LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Milda Baltrimaitė
Naujagimių kumeliukų imuninio statuso nustatymo metodai
ir jų palyginimas
Comparison of immune status determination methods of
newborn foals
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: asist., vet. gyd. Renata Gruodytė
2 DARBAS ATLIKTAS LSMU VA STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Naujagimių kumeliukų imuninio statuso nustatymo metodai ir jų palyginimas“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
2021-01-14 Milda Baltrimaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
2020-12-01 Živilė Ambrazevičienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
2020-12-01 asist., vet. gyd. Renata Gruodytė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) 2020-12-15 dr. Arūnas Rutkauskas
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas Prof. dr. Arūnas Stankevičius
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA... 4 SUMMARY... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS ANALIZĖ ... 91.1 Kumeliukų imuninė sistema ... 9
1.2. Transplacentinis barjeras ... 9
1.3. Žarnyno barjeras ... 10
1.4. Krekenos ir jų komponentai ... 11
1.5. Pasyvaus imuniteto nepakankamumas ... 13
1.5.1. Etiologija ... 13
1.5.2. Rizikos faktoriai ... 14
1.5.3. Diagnostika ... 15
1.5.4. Gydymas ... 17
1.6. Kraujo morfologiniai ir biocheminiai parametrai ... 18
1.6.1. Bendras leukocitų ir neutrofilų skaičius ... 18
1.6.2. Serumo bendrieji baltymai ir jų frakcijos ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 21
3. TYRIMO REZULTATAI ... 25
3.1. Pasyvaus imuniteto statuso įvertinimo rezultatai ... 25
3.2. Kraujo morfologinių rodiklių tyrimo rezultatai ... 31
3.3. Kraujo biocheminių rodiklių tyrimo rezultatai ... 32
3.4. Kumeliukų sveikatos būklės įvertinimas ... 34
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
IŠVADOS ... 40
4
SANTRAUKA
NAUJAGIMIŲ KUMELIUKŲ IMUNINIO STATUSO NUSTATYMO METODAI IR JŲ PALYGINIMAS
Milda Baltrimaitė
Magistro baigiamasis darbas
Nepakankamas pasyvus imunitetas yra vienas svarbiausių infekcinių ligų ir sepsio pasireiškimo rizikos faktorių pirmąjį kumeliukų gyvenimo mėnesį. Dėl didelės infekcijos rizikos kumeliukams su
nepakankamu pasyviu imunitetu ankstyva diagnozė yra kritiškai būtina.
Šio baigiamojo darbo tikslas buvo įvertinti greitus ir lengvai atliekamus pusiau kiekybinius testus, skirtus nustatyti imunoglobulinų kiekiui kraujo serume bei diferencijuoti kumeliukus su nepakankamu ir pakankamu pasyviu imunitetu, ir palyginti juos tarpusavyje.
Ištirti 10-ies kumeliukų kraujo mėginiai iškart po gimimo ir praėjus 24 valandoms. Atliktas imunokrito tyrimas, bendrųjų baltymų ir albuminų tyrimas kraujo biocheminiu analizatoriumi bei globulinų koncentracijos apskaičiavimas ir bendrųjų baltymų nustatymas optiniu refraktometru. Pagal refraktometru nustatytą bendrų baltymų koncentraciją įvertinus IgG kiekį, 10 (100 proc.) kumeliukų nustatytas PPI, tuo tarpu IgG koncentraciją įvertinus pagal imunokritą, PPI ir NPI nustatytas atitinkamai 4 (40 proc.) ir 6 (60 proc.), o IgG koncentraciją įvertinus pagal globulinų koncentraciją, PPI ir NPI nustatytas atitinkamai 3 (30 proc.) ir 7 (70 proc.) 24 val. amžiaus kumeliukams. Baltymų vertinimo refraktometru rezultatai statistiškai reikšmingai skiriasi nuo globulinų vertinimo rezultatų (p <0,05) bei nuo imunokrito rezultatų (p <0,05). Sveikų kumeliukų grupėje, po 5 (50 proc.) kumeliukus turėjo atitinkamai pakankamą ir nepakankamą pasyvų imunitetą, nustatytą imunokrito ir globulinų vertinimo metodais. Sergančių kumeliukų tarpe 1 (25 proc.) kumeliukui nustatytas PPI, o 3 (75 proc.) kumeliukams nustatytas NPI imunokrito metodu; 4 (100 proc.) sergantiems kumeliukams nustatytas NPI globulinų vertinimo metodu.
Raktažodžiai: kumeliukas, imuninis statusas, nepakankamas pasyvus imunitetas, imunokritas, globulinai, refraktometras
5
SUMMARY
COMPARISON OF IMMUNE STATUS DETERMINATION METHODS OF NEWBORN FOALS Milda Baltrimaitė
Master’s Thesis
Failure of passive transfer of immunity is one of the most important risk factors for various infectious diseases and sepsis in neonatal foals, thus early diagnosis of failure of passive transfer is crucial.
The aim of this study was to evaluate and compare rapid and easily performed semi-quantitative tests, used for determination of immunoglobulin concentrations and immune status in newborn foals.
10 foals were involved in the study. Blood samples were collected immediately after birth (presuckle) and after 24 hours (postsuckle). Immunocrit method, serum total protein and albumin measurement with clinical chemistry analyzer and calculation of serum globulin concentration and serum total protein measurement with optical refractometer were performed. Failure of passive transfer was determined for all 10 (100 %) foals by all methods immediately after birth. In 24-hours old foals, adequate passive transfer of immunity was determined for 10 (100 %) foals by optical refractometer’s TP concentrations, while by immunocrit results, failure of passive transfer and adequate passive transfer were determined for 4 (40 %) and 6 (60 %) foals, respectively. By evaluating globulin concentrations, failure of passive transfer and adequate passive transfer were determined for 3 (30 %) and 7 (70 %) foals, respectively. Serum TP measurement results differed significantly from the results of globulin measurement (p <0,05) and immunocrit (p <0,05). Among healthy foals, half of the foals (50 %) had failure of passive transfer and other half (50 %) had adequate passive transfer of immunity, determined both by immunocrit and globulin concentrations. Among sick foals, 1 foal (25 %) had adequate passive transfer and 3 (75 %) foals had failure of passive transfer, determined by immunocrit, while all sick foals (4; 100 %) had failure of passive transfer determined by globulin concentrations.
6
SANTRUMPOS
NPI – nepakankamas pasyvus imunitetas
dNPI – dalinai nepakankamas pasyvus imunitetas PPI – pakankamas pasyvus imunitetas
RID – radialinė imunodifuzija Ig – imunoglobulinai
IgG – imunoglobulinas G IgM – imunoglobulinas M IgA – imunoglobulinas A
NK – natūralioji žudikė (natural killer) IL-4 – interleukinas-4
IL-13 – interleukinas-13
TNF-α – navikų nekrozės faktorius α WBC – baltieji kraujo kūneliai (leukocitai) Neu – neutrofilai
Lym – limfocitai TP – bendrieji baltymai Alb – albuminai
7
ĮVADAS
Kumeliukų imuninės sistemos vystymasis prasideda dar gimdoje, tačiau jie gimsta turėdami silpną imunitetą ir hipogamaglobulinemiją. (1) Dėl epiteliochorinės placentos antikūnai nėra perduodami vaisiui gimdoje iš motinos, o turi patekti per virškinamąjį traktą post partum, kad humoralinis imunitetas būtų užtikrinamas pirmuosius gyvenimo mėnesius. (2) Rūšims, kurioms būdinga ši placenta, būdingas ir naujagimio „atviras“ virškinamasis traktas, kur dėl specifinių ląstelių vyksta imunoglobulinų pernaša per žarnyną į kraujotaką pirmąsias 24 valandas po gimimo, o tai užtikrina labai greitą reikalingos imunoglobulinų kocentracijos kraujyje pasiekimą. (3) Dar nežindę kumeliukai turi silpnai funkcionuojantį ląstelinį imunitetą, bet gimsta be autogeninių imunoglobulinų, todėl atsakas į patogenus yra labai ribotas iki pirmųjų krekenų pasisavinimo. (4)
Nepakankamas pasyvus imunitetas (NPI) apibūdinamas kaip kumeliuko nesugebėjimas išgerti pakankamai krekenų ar absorbuoti iš jų reikalingo imunoglobulinų kiekio. Šis sutrikimas pasireiškia nuo 3 % iki 24 % kumeliukų. (5) Nepakankamas pasyvus imunitetas yra vienas svarbiausių infekcinių ligų ir sepsio pasireiškimo rizikos faktorių pirmąjį kumeliukų gyvenimo mėnesį. (6)
Dėl didelės infekcijos rizikos kumeliukams su nepakankamu pasyviu imunitetu ankstyva diagnozė yra kritiškai būtina. Pasyvaus imuniteto nepakankamumas diagnozuojamas pagal imunoglobulino G kiekį kumeliuko kraujo serume. Radialinė imunodifuzija yra tiksliausias kiekybinis metodas ir laikomas „auksiniu“ standartu, nustatant IgG kiekį serume. (7) Nepaisant to, šis tyrimas turi daug trūkumų, tokių kaip ilga trukmė (18-24 valandos), reikalingas temperatūrinis režimas, didelė kaina, specializuotos laboratorijos ir kompetetingo techninio personalo poreikis. Taip pat rasta nemažai skirtumų tarp šio tyrimo rezultatų, atliktų su skirtingų gamintojų tyrimo komerciniais rinkiniais. (8) Praktikuojantiems veterinarijos gydytojams labiau reikalingas testas kumeliukų su pasyvaus imuniteto nepakankamumu identifikacijai nei kiekybiniam imunoglobulinų kiekio nustatymui. Toks testas turėtų būti paprastas, greitas, pigus, galimas atlikti gyvūno laikymo vietoje ir pakankamai patikimas. (9)
Imunoglobulino G nustatymo testų rezultatų interpretacija pastaruosius 40 metų yra didelio susidomėjimo subjektas, kuris gali sukelti nemažai sumaišties dėl skirtingų metodologijų, rezultatų reikšmių normų ir diagnostinių kriterijų. (6) Pastaruoju metu pradėti vertinti patogūs naudoti pusiau kiekybiniai metodai, skirti įvertinti pasyvaus imuniteto statusą (tokie kaip serumo bendrų baltymų, albuminų ir globulinų koncentracijų vertinimas). (2) Neseniai išvystytas imunokrito metodas, pirmiausia pradėtas taikyti kiaulininkystėje, yra paprastas būdas nustatyti serumo imunoglobulinų koncentraciją ir kumeliukams. (10) Serumo bendrų baltymų kiekio nustatymas optiniu refraktomertu yra laikomas greitu,
8 tiksliu ir nebrangiu metodu pasyvaus imuniteto nepakankamumui nustatymui veršeliams bei neseniai pradėtas taikyti ir kumeliukams. (8)
Darbo tikslas: įvertinti greitus ir nesudėtingai atliekamus pusiau kiekybinius testus, skirtus nustatyti imunoglobulinų kiekį kraujo serume, naudojamus diferencijuoti nepakankamo ir pakankamo pasyvaus imuniteto kumeliukus, ir juos palyginti.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti apytikslį imunoglobulinų kiekį kraujo serume pagal imunokrito koncentraciją ir įvertinti pasyvaus imuniteto statusą.
2. Nustatyti apytikslį imunoglobulinų kiekį kraujo serume pagal serumo bendrų baltymų ir albuminų kiekį, apskaičiuotą kraujo biocheminiu analizatoriumi bei įvertinti pasyvaus imuniteto statusą.
3. Nustatyti apytikslį imunoglobulinų kiekį kraujo serume pagal bendrų baltymų kiekį, nustatytą optiniu refraktometru, ir pagal tai įvertinti pasyvaus imuniteto statusą.
4. Palyginti skirtingais metodais nustatytą imuninį statusą ir jo pasiskirstymą pagal sveikatos būklę.
5. Įvertinti kelių kraujo morfologinių ir biocheminių rodiklių, svarbių kumeliukų imuninei sistemai, pokyčius pirmąją gyvenimo parą.
9
1. LITERATŪROS ANALIZĖ
1.1 Kumeliukų imuninė sistema
Naujagimių kumeliukų imuninis atsakas ženkliai skiriasi nuo suaugusių arklių bei kitų gyvūnų. Nors pagrindiniai imuniniai komponentai ir mechanizmai yra panašūs į suaugusių arklių, imuniteto reguliacija ir atsakas į patogenus skiriasi. (11)
Po gimimo, aplinkai pasikeitus iš in utero, kuri yra mažo antigeninio profilio, į ex utero, kumeliuką pasitinka didelis kiekis aplinkoje esančių antigenų, komensalinių bakterijų, parazitų ir kartais virulentiškų patogenų – su jais organizmas susiduria pirmą kartą. Per labai trumpą laiką kumeliuko imuninė sistema turi išmokti atpažinti patogenus, taip pat toleruoti komensalinius mikroorganizmus, nepavojingus aplinkos ir maisto antigenus. (11) Net adekvatų pasyvų imunitetą turintys kumeliukai yra labiau imlūs tam tikriems patogenams, kurie veikia tik naujagimius gyvūnus ir retai infekuoja suaugusiuosius. (12)
Naujagimis kumeliukas gali imunologiškai atsakyti į patogenus, tačiau atsakas yra lėtas ir silpnas palyginti su suaugusio arklio imunine sistema. Kumeliukas turi limfocitus (T ir B) jau nuo antro vaikingumo trimestro vidurio, tačiau limfocitų kiekis nepasiekia suaugusio arklio limfocitų kiekio normos iki mėnesio amžiaus, todėl ši imuninės sistemos dalis yra nepakankama gimimo metu. Humoralinis imunitetas, t.y. antigeno-antikūno reakcija, galima nuo trečio vaikingumo semestro.
Antikūnų gamyba prasideda in utero. Normalaus vaikingumo metu vaisiaus imuninė sistema gamina IgG ir IgM, jie minimaliomis koncentracijomis gali būti aptinkami kraujyje prieš pirmąjį žindimą. Gamyba tęsiasi ir po gimimo. Tačiau silpna naujagimio imuninė sistema reikalauja motininio imuniteto pirmomis gyvenimo savaitėmis. (11) Endogeninė antikūnų sintezė pasiekia reikiamą lygmenį tik 8-12 gyvenimo savaitę (> 5 g/l), dar didesnė koncentracija (> 8 g/l) pasiekiama 6-8 mėnesį. (13)
1.2. Transplacentinis barjeras
Placenta yra laikinas organas, susiformuojantis tik vaikingumo metu. Ji atlieka vaisiaus apsaugos, mitybos, kvėpavimo, endokrininę funkcijas bei atlieka svarbų imunologinį vaidmenį – dalyvauja antikūnų pernašoje, vaisiaus vystymosi reguliacijoje, citokinų išskyrime, turi įtakos citotoksinių limfocitų subpopuliacijų formavimuisi. (14) Epiteliochorinė kumelių placenta užkerta kelią imunoglobulinų pernašai gimdoje, dėl to apsauga nuo aplinkos oportunistinių patogenų kumeliukui
10 suteikiama į virškinamąjį traktą patekus krekenoms ir įvykus imunoglobulinų absorbcijai. (11) Epiteliochorinė placenta gali būti trumpai apibūdinama kaip neinvazyvi, kai vaikingumo metu gimdos epitelis lieka nepakitęs, todėl motina vaisių imonologiškai atpažįsta minimaliai. (15) Epiteliochorinį barjerą sudaro šeši sluoksniai, skiriantys motinos ir vaisiaus kraujotakos sistemas: motininis endotelis, motininio jungiamojo audinio sluoksnis, gimdos epitelis, trofoblastas, vaisiaus jungiamojo audinio sluoksnis ir vaisiaus endotelis. Šiai placentai būdingi minimalūs gimdos gleivinės stromos pokyčiai, apart vietinės angiogenezės, kuri reikalinga intensyvesnei kraujotakai, siekiant aprūpinti gimdą maistinėmis medžiagomis. (14) Kumelių placentai būdinga tai, kad kai kurios trofoblasto ląstelės migruoja į gimdos epitelį ir suformuoja endometriumo kaušelius (endometrial cups), kurie sekretuoja chorioninį gonadotropiną. Šių kaušelių susiformavimas iššaukia citotoksinę imuninę reakciją. Jie yra infiltruojami limfocitų, kurie neleidžia endometriumo kaušeliams sunykti 60-90 dienų. Pastebėta, jog citotoksiniai limfocitai išskiria natūralių žudikių (NK) ląstelių žymenis. Tokio pobūdžio NK ląstelių neaptikta nei graužikų, nei primatų organizmuose. (15)
1.3. Žarnyno barjeras
Žarnynas, be savo pirminės virškinimo ir maisto medžiagų absorbcijos funkcijos, taip pat sudaro veiksmingą apsauginį barjerą, kuris neleidžia patekti patogeniniams mikroorganizmams ar žalingoms makromolekulėms į organizmą. Vis dėlto, priešingai nei suaugusiems arkliams, vaisiaus ir neonataliniu periodu galutinai neišsivysčiusiame žarnyne vyksta intensyvi makromolekulių pernaša. Ją vykdo specializuoti, vaisiui būdingi enterocitai, kurie dengia plonųjų žarnų spindį. Makromolekulių, taip pat ir IgG pernaša daugiausiai vyksta proksimalinėje plonųjų žarnų dalyje. Kumeliukams būdinga pernaša nespecifinės skysčių pinocitozės būdu. (16) Didelės maromolekulės, tokios kaip IgG, yra „praryjamos” ir pernešamos į kraujotaką per limfagysles. Pinocitozę vykdančių ląstelių gyvenimo trukmė yra ribota, todėl absorbcija gali vykti tik pirmąsias 24 valandas, efektyviausiai vykstanti 12-16 valandų laikotarpiu po gimimo ir absorbcijos efektyvumui mažėjanti iki 24 valandų amžiaus. (17) Pinocitozę vykdantiems enterocitams galutinai subrendus, jie praranda šią savybę, makromolekulių transepitelinė pernaša nutrūksta ir žarnynas „užsidaro”. Subrendusiame žarnyne vis dar vyksta minimali makromolekulių pernaša, tačiau tik tam tikrose vietose ir ribotu pajėgumu. (16)
Pinocitozę vykdančių ląstelių pasikeitimas ir žarnyno „užsidarymas” įvyksta nepriklausomai nuo to, ar naujagimis tuo laikotarpiu maitinosi, ar ne, todėl labai svarbu užtikrinti kumeliuko mitybą būtent pirmąją parą. (17) Raidal ir McTaggart (18) tai patvirtino tyrimu, kuriame buvo siekiama išsiaišinti, ar
11 kumeliukams pirmąsias 12 valandų negavus krekenų pailgėja žarnyno padidėjusio pralaidumo laikotarpis. Nustatyta, jog pavėluotas krekenų patekimas į virškinamąjį traktą ženkliai sumažina pasisavinamų IgG kiekį, todėl, siekiant maksimalios IgG absorbcijos, būtina krekenas sugirdyti per pirmąsias 12 valandų. (18)
Suaktyvėjusi makromolekulių pernaša pirmąją gyvenimo parą sukelia ne tik pasyvią imunizaciją imunoglobulinais, bet ir leidžia patekti į naujagimio organizmą ir šiek tiek mikrobinių bei mitybinių patogenų. Reakcija į juos priklauso nuo imuninės sistemos būklės – gali būti sukeliama efektorinių ląstelių aktyvacija arba jie gali būti toleruojami. (16)
Krekenų baltymai įprastai turėtų būti greitai suskaidomi virškinamajame trakte, tačiau dėl reliatyviai mažo proteolitinio aktyvumo virškinamajame trakte, kurį sukelia nepakankamai išsivysčiusios kasos ir skrandžio, taip pat krekenų fermentų inhibitorių veikla pirmąją parą po gimimo, imunoglobulinai nėra suvirškinami. (16, 19)Sumažėjusi fermentinė veikla apsaugo makromolekules tol, kol jos pasiekia plonųjų žarnų epitelį, išsaugodamos savo antigeniškumą bei dydį, reikalingą transepitelinei pernašai. (16) IgG nuo suvirškinimo taip pat saugo antitripsinai. (17)
IgG pernaša kritiškai svarbi sepsio prevencijai ir naujagimio kumeliuko gyvybingumui. Tačiau kiti motininio imuniteto komponentai – citokinai ir imuninės ląstelės – taip pat perduodami naujagimiui su krekenomis ir atlieka svarbų vaidmenį naujagimio imuniteto indukcijoje, apsaugo nuo patogenų ir skatina imuninės sistemos vystymąsi. (11)
1.4. Krekenos ir jų komponentai
Imunoglobulinų turtingos krekenos yra pradedamos gaminti kumelės tešmenyje paskutinį vaikingumo mėnesį, o didžiausia IgG koncentracija krekenose susiformuoja per paskutines dvi savaites. IgG gaminami ne pieno liaukose, o cirkuliuoja kraujotakoje ir iš jos pernašami į pieno liaukų sekretą. Kraujotakoje cirkuliuojančių imunoglobulinų kiekį reguliuoja hormonai. Krekenų sekrecija vyksta labai trumpai – 12-24 valandų po atvedimo. Jose taip pat gausu kitų komponentų, tokių kaip laktoferinų, citokinų, komplemento baltymų, kurie stimuliuoja imuninę sistemą. (17) Krekenų sudėtis priklauso nuo kumelės laktacijos stadijos, veislės, lytinio ciklo stadijos, amžiaus, sveikatos būklės, šėrimo, laikymo sąlygų, jos yra turtingos baltymų – išrūgų baltymai sudaro maždaug 80 % visų baltymų, 65 % iš jų yra albuminai ir globulinai. Ig sudaro apie 20 % krekenose esančių išrūgų baltymų. (20)
Imunoglobulinai. Krekenose gausiausiai yra IgG, o mažiausiai – imunoglobulino A. IgA atsiradimo krekenose mechanizmas kol kas yra neaiškus. Praėjus 1-2 sav. po atvedimo, IgG koncentracija
12 kumelės piene sumažėja ir IgA tampa gausiausiai aptinkamu imunoglobulinu piene. Endogeninė IgA gamyba prasideda maždaug nuo 3 mėn amžiaus. Arkliai turi 7 skirtingus IgG izotipus su skirtingomis imunologinėmis funkcijomis. Palyginti su kumelių serumu, beveik visi IgG izotipai, IgA ir IgE taip pat yra randami ir krekenose. (11) Serumo IgG koncentracija pasiekia maksimumą praėjus maždaug 24 val. po gimimo. Vėliau dėl didelio katabolizmo aktyvumo pirmąsias 4 gyvenimo savaites ir dėl didėjančio plazmos tūrio iš motinos gautų IgG koncentracija ženkliai sumažėja. (26)
Imunoglobulinai veikia kaip neutralizuojantys antikūnai ir opsoninai, skatinantys fagocitozę, todėl krekenų komponentų absorbcija reikšmingai padidina serumo opsoninį pajėgumą kovojant su bakterijomis. (26)
Citokinai. Tai yra imuninio atsako moduliatoriai, kuriuos gamina ląstelės - T helperiai. (11) Citokinų kiekiai yra ištirti galvijų krekenose, mažai yra žinoma apie jų kiekius kumelių krekenose. Mariella et al (12) atliktas tyrimas rodo, kad krekenose yra aptinkami gama interferonas, interleukinas-4, interleukinas-13. IL-13 rastas ne visuose mėginiuose. Visi šie krekenose nustatyti citokinai buvo nustatyti ir kumeliukų serume, išskyrus minėtą IL-13, kuris rastas tik keliuose serumo mėginiuose. Citokinai atlieka svarbų vaidmenį kumeliuko imuninėje sistemoje – iš krekenų gautas IL-4 dalyvauja IgA antikūnų, kurie sukelia bakterinių ir virusinių patogenų šalinimą ir palaiko komensalinę mikroflorą virškinamajame trakte, sekrecinėje gamyboje. Chemokinas interleukinas-8 taip pat aptinkamas krekenose ir galimai yra atsakingas už leukocitų pernašą iš motinos kraujotakos į pieno liaukos sekretą. (12) Navikų nekrozės faktorius yra svarbus citokinas, sukeliantis uždegiminę reakciją infekcijų metu, todėl ypač svarbus sepsio atveju. Secor et al (21) atlikto tyrimo metu nustatyta, kad TNF-α patenka į kumeliuko organizmą su krekenomis.(21)
Kitos imuninės ląstelės. Krekenose gausu imuninių ląstelių. Leukocitų pasisavinimas iš krekenų per virškinamąjį traktą stebimas veršeliams, ėriukams ir paršiukams ir galimai tokiu pačiu principu būdingas ir kumeliukams. Motininės karvės imuninės ląstelės patenka į kraujotaką ir pasiekia koncentracijos piką praėjus 12-24 val. po krekenų patekimo į virškinamąjį traktą bei pasišalina iš kraujotakos praėjus 36 val. Kumelės krekenose randama CD4+ ir CD8+ limfocitų bei keletas B ląstelių. (11)
13
1.5. Pasyvaus imuniteto nepakankamumas
Dažniausiai pasitaikantis imunodeficitas arkliams yra pasyvaus imuniteto perdavimo sutrikimas. (5) Nepakankamas pasyvus imunotetas apibūdinamas kaip nesugebėjimas absorbuoti pakankamo Ig kiekio iš krekenų. Šis sutrikimas skirstomas į tris laipsnius: (22)
1. Nepakankamas pasyvus imunitetas (NPI), kai IgG kiekis yra≤ 4 g/l (arba ≤ 400 mg/dl).
2. Dalinai nepakankamas pasyvus imunitetas (dNPI), kai IgG kiekis yra 4-8 g/l (arba 400-800 mg/dl).
3. Pakankamas pasyvus imunitetas (PPI), kai IgG kiekis yra ≥ 8 g/l (arba ≥ 800 mg/dl).
Serumo IgG koncentracija ≥ 8 g/l yra siejama su ženkliai aukštesniu išgyvenamumo lygiu, todėl yra laikoma tinkamu koncentracijos slenksčiu imunitetui vertinti. (7) Normalių, sveikų kumeliukų serumo IgG kiekis dažnai yra ≥ 30 g/l. Septiniai kumeliukai, net jei gavo pakankamai krekenų ir įvyko pakankama IgG absorbcija, vis tiek dažnai turi labai žemą IgG kocentraciją dėl visų baltymų katabolizmo, įskaitant ir imunoglobulinus. (22) Nors minėtos imunoglobulinų koncentracijos ribos nustatytos prieš daugelį metų remiantis tyrimais, kurie atlikti gan ribotoje perspektyvoje, jomis vis dar galima remtis iki šiol. Liepman et al (2) atlikto tyrimo metu, atlikus kumeliukų išgyvenamumo duomenų analizę, nustatyta, jog, siekiant įvertinti kumeliukų mirštamumo riziką, galima naudotis ir kitomis IgG koncentracijos normomis. Nustatyta proporcinga sąsaja tarp IgG kiekio ir mirštamumo – kuo mažesnė IgG koncentracija ( žemiau nei <8 g/l ribos), tuo didesnė mirštamumo rizika. Netgi tie kumeliukai, kurių IgG koncentracija buvo 6,01-8 g/l, turėjo didesnę mirštamumo riziką nei tie, kurių IgG koncentracija buvo >8 g/l. Kumeliukai, turintys IgG kiekį > 8 g/l, išgyventi turėjo didesnę tikimybę. Tačiau tie, kurių IgG koncentracija buvo 8,01-12 g/l, neturėjo reikšmingai didesnių galimybių išgyventi nei tie kumeliukai, kurių IgG koncentracija viršijo 12 g/l. Šie duomenys leidžia teigti, jog svarbiausia IgG koncentracijos riba yra 8 g/l. (2) Mažesnis kiekis indikuoja gydymo poreikį, didesnis – adekvatų pasyvų imunitetą.
1.5.1. Etiologija
Pasyvaus imuniteto nepakankamumo pagrindinės priežastys: 1. nepakankama kumelės krekenų produkcija,
14 2. per mažas kumeliuko išgertų krekenų kiekis,
3. sutrikusi imunogobulinų absorbcija.
Kumelės krekenų produkcija priklauso nuo jos amžiaus, veislės, mitybos, tešmens būklės, gyvenimo aplinkos. Stresas, priešlaikinė laktacija ar priešlaikinis atvedimas, mastitas turi įtakos kumelės krekenų kokybei. (23) Jei kumeliukas atvedamas per anksti, gali būti, jog krekenos kumelės tešmenyje dar nėra galutinai pasigaminusios. Normalaus vaikingumo metu kumelei pradeda lašėti pienas kelias dienas prieš atvedimą. Jei laktuoti kumelė pradeda dar anksčiau, galima įtarti vaisiaus ar placentos patologiją. Tokiu atveju po atvedimo reikėtų įvertinti kumelės krekenų kokybę. Agalaktija gali pasireikšti dėl tam tikrų ligų ar intoksikacijos eraičinu. (17) Krekenų produkcija mažėja įvykus priešlaikiniam placentos atsiskyrimui ar esant placentitui. (24)
Kumelės krekenų kokybė ir sekrecija yra genetiškai paveldima, todėl jei kumelė sekretuoja prastos kokybės krekenas, tikėtina, jog tokias pačias gamins ir kitų kumelingumų metu. Rekomenduojama visais atvejais vertinti kumelės krekenų kokybę ir nustatyti IgG kiekį jose. Krekenų IgG koncentracija turėtų būti apie 30 g/L. (17)
Kumeliukas gali neišgerti pakankamai krekenų, jei jis yra sergantis, silpnas, negali atsistoti ir žįsti kumelės. Raumenų ir skeleto sutrikimai, tokie kaip sausgyslių kontraktūra, traumos atvedimo metu, neišsivystymas taip pat gali būti to priežastimi. Kumelė kartais gali atsisakyti kumeliuko ir neprileisti jo prie tešmens. Tokiu atveju būtina sugirdyti krekenas. (25)
Faktoriai, lemiantys absorbcijos sutirkimus, nėra galutinai išaiškinti, tačiau juos lemti gali pinocitozę vykdančių enterocitų kiekio sumažėjimas, ankstyvas šių enterocitų pasikeitimas, sutrikęs imunoglobulinų pernešimas į vaskuliarinę sistemą, ir, galimai, IgG katabolizmas dėl reikiamo energijos kiekio. (17) Per anksti atvestiems ar neišsivysčiusiems kumeliukams taip pat gali sutrikti absorbcija. Tokiais atvejais, taip pat ir komplikuoto atvedimo metu dėl streso poveikio išsiskiria gliukokortikodai, kurie paspartina pinocitotinių enterocitų brendimą ir sutrumpina galimos absorbcijos laiką. (7)
1.5.2. Rizikos faktoriai
Nepakankamas pasyvus imunitetas priklauso nuo daugelio rizikos faktorių, kurie gali būti skirstomi į susijusius su kumele, su laikymo sąlygomis ir su kumeliuku. (23)
Kumeliukai, kurie pirmą kartą atsistoja vėliau nei praėjus valandai po gimimo, ir kurie pirmą kartą žinda vėliau nei per pirmąsias 6 valandas po gimimo, turi didesnę tikimybę turėti NPI. Naujagimiai kumeliukai turėtų atsistoti per pirmąją valandą po gimimo ir atsigerti krekenų per pirmąsias 2-3 valandas.
15 Nevisiškai išsivystę ar per anksti atvesti kumeliukai dažnai turi silpnesnį raumenų tonusą, sunkiau atsistoja, taip pat gali turėti virškinamojo trakto sutrikimų, o tai trukdo įsisavinti tinkamą IgG kiekį. (23) Bendra kumeliuko būklė – energingumas, išsivystymas, sudėjimas, įgimti sutrikimai - yra svarbus rizikos faktorius nepakankamam pasyviam imunitetui susiformuoti. (32)
Kumelių, kurios kumeliuojasi nebe pirmą kartą, kumeliukai turi mažesnę tikimybę turėti NPI. Manoma, jog kumelės motiniški instinktai ir tešmens išsivystymas yra geresni vėlesniame amžiuje. (23) Taip pat labai svarbi yra krekenų kokybė, kuri gali būti nustatoma optiniu Brix refraktometru cukraus ir drėgmės kiekiui matuoti. Pakankamą Ig kiekį turinčių krekenų Brix refraktometrinis indeksas yra 20 – 30 %. Krekenos, kurių Brix indeksas yra mažesnis nei 20 %, yra nepakankamos kokybės, todėl kumeliukams, geriantiems tokias krekenas, kyla didelė rizika išsivystyti NPI. (32)
Laikymo sąlygos taip pat turi įtakos kumeliukų pasyvaus imuniteto statusui. Kumeliukai, kurie buvo atvesti ganyklose, turi mažesnę NPI išsivystymo riziką, o atvestieji arklidėse – didesnę. Tai paaiškinti galima tuo, kad esančios ganyklose kumelės patiria mažesnį stresą, o natūrali aplinka stiprina motiniškus instinktus. (23)
1.5.3. Diagnostika
Dėl padidėjusios infekcijos rizikos, esant nepakankamam pasyviam imunitetui, ankstyva diagnozė yra ypač svarbi. (7) Diagnostika yra paremta kumeliukų serumo IgG koncentracijos nustatymu praėjus 18-24 val. po gimimo. (5) Imuninio statuso vertinimas gali būti atliekamas praėjus 8-12 valandų po gimimo, tačiau tikslingiausia jį atlikti praėjus 18-24 valandoms. (27) Greitas IgG koncentracijos serume nustatymas leidžia nustatyti pasyvaus imuniteto statusą ir laiku atlikti medicininę intervenciją. (28)
1970-1980 m. visiškas pasyvaus imuniteto nepakankamumas buvo diagnozuojamas serumo IgG koncentracijai esant <2 g/L, dalinis nepakankamumas - <4 g/L, o pakankamas pasyvus imunitetas - >4 g/L. Atlikus daugiau mokslinių tyrimų, 1984 m. Koterba et al (2) nustatė kitas ir dabar plačiai diagnostikoje taikomas koncentracijos normas: <4 g/L serumo IgG koncentracija reiškia NPI, <8 g/L IgG reiškia dNPI, >8 g/L IgG reiškia PPI.
Naujagimiams kumeliukams serumo IgG koncentracijai nustatyti yra naudojama keletas skirtingų metodų: cinko sulfato drumstumo, glutaraldehido koaguliacijos, latekso agliutinacijos reakcijos; fermento imunoanalizė, turbidimetrinė imunoanalizė, radialinė imunodifuzija. Kai kuriems tyrimams atlikti galima įsigyti jau paruoštus naudoti testų rinkinius.
16 • Radialinės imunodifuzijos (RID) metodas yra kiekybinis tikslaus IgG kiekio nustatymo metodas. Jis yra laikomas auksiniu standartu šiuose tyrimuose, tačiau yra brangus, ilgai trunkantis (rezultatai gaunami po 24 valandų), reikalaujantis tam tikro temperatūros režimo ir atliekamas tik specialioje laboratorijoje. (28) Todėl šis metodas nėra praktiškas, kai kumeliukas serga ir jam būtina greita diagnozė ir gydymas. (5) Diagnostinis testas turėtų būti patikimas, greitai atliekamas ir ekonomiškas.
• Dažnai naudojamas greitasis SNAP testas – imunochromatografinis tyrimo metodas. Užlašinus serumo ant reagentu impregnuotų laukelių, pasikeičia jų spalva, pagal tai interpretuojamas Ig kiekis. (1) Testo jautrumas yra 90-95 %. (41)
• Serumo proteinų koncentracija, nustatyta biocheminiu tyrimu, gali būti naudojama įvertinti IgG koncentraciją. Kartais galima klaidinga rezultatų interpretacija dėl albuminų koncentracijos padidėjimo dehidratacijos atveju, dėl to padidėja ir bendrųjų baltymų kiekis, todėl reikėtų nesivadovauti vien bendrų baltymų kiekiu, o nustatyti bendrų baltymų, albuminų ir globulinų kiekius. (29) Serumo globulinų koncentracija, apskaičiuojama iš serumo bendrų baltymų ir albuminų koncentracijos, gali būti naudinga pasyvaus imuniteto statuso stebėsenai. Metodo jautrumas ir specifiškumas varijuoja atitinkamai tarp 90-95 % ir 73-79 %. Kelių mokslinių tyrimų metu pasitelkus daugiareikšmę regresiją, buvo nustatytos formulės, kurias pritaikius, galima apskaičiuoti imunoglobulinų kiekį, žinant bendrų baltymų, albuminų ir globulinų koncentracijas (2, 29).
• Cinko sulfato drumstumo reakcija yra paprastas, greitas ir subjektyvus metodas imunologiniam statusui įvertinti. Šį metodą galima atlikti lauko sąlygomis, gyvūno laikymo vietoje. Tyrimui naudojamas cinko sulfato tirpalas sumaišomas su 0,1 ml kraujo serumo ir paliekamas 1 minutę reakcijai įvykti, tuomet drumstumo reakcija vizualiai įvertinama ir palyginama su kontroliniu bario sulfato tirpalu. Metodo jautrumas ir specifiškumas yra atitinkamai 76 % ir 73 %. (30)
• Bendrųjų serumo baltymų nustatymas refraktometru yra greitas, nebrangus ir pakankamai tikslus imuninio statuso stebėsenos tyrimas ir gali būti naudojamas imunoglobulinų koncentracijos preliminariam įvertinimui, tačiau jo specifiškumas ir jautrumas yra mažesni nei anksčiau paminėtų tyrimų. Bendrų baltymų vertinimas serume yra jautresnis nei plazmoje. Imunoglobulinų koncentracijos atitikmuo nustatomas pagal apskaičiuotas normas, palyginus imunoglobulinų kiekį, nustatytą kiekybiniu metodu ir refraktometru. (8)
17 • Neseniai pradėtas naudoti imunokrito tyrimo metodas, paremtas amonio sulfato precipitacijos reakcija, taip pat yra greitas, pigus, patikimas tyrimas, kuriam reikalingas minimalus priemonių kiekis. (10) 2013 m. tyrimą atliko Vallet et al, jų metodas pirmiausia pritaikytas paršelių imunoglobulinų koncentracijai vertinti. (42). 40 % amonio sulfato tirpalas buvo sumaišytas su kraujo serumu lygiomis dalimis, mišiniu užpildytas hematokrito mikrokapiliaras, kuris buvo centrifuguojamas 5 min. Tuomet liniuote išmatuota precipitavusių Ig dalis mikrokapiliare milimetrais ir padalinta iš išmatuotos likusios serumo dalies mikrokapiliare milimetrais, gautas santykis. Nustatyta gautų imunokrito teigiamų rezultatų stipri koreliacija su imunoglobulinų kiekiu, kuris buvo nustatytas kiekybiniu gelio elektroforezės metodu. Šio metodo privalumai – rūšiai nespecifiškas, greitas, paprastas, nereikalaujantis daug priemonių ir atliekamas bet kurioje vietoje. (42) 2017 m. Thompson et al (43) pritaikė imunokrito metodą veršelių pasyvaus imuniteto vertinimui. Naudota tokia pati tyrimo metodika, tačiau mikrokapiliaro rezultatai vertinti naudojant hematokrito vertinimo skalę, rezultatai išreikšti procentais ir palyginti su imunoglobulinų koncentracija, nustatyta radialinės imunodifuzijos metodu. Nustatyta stipri teigiama koreliacija tarp rezultatų, metodas yra gana jautrus ir specifiškas nepakankamo pasyvaus imuniteto diagnozavimui. (43) Kumeliukams imunokrito tyrimą pirmą kartą atliko Mortola (10) 2019 m. Argentinoje. Nustatyta, kad tinkamiausia amonio sulfato koncentracija precipitacijos reakcijai įvykti yra 40 %. Tyrimo eiga buvo tokia pati, kaip ir prieš tai apibūdintų tyrimų; gauti rezultatai palyginti su agarozės gelio elektroforezės būdu nustatytomis IgG koncentracijomis. Nustatytas metodo jautrumas ir specifiškumas atitinkamai yra 94 % ir 82 %. (10)
1.5.4. Gydymas
Jei kumeliukui nepakankamas pasyvus imunitetas nustatytas anksčiau, nei praėjus 12 valandų po gimimo, krekenas jam galima sugirdyti per os. 50 kg sveriantis kumeliukas turėtų gauti 0,5 – 2 l krekenų, įvertinus jo dydį, amžių, imunoglobulinų koncentraciją krekenose. (24)
Kumeliukams, esantiems rizikos grupėje NPI, rekomenduojama sugirdyti ≥ 300 ml geros kokybės krekenų (refraktometrinis indeksas >23 %) 1-4 kartus per pirmąsias 6 val. po gimimo. Toks kiekis dažniausiai yra pakankamas reikalingai IgG koncentracijai (≥8 g/l) užtikrinti. (32)
Kumeliukams, vyresniems nei 12 valandų amžiaus, vienintelis tinkamas gydymas yra plazmos transfuzija. Plazmos kiekis, reikalingas pakelti IgG koncentraciją iki pakankamos, negali būti apskaičiuojamas labai tiksliai, nes priklauso nuo daugelio veiksnių: pasyvaus imuniteto nepakankamumo
18 laipsnio, IgG kiekio paruoštoje plazmoje, kumeliuko svorio ir sveikatos būklės. Standartiškai rekomenduojama pradinė kraujo plazmos dozė 45 kg sveriančiam kumeliukui yra 20 ml/kg, tai yra maždaug 1 litras plazmos. Komerciškai paruošta plazma dažniausiai yra hiperimuninė ir turi 15-25 g/l imunoglobulinų. 45 kg sveriančiam kumeliukui, viena dozė (950 ml) tokios plazmos pakelia serumo IgG koncentraciją 2-3 g/l. Priklausomai nuo NPI laipsnio, kumeliukui gali reikėti nuo vienos iki trijų dozių tokios plazmos. Plazmos transfuzija gali turėti daug šalutinių poveikių, tokių kaip niežulys, edema, urtikarija, tachikardija, tachipnėja, diegliai, anafilaksinis šokas, todėl svarbu stebėti kumeliuką. (32)
Transfuzijai gali būti naudojama ne tik komerciškai paruošta plazma, bet ir vietoje paimta pačios kumelės ar kito arklio plazma. Rekomenduojama naudoti tame pačiame ūkyje ar panašiomis aplinkos sąlygomis gyvenančių arklių plazmą dėl aplinkai būdingo antigenų spektro. 20 ml/kg plazmos, kurios IgG koncentracija yra 12 g/l, pakels kumeliuko serumo IgG kiekį 2 g/l. Daugumai kumeliukų su dNPI reikės 1-2 litrų plazmos. (32)
1.6. Kraujo morfologiniai ir biocheminiai parametrai
1.6.1. Bendras leukocitų ir neutrofilų skaičius
Pirmąsias 12 kumeliuko gyvenimo valandų stebima padidėjusi leukocitų koncentracija. To pagrindinė priežastis yra kraujyje cirkuliuojančių neutrofilų skaičiaus padidėjimas. Šie pokyčiai susiję su adrenokortikaliniu aktyvumu ir kumeliuko išsivystymo lygiu. Neutrofilų kiekis vaisiaus kraujotakoje yra nedidelis, tačiau gimimo metu dėl išsiskiriančio kortizolio neutrofilų stipriai padaugėja. Neutrofilų ir limfocitų santykis po kumeliuko gimimo yra 2,5:1, vėliau jis staigiai didėja ir jau po trijų valandų pasiekia 3,5-4:1 santykį. (35) Jei kortizolio koncentracijos šuolio gimimo metu nėra, sveikam kumeliukui gali būti būdinga ryški neutropenija, kurios sunkumas tiesiogiai koreliuoja su išgyvenamumo tikimybe. (38) Vėliau, praėjus parai, neutrofilų koncentracija pastoviai mažėja, suaugusiam arkliui būdinga neutrofilų koncentracija nusistovi maždaug 4-6 gyvenimo mėnesį. (33) Neutropenija su matomais nesubrendusiais ar toksiniais neutrofilais arba neutrofilija gali signalizuoti apie sisteminio uždegiminio atsako sindromą ir reikalauja neatidėliotinos intervencijos. (34)
Bendra leukocitų ir bendra limfocitų koncentracijos su amžiumi didėja. Limfocitų koncentracija yra pati mažiausia gimimo metu, vėliau stabiliai didėja kumeliukui augant. Tačiau kai kuriais atvejais dėl ligos ar didelio streso fiziologinė limfocitozė dėl katecholaminų išskyrimo gali stipriai padidinti bendrą limfocitų koncentraciją.. Nors limfoproliferaciniai procesai ir kortizolio poveikis limfocitams vis
19 dar išlieka neaiškūs, galima teigti, jog ką tik gimę kumeliukai yra itin imlūs infekcijoms. (36) Būdingos kumeliukams WBC, Neu ir Lym koncentracijų normos pateikiamos 1 lentelėje.
Lentelė 1. Kumeliukų WBC, Lym ir Neu reikšmių normos pagal Austin (34)
Kraujo rodiklis Norma 1 d. amžiaus
kumeliukui (x 109/l)
Norma 2-7 d. amžiaus kumeliukui (x 109/l)
WBC (bendras leukocitų
skaičius) 6,1 – 11,2 6,9 – 11,3
Lym (limfocitų skaičius) 1,0 – 2,2 1,6 – 2,8 Neu (neutrofilų skaičius) 4,2 – 8,6 4,1 – 8,5
1.6.2. Serumo bendrieji baltymai ir jų frakcijos
Serumo bendri baltymai itin svarbūs naujagimio augimui ir imuninės sistemos funkcijai, nes didelę jų dalį sudaro imunoglobulinai. Naujagimiams gyvūnams būdingos labai plačios serumo bendrųjų baltymų koncentracijos ribos – koncentracija stipriai skiriasi pirmąsias 24-36 val. po gimimo, nes ji priklauso nuo su krekenomis gautų Ig absorbcijos laiko ir absorbuotų Ig kiekio. (37) Kai kurie autoriai teigia, jog bendrųjų baltymų kiekis iškart po gimimo yra labai nedidelis dėl minimalios imunoglobulinų koncentracijos ir mažo albuminų kiekio. Dėl to naujagimiai kumeliukai yra metaboliškai nestabilios būklės, o tai predisponuoja ligų pasireiškimą poatvediminiu laikotarpiu ir gana aukštą mirtingumo procentą. (39) Dar nežindusių kumeliukų serume bendrųjų baltymų koncentracija dažniausiai yra mažesnė nei 5 g/dl (50 g/l), o po pirmojo žindymo koncentracija pakyla daugiau nei 6 g/dl (60 g/l) (2 lentelė). Baltymų koncentracija pirmąsias gyvenimo savaites gali išlikti mažesnė, nei ji būdinga suaugusiems arkliams. Albuminų koncentracija dažnai būna panaši į suaugusiems arkliams būdingas koncentracijos normas, tačiau albuminų-globulinų santykis dažnai yra mažesnis. (37)
Serumo baltymų koncentracijos nustatymas gali būti naudingas vertinant kumeliukų pasyvaus imuniteto statusą. Vien bendrųjų baltymų koncentracija negali būti patikimas rodiklis kumeliukų imuniteto vertinimui, skirtingai nei veršeliams, kuriems bendrųjų baltymų koncentracijos nustatymas yra vienas dažniausiai naudojamų metodų. Tačiau kartu vertinant ir albuminų bei globulinų koncentracijas, galima gana tiksliai diagnozuoti NPI kumeliukams. Reikėtų nepamiršti, kad albuminų koncentracija kinta ir esant dehidracijai ar uždegiminiams procesams. Fibrinogeno koncentracijos nustatymas galėtų būti naudingas vertinant uždegimo organizme galimybę. (39). Nustatyta, jog serumo globulinų koncentracija,
20 kuri gali būti apskaičiuojama iš bendrųjų baltymų koncentracijos atėmus globulinų koncentraciją, stipriai teigiamai koreliuoja su IgG koncentracija serume, tai leidžia nesudėtingai įvertinti kumeliuko imunoglobulinų kiekį. (32)
Kraujo rodiklis Norma kumeliukui gimimo metu (g/l)1
Norma 7 d. amžiaus kumeliukui (g/l)2
TP (bendri baltymai) 45 – 47 60 – 65
Alb (albuminai) 25 - 32 25 – 35
Glob (globulinai) 9 - 12 20 – 25
21
2. TYRIMO METODIKA
Tyrimo objektas. Lietuvos sunkiųjų arklių veislės naujagimiai kumeliukai.
Tyrimui atrinkti viename ūkyje vieno kumeliavimosi sezono metu ką tik gimę kliniškai sveiki naujagimiai. Tyrimas atliktas 2020 m. balandžio – birželio mėnesiais. Kumelingos kumelės, priklausomai nuo metų laiko, buvo laikomos arklidėje arba ganykloje. Kumeliavimosi sezono pradžioje dalis kumeliukų buvo atvesti arklidėje esančiuose garduose, kreikiamuose šiaudais ir pjuvenomis, kiti, - prasidėjus ganymo sezonui, atvesti ganykloje, kurioje gyveno banda kumelingų ar jau atsivedusių kumeliukus kumelių.
Tyrimo imtis. 10 kumeliukų (n=10).
Tyrimo metodai ir eiga. Atrinktiems gyvūnams iškart po gimimo atlikta klinikinė apžiūra ir įsitikinta, kad jie yra sveiki. Iš karto po gimimo (± 4 val.), kumeliukams dar negavus krekenų, paimti kraujo mėginiai iš v. cephalica vakuuminiais 5,0 ml švirkštais, biocheminiam tyrimui - į mėgintuvėlius be priedų, morfologiniam tyrimui - į mėgintuvėlius su EDTA. Tokia pati kraujo mėginių ėmimo procedūra pakartota po 24 valandų (± 8 val.). Mėginiai pristatyti tyrimui į laboratoriją.
Iškart po mėginių pristatymo į laboratoriją atlikti kraujo morfologiniai tyrimai MS4-5-VET aparatu. Vertinti rodikliai: baltieji kraujo kūneliai (WBC), limfocitai (Lym), neutrofilai (Neu).
Biocheminiam tyrimui skirti kraujo mėginiai centrifuguoti 3 min. 3000 aps./min., tada 1,0 ml serumo su mikropipete perkelta į 1,5 ml talpos mikromėgintuvėlius ir užšaldyta. Laikyta -18ºC temperatūroje iki ištyrimo.
Atlikus literatūros apžvalgą, pasirinkti trys imunoglobulinų nustatymo metodai – globulinų apskaičiavimas pagal kraujo biocheminio tyrimo metu nustatytas bendrų baltymų ir globulinų koncentracijas, STP nustatymas optiniu refraktometru bei imunokrito nustatymas. Šių tyrimų rezultatai naudoti apytikslei IgG koncentracijai įvertinti. Remiantis naujausių mokslinių tyrimų duomenimis, IgG koncentracijos serume rezultatus reikšminga vertinti tik pagal vieną normos ribą – 8 g/l. Literatūroje aprašyta, jog nustatyta proporcinga asociacija tarp IgG koncentracijos ir mirtingumo – kuo IgG koncentracija mažesnė nei 8 g/l, tuo didesnė kumeliukų mirtingumo tikimybė. Didesnė nei 8 g/l IgG koncentracija susieta su didesne išgyvenamumo tikimybe. Daugelis literatūros šaltinių nurodo šią koncentracijos ribą kaip nepakankamo pasyvaus imuniteto rodiklį (2, 6, 8, 10). Remiantis šia informacija,
22 tyrimo rezultatai suskirstyti į dvi IgG koncentracijos reikšmių kategorijas: < 8 g/l ir > 8 g/l IgG serume. Pagal šias kategorijas atitinkamai nustatytas imuninis statusas (2):
• ≤ 8 g/l IgG koncentracija atitinka nepakankamą pasyvų imunitetą (NPI). • ≥ 8 g/l IgG koncentracija atitinka pakankamą pasyvų imunitetą (PPI).
Atšildžius serumo mėginius kambario temperatūroje, atliktas serumo biocheminis tyrimas kraujo analizatoriumi „RX Daitona“. Tirtas bendrųjų baltymų (TP) ir albuminų (Alb) kiekis kraujo serume. Serumo globulinų kiekis apskaičiuotas iš bendrųjų baltymų kiekio (TP) atėmus albuminų kiekį (Alb). Pagal apskaičiuotą globulinų kiekį, remiantis Fouche ir bendraautorių (32) atliktu tyrimu, IgG kiekis įvertintas pagal nustatytas atitinkamas normos ribas. Apytikslis IgG kiekis ir pasyvaus imuniteto statusas vertinamas pagal globulinų koncentracijos ribas:
• ≤ 26,8 g/l globulinų atitinka ≤ 8 g/l IgG. • ≥ 26,8 g/l globulinų atitinka ≥ 8 g/l IgG..
Atliktas imunokrito tyrimas. Šviežias 40 % koncentracijos amonio sulfato tirpalas paruošiamas sumaišant 40,0 g amonio sulfato druską su 100,0 ml distiliuoto vandens. Tuomet 1,5 ml talpos mikromėgintuvėlyje sumaišyta 70 µL amonio sulfato tirpalo su 70 µL kraujo serumo, palikta 2 min. precipitacijos reakcijai įvykti, sumaišyta vartant mėgintuvėlį. Šiuo mišiniu užpildyti hematokrito mikrokapiliarai (be heparino) ir centrifuguoti hematokrito centrifugoje 5 min. Rezultatai įvertinti naudojantis hematokrito vertinimo skale, mikrokapiliarą prie skalės pridėjus taip, kad užkimšto galo ir kraujo serumo riba būtų ties nuliu, o viršutinė serumo riba būtų ties 100. Vertinama ryškiai matoma precipitavusių imunoglobulinų riba, nustatoma procentinė išraiška. Remiantis naujausio mokslinio tyrimo duomenimis, nustatyta reikšminga imunokrito reikšmės riba yra 9,5 %, kuri atitinka 8 g/l IgG. Šio tyrimo jautrumas ir specifiškumas, vertinant būtent šią koncentracijos ribą, atitinkamai yra 94 % ir 82 %. Gauti imunokrito rezultatai, remiantis Mortola ir bendraautoriais (10), interpretuoti taip:
• Imunokrito reikšmė ≤ 9,5 % atitinka ≤ 8 g/l IgG koncentraciją serume. • Imunokrito reikšmė ≥ 9,5 % atitinka ≥ 8 g/l IgG koncentraciją serume.
Atliktas serumo tyrimas optiniu refraktometru. 70 µL serumo užlašinta ant refraktometro objektyvo, uždengta stikleliu ir, nukreipus į šviesos šaltinį, vizualiai įvertinta baltymų koncentracija pagal skalėje matomą ribą tarp šviesaus ir tamsaus ploto. Remiantis gautais rezultatais nustatyta apytikslė IgG koncentracija ir pasyvaus imuniteto statusas. Remiantis naujausio mokslinio tyrimo duomenimis, bendrų baltymų koncentracija koreliuoja su IgG koncentracija serume ir gali būti vertinama pagal tam
23 tikras nustatytas koncentracijų normas. Šis metodas yra ženkliai mažiau jautrus ir specifiškas negu kiti du naudoti metodai. Imunoglobulinų koncentracija įvertinta pagal bendrųjų baltymų kiekį, nustatytą refraktometru, remiantis Elsohaby ir bendraautorių (8) nustatytomis normomis:
• ≤ 44 g/l (arba ≤4,4 g/dl) bendrų baltymų atitinka ≤8 g/l IgG. • ≥ 44 g.l (arba ≥ 4,4 g/dl) bendrų baltymų atitinka ≥ 8 g/l IgG.
Kumeliukų sveikatos būklė vizualiai stebėta pirmąsias 7 dienas po atvedimo, fiksuoti kliniškai pasireiškę susirgimai.
Duomenų statistinė analizė. Visų tyrimų rezultatai suvesti į MS Excel programoje sudarytas lenteles. Suformuotos dvi lentelės – kraujo morfologinių ir biocheminių tyrimų rezultatų bei imunoglobulinų nustatymui naudotų tyrimų rezultatų lentelės. Duomenys perkelti į SPSS statistinės analizės programą, atlikta analizė. Apskaičiuoti visų kraujo morfologinių ir biocheminių rodiklių vidurkiai bei paklaidos, rezultatai susisteminti lentelėse. Nustatytų pasyvaus imuniteto statusų pasiskirstymas pavaizduotas diagramose. Visų duomenų normalumas patikrintas naudojant Šapiro-Vilko testą (p>0,05). Kraujo morfologinių rodiklių - WBC, Neu, Lym; biocheminių rodiklių – TP, Alb; pasyvaus imuniteto vertinimui naudotų rodiklių - imunokrito, globulinų, bendrų baltymų, nustatytų refraktometru, - reikšmės palygintos iškart po gimimo ir praėjus 24 valandoms. Kraujo rodiklių pokyčių reikšmingumas įvertintas pasitelkus Stjudento kriterijaus t test funkciją. Pasyvaus imuniteto nustatymo metodų rezultatų skirtumas įvertintas naudojant Friedman testą, o kiekvieno tyrimo rezultatų skirtumai tarpusavyje įvertinti naudojant chi-kvadrato testą.
24
1 pav. Tyrimo schema
Tyrimo imties suformavimas - naujagimių kumeliukų įvertinimas Kraujo mėginių paėmimas 0 (± 4) val. ir 24 (± 8) val. po gimimo Kraujo morfologinių tyrimų atlikimas Imuninio statuso įvertinimo tyrimų atlikimas
Kraujo biocheminių tyrimų atlikimas, globulinų kiekio
apskaičiavimas, IgG koncentracijos įvertinimas
pagal gautas globulinų reikšmes
Imunokrito tyrimo atlikimas, IgG koncentracijos įvertinimas
pagal gautas imunokrito reikšmes
Bendrų baltymų nustatymas refraktometru,
IgG koncentracijos įvertinimas pagal gautas
baltymų koncentracijas
Pasyvaus imuniteto statuso nustatymas pagal
įvertintas IgG koncentracijas: <8 g/l ir >8 g/l. Kumeliukų sveikatos būklės stebėsena, kliniškai pasireškusių susirgimų fiksavimas Rezultatų statistinė analizė
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Pasyvaus imuniteto statuso įvertinimo rezultatai
Imunokrito tyrimas. 1 lentelėje pateikiamos imunokrito reikšmių variacijų ribos ir vidutinės reikšmės. Po gimimo imunokrito vidutinė reikšmė yra 0,85 proc., po 24 val. ji reikšmingai didėja ir pasiekia 8,15 proc. (p<0,05).
1 lentelė. Imunokrito tyrimo rezultatų reikšmių minimalios, maksimalios ir vidutinės reikšmės
Mėginio paėmimo laikas Mėginių skaičius, vnt. Minimali imunokrito reikšmė, % Maksimali imunokrito reikšmė, % Imunokrito vidurkis, % 0-4 val. po gimimo* 10 0,5 1,5 0,85 ± 0,33 24-32 val. po gimimo* 10 1 15 8,15 ± 5,01
*duomenų pasiskirstymas nenormalus (p<0,05) **duomenų pasiskirstymas normalus (p>0,05)
2 pav. Imunokrito rezultatų palyginimas, tyrimą atlikus po gimimo ir praėjus 24 val. (p<0,05)
2 paveikslėlyje pavaizduotas tiriamosios grupės imunokrito rezultatų palyginimas po gimimo ir praėjus 24 valandoms. Visiems gyvūnams (100 proc.) imunokrito koncentracija reikšmingai padidėjo per pirmąją parą po gimimo. 2 lentelėje pateikiamos 24 valandų amžiaus kumeliukų imunokrito reikšmės,
0 2 4 6 8 10 12 14 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Imunokritas, % Tiriamo sios im ties n ar iai
26 pagal jas nustatytos IgG koncentracijos ir joms priskiriamas imuninis statusas, remiantis Mortola ir kt. (10)
2 lentelė. 24 val. amžiaus kumeliukų imuninio statusas pagal IgG koncentraciją, įvertintą remiantis imunokrito reikšmėmis pagal Mortola (10)
Eil. Nr. Imunokritas po 24 val, % IgG konc., g/l Imuninis statusas
1. 1 <8 NPI 2. 9 <8 NPI 3. 14 >8 PPI 4. 9 <8 NPI 5. 10,5 >8 PPI 6. 15 >8 PPI 7. 11,5 >8 PPI 8. 8 <8 NPI 9. 3 <8 NPI 10. 1 <8 NPI
3 pav. Pasiskirstymas pagal pasyvaus imuniteto statusą, nustatytą imunokrito metodu 24 val. amžiaus kumeliukams
3 paveikslėlyje pavaizduotas tiriamosios grupės pasisikirstymas pagal imuninį statusą, nustatytą pagal imunokritą. 6-iems (60 proc.) kumeliukams nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas, 4-iems (40 proc.) - pakankamas pasyvus imunitetas.
60% 40%
27 Serumo globulinų kiekio nustatymas. Atlikus kraujo biocheminių parametrų – bendrųjų baltymų (TP) ir albuminų (Alb) tyrimą, remiantis gautais rezultatais apskaičiuotas globulinų kiekis (Glob). 3 lentelėje pateikiamos serumo globulinų koncentracijų variacijos ribos ir vidurkiai. Po gimimo vidutinė koncentracija buvo 5,83 g/l, po pirmosios paros ji padidėjo iki 21,06 g/l. (p >0,05).
3 lentelė. Serumo globulinų kiekio reikšmės ir jų vidurkiai
Mėginio paėmimo laikas Mėginių skaičius Minimali globulinų konc., g/l Maksimali globulinų konc., g/l Globulinų vidutinė konc., g/l 0-4 val. po gimimo 10 3,56 8,9 5,83 ± 1,59 24-32 val. po gimimo 10 6,5 39,62 21,06 ± 12,18
4 pav. Globulinų koncentracijų palyginimas tyrimą atlikus po gimimo ir po 24 val. Rezultatų skirtumas statistiškai nereikšmingas ( p>0,05)
4 paveikslėlyje pavaizduotas globulinų koncentracijų palyginimas po gimimo ir praėjus 24 valandoms. 9-iems kumeliukams (90 proc.) serumo globulinų koncentracija per pirmąsias 24 valandas po gimimo padidėjo, 1-am (10 proc.) kumeliukui stebimas nežymus globulinų koncentracijos sumažėjimas (p >0,05). Imuninis statusas įvertintas pagal imunoglobulinų koncentraciją, nustatytą pagal serumo globulinų koncentraciją 24 val. amžiaus. Globulinų koncentracijos, pagal jas nustatytos IgG
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Globulinų koncentracija, g/l Tiriamos ios im ties n ar iai
28 koncentracijos, remiantis Fouché (32), ir tiriamosios imties narių imuniniai statusai, įvertinti pagal atitinkamas IgG koncentracijų normas, pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. 24 val. amžiaus kumeliukų imuninis statusas pagal IgG koncentraciją, nustatytą remiantis globulinų koncentracija pagal Fouché (32)
Eil.
Nr. Globulinai po 24 val., g/L IgG konc., g/l Imuninis statusas
1. 6,5 <8 NPI 2. 19,32 <8 NPI 3. 35,99 >8 PPI 4. 12,72 <8 NPI 5. 32,8 >8 PPI 6. 39,62 >8 PPI 7. 20,53 <8 NPI 8. 26,31 <8 NPI 9. 7,9 <8 NPI 10. 8,96 <8 NPI
5 pav. Kumeliukų pasiskirstymas pagal pasyvaus imuniteto statusą, įvertintą pagal globulinų kiekį serume
5 paveikslėlyje pavaizduotas kumeliukų pasiskirstymas pagal pasyvaus imuniteto statusą, nustatytą pagal globulinų koncentraciją. 7-iems (70 proc.) kumeliukams nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas, 3-ims (30 proc.) kumeliukams nustatytas pakankamas pasyvus imunitetas.
Bendrų baltymų nustatymas refraktometru. Bendrų baltymų koncentracijų, nustatytų refraktometru, variacijos ribos ir vidutinės reikšmės nurodytos 5 lentelėje. Po gimimo serumo bendrų baltymų vidutinė koncentracija yra 6,74 g/dl, po 24 valandų padidėja iki 7,74 g/dl (p >0,05).
70% 30%
29
Lentelė 5. Serumo bendrų baltymų, nustatytų refraktometru, reikšmės ir jų vidurkiai
Mėginio
paėmimo laikas Mėginių skaičius
Minimali globulinų koncentracija, g/dl Maksimali globulinų koncentracija, g/dl Globulinų koncentracijos vidurkis, g/l 0-4 val. po gimimo 10 5,6 9,0 6,74 ± 1,01 24-32 val. po gimimo 10 6,4 9,4 7,74 ± 1,12
6 paveikslėlyje pavaizduotas bendrų baltymų, nustatytų refraktometru, koncentracijų palyginimas. 7-iems (70 proc.) kumeliukams bendrų baltymų koncentracija per pirmąją parą padidėjo, 3-ims (30 proc.) kumeliukams stebimas koncentracijos sumažėjimas (p>0,05).
6 pav. Bendrų baltymų, nustatytų refraktometru, koncentracijų palyginimas po gimimo ir po 24 val. (p >0,05)
6 lentelėje pateikiamos bendrų baltymų, nustatytų refraktometru, koncentracijos, pagal jas įvertintos IgG koncentracijos, remiantis Elsohaby (8), ir tiriamosios imties narių imuniniai statusai, įvertinti pagal IgG koncentracijos normas. Visiems 10 (100 proc.) kumeliukų nustatytas pakankamas pasyvus imunitetas. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TP koncentracija refraktometru, g/dl Tiriamos ios im ties n ar iai
30
6 lentelė. 24 val. amžiaus kumeliukų imuninis statusas pagal IgG koncentraciją, nustatytą remiantis bendrų baltymų koncentracija, nustatyta refraktometru, pagal Elsohaby (8)
Eil. Nr. Bendri baltymai po 24 val., g/dL IgG konc., g/l Imuninis statusas 1
1. 6,4 >8 PPI 2. 7,6 >8 PPI 3. 8,6 >8 PPI 4. 9,2 >8 PPI 5. 8,4 >8 PPI 6. 9,4 >8 PPI 7. 7,8 >8 PPI 8. 6,4 >8 PPI 9. 6,8 >8 PPI 10. 6,8 >8 PPI
Metodų palyginimas. Kumeliukų pasiskirstymo pagal imuninį statusą, nustatytą trimis skirtingais metodais, palyginimas pavaizduotas 6 paveikslėlyje.
6 pav. Pakankamo ir nepakankamo pasyvaus imuniteto atvejai, nustatyti skirtingais metodais
Pagal refraktometru nustatytą bendrų baltymų koncentraciją įvertinus IgG kiekį, 10 (100 proc.) kumeliukų nustatytas pakankamas pasyvus imunitetas, tuo tarpu IgG koncentraciją įvertinus pagal
0 2 4 6 8 10 12
Imunokritas Glob vertinimas TP vertinimas
Imunokritas Glob vertinimas TP vertinimas
Pakankamas pasyvus imunitetas 4 3 10
Nepakankamas pasyvus imunitetas 6 7 0
31 imunokritą, PPI ir NPI nustatytas atitinkamai 4-iems (40 proc.) ir 6-iems (60 proc.) kumeliukams, o IgG koncentraciją įvertinus pagal globulinų koncentraciją, PPI ir NPI nustatytas atitinkamai 3-ims (30 proc.) ir 7-iems (70 proc.) kumeliukams. Visų metodų tyrimų rezultatai statistiškai reikšmingai skiriasi (p <0,05). Kiekvienas metodas atskirai palygintas su kitais dviem metodais. Nustatyta, jog baltymų vertinimo refraktometru rezultatai statistiškai reikšmingai skiriasi nuo globulinų vertinimo rezultatų (p <0,05) bei nuo imunokrito rezultatų (p <0,05). Imunokrito ir globulinų vertinimo rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskiria (p >0,05).
3.2. Kraujo morfologinių rodiklių tyrimo rezultatai
Lentelė 7. Kraujo morfologinių rodiklių vidutinės reikšmės
Mėginio paėmimo laikas WBC vidurkis, m/mm3 Neu vidurkis, % Lym vidurkis, % 0-4 val. po gimimo 8,08 ± 2,72 44,01 ± 10,52 43,88 ± 10,13 24-32 val. po gimimo 7,06 ± 2,33 44,64 ± 13,35 45,56 ± 14,31
7 lentelėje pateiktos kraujo morfologinių rodiklių vidutinės reikšmės po gimimo ir praėjus 24 valandoms. Rodiklių koncentracijos, palyginus jas po gimimo ir po 24 valandų, statistiškai reikšmingai nesiskiria (p>0,05).
8 pav. WBC koncentracijų palyginimas po gimimo ir po 24 val. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 WBC , m/m m 3
Tiriamosios imties nariai
32 8 paveikslėlyje pavaizduotas WBC koncentracijų palyginimas po gimimo ir praėjus 24 valandoms. 4-iems (40 proc.) kumeliukams WBC koncentracija per pirmąją parą po gimimo padidėjo, 6-iems (60 proc.) ši koncentracija sumažėjo.
9 pav. Neutrofilų ir limfocitų vidutinių koncentracijų palyginimas
9 paveikslėlyje pavaizduotas neutrofilų ir limfocitų vidutinių koncentracijų po gimimo ir po 24 valandų palyginimas. Neutrofilų ir limfocitų koncentracijos po 24 val. yra nežymiai didesnės, palyginus su koncentracijomis po gimimo (p> 0,05).
3.3. Kraujo biocheminių rodiklių tyrimo rezultatai
Lentelė 8. Kraujo biocheminių rodiklių vidutinės reikšmės
Mėginio paėmimo laikas TP, g/l Alb, g/l Glob, g/l
0-4 val. po gimimo 27,17 ± 6,75 21,62 ± 6,08 5,83 ± 1,59 24-32 val. po gimimo 40,16 ± 15,65 19,095 ± 6,06 21,06 ± 12,18
8 lentelėje pateikiamos serumo biocheminiu tyrimu nustatytų bendrų baltymų, albuminų ir globulinų vidutinės koncentracijos.
43 43.5 44 44.5 45 45.5 46
Neu vidurkis Lym vidurkis
Kon ce n tra cija, % Kraujo parametrai
33
10 pav. Bendrų baltymų, albuminų ir globulinų koncentracijos po gimimo. TP ir Alb koreliacijos koef. r=0,974 (p<0,05). TP ir Glob koreliacijos koef. r=0,523 (p>0,05)
11 pav. Bendrų baltymų, albuminų ir globulinų koncentracijos 24 val. po gimimo. TP ir Alb koreliacijos koef. r=0,631 (p<0,05), TP ir gGlob koreliacijos koef. r=0,842 (p<0,001).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 Ko n ce n tr acija, g /l
Tiriamosios imties nariai
TP po gimimo Alb po gimimo Glob po gimimo
0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 Ko n ce n tr ac ija, g /L
Tiriamosios imties nariai
34 10 paveikslėlyje pavaizduotos serumo bendrų baltymų, albuminų ir globulinų koncentracijos po gimimo. Matoma stipri teigiama koreliacija tarp bendrų baltymų ir abuminų, Pirsono koreliacijos koeficientas r = 0,974 (p <0,05). Globulinų koncentracija yra ženkliai mažesnė nei baltymų ar albuminų visų kumeliukų kraujo serume. Bendrų baltymų ir globulinų Pirsono koreliacijos koeficientas r =0,523 (p>0,05), tačiau koreliacija statistiškai nepatikima (p >0,05).
11 paveikslėlyje pavaizduota serumo bendrų baltymų, albuminų ir globulinų koncentracijos praėjus 24 val. po gimimo. Matoma teigiama vidutinio stiprumo koreliacija tarp bendrų baltymų ir albuminų, koreliacijos koeficientas r =0,631 (p <0,05). Stebimas žymus globulinų koncentracijos padidėjimas. Šiuo atveju bendrų baltymų ir globulinų koreliacijos koeficientas r =0,842 (p <0,001).
12 pav. Kraujo biocheminių rodiklių vidurkių skirtumai po gimimo ir po 24 val.
12 paveikslėlyje vaizduojamas TP, Alb ir Glob vidutinių reikšmių palyginimas. Bendrų baltymų ir globulinų koncentracijų vidurkiai po gimimo ir po 24 val. skiriasi reikšmingai (p <0,05), albuminų koncentracijų vidurkiai po gimimo ir po 24 valandų skiriasi nereikšmingai (p >0,05).
3.4.
Kumeliukų sveikatos būklės įvertinimas
13 paveikslėlyje pavaizduotas kumeliukų pasiskirstymas pagal sveikatos būklę. 6 (60 proc.) kumeliukai buvo sveiki, 3-ims (30 proc.) kumeliukams pasireiškė omfalitas, 1-am (10 proc.) pasireiškė mekonijaus užsilaikymas. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
TP vidurkis, g/l Alb vidurkis, g/l Glob vidurkis, g/l
35
13 pav. Kumeliukų pasiskirstymas pagal sveikatos būklę
14 paveikslėlyje vaizduojamas pasiskirstymas pagal imuniteto statusą, nustatytą imunokrito metodu, tarp sergančių ir sveikų kumeliukų. Sveikų kumeliukų grupėje po 3 (50 proc.) kumeliukus turėjo atitinkamai pakankamą ir nepakankamą pasyvų imunitetą, tuo tarpu tarp sergančių kumeliukų 1-am (25 proc.) nustatytas pakankamas pasyvus imunitetas, 3-ims (75 proc.) - nepakankamas pasyvus imunitetas.
14 pav. Susirgimų pasireiškimas pagal pasyvaus imuniteto statusą, nustatytą pagal imunokritą 60%
30%
10%
Sveikas Omfalitas Mekonijaus užsilaikymas
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Sergantys Sveiki
36
15 pav. Susirgimų pasireiškimas pagal pasyvaus imuniteto statusą, nustatytą pagal globulinų koncentraciją
15 paveikslėlyje vaizduojamas pasiskirstymas pagal imuniteto statusą, nustatytą pagal globulinų koncentraciją tarp sergančių ir sveikų kumeliukų. Sveikų kumeliukų grupėje po 3 (50 proc.) kumeliukus turėjo atitinkamai pakankamą ir nepakankamą pasyvų imunitetą, tuo tarpu tarp sergančių kumeliukų 4-iems (100 proc.) nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Sergantys Sveiki
37
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS
Atlikus imunokrito tyrimą, 100 proc. kumeliukų iškart po gimimo nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas. Atsižvelgiant į plačiai žinomą faktą, jog kumeliukai gimsta be IgG arba su labai minimaliomis jo koncentracijomis ir turi nepakankamą pasyvų imunitetą, šie tyrimo rezultatai vertinti kaip pakankamai tikslūs. Praėjus 24 val. po gimimo, 100 proc. kumeliukų imunokritas reikšmingai padidėjo (p <0,05). 60 proc. 24 val. amžiaus kumeliukų nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas. Pasak Mortola (10), imunokrito tyrimo IgG koncentracijai įvertinti jautrumas ir specifiškumas, vertinant pagal vieną nustatytą normą, atitinkamai yra 94 proc. ir 82 proc. Tiriant veršelių imunokritą, nustatytas jautrumas buvo 88 proc. (43) Šis metodas nėra pakankamai gerai ištirtas, todėl, norint gauti tikslesnius rezultatus, tyrimą reikėtų kartoti su didesne imtimi. Tačiau atsižvelgiant į pokyčių dėsningumus ir kumeliukų fiziologiją, manoma, jog tyrimas galėtų būti pakankamai tikslus ir tinkamai atspindėti pasyvaus imuniteto statuso pasiskirstymą tiriamojoje grupėje.
Atlikus serumo TP ir Alb nustatymą biocheminiu tyrimu ir apskaičiavus Glob koncentracijas, 100 proc. kumeliukų iškart po gimimo nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas. Tuo pačiu principu, kaip imunokrito atveju, šie rezultatai vertinti kaip pakankamai tikslūs. 90 proc. kumeliukų serumo globulinų koncentracija per pirmąsias 24 valandas po gimimo padidėjo, 10 proc. kumeliukų stebimas nežymus globulinų koncentracijos sumažėjimas (p >0,05). 70 proc. kumeliukų nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas. Fouché (32) savo atlikto tyrimo metu nustatė, jog pagal serumo globulinų kiekį vertinant IgG koncentraciją, taikytos vertinimo normos jautrumas ir specifiškumas atitinkamai yra 90,70 proc. ir 76,92 proc. Autorė teigia, jog šis metodas galėtų būti efektyvus stebėsenos testas dėl didelio specifiškumo, bei pažymi, jog laiku nediagnozuotas pasyvaus imuniteto nepakankamumas turi didesnes pasekmes nei nebūtinas kumeliuko gydymas imunoglobulinais, todėl stebėsenos metu turėtų būti siekiama identifikuoti kuo daugiau nepakankamą pasyvų imunitetą turinčių gyvūnų. Reikėtų atsižvelgti į tai, jog kiekviena laboratorija turi skirtingą biocheminį analizatorių ir gali rodyti skirtingas kraujo parametrų koncentracijas, todėl vertinimas pagal moksliniame tyrime nustatytas reikšmes šiuo atveju gali būti nepakankamai tikslus.
Atlikus serumo TP nustatymą refraktometru, 100 proc. kumeliukų iškart po gimimo nustatytas pakankamas pasyvus imunitetas. Praėjus 24 valandoms, tik 70 proc. kumeliukų bendrų baltymų koncentracija padidėjo, o 30 proc. kumeliukų stebimas koncentracijos sumažėjimas (p >0,05), tačiau visiems kumeliukams (100 proc.) nustatytas pakankamas pasyvus imunitetas. Šie rezultatai reikšmingai skyrėsi nuo prieš tai atliktų dviejų tyrimų rezultatų (p <0,05). Šis metodas pasižymi mažesniu jautrumu ir specifiškumu nei prieš tai taikyti metodai – Elsohaby atlikto tyrimo metu nustatyta, kad pagal
