ŠVINO IR NIKELIO JONŲ ĮTAKA BENDRŲ BALTYMŲ IR METALOTIONEINŲ SINTEZEI LABORATORINIŲ PELIŲ KEPENYSE: CINKO JONŲ APSAUGOS POVEIKIO ĮVERTINIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

INDRĖ ŠVEIKAUSKAITĖ

ŠVINO IR NIKELIO JONŲ ĮTAKA BENDRŲ BALTYMŲ IR

METALOTIONEINŲ SINTEZEI LABORATORINIŲ PELIŲ

KEPENYSE: CINKO JONŲ APSAUGOS POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė dr. Ilona Sadauskienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

TVIRTINU

Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis

ŠVINO IR NIKELIO JONŲ ĮTAKA BENDRŲ BALTYMŲ IR METALOTIONEINŲ SINTEZEI LABORATORINIŲ PELIŲ KEPENYSE: CINKO JONŲ APSAUGOS POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė dr. Ilona Sadauskienė 2014 05 22 Darbo recenzentas Darbą atliko

Magistrantė Indrė Šveikauskaitė 2014 05 22

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 5

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Švino biologinis vaidmuo ... 11

1.1.1. Švino savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje ... 11

1.1.2 Švinas ir oksidacinis stresas ... 12

1.2 Nikelio poveikis organizmui ... 14

1.2.1 Nikelio savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje ... 14

1.2.2 Nikelis ir oksidacinis stresas ... 15

1.3 Cinko vaidmuo organizme ... 16

1.3.1 Cinko reikšmė organizmui ... 16

1.3.2 Cinko antioksidacinės savybės ... 17

1.4 Sunkiųjų metalų įtaka baltymų sintezei ... 19

1.4.1 Metalotioneinų reikšmė metalų detoksikavime ... 19

1.4.2 Toksiškų metalų įtaka genų raiškai ... 21

2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 23

2.1 Tyrimo objektas ir reagentai ... 23

2.2 Sunkiųjų metalų poveikio laboratorinėms pelėms tyrimo modelis ... 24

2.3 Baltymų sintezės greičio nustatymas ... 27

2.4 Metalotioneinų koncentracijos nustatymas ... 27

2.5 Duomenų patikimumo vertinimas ... 28

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1 Metalų įtaka baltymų sintezei ... 28

3.2 Metalų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse ... 31

3.2.1 Kompleksinis švino ir cinko poveikis metalotioneinų sintezei ... 31

3.2.2 Kompleksinis nikelio ir cinko poveikis MT sintezei ... 33

IŠVADOS ... 36

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 37

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 44

SANTRAUKA

Indrės Šveikauskaitės magistro baigiamasis darbas. Švino ir nikelio jonų įtaka bendrų baltymų ir metalotioneinų sintezei laboratorinių pelių kepenyse: cinko jonų apsaugos poveikio įvertinimas. Mokslinis vadovas dr. Ilona Sadauskienė. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Neuromokslų institutas, Molekulinės neurobiologijos laboratorija, Kaunas, 2014.

Pagrindinis tyrimo tikslas – įvertinti švino ir nikelio jonų įtaką baltymų ir metalotioneinų sintezei laboratorinių pelių kepenyse bei cinko apsauginį poveikį, veikiant švinui ir nikeliui.

Tyrimams naudotos 4-6 savaičių nelinijinės baltosios laboratorinės pelės, sveriančios nuo 20 iki 25 gramų. Pelių laikymo sąlygos atitiko reikalavimus.

Eksperimentams pelės buvo suskirstytos į 6 grupes: I – kontrolinė, II – gaunančios Pb(CH3COO)2 (dozė 10 mg Pb/kg), III – gaunančios ZnSO4 (1,56 mg Zn/kg), IV – ZnSO4 ir po 20 minučių Pb(CH3COO)2 (anksčiau nurodytos dozės), V – NiCl2 (1,12 mg Ni/kg) , VI – ZnSO4 ir po 20 minučių NiCl2 (anksčiau nurodytos dozės). Druskų tirpalai į pilvo ertmę švirkšti 14 dienų. Praėjus 14 dienų, pelės buvo anestezuotos, joms atlikta cervikalinė dislokacija. Tyrimams naudotos pelių kepenys.

Baltymų koncentracijai nustatyti naudojome Beer/Lambert metodą, spektrofotometriškai matavome sugertį ties 260 ir 280 nm banga. Metalotioneinų koncentraciją nustatėme pagal Peixoto metodiką, spektrofotometriškai sugertį matavome ties 412 nm banga.

SUMMARY

Master thesis of Indre Sveikauskaite. The effects of lead and nickel ions on total proteins and metallothioneins synthesis in mice liver: protective effects of zinc ions evaluation. Scientific supervisor dr. Ilona Sadauskiene. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Neuroscience Institute, Laboratory of Molecular Neurobiology, Kaunas 2014.

The present study was conducted to investigate the effects of lead and nickel ions on total proteins and metallothioneins synthesis in mice liver and evaluate protective effects of zinc ions.

Experiments were done on 4-6 weeks old white laboratory outbreed mice weighing 20-25 g. All experiments performed according to the Republic of Lithuania Law on the Care, Keeping and Use of animals (License of State Veterinary Service for working with laboratory animals No 0221).

For experiment mice were sorted out into 6 groups: I group – control; II group – Pb(CH3COO)2 (10 mg Pb per kg of body mass), III group – ZnSO4 (1,56 mg Zn per kg of body mass), IV – ZnSO4 and after 20 minutes Pb(CH3COO)2 (the same doses), V – NiCl2 (1,12 mg Ni per kg of body mass) , VI – ZnSO4 and after 20 minutes NiCl2 (the same doses).

Concentration of protein was determined by Lowry method. MTs were assayed in mice liver according to the method of Peixoto N. C.

PADĖKA

SANTRUMPOS

8-OH-dG – 8-hidroksi-2-deoksiguanozinas ADF – aktyviosios deguonies formos ALA – alaninas

ALAD – δ-aminolevulino rūgšties dehidratazė APE1 – apirimidininė endonukleazė

ATP – adenozino 5'-trifosfatas DNR – deoksiribonukleorūgštis FMSF – proteazių slopiklis

G-6-PDH – gliukozės 6- fosfatdehidrogenazė GPx – gliutationo peroksidazė

GSH – redukuotas glutationas

LD50 – vidutinė mirtinoji dozė; dozė, nuo kurios žūva pusė (50 proc.) tiriamų gyvūnų LPO – lipidų peroksidinė oksidacija

MT – metalotioneinai

MTF – metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys RNR – ribonukleorūgštis

SH – sulfhidrilinės grupės SM – sunkieji metalai

SOD – superoksido dismutazė TchA – trichloracto rūgštis

ĮVADAS

Oksidacinis stresas – aktyviųjų deguonies formų (ADF) sukelto biomolekulių pažeidimo rezultatas. Itin stiprus oksidacinis stresas sukelia ląstelių žūtį (Barja et al., 2002). Normaliomis sąlygomis ADF kiekiai yra reguliuojami ir kompensuojami jas naikinančių reakcijų. Nedideli ADF kiekiai valdo tam tikrus fiziologinius procesus ląstelėje: yra tarpiniai reakcijų produktai, svarbūs reguliuojant ląstelės dauginimąsi bei signalo perdavimo keliams, NO˚ veikia kraujagyslių tonusą. Sutrikus pusiausvyrai tarp ADF susidarymo ir pašalinimo, pradeda vystytis oksidacinis stresas. Jeigu oksidacinis stresas nestiprus, ląstelė sugeba apsisaugoti greitindama antioksidacinės sistemos fermentų sintezę. Dažniausiai ląstelė aktyvina katalazės ir glutationo reduktazės genų raišką. Oksidacinį stresą gali sukelti radiacija, ultragarsas, sunkieji metalai (Barja et al., 2002; Valko et al., 2004). Toksiški ir kancerogeniški metalai sąveikaudami su branduolio baltymais sukelia oksidacinį stresą ir DNR pažaidas (Valko et al., 2005). Vieni tokių metalų – švinas ir nikelis.

Švinas – sunkusis metalas, sukeliantis neurologines, virškinamojo trakto, reprodukcinės sistemos, imunologines patologijas (Patrick et al., 2006). Švinu galima apsinuodyti pro kvėpavimo ir virškinimo sistemas (Mudipalli et al., 2007). Nustatyta, jog kepenys – viena didžiausių švino talpyklų organizme, švinas kepenis pasiekia per žarnyno ir vartų venas (Ptašekas et al., 2002). Sunkusis metalas suriša baltymų, turinčių sulfidrilines grupes, molekules, skatina laisvųjų radikalų sintezę bei mažina antioksidantų aktyvumą bei sukelia oksidacinį stresą (Patrick et al., 2006; Sanders et al., 2009). Oksidacinis stresas – pirmasis apsinuodijimo švinu požymis, ADF randama plaučiuose, endoteliniame audinyje, kepenyse ir smegenyse (Hsu et al., 2002).

Cinkas – žmogui būtinas mikroelementas, esantis visuose organuose, audiniuose ir skysčiuose (Benters et al., 1997). Didžioji cinko dalis surišta su baltymais ar amino rūgštimis: GSH, cisteinu, histidinu (Oteiza et al., 2012). Cinkas laikomas netiesioginiu antioksidantu – nesuriša laisvųjų radikalų, tačiau palaiko antioksidacinę sistemą (Valko et al., 2005). Cinko trūkumas siejamas su audinių oksidacine pažaida, trūkstant cinko organizmas tampa jautresnis oksidaciniam stresui (Valko et al., 2005).

Organizmui kovojant su sunkiaisiais metalais, itin svarbūs apsauginiai baltymai – metalotioneinai (MT). MT – viduląsteliniai, mažos molekulinės masės, sunkiuosius metalus surišantys baltymai. Šią jų savybę sąlygoja molekulėje esančios cisteino liekanos (Coyle et al., 2002). MT būtini detoksikuojant organizmą (Curtis et al., 1999). Didžiausias metalotioneinų kiekis inkstuose, žarnyne, kasoje ir kepenyse (Coyle et al, 2002). Metalotioneinai – didžiausia cinko talpykla organizme. Oksidacinio streso metu sudėtinės metalotioneinų cisteino liekanos oksiduojamos, o cinko atpalaidavimas reikšmingas apsaugant ląstelę nuo oksidacinės pažaidos (Maret et al., 1995).

Įvairių studijų metu išsiaiškinta, jog sunkieji metalai sukelia oksidacinį stresą bei DNR pažaidas, tačiau vis dar nėra bendros išvados, koks mechanizmas tai lemia, remiantis tyrimų duomenimis – jų keletas. Šiame darbe vertinama cinko jonų geba apsaugoti kepenų baltymų sintezės sistemą nuo dviejų sunkiųjų metalų – švino ir nikelio – poveikio.

Darbo naujumas. Šiame darbe pateikti tyrimai ir analizė leidžia detaliau suprasti cinko apsauginį

poveikį, veikiant nikeliui ir švinui. Nustatėme, jog cinkas gali apsaugoti ląstelę sunkiųjų metalų poveikio, tačiau poveikis priklauso nuo intoksikavimo laiko. Cinkas gali apsaugoti ląstelę ankstyvoje švino intoksikavimo stadijoje, tačiau vėlyvoje nikelio intoksikavimo stadijoje.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: įvertinti švino ir nikelio jonų įtaką baltymų ir metalotioneinų sintezei laboratorinių pelių kepenyse bei cinko apsauginį poveikį, veikiant šiems metalams.

Darbo uždaviniai:

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1

Švino biologinis vaidmuo

1.1.1. Švino savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje

Švinas egzistuoja trijose formose: metalinis švinas, neorganinis švinas ir jo junginiai (švino druskos) bei organinis švinas (sudėtyje yra anglies) (Sanders et al, 2009).

Švinas sukelia neurologines, hematologines, reprodukcines bei imunologines patologijas (Patrick et al., 2006). Apsinuodijimas švinu galimas per kvėpavimo ir virškinimo sistemas. Maždaug 30-40 proc. įkvėpto švino patenka į kraujotaką. Absorbuotas švinas 30-35 dienas lieka kraujyje ir per tą laiką kaupiasi kituose audiniuose – kepenyse, aortoje, smegenyse, plaučiuose, kauluose ir dantyse (Patrick et al., 2006). Švino pusperiodis smegenyse – maždaug dveji metai, kauluose švinas gali išlikti apie 20-30 metų (Verstraeten et al., 2008). Tyrimų metu nustatyta, jog kepenų audinys didžiausia švino talpykla (iki 33 proc.) iš visų minkštųjų audinių (Mudipalli, 2007).

Švinas pasiekia kepenis per žarnyno ir vartų venas. Dalis švino pasišalina per kepenis kartu su tulžimi, likusioji – kaupiasi hepatocituose (Ptašekas et al., 2002). Švinui inhibuojant ALA dehidratazę, sutrikdoma hemo sintezė, pradeda vystytis toksinė anemija. Švinas turi itin daug įtakos energijos metabolizmo silpnėjimui (Rosenthal et al., 2009). Kaip ir kiti sunkieji metalai, švinas skatina laisvųjų radikalų sintezę bei silpnina antioksidantų veikimą. Sunkusis metalas taip pat suriša baltymų, turinčių sulfhidrilines grupes, molekules. Baltymai tampa neaktyvūs bei sutrikdomas oksidacinis balansas (Patrick et al., 2006).

Apsinuodijimo švinu mechanizmas kompleksinis: oksidacinis stresas, membranų biofizikiniai pokyčiai, ląstelės signalų išreguliavimas bei neurotransmisijos pablogėjimas, iššaukiantis švino jonų neurotoksiškumą. Švino toksiškumas pasireiškia dviem keliais: oksidacinio streso – aktyviųjų deguonies formų generacija ir tiesioginiu antioksidantų atsargų išeikvojimu (Patrick et al., 2006; Sanders et al, 2009). Sunkusis metalas inhibuoja ALAD, todėl padidėja ADF produkciją stimuliuojančios ALA. Švinas taip pat gali stimuliuoti membranos lipidų peroksidaciją, surišdamas fosfatidilcholiną bei pakeisdamas membranos biofizikines savybes (Gillis et al., 2012).

Švino buvimas organizme pastebimas tiriant glutationo metabolizmą. Glutationas – stipriausias organizmo antioksidantas, kurį sudaro cisteino, glicino ir glutamo rūgštys. Slopindamas laisvuosius radikalus, glutationas atsakingas už specifinių vaistų ir toksinų metabolizmą kepenyse. Švinas paveikia glutationo molekulę ir ši tampa neaktyvi (Gillis et al., 2012).

Nustatyta, kad nedidelės švino koncentracijos stimuliuoja ląstelių augimą. Galimas šio reiškinio mechanizmas grindžiamas švino gebėjimu surišti laisvą viduląstelinį kalcį bei aktyvuoti baltymo kinazę C (PKC). Švinas sukelia signalo perdavimo kaskadą, kuri pradeda stimuliuoti DNR sintezę (Rosenthal et al., 2009)

1.1.2 Švinas ir oksidacinis stresas

Nustatyta, jog švino sukeltas oksidacinis stresas – pirmasis apsinuodijimo šiuo sunkiuoju metalu požymis ligos patogenezėje. Oksidacinio streso požymių rasta įvairiuose organuose, ADF aptikta plaučiuose, endoteliniame audinyje, smegenyse bei kepenyse (Hsu et al., 2002). 1 pav. pateikiami švino

sukelto oksidacinio streso požymiai.

1 pav. Švino sukelto oksidacinio streso požymiai (pagal A. Mudipalli)

Švino oksidacinis stresas susijęs su ADF generavimo ir šalinimo disbalansu audiniuose ir ląstelės komponentuose: membranose, DNR, baltymuose. Membranų rūgštyse esantys dvigubi ryšiai silpnina C-H ryšį anglies atome ir H gali būti pašalinamas daug lengviau. Taip pat rūgštys, turinčios ne daugiau dviejų dvigubųjų rūgščių yra atsparesnės oksidaciniams stresui. Esminis švino sukelto oksidacinio streso mechanizmas siejamas su rūgščių struktūros pakeitimu. Membranos jautrumas peroksidacijai sąlygoja

• Modifikuojami membranos baltymai; • Pakeičiamas signalas;

• Riebiųjų rūgščių grandinės ilginimas.

Ląstelės

membrana

• Akumuliuojantis ALA sąveikauja su alkilinančiu agentu ir suformuoja DNR aduktus;

• Sąveika su cinką rišančiais baltymais transkripcijos

komplekse.

Genomas

• Baltymų funkcinių grupių inhibavimas SOD, GSH peroksidazė, GSH reduktazė;

• GSH išeikvojimas.

rūgščių ilgį, o švino sukeltas arachidono rūgšties pailgėjimas gali sukelti padidėjusią lipidų peroksidaciją membranoje. Taip pat švinas veikia kitus ląstelėje vykstančius procesus: endocitozę ir egzocitozę, signalo perdavimą, membranos fermentų aktyvumo pokyčius (Patra et al., 2011). 2 pav. pateiktas galimas švino sukelto oksidacinio streso mechanizmas ir taikiniai.

Manoma, kad glutationo bei antioksidacinio baltymo aktyvumo pokyčiai susiję būtent su švino sukeltu oksidaciniu stresu. Keleto studijų metu įrodyta, jog tai lemia aktyviųjų deguonies formų susidarymą, kuris sąlygoja biomolekulių: baltymų, lipidų ir DNR pažaidą (Stohs et al., 1995).

Nustatyta, jog ilgiau trunkantis švino poveikis sąlygoja OH+, H2O2, O2 ir LPO (lipidų peroksidazės) gamybą in vivo. Ilgalaikis švino poveikis gali nulemti ląstelių vidinių antioksidacinių gynybinių savybių išeikvojimą ir sisteminę mobilizaciją(Flora et al., 2008).

2 pav. Švino sukelto oksidacinio streso galimas mechanizmas ir taikiniai (Pagal Gagan Flora)

Keleto studijų metu įrodyta, kad švinas keičia antioksidacinių baltymų: superoksido dismutazės (SOD), katalazės, glutationo peroksidazės (GPx) ir gliukozės 6-fosfato dehidrogenazės (GGPD) aktyvumą (Chiba et al., 1996).Pagrindiniai potencialūs švino taikiniai – fermentai: SOD, katalazė ir GPx.

Selenas būtinas GPx aktyvumui, tačiau švinas jungiasi su selenu ir silpnina pastarojo aktyvumą. Katalazė – hemą sudarantis baltymas, todėl prisijungus švinui, jos aktyvumas mažėja (Flora et al., 2008). SOD aktyvumui būtinas cinkas ir varis. Vario jonai dalyvauja oksidacijoje, o cinkas stabilizuoja baltymo molekulę. Abu metalai pakeičiami švinu, kuris sumažina SOD aktyvumą (Halliwell et al., 1989).

1.2

Nikelio poveikis organizmui

1.2.1 Nikelio savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje

Nikelis – daugelyje junginių randamas elementas. Maždaug 150 000 tonų nikelio į aplinką pateko su vulkaninėmis dulkėmis ir akmenų erozijos metu, apie 180 000 tonų nikelio nuteka iš antropogeninių šaltinių – fosilijų oksidavimosi metu bei iš industrinių atliekų (Kasprzak et al., 2003). Maždaug 5 proc. viso nikelio sunaudojama liejyklose bei gaminant spausdintuvų kasetes (Keyuna et al., 2011).

Priklausomai nuo formos, nikelis į organizmą gali patekti per odą, plaučius ir virškinamąjį traktą (Hoffmal et al., 2007). Nikeliui jautriems žmonėms pasitaiko alerginė odos reakcija. Dažniausiai kontaktinį dermatitą sukelia nikelio turintys papuošalai bei aksesuarai (Keyuna et al., 2011).Nikelis ir jo druskos priskiriami pirmai kancerogenų grupei, sukelia nosiaryklės bei kvėpavimo sistemos vėžį (Murawska et al., 2012). Pagrindinės kancerogeniškos medžiagos, patenkančios nikelio įkvėpimo metu –

mažai tirpios vandenyje: kristalinio nikelio sulfidas, kristalinio nikelio subsulfidas ir įvairūs nikelio oksidai (Sunderman et al., 1968). Fagocitavusios, netirpių medžiagų dalelės su nikelio jonais sudaro viduląstelines vakuoles, kurios išsidėsto ląstelės centre aplink branduolį. Vakuolių rūgštinis pH 4,5 pagreitina nikelio jonų išsiskyrimą iš fagocitavusių dalelių ir taip ląstelės viduje sukuriama itin didelė sunkiojo metalo koncentracija (Chervona et al., 2012).Nustatyta, jog žmogus vienu metu gali įkvėpti iki 30 μm nikelio.Dalelės, mažesnės nei 10μm nusėda, gilesniuose plaučių audiniuose (Keyuna et al., 2011).

Svarbu paminėti, jog nikelis lengvai pereina placentą, gali patekti į motinos pieną (Dart et al., 2000).Tikslus nikelio genotoksiškumo mechanizmas nėra išaiškintas, tačiau laisvųjų radikalų susidarymas gali būti įvardijamas kaip viena pagrindinių grandžių (Murawska et al., 2012). Laisvieji radikalai susidaro Fentono reakcijos metu, kuriai būtini H2O2 ir Fe(II) ar Cu(II) jonai. Reakcijos produktas – reaktyvus hidroksilo radikalas OH•-, kuris reaguoja su kitomis molekulėmis. Taip sukeliama nukleobazių, ribozės ir deoksiribozės, oksidacija. Tai buvo patvirtinta sukūrus eksperimentinį modelį, kurio metu padidėjo 8-hidroksi-2`-deoksiguanozino (8-OH-dG) koncentracija. Šis produktas gali būti promutagenu, sukeliančiu kancerogeniškus pokyčius vaisiaus organizme(Valko et al., 2005; Murawska et al., 2012).

Tiriant žmones, ilgą laiką dirbusius su nikeliu, nustatyta, jog nikelis sukelia negrįžtamą plaučių pažaidą, anomalias plaučių funkcijas, inkstų vamzdelių nekrozę, anemiją bei nosies pertvaros opas. Taip pat ištirta, jog nikelis skatina kalcio ir cinko jonų ekskreciją su šlapimu. Nikelis, inhibuodamas ATP‘azę, gali sukelti neurologinius sutrikimus, konvulsijas ir komą (Keyuna et al., 2011).

1.2.2 Nikelis ir oksidacinis stresas

Dvivalentis nikelis sukelia oksidacinį stresą. Tiesa, lyginant su kitais sunkaisiais metalais, nikelio poveikis ADF indukcijai nestiprus (toksiškumas didėjimo tvarka: Ni (II)<Cr (VI)<Cd (II)) (Schmid et al., 2007).Nikelis dažniausiai nemutageniškas bakterinėse sistemose, jo mutageniškumas žinduolių sistemose nedidelis, tačiau jis geba indukuoti DNR grandinių trūkius bei chromosomų aberacijas heterochromatiniuose regionuose(Dally et al., 1997).

Pats nikelis nesukelia laisvųjų radikalų susidarymo iš deguonies, vandenilio peroksido ar lipidų hidroperoksidazių; nepaisant to, dvivalenčio nikelio reaktyvumas deguonies dariniams gali būti moduliuojamas chelatinimo reakcijų metu su histidino ar cisteino ligandais. Laisvieji radikalai, susidarę dvivalenčio nikelio – tiolo komplekso reakcijos metu su molekuliniu deguonimi ir/ar lipidų hidroperoksize, gali būti itin svarbūs dvivalenčio nikelio toksiškumo mechanizmui (Das et al., 2007).

ADF susiformavimas gali būti aiškinamas įvairiais būdais. Hidroksilo radikalai reaguoja su visais ląstelės DNR komponentais. Oksidacinė pažaida pasireiškia dėl laikinų genetinės informacijos modifikacijų. Dėl DNR pažaidos, formuojasi replikacijos klaidos, atsiranda transkripcijos bei signalo perdavimo indukcija ir genomo nestabilumas. Tuo pasireiškia nikelio kancerogeniškumas (Keyuna et al., 2011).

Norint išsiaiškinti nikelio gebėjimą sukelti oksidacinę DNR pažaidą, HeLa ląstelės buvo inkubuotos su NiCl2 18h. DNR grandinių trūkiai buvo sukelti esant 250 μM ir didesnei koncentracijai (3 pav.) (Dally et al., 1997).Kito eksperimento metu, ištyrus žmogaus limfocitus paaiškėjo, jog oksidaciniai

Nikelio sukelta oksidacinė DNR pažaida taip pat pastebėta eksperimentų su gyvūnais metu. Aukštesnis 8-hidroksiguanino lygis žiurkės inkstuose sumažėjo po vienkartinės nikelio acetato injekcijos (Kasprzak et al., 1992). Nikelis gali inaktyvuoti fermentus tiesiogiai, pavyzdžiui reakcijų su histidinu ar cisteinu metu bei pakeisti metalų jonus metalo fermentų struktūroje (Dally et al., 1997).

3 pav. Ni sukelta oksidacinė pažaida (Pagal H. Dally, 1998)

1.3

Cinko vaidmuo organizme

1.3.1 Cinko reikšmė organizmui

Periodinėje elementų lentelėje cinkas randamas II b grupėje, kartu su toksiškais metalais – kadmiu ir gyvsidabriu. Tačiau cinkas nėra toksiškas žmogui. Eksperimentų su pelėmis metu nustatyta, kad cinko LD50 – 3g/kg kūno svorio, o tai 10 kartų daugiau nei kadmio bei 50 kartų daugiau nei gyvsidabrio LD50 (Plum et al., 2010).

Cinkas būtinas elementas kiekvienam gyvam organizmui. Jis aktyvina daugiau nei 300 fermentų, svarbus DNR replikacijoje, transkripcijoje bei baltymų sintezėje. Jungdamasis su daugeliu fermentų, cinkas gali aktyvinti ląstelių antioksidacinę sistemą ir apsaugoti organizmą nuo oksidacinio streso poveikio (Patra et al., 2011). Suaugusio žmogaus organizme yra maždaug 1,5-2,5 gramai cinko, kuris randamas visuose organuose, audiniuose, skysčiuose (Benters et al., 1997). Maždaug 90 proc. viso cinko randama skeleto raumenyse ir kauluose. Mažesni cinko kiekiai yra virškinamajame trakte, odoje, kepenyse, inkstuose, smegenyse, plaučiuose, prostatoje bei kituose organuose (Frederickson et al., 2001).

transkripcijos faktoriaus, metalotioneinų bei kitų cinkui jautrių baltymų, kurie gali surišti arba atlaisvinti cinko molekules (Fukada et al., 2011). Ląstelėje 30-40 proc. cinko lokalizuota branduolyje, 50 proc. citozolyje, o likusi dalis yra membranose (Vallee et al., 1993).

Didžioji dalis ląstelinio cinko surišta su baltymais ar kitais ląstelės komponentais: GSH, cisteinu, histidinu ar difosfato molekulėmis. Laisvo cinko dalis ląstelėje palyginti maža (Oteiza et al., 2012).

Baltymuose cinkas gali būti struktūrinis elementas arba gali lokalizuotis atrankaus fermento katalizės vietoje. Cinkas yra baltymo dalyje, reguliuojančioje baltymo-baltymo sąveiką, sąveikas tarp baltymo ir kitų makromolekulių – pvz. DNR ar RNR (Andreini et al., 2006).

Cinkas itin svarbus ląstelės membranos vientisumui: kontroliuoja insulino veikimą ir gliukozės koncentraciją kraujyje bei yra būtinas imuninės sistemos vystumuisi ir palaikymui. Cinkas reikalingas kaulų ir dantų mineralizacijai, žaizdų gijimui, taip pat yra 70 skirtingų baltymų komponentas, dalyvaujantis lipidų, angliavandenių ir baltymų metabolizme (Hotz et al., 2003).

Cinko trūkumas organizme siejamas su netinkama mityba, chroniškomis ligomis ar per dideliu geležies ar vario vartojimu (Hotz et al., 2003). Cinko trūkumas pasireiškia prastu augimu ir vystymusi, apetito stoka, dermatitu, alopecija, prastu žaizdų gijimu bei imuninės sistemos susilpnėjimu. (Bray et al., 1990). Cinko trūkumas yra itin retas ir jį dažniausiai sukelia genetiniai sutrikimai (Roth et al., 1994).

Cinkas į žmogaus organizmą gali patekti trimis būdais: įkvepiant, per odą arba per virškinimo traktą. Nuo to priklauso, kokia cinko dalis pateks į organizmą (Plum et al., 2010). Apsinuodijimai cinku reti, dažniausiai jie susiję su netinkama mityba bei gėrimais, kurie buvo laikomi galvanizuotose talpyklėse (Duncan et al., 1992).

1.3.2 Cinko antioksidacinės savybės

Chroniškas organizmo atsakas į ilgalaikį cinko poveikį pasireiškia padidėjusia metalotioneinų sinteze, chroniškas cinko trūkumas pasireiškia padidėjusiu jautrumu oksidaciniam stresui (Valko et al., 2005).

Cinkas yra inertiškas metalas, nedalyvaujantis oksidacijos – redukcijos reakcijose. Stiprūs cinko antioksidaciniai efektai pirmą kartą pastebėti 80-ųjų pabaigoje ir buvo išaiškinti du pagrindiniai šio efekto mechanizmai:

porfobilinogeno formavimąsi (Gibbs et al., 1985). Gibbs et al. pasiūlė tris modelius, kurie paaiškintų stabilizavimo mechanizmą: pirmasis modelis vaizduoja tiesioginį cinko prisijungimą prie sulfhidrilinių grupių. Antrasis – cinko prijungimą netoli sulfhidrilinių grupių. Trečiasis – cinko prijungimą prie kitos baltymo pusės, taip garantuojant baltymo konformacinius pokyčius.

2. OH radikalų iš vandenilio peroksido susidarymo silpninimas, taip išvengiant ADF formavimosi. Yra du galimi mechanizmai, apsaugantys nuo OH radikalų formavimosi. Pirmasis – metalo pašalinimas iš rišančios vietos, naudojant didelio giminingumo ligandus. Antrasis – pašalinant redokso metalą iš sujungimo vietos, pakeičiant jį panašiu redokso neaktyviu metalu, pavyzdžiui, varis keičiamas cinku (Bray et al., 1990).

Ilgalaikio cinko vartojimo pavyzdys – metalotioneinų indukcija (Valko et al., 2005). Paskutinėmis studijomis įrodyta, jog metalotioneinai rodo ryšį tarp vidinio ląstelės cinko ir ląstelės redokso būsenos. Esant itin stipriam oksidaciniam stresui, keičiasi ląstelės redokso būsena ir iš metalotioneinų atpalaiduojamas cinkas, kaip sulfidų ir disulfidų pasikeitimo rezultatas(Jiang et al., 1998).

Cinko trūkumas siejamas su didesne nei įprasta audinių oksidacine pažaida, įskaitant padidėjusią lipidų, baltymų ir DNR oksidaciją(Valko et al., 2005).

Kai kurių eksperimentų su gyvūnais metu įrodyta, jog chroniškas arba ilgalaikis cinko netekimas padaro organizmą jautresnį oksidacinio streso sukeltoms pažaidoms. Cinko trūkumas, susijęs su ADF formavimusi, kliniškai aprašytas kaip plaučių pažaida, laisvųjų radikalų gamyba plaučių mikrosomose ir mitochondrijose (Burke et al., 1985; Valko et al., 2005).

Vieno eksperimento metu buvo tiriami cinko trūkumo efektai žiurkių sėklidžių baltymams, lipidams ir DNR po oksidacinės pažaidos (Oteiza et al., 1995). Buvo nustatytas mažesnis glutamino sintetazės aktyvumas, didesnės baltymo koncentracijos ir mažesnis 8-OH-dG lygis. Oksidacinė pažaida buvo aiškinama kaip padidėjusi ADF generecija ir/ar cinko valdomų antioksidantinių procesų susilpnėjimas.

Yra žinoma, kad cinkas kovoja su švino jonais virškinamajame trakte, juos surišdamas metalotioneinų transportiniais baltymais (Ryan-Harsham et al., 2005). Todėl galima daryti prielaidą, jog cinkas pasižymi švino toksiškumą mažinančiomis savybėmis. Kai švinu pažeistoms žiurkėms buvo suleista cinko, prieš tai buvęs kritinis SOD rodmuo tapo normalus, o ALAD inhibavimas buvo sustabdytas (Batra et al., 1998).

Cinkas taip pat veikia kaip antioksidantas smegenyse. Lyginant su kitais audiniais, smegenyse yra sąlyginai daug cinko (Valko et al., 2005).

1.4

Sunkiųjų metalų įtaka baltymų sintezei

1.4.1 Metalotioneinų reikšmė metalų detoksikavime

Metalotioneinai (MT) – viduląsteliniai, mažos molekulinės masės, cisteinu praturtinti baltymai, priklausantys metalus rišančių baltymų superšeimai (Coyle et al., 2002). MT aptinkami gyvūnų organizmuose, aukštesniuose augaluose, eukariotiniuose mikroorganizmuose bei daugelyje prokariotų (Kägi et al., 1979; Kojima et al., 1991). Šios unikalios biomolekulės patraukė biologų ir chemikų dėmesį dėl savo nepaprastos cheminės struktūros – metalotioneinai sudaryti iš 61 amino rūgšties (nė vienos aromatinės), iš kurių 20 – cisteino liekanos. Cisteino liekanos sąlygoja MT savybę prijungti sunkiųjų metalų jonus (Curtis et al., 1999). Metalotioneinai suriša metaboliniams procesams trikdančius sunkiuosius metalus ir juos atskiria. Švinas ir nikelis sukelia apsauginių baltymų sintezę (Jeremy et al., 2007). Šie baltymai dalyvauja viso organizmo metalų metabolizme (David et al., 2009).

Kol kas nėra išaiškintas tikslus MT sintezės mechanizmas, tačiau bendru sutarimu manoma, jog metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys (MTF-1) svarbiausias MT transkripcijoje. MTF-1 šešių cinko „pirštų“ DNR rišantis domenas funkcionuoja kaip cinką fiksuojantis domenas ir visi šeši skirtingi „pirštai“ gali aktyviai dalyvauti moduliuojant MTF-1 perkėlimą į baltymą bei surišant MT-1 geno aktyvatorius(Li et al., 2006).

Šiuo metu metalotioneinai skirstomi į 15 skirtingų šeimų (Binz et al., 1999). Žinduolių metalotioneinai – vienos grandinės polipeptidai. Aminorūgščių liekanos išsidėsto keliais galimais variantais: cys-x-cys; cys-x-y-cys; cys-cys, kai x ir y – nėra cisteino amino rūgštis (Coyle et al., 2002). Metalotioneinai sudaryti iš dviejų subvienetų: α-domeno, kuris gali prijungti keturis dvivalenčio metalo atomus ir mažiau stabilaus β-domeno, kuris gali prijungti vos tris (Kägi et al., 1979). 4 pav. vaizduojama, kaip MT prisijungia metalų jonus (Curtis et al., 1999).

transgeniniai gyvūnai. Paskutinių dviejų sistemų panaudojimu įrodyta, jog MT būtini surišant sunkiųjų metalų jonus ir detoksikuojant organizmą (Curtis et al., 1999). Naudojant žuvų (Cyprinus carpio) epitelio ląsteles buvo nustatytas apsauginis MT poveikis, kai ląstelės buvo paveiktos kadmiu, o vėliau gydomos menadionu (Wright et al., 2000). Drosophila melanogaster turi keturis MT genus, kurie skatinami to paties MTF-1 faktoriaus. Tikslingo mutageninio poveikio metu pastebėta, kad visi keturi genai dalyvauja sunkiųjų metalų homeostazėje ir detoksikavime (Egli et al., 2006). MT ir kadmio koncentracijų ryšys inkstuose buvo nustatytas laukinių gyvūnų – slankų ir laukinių pelių – organizmuose (Alhama et al., 2006).

MT – gausiausia cinko saugykla. MT dažniausiai suriša cinko jonus, tačiau gali surišti ir Cu1+/2+; Cd2+; Hg2+; Pb2+; Fe2+; Co2+). MT sudaryti iš cinko telkinių sričių, kurios pasižymi kintamu rišamuoju efektu, todėl MT yra pagrindiniai laisvo ląstelinio cinko reguliuotojai. Cisteino tiolatai metalotioneinuose suriša cinką tetraedrine struktūra, susidaro Zn3S9 bei Zn4S11 sritys (Curtis et al., 1999). Cinkas natūraliomis sąlygomis pirmiausia surišamas β-domene, todėl tiksliai galima nustatyti atpalaiduojamo cinko kiekį (Palumaa et al., 2005).

Didelis metalotioneinų cisteino liekanų skaičius reikšmingas oksidacinio streso metu. MT veikia kaip viduląstelinė nukleofilinė „talpykla“, kuri „sugauna“ elektrofilus, alkilinančius reagentus bei laisvuosius radikalus (Lazo et al., 1995). Oksidacinio streso metu sudėtinės MT cisteino liekanų dalelės gali būti oksiduojamos, o cinko jonų atpalaidavimas reikšmingas apsaugant nuo oksidacinės pažaidos (Maret et al., 1998).

Aptiktos kelios metalotioneinų izoformos: žinduolių MT-1 ir MT-2 randama visuose organuose, MT-3 tik smegenyse, o MT-4 gausu audiniuose. MT-1 ir MT-2 izoformos sužadinamos daugelios streso faktorių bei gliukokortikoidų, citokinų, reaktyvių deguonies formų ir metalų jonų. MT-3 ir MT-4 į šiuos veiksnius nereaguoja. Daugėja įrodymų, kad žinduolių MT-1 ir MT-2 izoformos susijusios su cinko homeostaze bei apsauginiu poveikiu prieš sunkiuosius metalus (Rigby et al., 2006). Tyrimų metu nustatyta, kad MT-3 izoforma cinko ir kadmio jonus suriša silpniau nei MT-2, tačiau MT-3 pasižymi didesniu metalų surišimo našumu bei plastiškumu. Mažesnė metalų surišimo trauka gali būti susijusi su heksapeptido bei rūgštiniais intarpais (Palumaa et al., 2005).

Didžiausias metalotioneinų kiekis organizme – inkstuose, kepenyse, žarnyne ir kasoje (Coyle et al., 2002). Kepenų MT kiekiai skirtinguose organizmuose skiriasi: žmonių, šunų, kačių, kiaulių MT lygis 400-700 μg/g kepenų; beždžionių, karvių ir avių apie 200 μg/g kepenų, o triušių ir graužikų vos 2-10 μg/g kepenų (Henry et al., 1994).

MT taip pat gali būti naudojami kaip biologiniai žymenys nustatant sunkiųjų metalų buvimą aplinkoje. Ankstyva MT indukcija žymėtais metalais reikalinga norint aptikti aplinkai toksiškus metalus (Cd, Hg, Cu) (Dabrio et al., 2002). Atrinkti sunkieji metalai, pvz. Cd, Cu ar Hg – itin geri MT biosintezės induktoriai, dėl to MT dažnai pasirenkami kaip biologiniai žymenys vandens ekosistemoje (Alhama et al., 2006).

1.4.2 Toksiškų metalų įtaka genų raiškai

Švinui ir nikeliui galima pritaikyti tris pagrindinius, kancerogeniškumą aiškinančius, mechanizmus: oksidacinis stresas, DNR pokyčius bei signalo perdavimo blokavimas (Beyersmann et al., 2008). Kancerogeniški metalai (pavyzdžiui, nikelis, vanadis, chromas) gali paskatinti redokso reakcijas biologinėse sistemose. Tyrimų in vivo ir in vitro metu nustatyta, kad jie skatina reaktyvių deguonies ir azoto formų susidarymą žinduolių ląstelėse.

5 pav. schemoje galima matyti, kad oksidacinio streso metu susidarę hidroksilo radikalai sukelia

oksidacinę lipidų, baltymų ir DNR pažaidą (Patra et al., 2011).

DNR, buvo greitai paneigta mokslininko Ciesiolka (Ciesiolka et al., 1992), įrodžiusio, kad švinas, prisijungęs prie RNR, sukelia molekulės trūkius.

5 pav. Hidroksilo radikalų poveikis ląstelei (Pagal R.C. Patra)

Švino genotoksiškumą sąlygoja du mechanizmai – pro-oksidacinio/anti-oksidacinio balanso ardymas bei sąveikavimas su DNR reparacijos sistemomis (McNeill et al., 2007). Švinas giminingas cinkui, todėl sugeba išstumti cinko molekules iš jų prisijungimo vietų baltymuose (Huang et al., 2004).

Eksperimentų metu gyvūnams į papilvę švirkščiant nikelio druskų tirpalus, pastebėta chromosomų pasikeitimų. Žinduolių ląstelėse minimolinės dvivalenčio nikelio jonų koncentracijos sukėlė DNR pažaidą, chromosomų bei seserinių chromatidžių pasikeitimus. Taip pat nikelis inhibuoja DNR reparaciją ir stiprina įvairių mutagenų poveikį (Beyersmann et al., 2008).

Esant net mažai mikromolinei koncentracijai, švinas sugeba inhibuoti apirimidininę endonukleazę (APE1) izoliuotame baltymo testo modelyje bei kultūrinėse AA8 ląstelėse. Tai sąlygoja pirimidino kaupimąsi DNR bei MMS indukuotą mutageniškumą (McNeill et al., 2007).

Naudojant ląstelių sistemas pastebėta, kad švinas sugeba sumažinti transkripcijos faktorių TFIIIA ir Sp1 DNR surišimą (Huang et al., 2004). Tačiau toks poveikis nepastebėtas tiriant cinko turinčius Fpg ir XPA baltymais (Asmuss et al., 1997).

Protaminai (baziniai baltymai su DNR) gali moduliuoti DNR pažaidą. Sunkieji metalai, ypač Ni(II), linkę prisijungti prie protamino 2. Šio peptido N-gale egzistuoja Arg-Thr-His aminorūgščių seka. Būtent ši seka dažnai gali tapti „spąstais“ sunkiesiems metalams. Ni (II) prie protamino 2 prisijungia itin stipriai ir specifiškai. Norėdami išnagrinėti šį ryšį, Bal et al (Bal et al., 1997) sintezavo baltymą, sudarytą iš 15 aminorūgščių (HP1-15), kuris N-gale turėjo identišką žmogaus protamino-2 aminorūgščių seką. Buvo pastebėta, jog peptidas Ni(II) prisijungė itin stipriai, o sukurtas HP1-15-Ni (II) kompleksas gebėjo aktyvuoti deguonį bei H2O2. Sukurtas kompleksas aktyviau nei vienas sintetintas peptidas jungėsi prie DNR. Po komplekso susidarymo nikelis tapo aktyvus ir galėjo ardyti DNR grandinę. Taip pat naujo komplekso poveikis galėjo paskatinti laisvųjų radikalų susidarymą.

Nikelis stimuliuodamas signalinius kelius, aktyvina profibrotinius bei hipoksinio atsako baltymus: interleukinus (IL)-8, IL-6; ciklooksigenazę – 2. Šių genų indukcija gali sąlygoti patologinius nikelio efektus bei vėžį (Ding et al., 2009). Nikelis, esant geležies jonams, geba paveikti rekombinantinių baltymų JHDM2A ir ABH3 aktyvumą (Chervona et al., 2012).

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1 Tyrimo objektas ir reagentai

Mokslinius tyrimus atlikti, laikantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo 14 straipsnio [Žin., 1997, Nr. 108-2728], Valstybinės veterinarijos tarnybos 2008 m. gruodžio 18 d. įsakymo Nr. B1-639 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų” [Žin., 2009, Nr. 8-2870] bei 1999 sausio 18 d. įsakymo Nr. 4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams” [Žin., 1999, Nr. 49-1591], Lietuvos Respublikos Sveikatos apsaugos ministro 1999 m. Balandžio 12 d. Įsakymo Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams” [Žin. 1999, Nr. 35-1053] bei Europos etikos komiteto nustatytų reikalavimų darbui su laboratoriniais gyvūnais. Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2012 02 09 posėdžio protokolo Nr. 1 išvada gautas leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais (leidimo Nr. 0221)

(žr. Priedas Nr. 1).

Pelėms buvo sudarytos optimalios sąlygos: patalpų temperatūra ~20˚C, santykinė oro drėgmė 55±10 proc., natūralus šviesos režimas. Pelės buvo šeriamos pilnaverčiu maistu, girdomos vandentiekio vandeniu. Šieno ir medienos drožlių pakratai buvo kasdien keičiami.

Eksperimentams naudoti šie reagentai: Tris, tiobarbituro rūgštis (TBR), ditiotreitolis (DTT), L-aminorūgščių mišinys – firmos „Sigma“ (JAV); etilendiamintetraacetatas (EDTA), N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfo rūgštis (HEPES), sacharozė, fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), 5,5 -ditiobisnitrobenzoinė rūgštis (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); adenozino 5'-trifosfatas (ATP), guanozino 5'-trifosfatas (GTP), 2-merkaptoetanolis, kalio chloridas (KCl), magnio chloridas (MgCl2), magnio acetatas (Mg(CH3COO)2), druskos rūgštis (HCl), fosforo rūgštis (H3PO4), natrio fosfatas – firmos „Merck“ (Vokietija); fosfokreatinkinazė, fosfokreatinas – firmos „Reanal“ (Vengrija); toluenas, natrio selenitas (Na2SeO3), natrio chloridas (NaCl), kadmio chloridas (CdCl2), cinko sulfatas (ZnSO4) – firmos „Lachema“ (Čekija); trichloracto rūgštis (TChA), natrio acetatas (CH3COONa), n-butanolis, fenolis, izopropanolis, chloroformas – Rusija. [14C]-leucinas (specifinis radioaktyvumas – 8880 MBq/mmol), chlorelos [14C]-baltymų hidrolizatas (specifinis radioaktyvumas – 1,48 GBq/mg C atomo) – (Čekija).

Tirpalams gaminti naudojotas dejonizuotas vanduo bei fiziologinis tirpalas.

2.2 Sunkiųjų metalų poveikio laboratorinėms pelėms tyrimo modelis

Vertinant sunkiųjų metalų poveikį, naudota LD50 – vidutinė mirtina dozė. LD50 – mažiausia medžiagos koncentracija, kuria paveikus žūva pusė (50 proc.) bandomųjų gyvūnų. Žinant vidutines mirtinas dozes, galima korektiškai planuoti tyrimus, išvengiant sunkiųjų metalų perdozavimo. Taip pat žinant šią reikšmę, galima palyginti skirtingų medžiagų toksiškumą. Norint nustatyti naudojamų medžiagų vidutines mirtinas dozes, į tris skirtingus narvelius patalpinta po 4 peles. Kiekvienai jų į pilvo ertmę sušvirkščiama atitinkamos metalo druskos tirpalo. ZnSO4 ir NiCl2 druskos tirpinamos fiziologiniame tirpale, o Pb(CH3COO)2 – bidistiliuotame vandenyje.

1 lentelė. Pelių išgyvenamumo priklausomybė nuo Pb, Ni ir Zn dozės

Švinas Nikelis Cinkas

Dozė (mg/kg) Mirtingumas Dozė (mg/kg) Mirtingumas Dozė (mg/kg) Mirtingumas 50 mg 100 mg 200 mg 0/4 2/4 4/4 10 mg 11 mg 12 mg 1/4 0/4 4/4 5,15 mg 10,3 mg 20,6 mg 0/4 2/4 4/4

Nustatant nikelio LD50, eksperimentas pradėtas nuo 11 mg koncentracijos remiantis literatūros duomenimis. Šioje eksperimentinėje grupėje visos pelės liko gyvos. 12 mg nikelio koncentracija buvo didžiausia ir lėmė visų pelių žūtį. Dozę sumažinus iki 10,5 mg, neišgyveno 1 pelė (1 lentelė)

Vertinant cinko LD50, tyrimas pradėtas nuo 5,15 mg dozės. Šioje grupėje visos pelės liko gyvos. 20,6 mg koncentracija sukėlė visų pelių žūtį, o dozę sumažinus iki 10,3 mg eksperimentinėje grupėje išgyveno 2 pelės.

Švino ir cinko grupėje kritusių ir išgyvenusių pelių santykis buvo 50 proc., todėl tirpale ištirpusio metalo kiekis (100 mg) laikytas vidutine mirtina doze. Kadangi nikelio grupėje kritusių ir išgyvenusių pelių santykis nebuvo vienodas (50 proc.), LD50 buvo apskaičiuojama pagal formulę (Jing-Hui, Marsh, 1988):

lgLD

=lg D

– δ(Ʃ L

-0,5)

DN – eksperimente naudota maksimali metalo druskos dozė; δ – panaudotų dozių santykio logaritmas;

Li – kritusių ir visų pelių santykis; Ʃ Li skirtingų Li reikšmių suma.

Nustatytos tokios vidutinės mirtinos dozės:

Tyrimo metu nustatytos vidutinės mirtinosios dozės leido planuoti, kokias sunkiųjų metalų dozės bus naudojamos kituose eksperimentuose. 2 lentelėje pateiktos visos darbe naudotos sunkiųjų metalų tirpalų dozės.

Švino, nikelio ir cinko jonų poveikiui įvertinti naudotas ūmaus 14 dienų intoksikavimo modelis. 14 dienų iš eilės pelėms į pilvo ertmę buvo švirkščiami vienodi tūriai sunkiųjų metalų druskų tirpalų. Tiriamosios pelės buvo suskirstytos į šešias grupes (2 lentelė).

2 lentelė. Eksperimentinės pelių grupės

1 gr. Pb(CH3COO)2 0,1 LD50 10 mg Pb/ kg

2 gr. ZnSO4 0,15 LD50 1,56 mg Zn/ kg

3 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių Pb(CH3COO)2 Anksčiau nurodytos dozės

4 gr. NiCl2 0,1 LD50 1,12 mg Ni/ kg

5 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių NiCl2 Anksčiau nurodytos dozės

6 gr. Fiziologinis tirpalas

Po 14 dienų periodo pelės buvo anestezuotos, joms atlikta cervikalinė dislokacija. Tyrimams naudotos pelių kepenis.

Nustatant sunkiųjų metalų poveikį metalotioneinų sintezei taip pat pasirinktas vienkartinio intoksikavimo modelis ir pelėms į pilvo ertmę po vieną kartą švirkšti anksčiau minėti tirpalai. Pb(CH3COO)2 pelės buvo veikiamos 8 valandas, NiCl2 – 24 h. Praėjus šiam laikui pelės anestezuotos ir dislokuotos. Tiriamosios pelės buvo suskirstytos į 6 grupes (3 lentelė).

3 lentelė. Vienkartinio intoksikavimo pelių grupės

1 gr. Pb(CH3COO)2 0,5 LD50 50 mg Pb/ kg

2 gr. ZnSO4 0,15 LD50 1,56 mg Zn/ kg

3 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių Pb(CH3COO)2 Anksčiau nurodytos dozės

4 gr. NiCl2 0,5 LD50 5,62 mg Ni/ kg

5 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių NiCl2 Anksčiau nurodytos dozės

2.3 Baltymų sintezės greičio nustatymas

Tiriant baltymų sintezės greitį pelėms į pilvą švirkšta [14C] arginino (7,4 MBq)/1 kilogramui kūno masės). Išankstinių eksperimentų metu buvo nustatyta, kad aminorūgštys 2 valandas tolygiai įjungiamos į naujai sintetinamus peptidus, todėl baltymų sintezės greičio matavimuose aminorūgšties įjungimo trukme pasirinktas 1 valandos laikotarpis.

Kai po radioaktyvios aminorūgšties sušvirkštimo praėjo valanda, peles užmigdytos anestetiku narkotanu ir dislokuotos. Eksplantuotos pelių kepenys tiksliai pasvertos, atšaldytos ant ledo ir audinys susmulkintas smulkintuve, pridėjus 3 tūrius (lyginant su kepenų mase) buferinio tirpalo (50 nM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanolis, 250 mM sacharozė). Gautas kepenų ekstraktas 15 minučių centrifuguotas 15000xg K-24 centrifūgoje, nufiltruotas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį ir gauta pomitochondrinio supernatanto frakcija.

Norint suardyti aminoacil-tRNR, 0,1 ml supernatanto sumaišyta su 0,5 ml 10 proc. TchA tirpalo ir gautas mišinys 10 minučių inkubuotas 90˚C temperatūroje. Paruoštas mėginys 20 minučių šaldytas ledo vonioje, susiformavus nuosėdoms, jos surinktos ant nitroceliuliozės filtrų „Synpor Nr. 3“, praplautos 5 proc. TchA tirpalu. Baltymų sintezės greičiui apibūdinti, skysčio scintiliaciniu skaitikliu „Delta 300“ matuotas TchA netirpių nuosėdų radioaktyvumas.

Baltymų koncentracijai nustatyti naudotas Beer/ Lambert metodas, spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 260 ir 280 nm banga. Baltymų sintezės greitis apskaičiuotas: imp [14

C]-arginino/min/mg baltymo.

2.4 Metalotioneinų koncentracijos nustatymas

Metalotioneinų koncentraciją nustatyta pagal Peixoto metodiką. Pasvertos kepenys susmulkintos smulkintuvu, pridėjus keturis tūrius buferinio tirpalo (sudaryto iš 20 mM Tris – HCl (pH 8,6), 0,5 M PMSF (proteazių slopiklis), 0,01 proc. β-merkaptoetanolio (merkapto grupių reduktorius). Gautas ekstraktas 30 minučių centrifuguotas Beckman J2-21 centrifuga 17 000 x g. Gautas supernatantas buvo naudojamas metalotioneinų koncentracijai nustatyti.

frakciją, į kurią pridėtas trigubas tūris šalto (-20 ˚C) etanolio, 1 valandą laikyta -20 ˚C temperatūroje. Po to 10 minučių centrifuguota K-24 centrifuga ir surinktos nuosėdos praplautos etanolio ir 1 proc. chloroformo mišiniu. Gautas tirpalas 10 minučių centrifuguotas 6000 x g.

Gautos nuosėdos ištirpintos 0,15 ml 0,25 M NaCl ir 0,15 ml 1N HCl tirpale, nuosėdoms ištirpus, įpilta 4,2 ml kambario temperatūros 2 M NaCl (pH 8,0) ir centrifuguota 5 minutes. Vėl nusiurbta supernatanto frakciją ir spektrofotometriškai nustatyta metalotioneinų koncentraciją, matuojant sugertį ties 412 nm banga. Metalotioneinų koncentracija išreikšta μg vienam gramui kepenų.

2.5 Duomenų patikimumo vertinimas

Eksperimentų metu gauti duomenys analizuoti naudojant SPSS 20 (SPSS Inc., Čikaga, JAV) statistinį paketą. Tyrimų rezultatai pateikti kaip vidurkiai (M) ± pasikliautinieji intervalai (PI 0,95). Norint įsitikinti, kad vidurkių lygybės hipotezė teisinga, taikytas Stjudento t testas. Skirtumai traktuoti kaip statistiškai reikšmingi, jeigu reikšmingumo lygmuo p<0,05.

Grafiniam gautų rezultatų išreiškimui naudota MS Excel (Microsoft, JAV) programa.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Metalų įtaka baltymų sintezei

Eksperimentų metu stengtasi išsiaiškinti, ar švino bei nikelio sukeltas oksidacinis stresas turi įtakos baltymų sintezės (transliacijos) sistemoje. Vertinti du aspektai: švino ir nikelio jonų poveikis transliacijai bei cinko jonų gebėjimas apsaugoti baltymus nuo sunkiųjų metalų poveikio.

6 pav. Baltymų sintezės greitis pelių kepenyse po 14 dienų Pb(CH3COO)2 , ZnSO4 ir/arba NiCl2 tirpalų

švirkštimo.

Baltymų sintezė kontrolinių pelių kepenyse po 14 d. (335 imp.[14_{C]-arginino/min./mg baltymo) prilyginta 100 proc. n=6-8; * –}

statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su kontrolinių pelių grupe.

6 pav. pateiktuose rezultatuose matyti, jog po 14 dienų Pb(CH3COO)2 tirpalo švirkštimo kasdien baltymų sintezė nepakito – liko kontrolės dydžio. Tokie pat rezultatai gauti atliekant tyrimą su cinku – cinko jonai įtakos baltymų sintezei neturėjo. Tačiau ZnSO4, suleistas 20 minučių prieš Pb(CH3COO)2 tirpalą, statistiškai nepatikimai padidino baltymų sintezę.

Po 14 dienų NiCl2 švirkštimo baltymų sintezės greitis padidėjo 57 proc. (p<0,05), lyginant su kontroline grupe. ZnSO4 tirpalas, sušvirkštas 20 minučių prieš NiCl2, sumažino nikelio poveikį transliacijai 33 proc.

Daugelyje literatūros šaltinių nurodoma, jog švinas gali aktyvinti arba slopinti baltymų sintezę, priklausomai nuo dozės bei efekto laiko. Švino aktyvumas taip pat priklauso nuo G6PD aktyvumo bei oksidacinio streso ląstelėje. Amerikiečių mokslininkai 15 savaičių triušių patinams kartą per savaitę švirkštę švino acetato tirpalą pastebėjo, jog baltymų sintezė inkstuose bei kepenyse reikšmingai padidėjo (Kanitz et al., 1999). Kepenyse suaktyvėjusi baltymų sintezė siejama su metalotioneinų – apsauginių baltymų – sintezės aktyvumu (Bouta et al., 1996). Nustatyta, jog švinas aktyvina mažos molekulinės

masės jį jungiančius baltymus (analogiškus į metalotioneinus) tam tikrose vietose – eritrocituose, plaučiuose, inkstuose, kepenyse, žarnyne (Gillis et al., 2012).

Kepenyse švinas randamas branduolyje, dauguma švino prisijungia prie branduolio membranos baltymų, viduląstelinis švinas siejamas su histono frakcijomis, o šviną rišančių baltymų nebuvo rasta kepenų ląstelių citoplazmoje (Gillis et al., 2012). Vienas pagrindinių ląstelės apsauginių mechanizmų, patekus sunkiajam metalui – specifinių Hsp genų sintezė. Sintezė suaktyvėja, kai ląstelėje susidaro oksidacinis stresas ar patenka sunkiųjų metalų jonų (Geraci et al., 2004).

Mūsų tyrimo metu gautą rezultatą, jog švinas neturėjo reikšmingos įtakos baltymų sintezei, galima sieti su ląstelių antioksidacinės apsaugos sistemos adaptacija prieš toksinį švino poveikį. Esant kompleksiniam švino ir cinko poveikiui, pastebėtas transliacijos suaktyvėjimas gali būti aiškinamas kaip cinko jonų gebėjimas aktyvinti metalotioneinų – apsauginių baltymų – sintezę. Pagal R.C. Patra et al. cinko ir švino konkurencija dėl vietos aktyviajame centre sąlygoja sumažėjusią švino absorbciją bei sunkiojo metalo toksiškumą, cinkas mažina švino koncentraciją kraujyje, kepenyse ir inkstuose. Švino poveikio metu sulėtėjusi baltymų sintezė gali būti siejama su sumažėjusiu DNR kiekiu bei aminorūgščių panaudojimu (Moussa et al., 2008).

Literatūroje nagrinėjamas nikelio jonų poveikis baltymų sintezei prieštaringas. Vienos studijos metu žiurkėms girdant vandeninį nikelio tirpalą pastebėtas reikšmingas bendrų baltymų koncentracijos sumažėjimas (Sidhu et al., 2005). Kaip ir kiti sunkieji metalai, nikelis patekęs į organizmą skatina apsauginių baltymų sintezę. Nikelis sutrikdo normalią baltymų funkciją, sukeldamas transkripcijos faktoriaus HIF-1α aktyvinimą bei vienintelis iš sunkiųjų metalų sugeba paveikti chromatino struktūrinius baltymus. Aktyvintas HIF-1α skatina visus transkripcijos etapus, dėl to paveikus nikeliu, gali aktyvėti baltymų sintezė. Tyrimo metu gautas rezultatas, jog nikelis reikšmingai padidino baltymų sintezę, gali būti siejamas su metalotioneinų sintezės aktyvinimu.

Esant kompleksiniam cinko ir nikelio poveikiui, baltymų sintezė padidėjo ne taip žymiai. Galima daryti prielaidą, jog esant cinko ir nikelio konkurencijai, cinkas užėmė daugiau vietos aktyviajame centre, todėl buvo iššaukta ne tokia intensyvi MTs sintezė.

Apibendrinant mūsų tyrimo metu gautus rezultatus galima daryti išvadą, jog nikelis po 14 poveikio dienų skatino baltymų sintezę, švinas statistiškai reiškmingo pokyčio baltymų sintezei neturėjo, o cinkas konkuravo su abiem sunkiaisiais metalais ir lėmė aktyvinamą apsauginių baltymų sintezę.

3.2 Metalų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse

Tyrimo metu išsiaiškinta, jog sunkieji metalai skirtingai veikia baltymų sintezę: nikelis skatina, švinas – neturi poveikio. Tolesnių eksperimentų metu bandyta išsiaiškinti švino, nikelio ir cinko įtaką specifinių apsauginių baltymų – metalotioneinų sintezei. Tirtas švino ir nikelio poveikis bei kompleksinis cinko ir vieno iš metalų poveikis.

Metalotioneinai – mažos molekulinės masės, daug cisteino turintys apsauginiai baltymai, gebantys surišti sunkiųjų metalų jonus (Zou et al., 2009). Švinas prie MT jungiasi ex vivo sąlygomis (Zou et al., 2009; Wallkes et al., 2004) ir MT kiekis gali padidėti prisijungus sunkiajam metalui (Ikebuchi et al., 1986). Šis teiginys patvirtintas studijų metu – pelėms sušvirkštus švino tirpalo ir po 24h išmatavus MT sintezę jų inkstuose, pastebėta, jog sintezė žaibiškai padidėjo kelis kartus (Zou et al., 2009). MT taip pat sugeba surišti laisvuosius radikalus. Metalotioneinai laikomi didžiausia cinko jonų saugykla organizme, atpalaiduodami cinko jonus, MT sugeba stabilizuoti ląstelės membraną (Nemec et al., 2009).

3.2.1 Kompleksinis švino ir cinko poveikis metalotioneinų sintezei

7 pav. MT koncentracija po Pb(CH3COO)2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo

Metalotioneino koncentracija kontrolinių pelių kepenyse 8 val. (28 μg/g) ir po 14 d. (33 μg/g) prilyginta 100 proc. n=6-8; * – statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su kontroline grupe; # – statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su Pb paveiktų

pelių grupe

Švirkščiant vienkartinę cinko tirpalo dozę 20 minučių prieš švino tirpalo sušvirkštimą, pastebėta dar aktyvesnė MT sintezė – 29 proc. (p<0,05). Po 14 dienų kompleksinio metalų poveikio, MT sintezė sumažėjo, apsauginių baltymų sintezė buvo 29 proc. (p<0,05) mažesnė nei švino grupėje.

Mūsų tyrimų metu nustatytą metalotioneinų sintezės padidėjimą galima traktuoti kaip organizmo apsauginę reakciją, siekiant sušvelninti sunkiųjų metalų poveikį, sustabdyti jų patekimą į ląsteles bei skatinti SM pasišalinimą iš ląstelių (Park et al., 2001). Literatūroje švinas įvardijamas kaip netiesioginis MT induktorius, kadangi gali aktyvuoti metalotioneinus tik in vivo. Kituose šaltiniuose nurodomas, jog švinas neaktyvuoja MT sintezės, o tik prisijungia prie apsauginių baltymų (Park et al., 2001; Choudhury et al., 2008). Tačiau po 2 savaičių Pb(CH3COO)2 poveikio, metalotioneinų sintezė padidėjo iki 142 proc., toks efektas gali būti siejamas su dideliu susikaupusio švino kiekiu.

Pastebėta suaktyvėjusi metalotioneinų sintezė abiem atvejais: po vienkartinės ZnSO4 injekcijos bei po 2 savaičių poveikio. Literatūros šaltiniuose cinkas aprašomas kaip metalotioneinus aktyvinantis elementas (Park et al., 2001). Esant kompleksiniam abiejų metalų poveikiui, MT sintezė suaktyvėjo po vienkartinės dozės. Tai gali būti susiję su Pb bei Zn aktyvinta metalotioneinų sinteze. Tačiau po dviejų savaičių kompleksinio metalų poveikio pastebėtas metalotioneinų sintezės sumažėjimas, kuris gali būti siejamas su abiejų metalų konkurencija dėl prisijungimo vietos metalotioneinuose (Coyle et al., 2002).

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Pb Zn Pb+Zn

Me

tal

ot

ion

ein

ų

k

once

n

tr

aci

ja

(pr

oc.)

3.2.2 Kompleksinis nikelio ir cinko poveikis MT sintezei

Tęsiant tyrimus, nustatytas nikelio ir/arba cinko poveikis metalotioneinų sintezei. Iš 8 pav. pateiktų rezultatų galima matyti, jog vienkartinė NiCl2 injekcija metalotioneinų sintezę padidino 35 proc. (p<0,05), o po dviejų savaičių NiCl2 poveikio, MT sintezė buvo padidėjusi 57 proc. (p<0,05), lyginant su kontroline pelių grupe.

8 pav. MT koncentracija pelių kepenyse po NiCl2 ir/arba ZnSO4, tirpalų sušvirkštimo

Metalotioneino koncentracija kontrolinių pelių kepenyse 24 val. (29 μg/g) ir po 14 d. (28 μg/g) prilyginta 100 proc. n=6-8; * – statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su kontrolinių pelių grupe; # – statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su Ni

paveiktų pelių grupe

Esant kompleksiniam metalų poveikiui, kai ZnSO4 tirpalas buvo sušvirkštas 20 minučių prieš NiCl2, gauti skirtingi rezultatai. Po vienkartinės metalų injekcijos, MT sintezė padidėjo 41 proc., o po 14 dienų poveikio cinkas sugebėjo inaktyvuoti nikelį ir MT sintezė buvo beveik lygi kontrolinei grupei.

Įvairių studijų metu išsiaiškinta, jog laisvo cinko kiekis ląstelėje didėja dėl nikelio poveikio. Esant tokiam efektui, ląstelėje susidaro vientisa grandinė: cinkas aktyvina MTF-1, pastarasis skatina mt2a geno raišką, dėl to pradeda aktyvėti MT sintezė (Nemec et al., 2009).

Apibendrinant mūsų tyrimų rezultatus, galima teigti, jog nikelis metalotioneinų sintezę aktyvino labiau nei švinas. Tai pastebėta tiek po paros, tiek po 14 dienų. Atliekant dviejų savaičių kompleksinio metalų poveikio tyrimus paaiškėjo, jog cinkas, sušvirkštas 20 minučių prieš nikelio tirpalą, metalotioneinų sintezę grąžino beveik iki kontrolės dydžio.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Ni Zn Ni+Zn

Me

tal

ot

ion

ein

ų

k

once

n

tr

aci

ja

(pr

oc.)

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Tyrimo metu sukurtas sunkiųjų metalų sukelto oksidacinio streso modelis, kurį galima pritaikyti tiriant galimus gydymo ir profilaktikos metodus. Tolimesnius tyrimus būtų galima tęsti su farmakognozijos specialistais: yra nemažai augalų, kurie pasižymi antioksidaciniu poveikiu, tačiau vis dar nėra rastas tinkamiausias metodas geresniam bioprieinamumui; žinomos aktyviosios medžiagos, tačiau vis dar ieškomas augalas, kuris tinkamiausias šių veikliųjų medžiagų išskyrimui.

Natūralūs antioksidantai skirstomi į fermentinius ir nefermentinius. Fermentiniai antioksidantai gaminami ląstelėje, o nefermentinius – karotinoidus, flavonoidus, vitaminus ir mineralus galime išskirti iš daugelio vaisių, daržovių, riešutų, kruopų (Flora et al., 2009).

Vieni daugiausiai tyrinėjamų natūralių antioksidantų – flavonoidai. Oksidacinį stresą gali mažinti nutraukdami ADF reakcijas (Terao, 2009). Jų aktyvumas priklauso nuo struktūros – metalų surišimo savybes lemia funkcinė hidroksilo grupė B žiede ir 5-hidroksi grupė A žiede, taip pat svarbios 2 ir 3 padėtyse C žiede esančios dvigubos jungtys su 4-okso grupe (Dugas et al., 2000). Geriausiai ištirtas flavonoidias – kvercetinas, galintis sudaryti chelatinį junginį su švinu per orto-fenolines grupes kvercetino B žiede (Bravo at el., 2001). Liu et al. (2010) įrodė kvercetino naudą bei apsauginį poveikį pelių inkstams po ilgalaikio švino švirkštimo. Kvercetinas sumažino ADF kiekį bei normalizavo GSH lygį inkstuose. Hu

et al. (2008) atliktame tyrime kvercetinas taip pat pagerino pelių sveikatos būklę po ilgalaikio švino

vartojimo. Tokie teigiami rezultatai leidžia tikėtis, jog kvercetinas taps puikiu vaistu kovojant su SM toksiškumu, tačiau norint tai įrodyti, reikia daugiau ir įvairesnių tyrimų.

Sunku atrasti tinkamus augalinius antioksidantus. Dėl nedidelės kainos ir nestiprių šalutinių efektų, augalai galėtų būti puikūs antioksidantai, tačiau tik dalinis jų bioprieinamumas organizme, ilgesnio gydymo trukmės bei didesnės dozės sukelia daugiau problemų. Kol kas plačiau aprašyti tik keli augalai, veiksmingi esant SM sukeltam oksidaciniam stresui. Vienas tokių – česnakas, kurio pagrindinė veiklioji medžiaga – alicinas. Česnakas pasižymi gebėjimu mažinti oksidacinį stresą, kadangi suriša SM jonus bei laisvuosius radikalus. Pourjafal et al. (2007) tyrimų metu įrodė, jog česnakas slopina oksidacinį stresą žiurkių inkstuose, kepenyse, kraujyje. Taip pat SM sukeltą oksidacinį stresą gali mažinti kurkuma. Shukla

et al. (2003) įrodė kurkumo apsauginį poveikį prieš švino sukeltą oksidacinį stresą žiurkių organizme. Daniel et al. (2009) šį rezultatą patvirtino tirdami žiurkių smegenis. Tačiau vis dar išlieka problema, kaip

Kinijoje ir Indonezijoje auginama ir Lietuvoje kol kas mažai žinoma azijinė centelė (Centella

asiatica) šiuo metu vis plačiau tyrinėjamas augalas. Tyrimų metu įrodyta, jog augalas geba sumažinti

chelatinių grupių skaičių ir oksidacinį stresą (Saxena et al., 2006). Šiuo metu netgi iškelta hipetezė, jog C.

asiatica galėtų atkurti prooksidantų/antioksidantų balansą po SM veikimo, tačiau tam vis dar trūksta

tyrimų.

IŠVADOS

1. Nustatyta, jog nikelio jonai aktyvino bendrą baltymų sintezę, o švino jonai sintezės procesui įtakos neturėjo.

2. Nepriklausomai nuo poveikio trukmės (sunkiesiems metalams veikiant 8 val., 24 val., ir 14 dienų), švino ir nikelio jonai skatino metalotioneinų sintezę pelių kepenyse.

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS

1. Alhama J, Romero-Ruiz A, Lopez-Barea J. Metallothionein quantification in clams by reversed-phase high-perfomance liquid chromatography coupled to fluorescence detection after monobromobimane derivatization. J. Chromatogr A 2006;1107:52-8

2. Binz P.-A. and Kägi J.H.R. Metallothionein: molecular evolution and classification. In: Metallothionein IV 1999, pp. 7-14, Klaassen C.D. (ed.), Birkhäauser, Basel

3. Chervona Y, Arita A, Costa M. Carcinogenic Metals and the Epigenome: Understanding the effect of Nickel, Arsenic, and Chromium. Metallomics. 2012 July; 4(7):619-627.

4. Duncan M.W., Marini A.M., Watters R.; Kopin I.K.; Markey S.P.J. Neuroscience 1992, 12, 1523-1537

5. Flora SJ, Kumar D, Das Gupta S. Interaction of zinc, methionine or thei combination with lead at gastrointestinal or post-absorptive level in rats. Pharmacol Toxicol 1991; 68:3-7

6. Flora SJ, Singh S, Tandon SK. Thiamine and zinc in prevention or therapy of lead intoxication. J. Int Med Res 1989; 17:68-75

7. Hsu PC, Guo YL. Antioxidant nutrients and lead toxicity. Toxicology 2002; 180; 33-44

8. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. Biochemistry 2007, P. 155 / W.H. Freeman and Company, New York

9. Andreini C, Banci L, Bertini I, Rosato A. Zinc through the three domains of life. J Proteome Res. 2006; 5:3173-3178

10. Bal W, Lukszo J, Kasprzak K S. Mediation of oxidative DNA damage by nickel (II) and copper (II) complexes with the N-terminal sequence of human protamine HP2. Chemical Research in Toxicology 1997, vol. 10, no.8, pp. 915-921

11. Barja G. Endogenous oxidative stress: relationship to aging, longevity and caloric restriction. Aging Res Rev 2002;1:97-411.

12. Batra N. Nehru B, Bansal MP. The effect of zinc supplementation on the effects of lead in the rat testis. Reprod Toxicol 1998; 12:535-540.

13. Benters J.; Flogel U.; Schafer T., Leibfritz D.; Hechtenberg S., Beyersmann D. Biochem. J. 1997, 322, 793-799

14. BeyersmannD, Hartwig A. Carcinogenic metal compounds: recent insight into molecular and cellular mechanisms. Arch Toxicol. 2008; 82: 493-512

16. Bravo A, Anacona JR. Metal complexes of the fl avonoid quercetin: antibacterial properties. Trans Met Chem 2001, 26: 20–23

17. Bray T M, Ray T MT, Bettger W J. Free Rad. Biol. Med. 1990, 8, 281-291 18. Burke J P , Fenton M R. proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985, 179, 187-191

19. Chervona Y., Arita A., Costa M. Carcinogenic Metals and the Epigenome: understanding the effect of Nickel, Arsenic, and Chromium. Metallomics. 2012 July, 4(7): 619-627.

20. Chiba M, Shinohara A, Matsushita K, Watanabe H, Inaba Y. Indices of lead exposure in blood and urine of lead exposed workers and concentration of major and trae element and activities of SOD, GSH-Px and catalase in their blood. Tohoku J Exp Med 1996; 178: 49-62.

21. Choudhury H, Mudipalli A. Potential considerations & concerns in the risk characterization for the interaction profiles of metals. Indian J Med Res. 2008;10:1–33.

22. Ciesiolka J, Lorenz S, Erdmann VA. Different conformational forms of Escherichia coli and rat liver 5S rRNA revealed by Pb(II) – induced hydrolysis. Eur J. Biochem, 1992;204:583-9

23. Coyle P., Philcox J.C., Carey L.C., Rofe A.M. Metallothionein: the multipurpose protein. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 59. 2002; 627-647

24. Curtis D, Jie L, Supratim Ch, Metallothionein: an intracellular protein to protect against cadmium toxicity; Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999. 39:267-94

25. Dabrio M, Rodriguez AR, Bordin G, Bebianno MJ, De Ley M, Sestakova I, et al. Recent developments in quantification methods for metallothionein. J Inorg Biochem 2002;88(2):123-34 26. Dally H, Hartwig A, Induction and reapair inhibition of oxidative DNA damage by nickel (II) and

cadmium (II) in mammalian cells. Carcinogenesis vol. 18 No. 5 p.p. 1021-1026, 1997

27. Danadevi K, Rozati R, Banu BS, Rao PH, Grover P. DNA damage in workers exposed to lead using comet assay. Toxicology. 2003; 187: 183-93

28. Daniel S, Limson JL, Dairam A, Watkins GM, Daya S. Through metal binding, curcumin protects against and cadmium-induced lipid peroxidation in rat brain homogenates and against lead-induced tissue damage in rat brain. J Inorg Biochem 2004, 98: 266–275

29. Das KK, Buchner V. Effect of nickel exposure on peripheral tissues: role of oxidative stress in toxicity and possible protection by ascorbic acid. Rev Environ Health. 2007; 22(2): 157-173 30. David A. Bender, Kathleen M. Botham, Peter J. Kennelly, Victor W. Rodwell, P. Anthony Weil

31. Ding J, He G, Gong W, Wen W, Sun W, Ning B, Huang S, Wu K, Huang C, Wu M, Xie W, Wang H. Effects of Nickel on Cyclin Expression, Cell Cycle Progression and Cell Proliferation in Human Pulmonary Cells. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009 June; 18(6).

32. Dugas AJ, Castaneda-Acosta J, Bonin GC, Price KL, Fischer NH, Winston GW. Evaluation of the total peroxyl radical-scavenging capacity of fl avonoids: structure-activity relationships. J Nat Prod 2000, 63: 327–331

33. Egli D, Domenech J, Selvaraj A, Balamurugan K, Hua H, Capdevila M, et al. The four members if the Drosophila metallothionein family exhibit distinct yet overlapping roles in heavy metals homeostasis and detoxification. Genes Cell 2006;11:647-58

34. Flora G, Gupta D, Tiwari A. Toxicity of lead: a review with recent updates. Interdiscip Toxicol 2012, Vol. 5(2): 47-58

35. Flora SJS. Structural, chemical and biological aspects of antioxidants for strategies against metal and metalloid exposure. Oxid Med Cell Longev 2009, 2: 191–206

36. Flora SJS, Mittal M, Mehta A. Heavy metal induced oxidative strees and it‘s possible reversal by chelation therapy. Indian J Med Res 128, 2008, pp 501-523

37. Flora SJS., Pande M., Kannan G.M., Mehta A. Lead induced oxidative stress and its recovery following co-administration of melatonin or N-acetylcysteine during chelation with succimer in male rats. Cellular and Molecular Biology 50, 2004 Cell. Mol. Biol.

38. Frederickson C.J.; Bush A.I.; Biometals 2001, 14, 353-366

39. Fukada T, Yamasaki S, Nishida K, Murakami M, Hirano T. Zinc homestasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. J Biol Inorg Chem. 2011; 16:1123-1134

40. Geraci F, Pinsino A, Turturici G, Savona R, Giudice G, Sconzo G. Nickel, lead and cadmium induce differential cellular responses in sea urchin embryos by activating the synthesis of different HSP70s. Biochem Biophys Res Commun. 2004;322:873–7.

41. Gillis B. S, Arbieva Z., Gavim I. M. Analysis of lead toxicity in human cells. BMC Genomics 2012, 13:334

42. Halliwell B, Gutteridge JMC, editors. Free radicals in biology and medicine. Oxford: Clarendon Press; 1989

43. Henry R.B., Liu J., Choudri S. and Klaassen C.D. (1994) Species variation in hepatic metallothionein. Toxicol Lett, 74: 23-33.

44. Hoffmal Nelson, Howland Lewin, Flomenbaum Goldfrank (2007) Manual of toxicologic emergencies. The McGraw – Hill Companies