MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
ERIKA STRAIGYTĖ
POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS GEBENIŲ LIPIKIŲ (HEDERA
HELIX L.) LAPŲ AUGALINIUOSE EKSTRAKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. R. Marksienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS
AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data:
POLIFENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS GEBENIŲ LIPIKIŲ (HEDERA
HELIX L.) LAPŲ AUGALINIUOSE EKSTRAKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. dr. R. Marksienė Data: Recenzentas: Data: Darbą atliko: Magistrantė Erika Straigytė Data: KAUNAS, 2019
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Gebenė lipikė (Hedera helix L.) – morfologija, augimas, paplitimas. ... 11
1.2 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) cheminė sudėtis ... 12
1.2.1 Fenoliniai junginiai ... 13
1.2.2 Flavonoidai ... 13
1.3 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) biologiškai aktyvių junginių poveikis ... 14
1.3.1 Poveikis kvėpavimo sistemai ... 15
1.3.2 Antimikrobinis poveikis... 15
1.3.3 Priešuždegiminis poveikis ... 16
1.4 Biologiškai aktyvių junginių ir antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 17
1.4.1 Spektrofotometriniai metodai naudojami fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo nustatymui ... 17
1.4.2 Reakcija su Folin- Ciocalteu reagentu ... 18
1.4.3 Berlyno mėlynojo reakcija ... 18
1.4.4 Reakcija su aliuminio (III) chloridu ... 18
1.4.5 Reakcija su 2,4 – dinitrofenilhidrazonu (DNPH) ... 18
1.4.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu ... 19
1.4.7 Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas ... 19
1.4.8 Dujų chromatografijos metodas (DC) ... 20
1.4.9 Plonasluoksnė chromatografija (PC) ... 21
1.5 Augaliniai vaistiniai preparatai Lietuvoje ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1 Tyrimo objektai ... 23
2.3 Aparatūra... 24
2.4 Tiriamo pavyzdžio ruošimas ... 24
2.5 Spektrofotometrinio tyrimo metodai... 24
2.5.1 Bendras fenolinių junginių kiekio, išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin – Ciocalteu metodu ... 24
2.5.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 25
2.5.3 Antioksidantinis CUPRAC metodo tyrimas spektrofotometriniu metodu ... 26
2.6 Statistinė duomenų analizė ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1 Spektrofotometrinės analizės rezultatai ... 28
3.1.1 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapuose surinktuose iš Europoje, spektrofotometriniu metodu ... 29
3.1.2 Bendras flavonoidų nustatymas gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose surinktuose iš skirtingų Europos miestų, spektrofotometriniu metodu ... 30
3.1.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose... 31
3.1.4 Europoje vyraujantys fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo kiekiai gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų augaliniuose ekstraktuose ... 32
3.1.5 Biologiškai aktyvių junginių kiekių įvairavimo palyginimas pagal Europos regionus ... 33
3.1.6 Bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo kiekio palyginimas Lietuvoje surinktoje gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų žaliavoje... 34
3.1.7 Bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo palyginimas gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalinėje žaliavoje surinktoje Kaune ir Naujoje akmenėje skirtingais metais ... 35
3.2 Rezultatų apibendrinimas... 37
4. IŠVADOS ... 39
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40
SANTRAUKA
E. Straigytės baigiamasis magistro darbas ,,Polifenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų augaliniuose ekstraktuose”. Darbo vadovas doc. dr. R. Marksienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: gebenė lipikė (Hedera helix L.) , spektrofotometrija, fenoliniai
junginiai, flavonoidai, antioksidacinis aktyvumas, CUPRAC.
Tyrimo tikslas: Įvertinti skirtingose Europos šalyse surinktų gebenių lipikių (Hedera
helix L.) lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ir polifenolinių junginių kiekį
spektrofotometriniu metodu.
Tyrimo uždaviniai: Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį esantį gebenių lipikių
(Hedera helix L.) lapų ekstraktuose; Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose; Nustatyti antioksidacinį aktyvumą gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose CUPRAC metodu; Palyginti bendrus fenolinių junginių ir flavonoidų kiekius bei antioksidacinį aktyvumą gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliavoje surinktoje skirtinguose Europos miestuose.
Tyrimo objektas ir metodai: Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapai surinkti iš įvairių
Europos šalių (n=10).
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas naudojant Folin – Ciocalteu reagentą spektrofometriniu metodu. Rezultatai apskaičiuoti pagal galo rūgšties kalibracinį grafiką mg/ml. Bendras flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu aliuminio (III) chlorido reakcija. Rezultatai apskaičiuoti pagal rutino ekvivalentą mg/g. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu CUPRAC metodu. Rezultatai apskaičiuoti pagal trolokso ekvivalentą mg/g.
Rezultatai ir išvados: Europoje surinktose augalinėse žaliavose bendras fenolinių
junginių ir flavonoidų kiekis buvo skirtingas. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Naujoje Akmenėje (2,104 0,052 GRE mg/ml), o mažiausias – Vienoje (0,342 0,01 GRE mg/ml). Didžiausias kiekis flavonoidų nustatytas taip pat Naujoje Akmenėje (0,280 0,016 RE mg/g), o mažiausias nustatytas Bratislavoje (0,146 0,007 RE mg/g). Taip pat buvo nustatytas gebenių lipikių lapų antioksidacinis aktyvumas. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas Naujoje Akmenėje (0,682 0,017 TE mg/g), o mažiausias Bratislavoje (0,025 0,001 TE mg/g) surinktuose lapuose.
SUMMARY
E. Straigytė master thesis “Evaluation of polyphenol compounds and antioxidant activity in Ivy (Hedera helix L.) leaves. The supervisor is doc. dr. R. Marksienė; Lithuanian University of Health Science Faculty of Pharmacy Department of Analytical and Toxicological Chemistry – Kaunas.
Key words: Ivy leaves (Hedera helix L.), spectrophotometry, phenols, flavonoids,
antioxidant activity, CUPRAC.
The aim: To evaluate the antioxidant activity and the amount of polyphenolic
compounds in ivy leaves (Hedera helix L.) extracts collected in different European countries by spectrophotometric method.
The objectives: Determine the total amount of phenolic compounds in ivy leaves
(Hedera helix L.); Determine the total flavonoid content in ivy leaves (Hedera helix L.); To measure the antioxidant activity of ivy leaves (Hedera helix L.) using CUPRAC method; Compare the total quantities of phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity of ivy leaves (Hedera helix L.) materials collected in different European cities.
Material and methods: Ivy leaves (Hedera helix L.) collected from different European
countries (n=10).
The total content of phenolic compounds has been evaluated by Folin-Ciocalteu method and calculated by gallic acid equivalent. Total content of flavonoids have been evaluated using spectrophotometer, results calculated and expressed in equivalent of rutin. The antioxidant activity has been measured with CUPRAC assay using spectrophotometer.
Results and conclusions: The total content of phenolic compounds and flavonoids
collected in Europe were different. Maximum content of phenolic compounds was determined in Naujoji Akmenė, Lithuania (2,104 0,052 GRE mg/ml) and the minimum was in Vienna (0,342 0,01 GRE mg/ml). Maximum content of flavonoids were determined also in Naujoji Akmenė, Lithuania (0,280 0,016 RE mg/g) and the minimum were identificated in Bratislava (0,146 0,007 RE mg/g). In this research was measured antioxidant activity of ivy leaves. Maximum antioxidantical activity show off leaves from Naujoji Akmenė, Lithuania (0,682 0,017 TE mg/g) and the minimum activity were in leaves from Bratislava (0,025 0,001 TE mg/g).
PADĖKA
Už patarimus, pagalbą ir konsultacijas ruošiant magistro baigiamąjį darbą dėkoju doc. dr. Rūtai Marksienei.
Už vertingus patarimus ir pagalbą dirbant laboratorijoje dėkoju lektoriui Mindaugui Marksai.
Dėkoju Ivan Bezruk už suteiktą augalinę gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliavą, kuri buvo rinkta ne Lietuvoje.
SANTRUMPOS
CUPRAC – (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) GRE – galo rūgšties ekvivalentas
RE – rutino ekvivalentas TE – trolokso ekvivalentas
DNPH – 2,4 – dinitrofenilhidrazonas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija DC – dujų chromatografija
PC – plonasluoksnė chromatografija UV – ultravioletinė spinduliuotė
ĮVADAS
Šiuolaikinėje visuomenėje vis dažniau atsigręžiama į vaistinius augalus ir jų panaudojimą gydymo tikslais. Didelis dėmesys yra skiriamas jų sudėtyje esančioms biologiškai aktyvioms medžiagoms, ieškoma būdų kaip greičiau ir tiksliau jas išskirti siekiant panaudoti vaistinių preparatų kūrime.
Šio darbo tyrimo objektas – gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalinė žaliava. Plačiai visame pasaulyje paplitusios gebenės lipikės (Hedera helix L.) kaupia tokias biologiškai aktyvias medžiagas kaip: fenolinės rūgštys, flavonoidai, saponinai, polifenoliniai junginiai, steroidai, aminorūgštys bei saponinai [1,2,5]. Šie junginiai lemia gebenių spazmolitinį, antimikrobinį, priešgrybelinį, priešuždegiminį poveikį bei poveikį kvėpavimo sistemai. Visa tai yra labai svarbu siekiant sukurti veiksmingą farmacinį preparatą [6,7,8]. Dažniausiai tokie preparatai yra vartojami atsiradus kosuliui, klampioms gleivėms ar peršalimo ligoms. Preparatų, kurie skirti palengvinti kosulio ir peršalimo simptomus, pagrindinė sudedamoji dalis – gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktas, kuris remiantis eksperimentais yra veiksmingas ir gerai toleruojamas. Gebenių lapų ekstraktas taip pat yra efektyvus gydant uždegimines bronchų ligas [8,10,11]. Preparatų formos įvairios – sirupai, geriamieji lašai ir tirpalai, šnypščios tabletės.
Gebenių lipikių cheminė sudėtis yra gana plačiai išanalizuota, tačiau yra žinoma, kad sudėtis ir kokybė yra labai priklausoma nuo klimato bei augimo sąlygų, todėl yra tikslinga išsiaiškinti kiekybinę gebenių lipikių (Hedera helix L.), augančių įvairiose Europos šalyse, lapų sudėtį.
Šiuo darbu siekiama nustatyti ir palyginti bendrą fenolinių junginių, flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą augalinėje žaliavoje, surinktoje iš skirtingų Europos miestų, taikant spektrofotometrinius metodus.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas:
Įvertinti skirtingose Europos šalyse surinktų gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ir polifenolinių junginių kiekį spektrofotometriniu metodu.
Uždaviniai:
1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį esantį gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose.
2. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose. 3. Nustatyti antioksidacinį aktyvumą gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose
CUPRAC metodu.
4. Palyginti bendrus fenolinių junginių ir flavonoidų kiekius bei antioksidacinį aktyvumą gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliavoje surinktoje skirtinguose Europos miestuose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Gebenė lipikė (Hedera helix L.) – morfologija, augimas, paplitimas.
1 pav. Gebenė lipikė (Hedera helix L.) [51]
Gebenės lipikės (Hedera helix L.) – nuolat žaliuojančios ir laipiojančios lianos augalas, priklausantis aralijinių (Araliaceae) šeimai ir gebenės (Hedera) genčiai. Gebenės lapai odiški, tamsiai žali, dvejopi, 4 -10 cm ilgio ir pločio. Generatyvinės šakelės turi sveikus, be skiaučių lapus, o vegetatyvinės – lapus su 3-5 skiautėmis. Lapų viršutinė dalis yra tamsiai žalia, blizganti, gyslota, o apatinė lapo dalis pilkšvai žalia su dar ryškesniu gyslotumu. Gebenių žydėjimas prasideda vasarą (liepos mėn.) ir tęsiasi iki vėlyvo rudens (rugsėjo – spalio mėn.). Žiedynai rutulio pavidalo, o žiedai susitelkę ant žiedyno – smulkūs ir gelsvi. Vaisiai – mažos juodos uogos [1]. Gebenės augdamos šalia vertikalių paviršių, tokių kaip medžiai, pastatai, akmenys ar uolos gali užaugti net iki 20-30 metrų aukščio, nes savo šaknelių pagalba geba prisitvirtinti ir augti ant jų. Kitu atveju gebenės auga kaip danga, užklojanti žemės paviršių [2].
Gebenės pasaulyje plačiai paplitusios, jos sutinkamos vakarinėje Azijoje, Europoje bei šiaurinėje Afrikos dalyje [3]. Taip pat jos yra sutinkamos rytinėje ir vakarinėje JAV dalyje, Turkijoje, Ukrainoje, šiaurės Irane ir Portugalijoje [4]. Daugelyje kitų pasaulio šalių gebenės paplitusios kaip dekoratyvinis augalas, taip pat auginamos siekiant uždengti tam tikras vietas. Gebenės lipikės nesunkiai auga įvairiomis sąlygomis. Dažniausiai yra sutinkamos molingame ir turtingame dirvožemyje, tačiau gali augti ir sausame dirvožemyje, smėlyje bei lengvai toleruoja sausrą. Taip pat jos yra atsparios atmosferos teršalams. Stipri šviesa kenkia gebenių augimui, todėl jos puikiai auga kaip žemės paklotas po medžiais, kur žolė auga sunkiai [2].
1.2 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) cheminė sudėtis
Gebenėse lipikėse (Hedera helix L.) randama tokių junginių kaip saponinai, flavonoidai, polifenoliniai junginiai, aminorūgštys, steroidai, vitaminai, fenolinės rūgštys. Lapai daugiausiai kaupia triterpeninius saponinus, tokius kaip: α-hederinas, β-hederinas, δ-hederinas, hederakosidai A,B,C,D,E,F,G,H,I, oleanolio rūgštis. Šių junginių gebenėse yra 2,5 – 6 %. Svarbiausi ir sudarantys didesnę dalį visų kaupiamų medžiagų yra hederageniniai: hederakosidas C (1,7 – 4,8 %), hederakosidas D (0,4 – 0,8%), hederakosidas B (0,1 – 0,2 %) bei monodesmosidas α-hederinas (0,1 – 0,3 %). Yra nustatyta, kad didesnis kiekis triterpeninių saponinų, net 8, 51 % yra lapuose, o kitose augalo dalyse šių medžiagų kiekis yra kur kas mažesnis. Rutinas, kvercetinas, astragalinas, kamferolis – flavonoidai, kurie yra dažniausiai sutinkami gebenių lipikių lapuose [1,2,5].
1 lentelė. Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapuose randami junginiai
Junginio
pavadinimas Struktūrinė formulė
Hederakosidas C
Rutinas
1.2.1
Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai yra viena iš svarbiausių grupių tarp antioksidantinį poveikį turinčių fitocheminių medžiagų. Fenolinių junginių apibrėžimas apima didelį kiekį junginių (daugiau kaip 8000), kurie savo struktūroje turi bent vieną aromatinį žiedą su viena ar daugiau hidroksi grupių. Fenoliai augaluose susidaro kaip antriniai metabolitai iš cikloheksano. Fenilalanino amonio liazė (PAL) yra pagrindinis fermentas, kuris katalizuoja fenolių biosintezę iš aromatinės fenilalanino amino rūgšties [17].
Fenolių struktūra svyruoja nuo paprastų, mažos molekulinės masės su vienu aromatiniu žiedu iki didelių, sudarančių kompleksus su taninais ir išvestiniais polifenoliais. Jie gali būti klasifikuojami pagal anglies atomų skaičių ir išsidėstymą flavonoiduose (flavonoliuose, flavonuose, flavan-3-oliuose, antocianidinuose, flavononuose, izoflavonuose ir kituose), ne flavonoiduose (fenolinėse rūgštyse, stilbenuose ir kituose), taip pat dažnai yra randami susijungę su organinėmis rūgštimis ir cukrais [18,19].
Fenolinių junginių prevencinis poveikis širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinių ligų bei vėžio atveju yra nustatytas remiantis epidemiologinių tyrimų in vitro ir in vivo duomenimis. Taip pat nustatyta, kad polifenoliai veikia įvairių fermentų ir ląstelių receptorių aktyvumą [20].
1.2.2
Flavonoidai
Tai mažos molekulinės masės antriniai metaboliniai polifenolių junginiai, kurie plačiai pasiskirstę augalų karalystėje. Flavonoidų biologinis aktyvumas yra svarbus augalams, gyvūnams ir bakterijoms. Augaluose flavonoidai yra sintezuojami tam tikrose vietose ir yra atsakingi už spalvą ir gėlių aromatą. Flavonoidai apsaugo augalus nuo skirtingų biotinių ir
abiotinių įtampų ir veikia kaip unikalus UV filtras. Taip pat jie yra atsakingi už augalų atsparumą šalčiui ir sausrai [21,22].
Flavonoidai yra sudaryti iš penkiolikos anglies atomų, kurie įprastai susideda iš dviejų aromatinių žiedų (A ir B) sujungtų trimis anglies atomais, kurie susijungia į heterociklinį žiedą (C). Flavonoidai, kurių randama daugiau kaip 6500, yra pirmoji polifenolių klasė turinti C6-C3-C6 skeletą. Priklausomai nuo aromatinio žiedo sąsajos su benzopirano žiedu flavonoidai gali būti skirstomi į tris klases: flavonoidai, izoflavonoidai ir neoflavonoidai. Priklausomai nuo oksidacijos ir prisotinimo laipsnio heterocikliniuose žieduose flavonoidai gali būti suskirstyti į: flavano, flavanono, dihidroflavonolio, flavonolio, flavono, flavon-3-olio ir flavon-3,4-diolio grupes. Izoflavonoidai yra skirstomi į šiuos pogrupius: izoflavono, izoflavono, izoflavonono, izoflavon-3-eno, izoflavonolio, rotenoido, kumestano, 3-arilkumarino, kumaronochromeno, kumaronochromono ir pterokarpino. Neoflavonoidai taip pat skirstomi į tris pogrupius: 4-arilkumarilo, 3,4-dihidro-4-arilkumarino ir neoflaveno [23,24,25].
2 pav. Flavonoidų struktūrinė formulė [52]
1.3 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) biologiškai aktyvių junginių poveikis
Farmakologinį poveikį gebenėje labiausiai apsprendžia triterpeniniai saponinai, dėl kurių gebenės lapų ekstraktai pasižymi spazmolitiniu, priešgrybeliniu ir antibakteriniu poveikiu, mažina lygiųjų raumenų ir bronchų spazmus. Priešgrybelinis ir antibakterinis poveikis pastebėtas prieš gram+ bakterijas [6,7].
Vienas dažniausiai sutinkamų gebenės lipikės poveikių – atsikosėjimo lengvinimas. Taip pat yra tyrimų, kurių rezultatai rodo, jog gebenės lapų ekstraktai yra naudingi bronchito gydyme. Nustatyta, kad gydant bronchitą poveikis yra stipresnis, kai gebenės sirupas yra
papildomas vaistas (poveikis stipresnis, jeigu tai yra ne antibiotikai). Teigiama, kad sekretolitinės ir bronchodilatuojančios savybės yra susijusios su α-hederinu [8].
Taip pat gebenė lipikė yra naudojama ir kosmetiniuose preparatuose: šampūnuose, kremuose, losjonuose. Šių kosmetinių priemonių paskirtis - mažinti odos niežulį, kovoti su celiulitu [9].
1.3.1
Poveikis kvėpavimo sistemai
Literatūroje yra teigiama, jog α-hederinas yra svarbiausias junginys iš visų saponinų, nes jis yra atsakingas už terapinį poveikį. α-hederinas slopina β2 receptorių internalizaciją, todėl padidėja ląstelių adrenerginis praeinamumas. Tada II tipo alveolinės epitelio ląstelės sužadina paviršinio aktyvumo medžiagas, ko pasekoje yra sumažinamas gleivių klampumas. Todėl gebenės preparatai yra naudojami bronchinių uždegiminių ligų gydyme.
2009 m. buvo atliktas tyrimas, kuriame dalyvavo 9657 pacientai sergantys bronchitu (iš jų 5181 vaikas). Pacientams buvo skiriamas sirupas su džiovintų gebenės lipikės lapų ekstraktu. Dozė buvo paskirta pagal amžių:
• 0-5 metų: po 2,5 ml 3 kartus per dieną; • 6-12 metų: po 5 ml 3 kartus per dieną;
• > 12 metų ir suaugusieji: po 5-7,5 ml 3 kartus per dieną.
Vidutinė gydymo sirupu trukmė buvo 7 dienos ir nustatyta vidutinė dozė buvo 15 ml per parą (10 ml vaikams ir 22 ml suaugusiesiems). Po 7 dienų gauti rezultatai parodė, jog 95,1% pacientų pasireiškė simptomų pagerėjimas arba išnykimas, taip pat 93% sumažėjo arba išnyko kosulys ir 91% sumažėjo arba išnyko dusulys ir krūtinės skausmas [8,10,11].
1.3.2 Antimikrobinis poveikis
Gebenių lipikių ekstraktas, su dideliu kiekiu hederakosido C, pasižymi aktyvumu net prieš 23 bakterijas (22 (gram+ ir gram-) bakterijos bei 1 mielė) [1].
2012 m. buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo ištirti 27 vandeniniai ekstraktai gauti iš 21 augalo (vienas iš jų yra gebenė lipikė), kurie yra naudojami kvėpavimo takų infekcijoms gydyti. Antibakterinis ir priešgrybelinis aktyvumas prieš dermatofitus ir mieles buvo nustatytas naudojant mikrodilutacijos metodą. Testams atlikti buvo naudojami Mueller Hinton sultinys ir
Mueller Hinton agaras. Tyrimo metu kultūra buvo intubuota ties 37o C ir laikyta 7 dienas. Rezultatai parodė, kad visi ekstraktai buvo aktyvesni prieš teigiamas nei prieš gram-neigiamas bakterijas. Visi ekstraktai turėjo slopinamąjį aktyvumą prieš gram-teigiamas bakterijas, tokias kaip Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis. Geriausias antimikrobinis poveikis prieš gram-neigiamas bakterijas, kuriuo pasižymėjo visi ekstraktai, buvo prieš Haemophilus influenzae. Taigi šis tyrimas įrodo, jog augalai, ištirti šiame tyrime, jų tarpe ir gebenės lipikės, gali būti naudojami kaip potencialūs antimikrobinių medžiagų šaltiniai. Taip pat šis poveikis puikiai gali būti pritaikomas įvairių farmacinių preparatų kūrime [12,13].
1.3.3
Priešuždegiminis poveikis
Nustatyta, kad keletas junginių – α-hederinas, hederakosidas C, hederakosidas E, hederakosidas F, išskirtų iš gebenių lipikių, turi priešuždegiminių savybių [14]. Siekant įrodyti gebenių lipikių priešuždegiminį poveikį buvo atliekamas tyrimas, kuriame buvo siekiama sustiprinti oseltamiviro (kitaip žinomo kaip Tamiflu) antivirusinį veiksmingumą kartu vartojant gebenių lapų ekstraktą. Tyrimams buvo naudojamos 6 pelės, kurios 5 dienas gavo oseltamiviro, gebenių ekstrakto ir oseltamiviro kartu su gebenių ekstraktu injekcijas. Tyrime buvo naudotas suboptimalus oseltamiviras, kuris imituoja prastą klinikinį atsaką į gydymą antivirusiniais vaistais. Taigi geriamojo gebenių ekstrakto vartojimas kartu su oseltamiviru padidino jo antivirusinį aktyvumą, o hederakosidas F žymiai sumažino citopatinį poveikį ląstelėms užsikrėtusioms PR8. Taip pat lyginant gydymu tik su oseltamiviru – infekuotoms pelėms sumažėjo plaučių uždegimas. Naudojant suboptimalų oseltamivirą ir gebenių ekstraktą padidėjo apsauga nuo PR8 infekcijos, taigi tai paaiškina gebenių lipikių antivirusinį ir priešuždegiminį poveikį [15].
Kitame tyrime buvo nustatinėjamas α-hederino priešuždegiminis poveikis esant plaučių uždegimui. Tyrime buvo naudotos 48 vyriškos lyties jūrų kiaulytės, kurios buvo suskirstytos į kontrolines, jautrias ir iš anksto apdorotas grupes. Įvertinus plaučių histopatologiją, IL-4, IFN-γ ir IL-17 koncentraciją kraujyje buvo galima matyti, kad visi patologiniai pokyčiai pagerėjo iš anksto apdorotose grupėse. Šis tyrimas įrodė, kad α-hederinas gali susilpninti plaučių uždegimą bei pagerinti citokinų poveikį [16].
1.4 Biologiškai aktyvių junginių ir antioksidacinio aktyvumo nustatymo
metodai
Prieš pradedant nustatinėti biologiškai aktyvius junginius bei antioksidacinį aktyvumą yra būtina paruošti augalinės žaliavos ekstraktus. Žaliava gali būti naudojama šviežia, šaldyta ar džiovinta, ji yra susmulkinama/sumalama siekiant užtikrinti efektyvesnę ekstrakciją ir žaliavos sąlytį su tirpikliu. Ruošiant ekstraktus svarbiausia tirpiklio parinkimas. Ekstrakcijai dažniausiai naudojami tirpikliai yra šie: alkoholiai (metanolis, etanolis ir propanolis), acetonas, etilacetatas vanduo bei jų mišiniai [26,27].
Yra žinoma gana daug ekstrakcijos metodų, tačiau seniausias ir geriausiai žinomas yra Soksleto metodas bei maceracija. Populiarūs jie yra dėl trumpo ekstrakcijos laiko ir mažų tirpiklio sąnaudų. Tačiau dėl gana mažo efektyvumo, šie metodai buvo pakeisti naujais, labiau ištobulintais metodais: ultragarso ekstrakcija (UAE - ultrasound-assisted extraction), mikrobangos ekstrakcija (MAE – microwave-assisted extraction), superkritinių skysčių ekstrakcija (SFE – supercritical fluid extraction), subkritinio vandens ekstrakcija (SCWE – sub- critical water extraction) ir aukšto hidrostatinio slėgio skysčių ekstrakcija (HHPP – high hydrostatic pressure processing) [28,29].
Fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo nustatymui yra naudojama daug įvairiausių metodų, tačiau dažniausiai naudojami yra šie: efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), dujų chromatografija (DC), plonasluoksnė chromatografija (PC) ir spektrofotometriniai metodai [30].
1.4.1
Spektrofotometriniai metodai naudojami fenolinių junginių,
flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo nustatymui
Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti dažniausiai naudojama reakcija su Folin- Ciocalteu ir Berlyno mėlio susidarymo reakcija. Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti dažniausiai naudojama reakcija su AlCl3 ir reakcija su 2,4 – dinitrofenilhidrazonu (DNPH). Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti dažniausiai taikoma ABTS, DPPH, FRAP ir CUPRAC metodai [30,31].
1.4.2
Reakcija su Folin- Ciocalteu reagentu
Folin – Ciocalteu reagentas sudarytas iš natrio molibdato, natrio volframato ir kitų reagentų mišinio. Reaguodamas su fenoliais keičia spalvą nuo geltonos iki mėlynos, dėl cheminės redukcijos, kuri vyksta šarminėje aplinkoje. Absorbcija išmatuojama spektrofotometru po 30 – 60 min. esant 750 nm šviesos bangos ilgiui. Bendras fenolinių junginių kiekis yra apskaičiuojamas ir išreiškiamas pagal galo rūgšties ekvivalentą [32,33].
1.4.3
Berlyno mėlynojo reakcija
Siekiant greitai nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį naudojama reakcija, kuri yra paremta polifenolinių junginių reakcija, kuri vyksta rūgštinėje aplinkoje su kalioheksocianoferoatu ir geležies (III) chloridu. Žaliavoje esantys polifenoliai oksiduojasi reaguodami su geležies cianido jonu. Tada geležies cianido jonas (𝐹𝑒(𝐶𝑁)63−) redukuojamas iki geležies cianido jonų (𝐹𝑒(𝐶𝑁)64−). 𝐹𝑒(𝐶𝑁)64− reaguodamas su trivalentės geležies jonu sudaro Berlyno mėlynojo kompleksą (𝐹𝑒4−[𝐹𝑒(𝐶𝑁)6]3). Spektrofotometru išmatuojama absorbcija prie 700 nm bangos ilgio. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas ir išreiškiamas pagal tanino rūgšties standartą [34,35].
1.4.4 Reakcija su aliuminio (III) chloridu
Reakcija yra naudojama siekiant nustatyti bendrą flavonoidų kiekį augalinėje žaliavoje. Reakcija pagrįsta flavonoido ir aliuminio komplekso susidarymu rūgštinėje aplinkoje. Spektofotometru yra išmatuojama absorbcija prie 410 – 423 nm šviesos bangos ilgio (absorbcijos maksimumas). Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuojamas ir išreiškiamas pagal rutino, kvercetino, galo rūgšties ar kitos medžiagos ekvivalentą [36,37].
1.4.5
Reakcija su 2,4 – dinitrofenilhidrazonu (DNPH)
Reakcijos metu susidaręs 2,4 – dinitrofenilhidrazonas iškrenta į geltonos, oranžinės ar raudonos spalvos nuosėdas, o tai parodo teigiamą reakciją. Reakcija vykdoma rūgštinėje aplinkoje, tirpalą kaitinant 50°C temperatūroje 50 min. Atvėsinus tirpalą iki kambario
temperatūros matuojama absorbcija prie 495 nm šviesos bangos ilgio. Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuojamas ir išreiškiamas sudarant standartinę kreivę [38].
1.4.6
Antioksidacinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu
Šis metodas pagrįstas redukcija dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) komplekso į chromogeninį (Cu(I)-Nc) kompleksą. Metodo metu redukuojamas dvivalentis varis (Cu (II)) į vienvalentį (Cu (I)). Redukcija vyksta neutralioje aplinkoje per 30 min. Absorbcija matuojama prie 450 nm šviesos bangos ilgio. Antioksidacinis aktyvumas apskaičiuojamas ir išreiškiamas pagal trolokso ar kitų standartinių antioksidantų ekvivalentą [39,40,41].
1.4.7
Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas
Metodas dažniausiai yra taikomas dėl jo suteikiamos galimybės tiksliai ir selektyviai atskirti tarpusavyje labai giminingas medžiagas. Fenolinių junginių kiekybiniam ir kokybiniam nustatymui dažniausiai naudojama atvirkštinių fazių C18 analitinė kolonėlė (RP - C18) su prieškolone. Palaikoma temperatūra 25C, o eliuentų sistema sudaroma iš polinių rūgščių organinių tirpiklių [42,43].
Efektyviosios skysčių chromatografijos privalumai – vienu metu galima leisti kelis mėginius, yra reikalingi nedideli kiekiai tirpiklio ir metodo jautrumas (yra jautresnis už spektrofotometriją ar plonasluoksnę chromatografiją (PC)). Šie privalumai yra labai naudingi siekiant sutaupyti laiko bei sumažinti išlaidas. Tačiau nėra išvengiama ir trūkumų, pagrindiniai jų – brangi ir sudėtinga aparatūra, ilgas analizės laikas [44].
3 pav. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) schema [53]
1.4.8
Dujų chromatografijos metodas (DC)
Dėl greitos ir jautrios analizės šis metodas vis dar vienas dažniausiai naudojamų. Tai toks metodas kur judančioji fazė – dujos. Tačiau dėl mažo fenolinių junginių lakumo šis metodas yra derinamas kartu su masių spektrofotometrija. Įprastai analizuojant dujų fazę reikia atlikti mėginio ekstrakciją, izoliaciją ir valymą bei cheminio derivatizavimo etapą, kai hidroksilo grupės yra pakeičiamos esteriais arba eteriais [45].
Lakiųjų junginių esterifikacijai yra daug galimų reagentų: diazometanas (metilo esterių gamybai), etilo ir metilo chloroformatas (metilo ir etilo esterių gamybai), dimetilo sulfoksidas su metil – jodidu (metilo esterių gamybai). Fenolių nustatyme naudojami trialkilsililai, tokie kaip: N, O-bis- (trimetilsilil) acetamidas (BSA), N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoracetamidas (MSTFA ) bei N, O-bis- (trimetilsilil) -trifluoracematinas (BSTFA) [46].
4 pav. Dujų chromatografo schema [54]
1.4.9
Plonasluoksnė chromatografija (PC)
Plonasluoksnė chromatografija taikoma siekiant nustatyti fenolines rūgštis. Ypatingai naudinga ji yra greitam, augalinių ekstraktų farmakologiškai aktyvių medžiagų, įvertinimui prieš išsamią instrumentinę analizę. Dažniausiai silicio dioksidas yra naudojamas kaip stacionari fazė, o plokštelės yra sudarytos iš 2 - aminoetil difenilborinato ir polietilenglikolio derinio arba iš AlCl3. Aptikimas dažniausiai vyksta naudojant UV šviesą ir esant 350-365 ar 250-260 nm šviesos bangos ilgiui [45].
5 pav. Plonasluoksnės chromatografijos schema [55]
1.5 Augaliniai vaistiniai preparatai Lietuvoje
Gebenių lipikių lapų ekstraktai yra plačiai naudojami atsikosėjimo lengvinimui. Vaistinėse šių preparatų galima rasti įvairiomis formomis: sirupai, šnypščiosios tabletės, geriamieji tirpalai ir geriamieji lašai. Vokietijos kompanija „Engelhard Arzneimittel“ gamina geriamąjį tirpalą „PROSPAN“ su gebenių lipikių ekstraktu (35 mg/5 ml), geriamuosius lašus „PROSPAN“, kurių 1ml yra 20 mg gebenių lapų sausojo ekstrakto, sirupą „PROSPAN“, kurio
1 ml yra 7 mg gebenių lapų sausojo ekstrakto bei šnypščiąsias „PROSPAN“ tabletės, vienoje tabletėje yra 65 mg gebenių lapų sausojo ekstrakto. Visi šie preparatai yra skirti kosulio ir atsikosėjimo pagerinimui sergant ūminiu bronchitu bei kitomis ūminėmis kvėpavimo takų ligomis. Kita Vokietijos įmonė „Krewel Meuselbach“ gamina „HEDELIX“ sirupą ir geriamuosius lašus. 1 ml sirupo yra 8 mg gebenių lapų tirštojo ekstrakto ir 1 ml tirpalo yra 40 mg gebenių tirštojo ekstrakto. Vartojami atsikosėjimo palengvinimui lėtinio bronchito ir peršalimo ligų atvejais. Slovėnijoje įsikūrusi bendrovė „KRKA“ gamina sirupą „HERBION“, kurio 1 ml yra 7 mg gebenių lapų sausojo ekstrakto. Šis sirupas vartojamas atsikosėjimo lengvinimui, kai pasireiškia drėgnas kosulys. Dar viena įmonė „SOPHARMA AD“, kuri įsikūrusi Bulgarijoje, gamina sirupą „HELITUSPAN“, kuris vartojamas gleivių ir skreplių pasišalinimo iš kvėpavimo takų palengvinimui bei produktyvaus kosulio palengvinimui. 1 ml sirupo yra 7 mg gebenių lapų sausojo ekstrakto. Homeopatinių preparatų įmonė „Biologische Heilmittel Heel GmbH“ įsikūrusi Vokietijoje gamina geriamuosius lašus „GALIUM-HEEL N“, kurių sudėtyje be kitų augalinių ekstraktų yra gebenės lipikės lapų ekstrakto (100 g geriamųjų lašų – 5 g gebenių lapų ekstraktas).
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektai
Gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalinė vaistinė žaliava – lapai, surinkti iš įvairių Europos miestų. Žaliava džiovinama kambario temperatūroje, išdžiovinta laikoma popieriniuose maišeliuose kambario temperatūroje, sausoje, tamsioje ir gerai vėdinamoje vietoje.
2 lentelė. Gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalinė žaliava
Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapai (rinkimo vieta) Kaunas; Charkovas; Viena; Budapeštas; Brno; Krokuva; Praha; Bratislava; Varšuva; Naujoji Akmenė;
2.2 Reagentai
1. Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98 proc., Acros organics), 2. Metanolis 99,8 proc. (Sigma- Aldrich, Vokietija),
3. Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV), 4. Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija),
6. Vario (II) chlorido dihidratas („Alfa Aesar GmbH & Co KG“ ,Karlsruhe, Vokietija),
7. Neokuproinas (Sigma- Aldrich,Scnelldorf, Vokietija), 8. Amonio acetatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija),
9. Ledinė acto rūgštis (99,5% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), 10. Aliuminio chloridas (99,99% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), 11. Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija).
2.3 Aparatūra
Augalinės žaliavos ekstraktai iš gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų buvo ruošiami panaudojant ultragarso vonelę (WiseClean). Buvo naudojama vandens gryninimo sistema Millipore (Bedford, MA). Centrifugavimui buvo naudotas Centurion Scientific C2006 (Centurion Scientific Ltd, Jungtinė Karalystė) aparatas. Taip pat svėrimams buvo naudotos analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija).
Bendras fenolinių junginių, flavonoidų ir oksidacinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Dynamica, HALO DB – 20/ UV spectrophotometer). Bandiniams tirti panaudotos 1 cm skersmens kiuvetės.
2.4 Tiriamo pavyzdžio ruošimas
Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,1 g susmulkintų gebenių lipikių lapų. Ekstrakcija vykdoma 50 min. su 10 ml 70 proc. (v/v) metanoliu ultragarso vonioje. Ekstraktai buvo filtruojami per filtravimo popierių ir centrifuguojami. Laikomi tamsioje vietoje tolimesniems tyrimams.
2.5 Spektrofotometrinio tyrimo metodai
2.5.1 Bendras fenolinių junginių kiekio, išreikšto galo rūgšties ekvivalentu,
nustatymas Folin – Ciocalteu metodu
Tyrimams atlikti paruošiamas darbinis reagentas: 7% natrio karbonato tirpalas paruošiamas 17,5 g medžiagos tirpinant 250 ml distiliuoto vandens. Analizei imamas 1 ml
augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, kuris sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagento, 9 ml distiliuoto vandens ir po 5 min. įpilama 10 ml 7% natrio karbonato tirpalas ir praskiedžiama iki 25 ml. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 90 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Praėjus 90 min. spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 750 nm šviesos bangos ilgyje. Matavimai kartojami tris kartus.
Tokiomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamasis tirpalas, buvo paruoštas lyginamasis tirpalas, tačiau vietoje gebenės lipikės augalinės žaliavos ekstrakto buvo pilama 1 ml distiliuoto vandens.
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį.
y = 0,9068x + 0,0617; R2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml [47,48].
2.5.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Ruošiamas reagentas iš 4 ml 96% etanolio, 0,2 ml 33% ledinės acto rūgšties, 0,8 ml 5% heksametilentetramino (5g medžiagos tirpinama 100 ml distiliuoto vandens), 0,6 ml 10% aliuminio chloride ( 10 g aliuminio chloride miltelių tirpinama 100 ml distiliuoto vandens), distiliuoto vandens ir 0,2 ml gebenių lipikių augalinės žaliavos ekstrakto. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti 30 min. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje.
Ruošiant lyginamąjį tirpalą viskas daroma taip pat, tačiau vietoje augalinės žaliavos ekstrakto naudojamas 70% (v/v) etanolis.
Praėjus nustatytam laikotarpiui atliekami matavimai su spektrofotometru prie 407 nm bangos ilgio. Matavimai pakartojami tris kartus.
Gauti duomenys vertinami pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį.
𝑅2 = 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml [47].
2.5.3 Antioksidantinis CUPRAC metodo tyrimas spektrofotometriniu
metodu
CUPRAC reagento tirpalas buvo gautas sumaišius vario druską (CuCl2x2H2O), neokuproiną ((CH3)2 C12 H6N2)) ir acetoninį buferį, kurio pH=7, santykiu 1:1:1. Sumaišytas tirpalas 1 valandą buvo laikytas tamsoje, kambario temperatūroje. CuCl2 tirpalas buvo gamintas atsvėrus 0,17 g CuCl2x2H2O druskos, kuri buvo tirpinama išgrynintame vandenyje ir skiedžiama matavimo kolboje iki 100 ml. Neokuproino tirpalas buvo gamintas tirpinant 0,1566 g neokuproino 70 proc. metanolyje ir skiedžiant matavimo kolboje išgrynintu vandeniu iki 100 ml. Gaminant acetatinį buferį buvo atsverta 0,077 g amonio acetato (NH4CH3CO2), tirpinama vandenyje ir praskiesta vandeniu matavimo kolboje iki 1000 ml.
Tirtų junginių antioksidantiniam nustatymui buvo naudotas UV spektrofotometras ir CUPRAC reagentas. Į kiuvetę įpilama 3 ml sumaišyto reagento tirpalo. Sumaišytas CUPRAC reagentas sudarytas iš lygių dalių: vario (II) chlorido, neokuproino ir buferinio amonio acetato tirpalo, santykiu 1:1:1. Į reagentu užpildytas kiuvetes automatinėmis pipetėmis įpilama 3 μl tiriamojo ekstrakto mėginio. Spektrofotometru matuojama tiriamųjų mėginių šviesos absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Matavimai kartojami tris kartus.
Antioksidantinis aktyvumas CUPRAC metodu išreiškiamas pagal trolokso kalibracinę kreivę.
y=0,3899x + 0,0908; R2 = 0,99;
y = absorbcijos dydis;
2.6 Statistinė duomenų analizė
Gauti duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2016 (Microsoft, JAV) ir ,,SPSS 21” (IBM, JAV) programomis. Bandymai buvo kartoti tris kartus (n=3), apskaičiuotas matematinis vidurkis, standartinis nuokrypis ir statistinis standartinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, kai p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6 pav. Europos šalys iš kurių surinkta augalinė gebenės lipikės (Hedera helix L.) žaliava
Tyrimai buvo atliekami naudojant gebenės lipikės (Hedera helix L.) lapus. Šie lapai buvo surinkti iš įvairių Europos miestų, tokių kaip – Kaunas, Charkovas, Viena, Budapeštas, Brno, Krokuva, Praha, Bratislava, Varšuva, Naujoji Akmenė.
3.1 Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami naudojant metanolinius (70%) (v/v) gebenių lipikių lapų ekstraktus. Tiriant šiuos ekstraktus buvo nustatytas bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis bei antioksidacinis aktyvumas augalinėje žaliavoje. Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentu GRE mg/ml, bendras flavanoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu RE mg/g ir antioksidantinio aktyvumo rezultatai apskaičiuoti pagal trolokso kalibracinę kreivę mg/ml.
Augalinės žaliavos, surinktos įvairiuose Europos miestuose, analizė buvo vykdoma tris kartus (n=3). Gauti rezultatai statistiškai įvertinti, statistiškai reikšmingas skirtumas buvo laikomas, kai p<0,05.
3.1.1
Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas gebenių lipikių
(Hedera helix L.) lapuose surinktuose iš Europoje,
spektrofotometriniu metodu
Pagal galo rūgšties ekvivalentą buvo apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis. Rezultatai pateikiami 7 paveiksle. Gauti rezultatai augaliniuose ekstraktuose įvairuoja nuo 0,342 iki 2,104 GRE mg/ml. Iš diagramos galima nustatyti, jog maksimalus fenolinių junginių kiekis 2,104 ( 0,052) GRE mg/ml yra gebenių lipikių augaliniame ekstrakte, surinktame Naujojoje Akmenėje. Kiek mažesni, bet gana panašūs rezultatai buvo pastebėti Kaune (1,324 0,033 GRE mg/ml), Varšuvoje (1,271 0,05 GRE mg/ml) ir Charkove (1,138 0,03 GRE mg/ml) augaliniuose ekstraktuose. Minimalus fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas gebenių lipikių augaliniame ekstrakte, kurio žaliava buvo surinkta Vienoje – 0,342 ( 0,01) GRE mg/ml. 2011 m. buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo nustatinėjamas bendras fenolinių junginių kiekis 24 augaluose (vienas iš jų gebenė lipikė) surinktuose Sardinijoje. Fenolinių junginių kiekis taikant Folin – Ciocalteu metodą gebenėse lipikėse buvo nustatytas 1,267 0,05 GRE mg/ml fenolinių junginių kiekis [49]. Kitame, 2014 m. Serbijoje atliktame tyrime, kuriame taip pat buvo nustatinėjamas bendras fenolinių junginių kiekis Folin – Ciocalteu metodu, gebenėse lipikėse buvo nustatytas 1,586 0,04 GRE mg/ml fenolinių junginių kiekies [50]. Iš gautų rezultatų galima daryti išvadą, jog augalai, iš kurių buvo pagaminti ekstraktai, fenolinius junginius kaupia labai įvairiais kiekiais. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05.
7 Pav. Spektrofotometriniu metodu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis (mg/ml) gebenių lipikių lapuose; n=3
3.1.2
Bendras flavonoidų nustatymas gebenių lipikių (Hedera helix L.)
lapų ekstraktuose surinktuose iš skirtingų Europos miestų,
spektrofotometriniu metodu
Pagal rutino ekvivalentą buvo apskaičiuotas bendras flavonoidų kiekis. Rezultatai pateikiami 8 paveiksle. Gauti rezultatai gebenių lipikių augaliniuose ekstraktuose įvairuoja nuo 0,146 iki 0,280 RE mg/g. Iš diagramos galima nustatyti, jog maksimalus flavonoidų kiekis yra gebenių lipikių augaliniame ekstrakte surinktame Naujojoje Akmenėje – 0,280 ( 0,016) RE mg/g. Didesniu flavonoidų kiekiu pasižymėjo augaliniai ekstraktai iš Kauno (0,279 0,013 RE mg/g) ir Charkovo (0,251 0,015 RE mg/g). Minimalus flavonoidų kiekis buvo nustatytas augaliniame ekstrakte surinktame Bratislavijoje – 0,146 ( 0,007) RE mg/g. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05.
1.324 1.138 0.342 0.657 0.603 0.481 0.676 0.739 1.271 2.104 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Fen ol ini ų j un gi ni ų k iek is G RE m g/ m l
8 Pav. Spektrofotometriniu metodu nustatytas bendras flavonoidų kiekis (mg/g) gebenių lipikių lapų ekstraktuose; n=3
3.1.3
Antioksidacinio aktyvumo nustatymas gebenių lipikių (Hedera helix
L.) lapų ekstraktuose
Pagal trolokso kalibracinės kreivės regresinę lygtį mg/g buvo apskaičiuoti antioksidacinio aktyvumo duomenys, kurie gauti tyrimą atlikus UV spektrofotometru. Rezultatai pavaizduoti 9 paveiksle. Maksimalus antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas gebenės lipikės lapų ekstrakte iš Naujosios Akmenės – 0,682 ( 0,017) TE mg/g. Kiek mažesniu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo augaliniai ekstraktai iš Kauno (0,664 0,016 TE mg/g), Charkovo (0,528 0,013 TE mg/g) ir Varšuvos (0,282 0,007 TE mg/g). Minimalus antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas gebenės lipikės lapų ekstrakte iš Bratislavos – 0,025 ( 0,001) TE mg/g. Panašus antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas augaliniuose ekstraktuose iš Vienos (0,035 0,001 TE mg/g) ir Prahos (0,03 0,001 TE mg/g). Didesniu nei minimalus antioksidacinis aktyvumas, bet gerokai mažesniu nei maksimalus, pasižymėjo augaliniai gebenių lipikių ekstraktai surinkti Budapešte (0,169 0,004 TE mg/g), Brno (0,126 0,003 TE mg/g) ir Krokuvoje (0,09 0,002 TE mg/g). Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05. 0.279 0.251 0.158 0.193 0.189 0.176 0.159 0.146 0.2 0.28 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Fl av on oi dų k iek is RE m g/ g
9 Pav. Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas (mg/g), surinktų iš skirtingų Europos miestų; n=3
3.1.4
Europoje vyraujantys fenolinių junginių, flavonoidų ir
antioksidacinio aktyvumo kiekiai gebenių lipikių (Hedera helix L.)
lapų augaliniuose ekstraktuose
10 paveiksle pateikti skirtingų Europos miestų fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo vidurkiai gebenių lapų ekstraktuose. Galima matyti, jog gebenių lapuose, surinktuose Europoje, labiausiai vyrauja fenoliniai junginiai (0,9335 0,03 GRE mg/ml). Flavonoidai ir antioksidacinis aktyvumas įvertintas gebenių lapuose parodė mažesnes, tačiau tarpusavyje panašias reikšmes. Flavonoidai – 0,2031 0,016 RE mg/g, antioksidacinis aktyvumas – 0,2631 0,02 TE mg/g. Manoma, kad Europoje augantys gebenių lipikių (Hedera
helix L.) lapai, dėl tinkamų sąlygų, yra labiau linkę kaupti fenolinius junginius nei flavonoidus.
Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05.
0.664 0.528 0.035 0.169 0.126 0.09 0.03 0.025 0.282 0.682 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Kon cen tr ac ija T E m g/ g
10 pav. Europoje surinktų gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo vidurkių palyginimas
3.1.5
Biologiškai aktyvių junginių kiekių įvairavimo palyginimas pagal
Europos regionus
Norint palyginti fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo įvairavimą, šalys, iš kurių miestų buvo surinkti gebenės lipikės lapai, buvo suskirstytos į šiaurės Europos (Lietuva, Lenkija), rytų Europos (Ukraina, Čekija, Slovėnija, Vengrija) ir vakarų Europos (Austrija) regionus. (11 pav) Palyginus, nustatyta, jog šiaurės Europoje augusių gebenių lapuose randama didžiausi kiekiai fenolinių junginių ir flavonoidų bei antioksidacinis aktyvumas yra didžiausias. Vakarų Europoje nustatyti mažiausi šių biologiškai aktyvių junginių kiekiai bei mažiausias antioksidacinis aktyvumas. Fenolinių junginių vakarų Europoje nustatoma 3,8 karto mažiau, flavonoidų – 1,5 karto ir antioksidacinis aktyvumas yra mažesnis 12,3 kartus nei šiaurės Europoje. Tokį skirtumą galimai lemia augimo, klimato sąlygos taip pat įtakos gali turėti ir ekstrakcijos metodai. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05.
0.9335 0.2031 0.2631 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
11 pav. Fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo įvairavimo palyginimas Europos regionuose
3.1.6
Bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo
kiekio palyginimas Lietuvoje surinktoje gebenių lipikių (Hedera helix
L.) lapų žaliavoje
12 paveiksle pateikiami bendri kiekiai fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinis aktyvumas dviejuose Lietuvos miestuose surinktoje augalinėje žaliavoje. Gebenių lapai buvo surinkti Kaune - miestas esantis centrinėje Lietuvos dalyje (aukštaitija) ir Naujoje Akmenėje - į šiaurę nutolęs miestas (žemaitija). Galima matyti, jog flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas skiriasi labai nežymiai, tačiau fenolinių junginių kiekis skiriasi 1,5 kartus. Tokiems rezultatams įtakos gali turėti tai, jog žaliavos buvo surinktos iš skirtingų šalies regionų, kuriuose augimo sąlygos gali nežymiai skirtis ir taip paveikti biologiškai aktyvių medžiagų kiekius augalinėje žaliavoje. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas, p<0,05.
1.295 0.762 0.342 0.233 0.187 0.158 0.429 0.175 0.035 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Šiaurės Europa Rytų Europa Vakarų Europa Fenoliniai junginiai GRE mg/ml Flavonoidai RE mg/g Antioksidacinis aktyvumas TE mg/g
12 pav. Bendro fenolinių junginių, flavonoidų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo palyginimas žaliavoje, surinktoje skirtinguose Lietuvos miestuose
3.1.7
Bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo
palyginimas gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalinėje žaliavoje
surinktoje Kaune ir Naujoje akmenėje skirtingais metais
2018 metais Rolandas Gedminas savo magistriniame darbe nustatinėjo bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą gebenių lipikių augalinėje žaliavoje surinktoje 2017 m. 13 paveiksle pateikti duomenys, kuriuose bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas yra lyginamas su 2018 m. surinkta augaline gebenių lipikių žaliava. Taigi tiek 2017, tiek 2018 m. žaliavoje nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis yra labai panašus, tačiau antioksidacinio aktyvumo skirtumas yra labai ženklus. Iš diagramos galime matyti, kad 2017 m. gebenių lipikių lapai pasižymėjo gana aukštu antioksidaciniu aktyvumu – 3,306 ir 3,307 0,09 RE mg/g, tai yra 4,8 kartus aukštesnis antioksidacinis aktyvumas nei žaliavoje surinktoje tuose pačiuose miestuose 2018 m.. Statistiškai reikšmingas skirtumas nebuvo nustatytas, p>0,05 [48]. 1.324 2.104 0.279 0.28 0.664 0.682 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Kaunas Naujoji Akmenė
13 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo palyginimas Kaune ir Naujoje Akmenėje 2017-2018 m. 1.324 1.455 2.104 1.453 0.664 3.306 0.682 3.307 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Kaunas 2018 Kaunas 2017 Naujoji Akmenė 2018 Naujoji Akmenė 2017 Fenoliniai junginiai GRE mg/ml Antioksidacinis aktyvumas TE mg/g
3.2 Rezultatų apibendrinimas
Atlikus spektrofotometrinius gebenių lipikių (Hedera helix .L) tyrimus buvo nustatyta fenolinių junginių kiekis (mg/ml), flavonoidų kiekis (mg/g) ir antioksidacinis aktyvumas (mg/g). Didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas augalinėje žaliavoje surinktoje Naujojoje Akmenėje – 2,104 0,052 GRE mg/ml. Identifikuotas kiekis yra 6,15 karto didesnis už Vienoje surinktą žaliavą, kurioje buvo nustatytas mažiausias fenolinių junginių kiekis – 0,342 0,01 GRE mg/ml. Taip pat surinktoje žaliavoje buvo nustatinėjamas didžiausias flavonoidų kiekis, kuris nustatytas Naujojoje Akmenėje surinktoje augalinėje žaliavoje – 0,280 0,016 RE mg/g. Didžiausias kiekis buvo 1,9 karto didesnis negu Bratislavoje surinktoje žaliavoje, kurioje nustatytas mažiausias flavonoidų kiekis - 0,146 ( 0,007) RE mg/g. Naudojant UV spektrofotometrą buvo nustatytas antioksidacinis aktyvumas, kuris didžiausias buvo žaliavoje surinktoje Naujoje Akmenėje – 0,682 0,017 TE mg/g ir tai buvo 27,2 karto didesnis negu mažiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjusioje žaliavoje - 0,025 0,001 TE mg/g, kuri buvo surinkta Bratislavoje. Visų gebenės lipikės (Hedera helix L.) augalinių žaliavų palyginimas pateiktas 14 paveiksle.
Palyginus biologiškai aktyvių medžiagų kaupimą gebenės lipikės lapuose pagal Europos regionus (šiaurės Europa, rytų Europa ir vakarų Europa) buvo nustatyta, kad didžiausius šių medžiagų kiekius kaupia gebenės lapai užaugę šiaurės Europos regione. Šiems regionams priklausė žaliavos, surinktos iš Lietuvos (Naujoji Akmenė, Kaunas) bei Lenkijos (Varšuva, Krokuva).
Taip pat buvo palyginti Lietuvos miestuose – Kaune ir Naujoje Akmenėje, surinktų gebenės lipikės lapuose kaupiamų fenolinių junginių kiekiai ir antioksidacinis aktyvumas. Žaliava buvo rinkta 2017 ir 2018 m. Palyginus šias žaliavas nustatyta, jog 2018 m. surinktoje žaliavoje vyrauja didesni kiekiai fenolinių junginių nei žaliavoje surinktoje 2017 m., tačiau didesniu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo 2017 m. surinkta gebenių lipikių augalinė žaliava.
Iš atliktų tyrimų rezultatų galima matyti, kad augalinė žaliava surinkta Lietuvoje pasižymi didesniais kiekiais kaupiamų medžiagų. Taip pat galima teigti, kad gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliava, augusi ir surinkta Lietuvoje, didesniais kiekiais kaupia fenolines medžiagas. Tirtų kaupiamų medžiagų kiekiai augalinėje žaliavoje labai skyrėsi, todėl galima daryti išvadą, jog rezultatų įvairavimas priklauso nuo augimo sąlygų, klimato, temperatūros, drėgmės bei šviesos kiekio.
14 pav. Fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo rezultatų palyginimas tarp gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų rinktų iš skirtingų Europos miestų
1.324 1.138 0.342 0.657 0.603 0.481 0.676 0.739 1.271 2.104 0.279 0.251 0.158 0.193 0.189 0.176 0.159 0.146 0.2 0.28 0.664 0.528 0.035 0.169 0.126 0.09 0.03 0.025 0.282 0.682 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Kaunas Charkovas Viena Budapeštas Brno Krokuva Praha Bratislava Varšuva Naujoji Akmenė
4. IŠVADOS
1. Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktuose, surinktuose iš skirtingų Europos miestų, buvo nustatytas bendras polifenolinių junginių kiekis taikant Folin – Ciocalteu metodą. Didžiausias kiekis šių junginių nustatytas žaliavoje rinktoje iš Naujosios Akmenės - 2,104 0,052 GRE mg/ml. Mažiausias kiekis – 0,342 0,01 GRE mg/ml, Vienoje rinktoje augalinėje žaliavoje. Tai yra 6,15 karto mažesnis fenolinių junginių kiekis nei žaliavoje iš Naujosios Akmenės. Statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo nustatyta p>0,05.
2. Bendras flavonoidų kiekis gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliavoje buvo nustatinėjamas taikant spektrofotometrinį metodą. Didžiausias kiekis flavonoidų buvo identifikuotas augalinės žaliavos ekstrakte iš Naujosios Akmenės - 0,280 0,016 RE mg/g. Mažiausias kiekis nustatytas augalinės žaliavos ekstrakte, surinktame Bratislavoje - 0,146 0,007 RE mg/g, tai 1,9 karto mažiau lyginant su didžiausiu aptiktu kiekiu. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta p>0,05. 3. Siekiant įvertinti antioksidacinį gebenių lapų aktyvumą buvo taikomas CUPRAC
spektrofotometrinis metodas. Įvertinus nustatyta, jog maksimalus antioksidacinis aktyvumas yra Naujoje Akmenėje surinktuose gebenės lapuose - 0,682 0,017 TE mg/g. Tai yra 27,2 karto daugiau nei minimalus antioksidacinis aktyvumas, kuris nustatytas žaliavoje surinktoje Bratislavoje - 0,025 0,001 TE mg/g. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta p>0,05.
4. Palyginus bendrus fenolinių junginių ir flavonoidų kiekius bei antioksidacinį aktyvumą augalinėje gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliavoje, surinktoje skirtinguose Europos miestuose nustatyta, kad fenolinių junginių vidurkis siekia 0,9335 0,03 GRE mg/ml, nustatytas flavonoidų vidurkis - 0,2031 0,016 RE mg/g, o palyginus antioksidacinį aktyvumą nustatytas 0,2631 0,02 TE mg/g vidurkis. Statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo nustatyta p>0,05.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atliktais tyrimais ir gautais rezultatais nustatyta, kad gebenių lipikių (Hedera
helix L.) augalinė žaliava, rinkta šiaurinėje Europos dalyje, pasižymėjo didesniais kiekiais
fenolinių junginių ir flavonoidų bei didesniu antioksidaciniu aktyvumu. Todėl yra rekomenduojama gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliavą rinkti šiaurinėje Europos dalyje.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Lutsenko Y., Bylka W., Matławska I., Darmohray R. Hedera helix as a medicinal plant. Herba Pol. 2010; 84–96 p.;
2. Musthafa M., Nastaran A., Marikar F., Rajandram D., Ahmed A. Phytochemical, Pharmaceutical and Biochemical Activites of Selected Climber Plants: A Review. Annu Res Rev Biol. 2017; 1–22 p.; Prieiga per interneta:
http://www.sciencedomain.org/abstract/20875
3. Valcárcel, V., & Vargas, P. Quantitative morphology and species delimitation under the general lineage concept: Optimization for Hedera (Araliaceae). American Journal of Botany. 2010; 97(9), 1555–1573;
4. Plant Invaders of Mid-Atlantic Natural Areas, 4th ed. 2010; Prieiga per internetą:
https://www.invasive.org/alien/pubs/midatlantic/hehe.htm .;
5. Medeiros JR, Medeiros H, Mascarenhas C, Davin LB, Lewis NG. Bioactive
components of Hedera helix. 2002;
6. Sieben, A., Prenner, L., Sorkalla, T., Wolf, A., Jakobs, D., Runkel, F., Häberlein, H. α-Hederin, but Not Hederacoside C and Hederagenin fromHedera helix, Affects the Binding Behavior, Dynamics, and Regulation of β2-Adrenergic Receptors. Biochemistry. 2009; 3477–3482.;
7. Ferrara L, Naviglio D, Faralli S. Identification of active principles of Hedera helix L. in aqueous extracts. The Journal of Phytochemistry. Photon. 2013;114:170-175; 8. Fazio, S., Pouso, J., Dolinsky, D., Fernandez, A., Hernandez, M., Clavier, G., &
Hecker, M. Tolerance, safety and efficacy of Hedera helix extract in inflammatory bronchial diseases under clinical practice conditions: A prospective, open, multicentre postmarketing study in 9657 patients. Phytomedicine. 2009; 16(1), 17–24;
9. European Medicines Agency. Assessment report on Hedera helix L., folium. 2015; 44;
Prieiga per internetą:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_- _HMPC_assessment_report/2010/03/WC500075293.pdf
10. Zeil, S., Schwanebeck, U., & Vogelberg, C. Tolerance and effect of an add-on treatment with a cough medicine containing ivy leaves dry extract on lung function in children with bronchial asthma. Phytomedicine. 2014; 21(10), 1216–1220.;
11. Stauss-Grabo, M., Atiye, S., Warnke, A., Wedemeyer, R. S., Donath, F., & Blume, H. H. Observational study on the tolerability and safety of film-coated tablets containing
ivy extract (Prospan® Cough Tablets) in the treatment of colds accompanied by coughing. Phytomedicine. 2011; 18(6), 433–436;
12. Orhan, D.D., Ozc ̧ elik, B., Hos ̧ bas ̧ , S., Vural, M. Assessment of antioxidant, antibacterial, antimycobacterial, and antifungal activities of some plants used as folk remedies in Turkey against dermatophytes and yeast-like fungi. Turk. J. Biol. 2012; 36, 672–686;
13. Journal M., Qaisar M., Labs P. Preliminary Phytochemical Screening and Antimicrobial Activity of Hedera Helix L . 2011;
14. Gepdiremen A, Mshvildadze V, Suleyman H, Elias R. Acute anti-inflammatory activity of four saponins isolated from ivy: alpha-hederin, hederasaponin-C, hederacolchiside-E and hederacolchiside-F in carrageenan-induced rat paw edema. Phytomedicine. 2005;12(6–7):440–4;
15. Hong, E.-H., Song, J.-H., Shim, A., Lee, B.-R., Kwon, B.-E., Song, H., … Ko, H.-J. Coadministration of Hedera helix L. Extract Enabled Mice to Overcome Insufficient Protection against Influenza A/PR/8 Virus Infection under Suboptimal Treatment with Oseltamivir. PLOS ONE. 2015; 10(6), e0131089;
16. Keyhanmanesh, R., Saadat, S., Mohammadi, M., Shahbazfar, A.-A., & Fallahi, M. The Protective Effect of α-Hederin, the Active Constituent of Nigella sativa, on Lung Inflammation and Blood Cytokines in Ovalbumin Sensitized Guinea Pigs. Phytotherapy Research. 2015; 29(11), 1761–1767;
17. Cartea, M. E., Francisco, M., Soengas, P., & Velasco, P. Phenolic Compounds in Brassica Vegetables. Molecules. 2010; 16(1), 251–280;
18. Pereira, D.M.; Valentao, P.; Pereira, J.A.; Andrade, P.B. Phenolics: From Chemistry to Biology. Molecules 2009, 14, 2202-2211;
19. Jahangir, M.; Kim, H.K.; Choi, Y.H.; Verpoorte, R. Health-Affecting Compounds in Brassicaceae. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2009; 8, 31-43;
20. Dai, J., & Mumper, R. J. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules. 2010; 15(10), 7313–7352;
21. Samanta A, Das G, Das SK. Roles of flavonoids in plants. carbon. 2011;100(6);
22. Buer, C. S., Imin, N., & Djordjevic, M. A. Flavonoids: New Roles for Old Molecules. Journal of Integrative Plant Biology. 2010; 52(1), 98–111;
23. Iwashina, T. The Structure and Distribution of the Flavonoids in Plants. Journal of Plant Research. 2000;113(3), 287–299.;
24. Weston, L. A., & Mathesius, U. Flavonoids: Their Structure, Biosynthesis and Role in the Rhizosphere, Including Allelopathy. Journal of Chemical Ecology. 2013;39(2), 283–297;
25. Y. Xie, W. Yang, F. Tang, X. Chen, L. Ren, Antibacterial activities of flavonoids: structure-activity relationship and mechanism, Curr. Med. Chem. 22. 2015;132-149; 26. Giao, M.S.; Pereira, C.I.; Fonseca, S.C.; Pintado, M.E.; Malcata FX. Effect of particle
size upon the extent of extraction of antioxidant power from the plants Agrimonia eupatoria, Salvia sp. And Satureja montana. 2009. 412-416 p;
27. Garcia-Salas P, Morales-Soto A, Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A. Phenolic- compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules. 2010;15(12):8813–26;
28. Hasmida MN, Nur Syukriah AR, Liza MS, Mohd Azizi CY. Effect of different extraction techniques on total phenolic content and antioxidant activity of Quercus infectoria galls. International Food Research Journal. 2014 May 1;21(3);
29. Luthria DL. Application of green chemistry principles for extraction of phytolipids and phenolic compounds. Indian J Chem - Sect B Org Med Chem. 2006;45(10):2291-6; 30. Naczk M, Shahidi F. Extraction and analysis of phenolics in food. J Chromatogr A.
2004;1054(1– 2):95–111;
31. Alexieva J, MIHAYLOVA D, POPOVA A. Antioxidant capacity and thin layer chromatography of ethanol extracts of Allium ursinum L. and Allium bulgaricum L. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies. 2014;18:91-6;
32. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventós RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 1998;299:152–78;
33. Cicco N, Lanorte MT, Paraggio M, Viggiano M, Lattanzio V. A reproducible, rapid and inexpensive Folin–Ciocalteu micro-method in determining phenolics of plant methanol extracts. Microchemical Journal. 2009 Jan 1;91(1):107-10;
34. Khodavirdilo B. A cheap and simple method for determining of Antibiotics in pharmaceutical products by using Prussian Blue reaction. Asian J Biomed Pharm Sci. 2012;2:65–71;
35. Lukacheva, L. V., Zakemovskaya, A. A., Karyakina, E. E., Zorov, I. N., Sinitsyn, A. P., Sukhacheva, M. V., Karyakin, A. A. Determination of glucose and lactose in food products with the use of biosensors based on Berlin blue. Journal of Analytical Chemistry. 2007;62(4), 388–393;
36. Pękal A, Pyrzynska K. Evaluation of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid Content Assay. Food Anal Methods. 2014;7:1776–82;
37. Hamidu L, Ahmad AR, Najib A. Qualitative and quantitative test of total flavonoid buni fruit (Antidesma bunius (L.) Spreng) with UV-Vis spectrophotometry method. Pharmacogn J. 2018;10:60– 3;
38. Mir SA, Bhat AS, Ahangar AA. A simplified 2, 4-dinitrophenylhydrazine assay for flavonoids and its comparison with a standard flavonoid assay. Int J PharmTech Res. 2014;6:751–8;
39. Özyürek M, Güçlü K, Tütem E, Başkan KS, Erçağ E, Celik SE, Baki S, Yıldız L, Karaman Ş, Apak R. A comprehensive review of CUPRAC methodology. Analytical methods. 2011;3(11):2439-53;
40. Ayse Karadag & Beraat Ozcelik & Samim Saner. Review of Methods to Determine Antioxidant Capacities. Food Anal. Methods 2009; 2:41–60;
41. Raudonis R, Raudonė L, Janulis V, Viškelis P. Antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo nustatymo metodai (apžvalga). Sodininkystė ir daržininkystė. 2012;31(3-4):15-35; 42. Zeliou K, Kontaxis NI, Margianni E, Petrou C, Lamari FN. Optimized and Validated
HPLC Analysis of St. John’s Wort Extract and Final Products by Simultaneous Determination of Major Ingredients. J Chromatogr Sci [Internet]. 2017;55:805–12.
Prieiga per internetą:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28472287%0Ahttp://academic.oup.com/chroms ci/article/55/8/805/3792897/Optimized-and-Validated-HPLC-Analysis-of-St-Johns 43. KM, Kalili de VA. Recent developments in the HPLC separation of phenolic
compounds. 2011;
44. Loescher C., Morton D., Razic S., Agatonovic-Kustrin S. High performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) for the qualitative and quantitative analysis of Calendula officinalis-Advantages and limitations. J Pharm Biomed Anal. 2014; 52–9 p.; Prieiga per interneta: http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2014.04.023;
45. Stalikas CD. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and flavonoids. J Sep Sci. 2007;30:3268–95;
46. Of J, Chemistry A, Mars R. Phenolic acids in foods : An overview of analytical methodology phenolic acids in foods : An overview of analytical methodology. 2015;2866–87;
47. Gasparavičiūtė S. Lietuvos natūraliose augavietėse augančių rykštenės ( Solidago L . ) rūšių fenolinių junginių įvairavimo tyrimai spektrofotometriniu metodu. 2017;
48. Gedminas R. Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ir preparatų analitinių rodiklių įvairavimo tyrimas. 2018;
49. Piluzza G, Bullitta S. Correlations between phenolic content and antioxidant properties
in twenty-four plant species of traditional ethnoveterinary use in the Mediterranean area. Pharmaceutical biology. 2011;49(3):240-7;
50. Žugić A, Đorđević S, Arsić I, Marković G, Živković J, Jovanović S, Tadić V.
Antioxidant activity and phenolic compounds in 10 selected herbs from Vrujci Spa, Serbia. Industrial Crops and Products. 2014;52:519-27;
51. Gebenių lipikių paveikslai. Prieiga per internetą:
https://keyserver.lucidcentral.org/weeds/data/media/Html/hedera_helix.htm
52. Isoda H, Motojima H, Onaga S, Samet I, Villareal MO, Han J. Analysis of the erythroid differentiation effect of flavonoid apigenin on K562 human chronic leukemia cells. Journal of Chemico–Biological Interactions. 2014; 220:269–277.
53. S. Sasnauskienė, R. Firantienė, V. Jablonskienė. Chromatografijos metodai ir jų taikymas. Labaratorinė medicina. 2012; t. 14, Nr. 1(53), p. 33-39.
54. Dujų chromatografo schema. Prieiga per internetą:
https://en.wikipedia.org/wiki/Gas_chromatography
55. Plonasluoksnės chromatografijos schema. Prieiga per internetą:
PRIEDAI
1 priedas. Publikacija tezių knygoje - Straigyte E., Bezruk I., Marksa M. „Evaluation of polyphenol compounds and antioxidant activity in ivy (Hedera helix L.) leaves“. XXVI International scientific and practical conference of young scientists and students „Topical issues of new drugs development“. April 10 – 12, 2019, Kharkiv.
