojami esant venų uždegimui, blauzdų venų varikozei, hemorojui, nudegimams, odos pažeidimams ar odos uždegimams. Žiedų nuovirai vartojami malšinant sąnarinius skausmus, gydant tulžies pūslės susirgimus, sergant žarnyno uždegimais ar kraujuojant iš gimdos. Šviežios žiedų sultys gali būti naudojamos gydant hemorojų ar vidurių užkietėjimą. Kompresai dedami ant skaudančių sąnarių bei sumuštų vietų, nes mažina uždegimą. Kaštonų lapai kai kur naudojami kaip kosulį slopinanti priemonė, naudojami gydant tuberkuliozę, podagrą. Kaštonų vaisių preparatai nuo seno tradiciškai naudojami gydant lėtines venų ligas [60].

Siekiant moksliniais įrodymais pagrįsti tradicinį paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų vartojimą atliekami moksliniai tyrimai. Šiuo metu yra atlikta pakankamai daug tyrimų, įrodančių Aesculus hippocastanum L. augalinių žaliavų ekstraktų naudą žmogaus sveikatai. Paprastųjų kaštonų vaistinių augalinių žaliavų ekstraktai yra gana plačiai naudojami vaistinių preparatų gamybai. Europoje medicinos praktikoje yra naudojami paprastųjų kaštonų vaisių, lapų bei žiedų ekstraktai, iš ekstraktų gryninami individualūs biologiškai aktyvūs junginiai (pavyzdžiui, escinas). Gauti preparatai vartojami esant lėtiniam venų nepakankamumui, hemorojui, pooperacinėms edemoms [11;39;60]. Europoje Aesculus hippocastanum L. ekstraktai dažniausiai vartojami gydant lėtines venų ligas, o JAV – pooperacines edemas [33;66].

Tyrimų metu nustatyta, kad paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktai gali būti vartojami gydant lėtines venų ligas, kurios pasireiškia sunkumu kojose, skausmu, vizualiai matomomis iššokusiomis venomis. Kaštonų vaisių preparatai vartojami gydant lėtines venų ligas, dažniausiai pasireiškiančias kaip venų varikozė, hemorojus, patinimai, skausmas ar sunkumo jausmas apatinėse galūnėse. Nustatyta, kad antiedeminį ir vazoprotekcinį paprastųjų kaštonų vaisių poveikį lemia

β-escinas [49]. β-β-escinas slopina uždegimą, mažina patinimą, pasižymi venotoniniu poveikiu, dėl to sumažina venų pralaidumą [53;59;66].

Moksliniais tyrimais įrodytas antiangiogeninis (kraujagysles apsaugantis) kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų poveikis. Atlikus tyrimus nustatyta, kad iš paprastųjų kaštonų išskirtas escinas sumažina žiurkių aortos disfunkciją. Manoma, kad tokį poveikį lemia padidėjęs ląstelių pralaidumas kalcio jonams, endotelio azoto oksido sintezės aktyvumas ir padidėjęs azoto oksido susidarymas. Dėl šių priežasčių sustiprėja kraujagyslių lygiųjų raumenų susitraukimas [53].

Paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktas priklausomai nuo dozės sutraukia jaučių mezenterines venas ir arterijas. Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktas reikšmingai slopina ADF sukeltą trombocitų agregaciją. Manoma, kad šie poveikiai yra paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakto poveikio gydant lėtinį venų nepakankamumą mechanizmo dalis [24]. Preparatai, kurių sudėtyje yra kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų, gerina kraujo apytaką bei mažina kraujo krešėjimą, todėl gali būti naudojami venų aterosklerozės, varikozinio jų išsiplėtimo, hemorojaus profilaktikai bei gydymui. Manoma, kad poveikį lemia kumarinai (eskulinas ir fraksinas) [70].

Aesculus hippocastanum L. vaistinių augalinių žaliavų ekstraktai pasižymi priešuždegiminiu

poveikiu, turi karščiavimą mažinančių savybių. Paprastųjų kaštonų lapų ir žievės ekstraktai mažina skausmą [34]. Kaštonų lapų ekstraktai vartojami gydant artritą. Priešuždegiminis paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktų poveikis įrodytas naudojant gyvūnų modelius. Išskirta ir identifikuota keletas junginių, pasižyminčių priešuždegiminiu poveikiu. Tyrimų metu nustatyta, kad escinas, Ia, Ib, IIa ir Iib mažina kraujagyslių pralaidumą žiurkėms ir pelėms. Šie junginiai pelėms mažina letenos edemą, sukeltą karagenino [44]. Atlikus mokslinius tyrimus nustatyta, kad kaštonų vaisiuose esančios oleino, linolo ir linoleno rūgštys slopina ciklooksigenazę-1 ir ciklooksigenazę-2. Įrodyta, kad linolo ir linoleno rūgštys yra selektyvūs ciklooksigenazės-2 inhibitoriai [50;71].

Priešvėžinis poveikis. Tyrimų su gyvūnais metu yra nustatyta, kad Aesculus hippocastanum L. augalinių žaliavų preparatai slopina vėžinių ląstelių poliferaciją bei augimą [57]. In vitro ir in vivo tyrimu metu įrodyta, kad β-escinas pasižymi priešvėžiniu aktyvumu nustatyta, kad β-escinas, išskirtas iš paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų, slopina gaubtinės žarnos karcinogenezę žiurkėms. In vitro tyrimų metu nustatytas β-escino citotoksinis poveikis gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijoms [57].

Nutukimą mažinantis poveikis. Nustatyta, kad kaštono vaisių ekstraktas slopina lipazės išsiskyrimą. Atliekant tyrimus su gyvūnais nustatyta, kad A. hippocastanum augalinių žaliavų ekstraktai mažina riebalinį sluoksnį bei trigliceridų koncentraciją kraujyje [20;26;27].

Paprastųjų kaštonų preparatai gali turėti nepageidaujamą poveikį. Vartojant didelėmis dozėmis gali sukelti nepageidaujamus inkstų bei kepenų pažeidimus ar sukelti alerginę reakciją. Apsinuodijus paprastųjų kaštonų preparatais pasireiškia pykinimas, vėmimas, galvos skausmas ar

svaigimas. Paprastųjų kaštonų preparatai mažina kraujo krešumą, todėl asmenys, kurie serga kraujo ligomis, šiuos preparatus turėtų vartoti tik pasitarę su gydytoju. Kaštonų preparatų negalima vartoti nėštumo metu (išskyrus išoriškai ir nedideliais plotais) bei žindymo laikotarpiais [65].

Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų biologinį poveikį lemia įvairių grupių biologiškai aktyvūs junginiai. Biologiškai aktyvių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties duomenys yra svarbus parametras, apibūdinantis augalinių žaliavų ir iš jų pagamintų preparatų kokybę. Pasaulio mokslininkai yra atlikę nemažai mokslinių tyrimų tirdami Aesculus hippocastanum L. vaistinę augalinę žaliavą. Atlikta tyrimų, kurių metu tirtos paprastųjų kaštonų augalinėse žaliavose kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos. Trūksta duomenų apie cheminės sudėties įvairavimą paprastųjų kaštonų skirtinguose organuose. Duomenys apie paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų fenolinių junginių cheminės sudėties skirtumus papildytų jau turimas žinias, sudarytų sąlygas gaminti užtikrintos kokybės žinomos sudėties preparatus.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – paprastųjų kaštonų (Aesculus hippocastanum L.) vaisiai, lapai bei žiedai. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimui atlikti naudota Aesculus hippocastanum L. žaliava rinkta Šiaulių miesto centriniame parke, kaštonų alėjoje. Žaliava tyrimui surinkta 2015m. Lapai bei vaisiai rinkti rugsėjo mėnesį, žiedai surinkti birželio mėnesį. Visa žaliava rinkta nuo tų pačių medžių.

2.2. Tyrime naudoti reagentai

Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai. 96 proc. Etanolis (UAB „Stumbras“, Lietuva), Folin – Ciocalteu („Sigma – Aldrich“, Vokietija), natrio karbonatas („ROTH“, Vokietija), aliumino chlorido heksahidratas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), acto rūgštis (UAB „Fasuotos cheminės medžiagos“, Lietuva), heksametilentetraminas („Lachema“, Čekija), ABTS („Alfa Aesar“, Vokietija), kalio persulfatas („Alfa Aesar“, Vokietija), natrio acetatas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), TPTZ („Alfa Aesar“, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas („Alfa Aesar“, Vokietija), DPPH („Sigma – Aldrich“, Vokietija), galo rūgšties monohidratas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), troloksas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), rutino trihidratas („ROTH“, Vokietija).

2.3. Tyrime naudota aparatūra

Svarstyklės Sartorius Lab Instruments GmbH &Co. KG, 37070 goettingen, Germany. Elektrinė smulkintuvė – IKA (Vokietija). sijoklis Retsch (Vokietija). Ultragarso vonelė – Ekmasonic P 120 H (Vokietija). Centrifuga – Thermo Electron LED GmbH D – 37520 Osteorode (Vokietija). Nuodžiūvio matuoklis Swiss Quality (Vokietija). Spektrofotometras – Spectronic Compec M550 (Vokietija).Eefektyvioji skysčių chromatografija atlikta naudojant sistemą Waters e2695 Alliance ( „Waters“, Milfordas, MA, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998. Skirstymui atlikti naudota ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) kolonėlė (150 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 3 μm) su ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) prieškolone (dalelių dydis 3 μm).

2.4. Tyrimų metodai

2.4.1. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ėminių paruošimas fenolinių junginių

sudėties tyrimui atlikti

Aesculus hippocastanum L. lapai ir žiedai buvo džiovinami kambario temperatūroje.

Paprastojo kaštono vaisiai buvo smulkinami elektriniu smulkintuvu, susmulkinta žaliava buvo laikoma kambario temperatūroje kol visiškai išdžiuvo. Išdžiovinta žaliava buvo smulkinama naudojant elektrinį smulkintuvą iki dalelių praeinančių pro 355 µm sietą. Nuodžiūvis nustatytas Europos farmakopėjoje nurodytu metodu [23]. Kiekybinės analizės rezultatai perskaičiuoti absoliučiai sausai paprastųjų kaštonų augalinei žaliavai.

2.4.2. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų paruošimo metodika

Atsveriama apie 0,1 g (tikslus svėrinys) paprastojo kaštono smulkintos žaliavos, kuri buvo užpilama skirtingų koncentracijų etanolio – vandens mišiniais(v/v). Lapų ėminiai ekstrahuoti 60 proc. (v/v) etanoliu, žiedų – 50 proc. (v/v) etanoliu, vaisių – 40 proc. (v/v) etanoliu. Visi paruošti bandiniai ekstrahuojami ultragarso vonelėje taikant vienodas sąlygas: dažnis 37 kHz, galia 100 proc., temperatūra 22°C. Lapų bandiniai ultragarso poveikyje ekstrahuoti 60 min, vaisių – 20 min, žiedų – 40 min. Ekstraktai centrifuguojami centrifugoje (sąlygos: 3000 apsisukimų, 19°C temperatūra, 2 minutes). Supernatantas perkeliamas į 10 ml matavimo kolbą, pilama atitinkamos koncentracijos etanolio iki žymės. Gautas ekstraktas filtruojamas per 0,22 µm porų dydžio membraninį filtrą.

2.4.3. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų hidrolizės metodika

Atliekant paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų etanolinių ekstraktų rūgštinę hidrolizę, 10 ml matavimo kolboje 5 ml ekstrakto sumaišomi su 2,5 ml koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties, skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymos. Gautas tirpalas perkeliamas į apvaliadugnę kolbą ir prijungus grįžtamąjį šaldytuvą 1 valandą kaitinamas vandens vonioje. Prieš ESC analizę gautas ekstraktas filtruojamas per 0,22 µm porų dydžio membraninį filtrą.

2.4.4. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas taikant Folin – Ciocalteu

reagentą

Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudojamas spektrofotometrinis Folin – Ciocalteu metodas. Analizei paimama 0,2 ml tiriamojo ekstrakto, skiedžiama etanoliu iki 5ml. Imama 0,5 ml paruošto bandinio, pilama 2,5 ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento ir gerai sumaišoma. Įpilama 2ml 7,5 proc. Na2CO3 ir vėl gerai sumaišoma. Ruošiamas palyginamasis bandinys : Imama 1

ml paruošto bandinio, pilama 5 ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento, 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 ir gerai

sumaišoma.. Taip paruošti bandiniai laikomi tamsoje 1val. Praėjus 1 valandai atliekama analizė

spektrofotometru bangos ilgiui esant 765nm [3;9;61;69].

Bendras fenolinių junginių kiekis yra išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) vienam gramui sausos žaliavos (mg/g) naudojantis galo rūgšties kalibracinės kreivės tiesine regrecijos lygtimi:

y = 2,967x + 0,0135; R2 = 0,9998 ; p<0,001

Bendras fenolinių junginių kiekis absoliučiai sausai kaštonų augalinei žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę :

GRE = c*V / m (mg/g)

c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.4.5. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas naudojant metodą su aliuminio

chloridu

1,5 ml paruošto ekstrakto sumaišoma su 2 ml 96% etanolio (v/v), pilama 0,1 ml 30% acto rūgšties, 0,3 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo. Paruoštas tirpalas laikomas 30 minučių. Praėjus 30 min tirpalas maišomas su 0,4 ml 5% heksametilentetramino tirpalo ir pilama distiliuoto vandens iki 5 ml žymos. Pagaminamas lyginamasis bandinys: 1,5 ml ekstrakto sumaišoma su 2 ml 96% etanolio (v/v), įpilama 0,1 ml 30% acto rūgšties ir distiliuoto vandens iki 5 ml žymos. Analizė atliekama su spektrofotometru, nustačius 407 nm ilgio bangą [5;59].

Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais vienam gramui visiškai sausos augalinės žaliavos (mg/g), pagal rutino kalibracinės kreivės tiesinės regrecijos lygtį:

Bendras fenolinių junginių kiekis absoliučiai sausai kaštonų augalinei žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę:

C = c*V/m (mg/g)

c – rutino koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.4.6. Antiradikalinio aktyvumo tyrimas naudojant ABTS metodą

Gaminamas motininis ABTS tirpalas. Tamsaus stiklo buteliuke 2mM ABTS miltelių tirpinama 50 ml distiliuoto vandens. Ištirpinus miltelius pridedama 0,7 mM kalio persulfato. Pagamintas tirpalas laikomas 16-17 val. tamsoje, kambario temperatūroje. Reakcijos metu susidaro stabilus ABTS•+ katijonas.

Naudojant spektrofotometrą, esant 734 nm ilgio bangai darbinis ABTS•+ tirpalas skiedžiamas vandeniu iki kol gaunama 0,800 ± 0,005 dydžio absorbcija. Į tamsaus stiklo buteliuką pilama 3000 µl paruošto darbinio ABTS•+ tirpalo ir 10 µl augalinės žaliavos ekstrakto. Paruošti mėginiai laikomi tamsoje 1val. Lyginamuoju tirpalu naudojamas distiliuotas vanduo. Praėjus valandai mėginiai analizuojami spektrofotometru nustačius 734 nm ilgio bangą [4;62;63].

Antiradikalinis aktyvumas yra išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos, remiantis trolokso kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtimi:

y = - 1,2534x + 3,116; R2 = 0,9972; p< 0,001

Antiradikalinis aktyvumas absoliučiai sausai kaštonų augalinei žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę:

TE = c* V/ m (µmol/g)

c – trolokso koncentracija (µmol/ml), nustatyta iš trolokso kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

2.4.7. Antiradikalinio aktyvumo tyrimas naudojant DPPH metodą

Gaminamas darbinis DPPH tirpalas. 60 μM DPPH tirpalo skiedžiama su 96 proc. etanoliu (v/v). Skiedimas vykdomas tol, kol spektrofotometre nustačius 515 nm ilgio bangą šviesos absorbcija pasiekiama 0,8 ± 0,005 absorbcijos vienetai.

Tiriamasis tirpalas gaminamas iš 10 µl paruošto ekstrakto į jį įpylus 3ml DPPH reagento. Lyginamuoju tirpalu laikomas 96% etanolis (v/v). Paruošti mėginiai laikomi 30 minučių. Analizė atliekama spektrofotometru, jame nustačius 515nm ilgio bangą [4].

Antiradikalinis aktyvumas yra išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos, remiantis trolokso kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtimi:

y = -0,9069 x + 2,937; R2 _{= 0,999; p< 0,001.}

Antiradikalinis aktyvumas absoliučiai sausai kaštonų augalinei žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę:

TE = c* V/ m (µmol/g)

c – trolokso koncentracija (µmol/ml), nustatyta iš trolokso kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.4.8. Redukcinio aktyvumo tyrimas naudojant FRAP metodą

FRAP reagentas turi būti paruoštas prieš pat atliekant analizę. Į 300 mM ( pH = 3,6) natrio acetato buferinio tirpalo, įpilama 10 mM TPTZ tirpalo, 40 mM vandenilio chlorido rūgštyje bei 20 mM geležies chlorido heksahidrato tirpalo. Visi reagentai maišomi santykiu 10:1:1.

Tiriamasis tirpalas gaminamas iš 10 µl paruošto ekstrakto į jį įpylus 3ml FRAP reagento. Lyginamasis tirpalas gaminamas iš 10 µl distiliuoto vandens ir 3 ml FRAP reagento mišinio. Paruošti mėginiai laikomi 1 valandą. Analizė atliekama spektrofotometru, jame nustačius 593nm ilgio bangą [10].

Antioksidantinis aktyvumas yra išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos, remiantis trolokso kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtimi:

y = 10,4587x + 0,0860; R2 = 0,9966; p< 0,001.

Redukcinis aktyvumas absoliučiai sausai kaštonų augalinei žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę:

c – trolokso koncentracija (µmol/ml), nustatyta iš trolokso kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

2.4.9. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika flavonoidų glikozidų

sudėties tyrimui

Judriąją fazę sudarė du eliuentai (A ir B). Eliuentas A – 0,05 proc. trilfluoracto rūgštis, eliuentas B – acetonitrilas. Gradiento kitimas – 0 – 5 min 12 proc. B, 5–50 min – 12–30 proc. B, 50– 51 min – 30–90 proc. B, 51–56 min 90 proc. B, 57 min 12 proc. B. Eliuentų tėkmės greitis – 0,5 ml/min, injekcijos tūris – 10 µl. Temperatūra palaikyta 25°C. Smailės buvo atskirtos nuo lydinčių junginių, o jų grynumas įvertinas pagal UV absorbcijos spektrą ( 200-400 nm). Chromatografinės smailės identifikuotos pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką bei lyginant analičių ir etaloninių junginių UV spektrus. Kiekybinis analičių įvertinimas buvo atliktas remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale. Tirtų flavonoidų glikozidų kiekiai skaičiuoti bangos ilgiui esant 350 nm [15;68].

2.4.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika flavonoidų aglikonų

sudėties tyrimui

Judrioji fazė buvo sudaryta iš 75 proc. eliuento A (0,05 proc. trifluorido rūgštis), ir 25 proc. eliuento B (acetonitrilas). Taikytas izokratinis eliuavimas. Eliuento tėkmės greitis nustatytas 0,7 mL/min, injekcijos tūris - 10 μL. Palaikyta 25°C temperatūra. Smailės buvo atskirtos nuo lydinčių junginių, o jų grynumas įvertinas pagal UV absorbcijos spektrą ( 200-400 nm). Chromatografinės smailės identifikuotos pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką bei lyginant analičių ir etaloninių junginių UV spektrus. Kiekybinis analičių įvertinimas buvo atliktas remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale. Tirtų flavonoidų aglikonų kiekiai skaičiuoti bangos ilgiui esant 370 nm [15;68].

2. 5. Duomenų analizės metodai.

Gauti duomenys apdoroti naudojant kompiuterines programas Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, JAV) ir SPSS Statistics 20.0 (IBM, JAV). Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų kiekybinės analizės duomenys pateikiami įvertinus gautų tyrimų rezultatų vidurkį ir standartinę paklaidą. Kiekybinių duomenų vidurkiai palyginti taikant ANOVA analizę su aposterioriniu TukeyHSD daugkartinio palyginimo kriterijumi.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1.

Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Biologiškai aktyvios medžiagos iš augalinių žaliavų išekstrahuojamos esant tam tikroms sąlygoms. Nustatyti ekstrakcijos sąlygas, kuriomis pagamintame ekstrakte būtų daugiausiai veikliųjų medžiagų yra svarbu, nes tik tokiu būdu būtų galima pagaminti užtikrintos kokybės ekstraktą, kurį būtų galima panaudoti sveikatinimo tikslais.

Siekiant parinkti paprastųjų kaštonų lapų, žiedų ir vaisių augalinių žaliavų ekstrakcijos sąlygas, atlikti tyrimai, kurių metu tirta, kokios koncentracijos etanolį naudojant ekstrakcijai pagamintame ekstrakte yra didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis. Siekiant nustatyti tinkamiausios koncentracijos tirpiklį naudotas 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc., 80 proc., ir 96 proc. etanolis (v/v). Ekstraktai buvo gaminami taikant maceracijos metodą ultragarso vonelėje. Didžiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis (103,71 ± 0,75 mg/g) paprastųjų kaštonų lapų ekstraktuose nustatytas ekstrahentu naudojant 60 proc. (v/v) etanolį (1 pav.). Mažiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis yra lapų ekstrakte, pagamintame ekstrahentu naudojant 96 proc. (v/v) etanolio (45,26 ± 0,33 mg/g) (1 pav.).

1 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. lapų ėminiuose, ekstrakcijai naudojant skirtingų koncentracijų etanolį

*Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Atlikus tyrimus nustatyta, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis yra ekstrakte, kurio gamybai naudojamas 60 proc. (v/v) etanolis, todėl kitų bandymų metu tiriant paprastųjų kaštonų lapus naudotas būtent tokios koncentracijos tirpiklis.

Ištyrus paprastųjų kaštonų žiedų ekstraktus, didžiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ekstrakte, pagamintame ekstrahentu naudojant 50 proc. (v/v) ir 60 proc. (v/v) etanolį (99,56 ± 1,44 mg/g ir 102,23 ± 1,48 mg/g, atitinkamai). Mažiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas paprastųjų kaštonų žiedų ekstrakte, gautame ekstrahentu naudojant 96 proc. (v/v) etanolį (41,70 ± 0,60 mg/g) (2 pav.).

2 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. žiedų ėminiuose, ekstrakcijai naudojant skirtingų koncentracijų etanolį

*Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Atlikus tyrimus nustatyta, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis yra ekstrakte, kurio gamybai naudojamas 50 ir 60 proc. (v/v) etanolis. Tolimesniems kaštonų žiedų fenolinių junginių sudėties tyrimams vykdyti pasirinktas 50 proc. (v/v) etanolis.

Tiriant paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktus, gautus kaip ekstrahentą naudojant skirtingų koncentracijų etanolį, didžiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis (223,88 ± 2,59 mg/g) nustatytas naudojant 40 proc. (v/v) etanolį (3 pav.). Mažiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ekstraktuose, kurių gamybai buvo naudojamas 80 proc. (v/v) ir 96 proc. (v/v) etanolis, (atitinkamai, 117,06 ± 1,35 mg/g ir 111,13 ± 1,28 mg/g). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp bendro fenolinių junginių kiekio šiuose ekstraktuose nenustatyta (p>0,05) (3 pav.).

3 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. vaisių ėminiuose, ekstrakcijai naudojant skirtingų koncentracijų etanolį

*Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Atlikus tyrimus nustatyta, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis yra ekstrakte, kurio gamybai naudojamas 40 proc. (v/v) etanolis, todėl kitų bandymų metu tiriant paprastųjų kaštonų vaisius naudotas būtent tokios koncentracijos tirpiklis.

Siekiant pagaminti kokybišką ir daugiausiai fenolinių junginių turintį ekstraktą, svarbu nustatyti, kiek laiko reikia ektrahuoti ekstraktą. Atliekant šį tyrimą, gaminant ekstraktus naudotas tokios koncentracijos etanolis, kurį naudojant pagamintame ekstrakte nustatytas didžiausias fenolinių junginių kiekis. Ekstraktai buvo gaminami taikant maceracijos metodą ultragarso vonelėje. Ekstrakcija vykdyta 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min.

Vertinant ekstrakcijos trukmės įtaką bendram fenolinių junginių kiekiui paprastųjų kaštonų lapų ekstrakte nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis kito nuo 76,11 mg/g iki 116,47 mg/g. Didžiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis (116,47 ± 0,84 mg/g) nustatytas ekstrakte, kuris ultragarso poveikyje ekstrahuotas 60 min. Mažiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis (76,11 ±2,20 mg/g) nustatytas ekstrahuojant ultragarso poveikyje 10 min. (4 pav.).

4 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. lapų ėminiuose, ekstrahuojant skirtingais laiko intervalais

*Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Ekstrahuojant paprastųjų kaštonų žiedus ultragarso poveikyje skirtingais laiko intervalais, didžiausi (p<0,05) fenolinių junginių kiekiai nustatyti ekstraktuose, gautuose ekstrakciją vykdant 40, 50 ir 60 min (atitinkamai, 99,56 ± 1,44 mg/g, 100,45 ± 1,45 mg/g ir 105,20 ± 1,52 mg/g). Ultragarso poveikyje paprastojo kaštono žiedų ekstrakciją vykdant 10 min ir 30 min nustatytas mažiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis (atitinkamai, 77,01 ± 1,11 mg/g ir 83,24 ± 1,20 mg/g) (5 pav.).

5 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. žiedų ėminiuose, ekstrahuojant skirtingais laiko intervalais

Paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis priklausomai nuo ekstrakcijos trukmės įvairuoja nuo 178,78 mg/g iki 241,97 mg/g. Ilgėjant ekstrakcijos laikui iki 20 min, fenolinių junginių kiekis paprastųjų kaštonų vaisių ekstraktuose didėja. Didžiausias (p<0,05) bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakte, gautame ekstrakciją vykdant 20 min ir 30 min (atitinkamai, 260,37 ± 3,01 mg/g ir 248,20 ± 2,87 mg/ml) (6 pav.). Ekstrahuojant ilgiau nei 30 min, bendras fenolinių junginių kiekis ekstraktuose sumažėja.

6 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. vaisių ėminiuose, ekstrahuojant skirtingais laiko intervalais

*Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Remdamiesi gautais tyrimų rezultatais, vykdydami tolimesnius paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų fenolinių junginių sudėties tyrimus lapų augalinės žaliavos ekstrakciją vykdėme 60 min. ekstrahentu naudojant 60 proc. (v/v) etanolį, žiedų augalinės žaliavos – 40 min. ekstrahentu naudojant 50 proc. (v/v) etanolį, vaisių augalinės žaliavos – 20 min. ekstrahentu naudojant 40 proc. (v/v) etanolį.

3.2. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų flavonoidų sudėties tyrimas

Flavonoidai – tai viena dažniausiai aptinkamų veikliųjų medžiagų grupių augaluose. Šiuo metu yra išskirta apie 4000 flavonoidų, tačiau tobulėjant tyrimų metodikoms jų identifikuojama vis daugiau. Šie junginiai kaupiasi augale ir dalyvauja daugelyje jo vegetacijos procesų (tokių kaip brendimas, augimas), tai pat jie suteikia spalvą augalo žiedams. Tyrimų metu įrodytas teigiamas flavonoidų poveikis organizmui. Yra įrodyta, kad šie junginiai apsaugo kraujagyslių sieneles bei

normalizuoja kraujagyslių pralaidumą, stabilizuoja membranos fosfolipidus, sustiprina endotelio barjerinį efektą. Flavonoidai slopina trombocitų sukibimą bei veikia lygiuosius raumenis [19]. Flavonoidai pasižymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu – geba jungtis su laisvaisiais radikalais, taip užkirsdami kelią įvairiems organų pažeidimams. Įrodyta, kad flavonoidai turi šlapimą bei tulžį varančių savybių, veikia priešuždegimiškai bei antibakteriškai ir turi vazoprotekcinių savybių. Flavonoidai slopina mažo tankio lipoproteinų oksidaciją, taip sumažindami aterosklerozės riziką [37;38;40]. Flavonoidai pasižymi plačiu biologiniu poveikiu, todėl svarbu ištirti jų kokybinę ir kiekybinę sudėtį augalinėse žaliavose.

Bendram flavonoidų kiekiui vaistinėje augalinėje žaliavoje nustatyti naudotas metodas su AlCl3 reagentu. Šis metodas yra pagrįstas aliuminio chlorido reakcija su flavonoidais. Aliuminio ir

flavonoidų komplekso formavimas yra vienas iš dažniausiai naudojamų metodų siekiant nustatyti bendrą flavonoidų kiekį [5].

Tyrimo metu buvo nustatyta, kad didžiausias flavonoidų kiekis kaupiamas Aesculus

hippocastanum L. žieduose (16,23 ± 0,23 mg/g) ir lapuose (16,02 ± 0,23 mg/g). Mažiausias flavonoidų

kiekis nustatytas Aesculus hippocastanum L. vaisiuose (2,85 ± 0,04 mg/g.) (7 pav.).

7 pav. Bendras flavonoidų kiekis (mg/g) paprastųjų kaštonų lapuose, žieduose bei vaisiuose. *Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Kapusta ir kt. (2007) tyrę paprastųjų kaštonų vaisių ekstrakto flavonoidų kiekybinę sudėtį nustatė panašų flavonoidų kiekį - 3,5 proc. Hubner ir kt., (1999) paprastųjų kaštonų vaisiuose nustatė ženkliai mažesnį flavonoidų kiekį (0,3 proc.) [37;40].

Įvairių šalių mokslininkai, tyrę paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų flavonoidų sudėtį identifikavo kemferolį, kvercetiną, liuteoliną ir apigeniną bei jų glikozidus: kvercetino gliukozidą,

galaktozidą, arabinozidą, ramnozidą, rutinozidą, kemferolio gliukozidą, arabinozidą ir ramnozidą [64]. Kemferolio ir kvercetino dariniai kraujagysles gali veikti keliais skirtingais būdais. Flavonoidai apsaugo kraujagyslių sieneles ir normalizuoja jų pralaidumą. Taip pat, dėl to, kad stabilizuoja membranų fosfolipidus, stiprina endotelio barjerinį efektą. Jie taip pat turi įtakos trombocitų agregacijai, sekrecijai, bei veikia lygiuosius raumenis [29]. Įvertinus bendrą flavonoidų kiekį, aktualu ištirti individualių flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

ESC metodas yra vienas iš dažniausiai naudojamų metodų siekiant identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti fenolinių junginių kiekį vaistinėje augalinėje žaliavoje. ESC pasižymi trumpa analizės trukme (rezultatai gaunami greičiau nei per 1 val). Šiuo metodu galima identifikuoti daug junginių (beveik visus tirpius junginius) [5;15;52].

Kvercetinas – flavonoidas, kuris yra net 400 kartų stipresnis antioksidantas nei vitaminas E. Šis flavonoidas pasižymi antivirusiniu bei priešbakteriniu poveikiu, taip pat turi stiprų priešalerginį, antihistamininį poveikį. Kvercetinas teigiamai veikia prostatos veiklą, blokuodamas prostatos vėžio ląstelių augimą, taip pat gali sumažinti nuovargį bei nerimą [50;58]. Kemferolis pasižymi stipriomis priešuždegiminėmis ir antioksidantinėmis savybėm. Tyrimų metu nustatyta, kad kemferolis turi priešvėžinių savybių, nes gali citotoksiškai veikti vėžines ląsteles. Kemferolis taip pat pasižymi teigiamu poveikiu širdies ir kraujagyslių sistemai, nes mažina mažo tankio lipoproteinų kiekį kraujyje, taip sumažindamas aterosklerozės riziką. Tam kad pasiekti geriausią poveikį yra svarbu nustatyti, kurioje Aesculus hippocastanum L. augalinėje žaliavoje kaupiasi daugiausiai kvercetino ir kemferolio [51;70].

ESC metodu tirti hidrolizuoti Aesculus hippocastanum L. vaisių, lapų bei žiedų ekstraktai. Tyrimo metu identifikuoti du flavonoidai – kvercetinas ir kemferolis (8 pav.).

8 pav. Aesculus hippocastanum L. lapų (a), vaisių (b) bei žiedų (c) hidrolizuotų etanolinių ekstraktų chromatogramos (λ=370 nm). 1 – kvercetinas, 2 – kemferolis.

Atlikus hidrolizuotų paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktuose identifikuotų flavonoidų kiekybinę analizę nustatyta, kad daugiausiai (p<0,05) kvercetino kaupiasi Aesculus

hippocastanum L. lapuose (28,96 ± 1,02 mg/g). Mažiausias (p<0,05) kvercetino kiekis nustatytas

paprastųjų kaštonų žieduose (6,20 ± 0,37 mg/g). Aesculus hippocastanum L. vaisių ėminiuose nustatyta 8,62 ± 0,32 mg/g kvercetino (9 pav.).

9 pav. Kvercetino kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. lapuose, žieduose bei vaisiuose *Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Atlikus hidrolizuotų paprastųjų kaštonų ekstraktų flavonoidų kiekybinę analizę nustatyta, kad kemferolio kiekis tirtuose ėminiuose įvairuoja nuo 1,82 mg/g iki 40,11 mg/g. Nustatyta, kad daugiausiai kemferolio kaupia Aesculus hippocastanum L. žiedai (40,11 ± 1,66 mg/g). Mažiausias kemferolio kiekis nustatytas Aesculus hippocastanum L. vaisiuose ( 1,82 ± 0,11 mg/g). Paprastųjų kaštonų lapuose nustatyta 5,75 ± 0,21 mg/g kemferolio (10 pav.)

10 pav. Kemferolio kiekis (mg/g) Aesculus hippocastanum L. lapuose, žieduose bei vaisiuose *Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Kemferolio kiekybinę sudėtį paprastųjų kaštonų augalinėse žaliavose tyrė ir kiti mokslininkai. Lyginant su mūsų gautais rezultatais, Kedzieski ir kt. (2016), tyrę paprastųjų kaštonų vaisių flavonoidų sudėtį, nustatė mažesnį kiekį kemferolio (0,0007-0,0764 proc.) [41].

Palyginus kvercetino ir kemferolio kiekybinę sudėtį paprastųjų kaštonų augalinėse žaliavose, nustatyta, kad kvercetinas yra vyraujantis komponentas paprastųjų kaštonų lapuose ir vaisiuose, o paprastųjų kaštonų flavonoidų komplekse dominuoja kemferolis. Hleba ir kt. (2014), tyrę hidrolizuotų paprastųjų kaštonų žiedų ekstraktų biologiškai aktyvių junginių sudėtį taip pat nustatė, kad flavonoidų komplekse dominuojantis junginys yra kemferolis [31].

Siekiant įvertinti individualių flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį Aesculus

hippocastanum L. augalinėse žaliavose atlikta nehidrolizuotų lapų, žiedų ir vaisių ekstraktų ESC

analizė. Aesculus hippocastanum L. vaisiuose, lapuose bei žieduose identifikuoti 6 junginiai: rutinas, hiperozidas, izokvercetinas, avikularinas, astragalinas ir kvercitinas (11 pav.).

11 pav. Aesculus hippocastanum L. lapų (a), vaisių (b) bei žiedų (c) chromatogramos ( λ 350 nm). 1 – rutinas, 2 – hiperozidas, 3 – izokvercetinas, 4 – avikularinas, 5 – astragalinas, 6 – kvercitrinas.

Tiriant nehidrolizuotų Aesculus hippocastanum L. lapų augalinės žaliavos ekstraktų kokybinę sudėtį identifikuoti 5 junginiai: rutinas, hiperozidas, izokvercitrinas, avikularinas ir kvercitrinas. Astragalino paprastųjų kaštonų lapų ėminiuose neaptikta. Oszmiański ir kt. (2014) paprastųjų kaštonų lapuose taip pat identifikavo hiperozidą, avikulariną ir kvercitriną, tačiau rutino nenustatė [54].

Paprastųjų kaštonų lapuose daugiausia nustatyta kvercitrino (8,51 ± 0,40 mg/g). Avikularino

Aesculus hippocastanum L. lapuose nustatyta 1,51 ± 0,07 mg/g. Rutino kiekis (0,05 ± 0,001 mg/g)

mažiausias iš visų paprastųjų kaštonų lapuose identifikuotų flavonoidų. Hiperozido kaštonų lapų ėminiuose nustatyta 0,20 ± 0,09 mg/g, izokvercitrino – 0,17 ± 0,007 mg/g. (12 pav.)

Mūsų nustatytas hiperozido kiekis paprastųjų kaštonų lapuose, atitinka kitų mokslininkų nustatytą kvercitrino ir hiperozido kiekį (atitinkamai, 8,22 mg/g ir 0,20 mg/g). Oszmiański ir kt., (2014) tyrę paprastųjų kaštonų lapų flavonoidų kiekybinę sudėtį nustatė didesnį kiekį avikularino 2,48 mg/g.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Rutinas Hiperozidas Izokvercitrinas Avikularinas Kvercitrinas

K ie k is ; m g/ g

12 pav. Flavonoidų kiekybinė sudėtis Aesculus hippocastanum L. lapuose *Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Tiriant nehidrolizuotų Aesculus hippocastanum L. žiedų augalinės žaliavos ekstraktų kokybinę sudėtį identifikuoti 5 junginiai: rutinas, hiperozidas, avikularinas, astragalinas ir kvercitrinas. Izokvercitrino paprastųjų kaštonų žiedų ėminiuose neaptikta.

Aesculus hippocastanum L. žieduose daugiausia nustatyta astragalino (12,26 ± 0,53 mg/g).

Avikularino paprastųjų kaštonų žieduose kaupiasi labai nedidelis kiekis (0,09 ± 0,003 mg/g). Paprastųjų kaštonų žiedų ėminiuose rutino nustatyta 0,35 ± 0,01 mg/g, kvercitrino nustatyta 0,45 ± 0,21 mg/g. Hiperozido paprastųjų kaštonų žieduose nustatyta mažiausiai iš visų identifikuotų flavonoidų – 0,06 ± 0,003 mg/g. (13 pav.)

13 pav. Flavonoidų kiekybinė sudėtis Aesculus hippocastanum L. žieduose *Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Tiriant nehidrolizuotų Aesculus hippocastanum L. vaisių augalinės žaliavos ekstraktų kokybinę sudėtį identifikuoti 4 junginiai: rutinas, izokvercitrinas, astragalinas ir kvercitrinas. Hiperozido ir avikularino paprastųjų kaštonų vaisių ėminiuose neaptikta. Įvertinus paprastųjų kaštonų vaisių ėminių flavonoidų glikozidų kiekybinę sudėtį nustatyta, kad vyraujantis komponentas yra rutinas. Rutino paprastųjų kaštonų vaisių ėminiuose nustatyta 0,543 ± 0,40 mg/g. Astragalino kiekis (0,023 ± 0,0001 mg/g) mažiausias iš visų paprastųjų kaštonų sėklose identifikuotų flavonoidų. Izokvercitrino kaštonų vaisių ėminiuose nustatyta 0,060 ± 0,09 mg/g, kvercitrino – 0,093 ± 0,007 mg/g. (14 pav.)

14 pav. Flavonoidų kiekybinė sudėtis Aesculus hippocastanum L. vaisiuose *Skirtingos raidės parodo statistiškai reikšmingus (p<0,05) skirtumus tarp ėminių

Apibendrinant gautus tyrimų rezultatus galima teigti, kad tų pačių flavonoidų kokybinė ir kiekybinė sudėtis skirtingų Aesculus hippocastanum L. augalinių žaliavų ėminiuose skiriasi. Nustatyta, kad kvercetino daugiausiai (p<0,05) kaupia Aesculus hippocastanum L. lapai (28,96 ± 1,02 mg/g), mažiausiai (p<0,05) – žiedai (6,20 ± 0,37 mg/g). Kemferolio daugiausia (p<0,05) kaupia Aesculus

hippocastanum L. žiedai (40,11 ± 1,66 mg/g), mažiausiai (p<0,05) – vaisiai (1,82 ± 0,11 mg/g). Rutino

daugiausiai (p<0,05) nustatyta paprastųjų kaštonų vaisiuose (0,543 ± 0,40 mg/g), mažiausiai (p<0,05) rutino nustatyta paprastųjų kaštonų lapuose (0,54 ± 0,40 mg/g). Hiperozido didžiausias kiekis (p<0,05) nustatytas paprastųjų kaštonų lapuose (0,204 ± 0,009 mg/g), mažiausiai (p<0,05) nustatyta žieduose – 0,058 ± 0,003 mg/g. Aesculus hippocastanum L. vaisiuose hiperozido iš vis neaptikta. Izokvercitrino didžiausias kiekis (p<0,05) nustatytas Aesculus hippocastanum L. lapuose (0,172 ± 0,007 mg/g), mažiausias kiekis (p<0,05) – vaisiuose (0,060 ± 0,09 mg/g). Paprastųjų kaštonų žieduose

izokvercitrino nenustatyta. Avikularino daugiausia (p<0,05) kaupia Aesculus hippocastanum L. lapai (1,508 ± 0,07 mg/g), mažiausiai (p<0,05) – žiedai (0,095 ± 0,09 mg/g). Astragalino didžiausias kiekis (p<0,05) nustatytas Aesculus hippocastanum L. žieduose (12,564 ± 0,53 mg/g), mažiausias (p<0,05) nustatytas vaisiuose (0,023 ± 0,0001 mg/g). Kvercitrino didžiausias kiekis (p<0,05) nustatytas

Aesculus hippocastanum L. lapuose (8,514 ± 0,40 mg/g), mažiausias (p<0,05) kvercitrino kiekis

nustatytas Aesculus hippocastanum L. vaisiuose (0,093 ± 0,007 mg/g).

3.3. Paprastųjų kaštonų augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo

tyrimai

Kiekviename organizme susidaro laisvieji radikalai, kurie gali sukelti įvairias ligas (pvz. širdies bei kraujagyslių lėtines ligas, vėžinius susirgimus ir kt.) [12;63]. Augalinių žaliavų ekstraktuose esančių fenolinių junginių bei flavonoidų biologinis poveikis yra siejamas su antioksidantiniu aktyvumu, todėl yra svarbu nustatyti ekstraktų antioksidantinį aktyumą [45]. Antioksidantiniai tyrimai atliekami in vitro. Dažniausiai pasirenkami šie metodai: DPPH, ABTS ir FRAP spektrofotometriniai tyrimai. Šie metodai yra gana paprasti ir nereikalaujantys papildomos įrangos. Tyrimų metu įvertinamos antioksidantinės tiriamosios žaliavos savybės. Kadangi tyrimai atliekami sudėtiniuose mišiniuose (vaistinės augalinės žaliavos ekstraktuose) tyrimų metu yra nustatomas suminis antioksidantinis aktyvumas, o ne atskirų komponentų, esančių ekstrakto sudėtyje [4;8].

ABTS radikalo-katijono surišimo metodas yra gana paprastas ir nereikalaujantis papildomos sudėtingos įrangos. Šiuo metodu galima tirti tiek lipofilines, tiek hidrofilines sistemas, tyrimai gali būti atlikti plačiame pH spektre [4;63]. Atlikus antioksidantinio aktyvumo tyrimą taikant ABTS radikalo-katijono surišimo metodą nustatyta, kad stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymi Aesculus

hippocastanum L. žiedų (294,68 ± 2,13 µmol TE/g) ir lapų (293,93 ± 0,85 µmol TE/g) ekstraktai

(p<0,05). Silpniausias antioksidantinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas ištyrus A. hippocastanum L. vaisių ekstraktus (249,43 ± 1,80 µmol TE/g) (15 pav.).