DARBAS ATLIKTAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE,

DARBAS ATLIKTAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Vaginalinių žvakučių su medetkos žiedų

augalinės žaliavos ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis kokybės tyrimas“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Kristina Ščiglinskaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Kristina Ščiglinskaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

KRISTINA ŠČIGLINSKAITĖ

VAGINALINIŲ ŽVAKUČIŲ SU MEDETKOS ŽIEDŲ AUGALINĖS

ŽALIAVOS EKSTRAKTU MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS

KOKYBĖS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Ramunė Morkūnienė Data

VAGINALINIŲ ŽVAKUČIŲ SU MEDETKOS ŽIEDŲ AUGALINĖS

ŽALIAVOS EKSTRAKTU MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS

KOKYBĖS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė Data

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė

Kristina Ščiglinskaitė Data Data

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Vaginalinis vaistinių preparatų vartojimo būdas: privalumai, trūkumai, veikliųjų medžiagų absorbcija ... 12

1.2. Vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagrindai bei jų galima įtaka preparatų biologiniam pasisavinimui ... 13

1.2.1. Lipofiliniai vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagindai ... 15

1.2.2. Hidrofiliniai vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagrindai ... 17

1.3. Vaistinės medetkos pritaikymas ginekologijos praktikoje ... 19

1.3.1. Vaistinė medetka – farmakologinės savybės ... 20

1.4. Biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija ir jai taikomi metodai... 24

1.4.1. Maceracija ... 24

1.4.2. Ekstrakcija ultragarsu ... 25

1.4.3. Ekstrakcijos metodų privalumai bei trūkumai ... 25

1.5. Ekstrakcijoje naudojami tirpikliai ... 26

1.5.1. Ekstrakcija etilo alkoholiu ... 27

1.5.2. Ekstrakcija išgrynintu vandeniu ... 27

1.5.3. Ekstrakcija augaliniais aliejais ... 28

2. TYRIMO METODAI IR METODIKA ... 29

2.1. Naudojamos medžiagos bei įranga ... 29

2.1.2. Naudojama įranga ... 29

2.2. Ekstraktų gamyba ... 30

2.2.1. Etanolinių ekstraktų gamyba ... 30

2.2.2. Aliejinio ekstrakto gamyba ... 32

2.2.3. Vandeninio ekstrakto gamyba ... 32

2.3. Karotinoidų kiekio nustatymas etanoliniuose ekstraktuose, pagamintuose maceracijos metodu 32 2.4. Fenolinių junginių kiekio nustatymas ekstraktuose... 33

2.5. Flavonoidų kiekio nustatymas ekstraktuose ... 34

2.6. Vaginalinių žvakučių gamyba ... 35

2.6.1. Kakavos sviesto pagrindo vaginalinių žvakučių gamyba ... 35

2.6.2. Želatinos-glicerolio pagrindo vaginalinių žvakučių gamyba ... 36

2.6.3. Želatinos-glicerolio-propilenglikolio pagrindo vaginalinių žvakučių gamyba ... 37

2.6.4. Polietilenglikolio (PEG) pagrindo vaginalinių žvakučių gamyba ... 37

2.7. Vaginalinių žvakučių kokybės vertinimas taikant biofarmacinius tyrimus in vitro ... 39

2.7.1. Masės vienodumo tyrimas ... 39

2.7.2. Vaginalinių žvakučių suirimo ir fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimas in vitro ... 39

2.8. Statistinė rezultatų analizė ... 40

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 41

3.1. Ekstrakcijos metodo bei tirpiklio parinkimas. Skirtingų ekstraktų palyginimas ... 41

3.1.1. Karotinoidų kiekio ekstraktuose priklausomybės nuo ekstrakcijai naudojamo tirpiklio koncentracijos vertinimas ... 41

3.1.2. Bendrojo fenolinių junginių kiekio palyginimas ekstraktuose, pagamintuose skirtingais ekstrakcijos metodais ... 42

3.1.3. Bendrojo flavonoidų kiekio palyginimas ekstraktuose, pagamintuose skirtingais ekstrakcijos metodais ... 43

3.1.4. Bendrojo fenolinių junginių kiekio ekstraktuose priklausomybės nuo ekstrakcijai naudojamo tirpiklio vertinimas ... 45

3.2. Vaginalinių žvakučių kokybės vertinimas ... 48

3.2.1. Masės vienodumo tyrimas ... 48

3.2.2. Suirimo laiko tyrimas ... 49

3.3. Biologiškai aktyvių junginių atpalaidavimo iš vaginalinių žvakučių tyrimas in vitro - pagrindo bei pagalbinių medžiagų įtaka veikliosios medžiagos atpalaidavimui ... 52

3.3.1. Vaginalinėse žvakutėse įterptų pagalbinių medžiagų įtakos fenolinių junginių atpalaidavimui vertinimas ... 52

3.3.2. Vaginalinių žvakučių pagrindo medžiagų įtakos fenolinių junginių atpalaidavimui vertinimas ... 54

IŠVADOS ... 57

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 59

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 60

SANTRAUKA

K. Ščiglinskaitės magistro baigiamasis darbas „Vaginalinių žvakučių su medetkos žiedų augalinės žaliavos ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis tyrimas“. Mokslinė vadovė doc. dr. A. M. Inkėnienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. Kaunas, 2020.

Tyrimo tikslas: Sumodeliuoti vaginalines žvakutes su vaistinės medetkos (lot. Calendula

officinalis L.) žiedų augalinės žaliavos ekstraktu ir įvertinti farmacinių veiksnių įtaką jų kokybei.

Tyrimo uždaviniai: Remiantis moksline literatūra parinkti tinkamą ekstrakcijos metodą bei tirpiklį

vaistinės medetkos žiedų augalinės žaliavos ekstrakcijai vykdyti. Pagaminus ekstraktus, palyginti juose esančių biologiškai aktyvių junginių – karotinoidų, flavonoidų, fenolinių junginių kiekį, priklausomai nuo ekstrakcijai naudoto tirpiklio ir ekstrakcijos metodo. Parinkti vaginalinių žvakučių sudėtis su skirtingais (hidrofobiniais bei hidrofiliniais) pagrindais, įterpiant pasirinktą (vandeninį) vaistinės medetkos žiedų augalinės žaliavos ekstraktą ir pagal pasirinktus kriterijus (masės vienodumo tyrimą, suirimo testą) įvertinti pagamintų žvakučių kokybę. Įvertinti fenolinių junginių atpalaidavimą iš pagamintų vaginalinių žvakučių per pusiau pralaidžią membraną biofarmaciniu tyrimu in vitro ir nustatyti skirtingų pagrindų bei pagalbinių medžiagų įtaką fenolinių junginių atpalaidavimo kinetikai.

Darbo objektas: Skirtingų pagrindų vaginalinės žvakutės su pagamintu vandeniniu vaistinės medetkos

SUMMARY

Master‘s final thesis Project by K. Sciglinskaite on „Modeling and Biopharmaceutical Quality Research of Vaginal Suppositories with Calendula‘s petals Raw Plant Material Extract“. Associate Professor Doc. Dr. A. M. Inkeniene; The Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. Kaunas, 2020.

Aim of the research: to model vaginal suppositories with calendula‘s (lot. Calendula

SANTRUMPOS

GRE – galo rūgšties ekvivalentas RE – rutino ekvivalentas KS – kakavos sviestas ŽG – želatina-glicerolis ŽGP – želatina-glicerolis-propilenglikolis PEG – polietilenglikolis EU – ekstrakcija ultragarsu

ĮVADAS

Šiomis dienomis vis labiau populiarėjantys ir vis daugiau dėmesio susilaukiantys sveikatinimosi bei aplinkos tausojimo klausimai skatina šiuolaikinį žmogų rinktis kuo natūralesnius, ekologiškesnius gydymo metodus bei priemones. Nors dalis šių dienų visuomenės vis dar skeptiškai reaguoja į faktą, jog natūralūs, liaudies medicinoje jau daugybę metų taikomi principai, patvirtinti šiuolaikiniais tyrimais, gali turėti didelę įtaką tam tikrų ligų prevencijai bei gydymui – jų aktualumas ir poreikis nenumaldomai auga.

Vaginalinio vaistinių preparatų vartojimo būdo atsiradimas yra siejamas su pačia medicinos praktikos pradžia. Šiandieninėje medicinos praktikoje vaginalinis vaistų skyrimo būdas yra laikomas patrauklia alternatyva vaistų skyrimui per os, ypač vietinių lytinių organų ligų ar moteriškų reprodukcinių ligų gydyme [1]. Vaginalinės žvakutės – tai kieti, vienadoziai vaistiniai preparatai, vartojami makšties gleivinėje. Šios vaisto formos gamyboje naudojami pagrindai – kakavos sviesto, želatinos-glicerolio, polietilenglikolio ir kiti – yra inertiški daugeliui veikliųjų medžiagų, o svarbiausia – nedirginantys makšties gleivinės ir saugūs vartoti net ir absorbcijos atveju. Žvelgiant iš biofarmacinės perspektyvos – apie vaginalines žvakutes bei jų gamybai naudojamų pagrindų ir pagalbinių medžiagų įtaką veikliųjų junginių atpalaidavimui informacijos nėra daug. Tai, kad šis vaistinių preparatų vartojimo būdas yra prieinamas tik moterims, galėjo apriboti tolimesnį biofarmacinių tyrimų vystymą [2]. Būtent dėl šios priežasties vaginalinės žvakutės buvo pasirinktos kaip biofarmacinių tyrimų objektas šiame darbe.

Vaistinės medetkos taikymo medicinos, o ypač – ginekologijos tikslais istorija siekia šimtmečius. Jau viduramžiais iš augalo žiedų buvo gaminami nuovirai, tinktūros bei ekstraktai, kurie išoriškai buvo naudojami žaizdų gijimui skatinti, sudirgusiai odai nuraminti, uždegiminėms odos bei gleivinių ligoms gydyti [3]. Šiai dienai vaistinė medetka yra oficialiai pripažinta kaip augalas, pasižymintis antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis, antiseptinėmis bei kitomis farmakologinėmis savybėmis, kurias lemia gausi žaliavoje kaupiamų cheminių junginių sudėtis. Visos šios savybės gali būti pritaikomos siekiant išlaikyti ar atkurti makšties gleivinės drėgmės balansą, apsaugoti gleivinės paviršių nuo žalingų aplinkos veiksnių, skatinti mechaninių bei mikrobiologinių gleivinės pažeidimų gijimo procesus, epitelio regeneraciją bei siekiant užkirsti kelią infekcijos plitimui [4,5]. Šios priežastys lėmė medetkos žiedų augalinės žaliavos, kaip veikliosios medžiagos, pasirinkimą šiame darbe.

gamybos metodus. Vaistinės medetkos žiedų augalinės žaliavos ekstraktai buvo gaminami dviem būdais – maceracijos bei ekstrakcijos ultragarsu, o kaip ekstrahentai buvo naudojami skirtingi tirpikliai – etanolis, linų sėmenų aliejus bei išgrynintas vanduo. Atlikus pagamintų ekstraktų vertinimą, vaginalinės vaisto formos gamybai buvo pasirinktas vandeninis vaistinės medetkos žiedų ekstraktas, kurio gamybai buvo taikomas ekstrakcijos ultragarsu metodas. Vaginalinės žvakutės buvo gaminamos liejimo būdu, į skirtingos sudėties pagrindus įterpiant tokį pati kiekį augalinio ekstrakto.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Sumodeliuoti vaginalines žvakutes su vaistinės medetkos (lot. Calendula officinalis L.) žiedų

augalinės žaliavos ekstraktu ir įvertinti farmacinių veiksnių įtaką jų kokybei.

Uždaviniai:

1. Atlikus mokslinės literatūros ir mokslinių tyrimų rezultatų analizę, pasirinkti tinkamą ekstrakcijos metodą bei tirpiklį vaistinės medetkos žiedų augalinės žaliavos ekstrakcijai vykdyti.

2. Palyginti biologiškai aktyvių junginių – karotinoidų, flavonoidų, fenolinių junginių kiekį pagamintuose vaistinės medetkos ekstraktuose, priklausomai nuo ekstrakcijai naudojamo tirpiklio ir ekstrakcijos metodo.

3. Parinkti vaginalinių žvakučių sudėtis su skirtingais (hidrofobiniais bei hidrofiliniais) pagrindais, įterpiant pasirinktą vaistinės medetkos žiedų augalinį ekstraktą ir įvertinti žvakučių kokybę.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Vaginalinis vaistinių preparatų vartojimo būdas: privalumai, trūkumai,

veikliųjų medžiagų absorbcija

Vaginalinis vaistinių preparatų vartojimo būdas yra žinomas nuo neatmenamų laikų ir manoma, jog jis yra toks pats senas, kaip ir pati medicinos praktika. Šiuolaikinėje medicinos praktikoje vaginalinis vaistų skyrimo būdas yra laikomas puikia alternatyva vaistų skyrimui per os, ypač vietinių lytinių organų ligų bei moterų reprodukcinių ligų gydyme [1,6]. Nepaisant keleto apribojimų, tokių kaip fiziologiniai makšties gleivinės pokyčiai reprodukcinio ciklo metu, tiesioginis vaginalinis vaistų skyrimo būdas gali būti naudingas siekiant užkirsti kelią neigiamiems padariniams, tokiems kaip sisteminis šalutinis poveikis. Moksliškai įrodyta, jog makšties gleivinė gali absorbuoti skirtingas aktyviąsias molekules ir yra pakankamai gerai aprūpinama krauju, kad būtų galima sukelti sisteminį poveikį [2,7,8].

Vaginaliniai vaistiniai preparatai yra skirstomi į skystus, pusiau kietus bei kietus. Juose gali būti įterpta viena arba kelios veikliosios medžiagos. Dažniausiai šie vaistiniai preparatai yra vartojami vietiniam poveikiui sukelti. Europos farmakopėjoje (Ph.Eur.) yra išskiriami šie vaginaliniai vaistiniai preparatai:

 Vaginalinės žvakutės  Vaginalinės tabletės  Vaginalinės kapsulės

 Vaginaliniai tirpalai, emulsijos bei suspensijos

 Tabletės vaginaliniams tirpalams bei suspensijoms paruošti  Pusiau kieti vaginaliniai preparatai (tepalai, kremai, geliai)  Vaginalinės putos

 Medicininiai vaginaliniai tamponai

tokių kaip skiedikliai, adsorbentai, paviršinio aktyvumo medžiagos, slidikliai, antimikrobiniai konservantai ar dažančiosios medžiagos, patvirtintos kompetentingų institucijų (Ph. Eur.) [2].

Žvelgiant iš biofarmacinės perspektyvos, apie vaginalines žvakutes yra žinoma nedaug. Makšties gleivinė pasižymi geromis absorbcinėmis savybėmis, tačiau šis vaistų skyrimo būdas siekiant sukelti sisteminį poveikį yra pasirenkamas retai. Tai, kad šis vaistinių preparatų vartojimo būdas yra tinkamas tik moterims, galėjo apriboti jo taikymą sisteminiam vaistų skyrimui bei tolimesniems tyrimams. Vaginalinis vaistinių preparatų vartojimo būdas dažniausiai yra taikomas veikliosioms medžiagoms, turinčioms vietinį poveikį makšties gleivinei. Produkto formulavimas, paruošimo būdas, išleidimo kontrolė bei kokybės reikalavimai yra labai panašūs į rektalinėms žvakutėms keliamus reikalavimus [2,7].

Tiek vaginaliniai, tiek rektaliniai vaistiniai preparatai, skirti vietiniam poveikiui sukelti, biofarmaciniu požiūriu yra prilyginami ant odos vartoti skirtiems preparatams. Svarbu yra atkreipti dėmesį į tai, kad vaistinį preparatą skiriant vaginaliai arba rektaliai, didesnis kiekis veikliosios medžiagos pasiekia sisteminę kraujotaką, nei jį pavartojus ant odos. Tai gali sukelti nepageidaujamą sisteminį poveikį. Didelis veikliosios medžiagos tirpumas lipiduose ir maža molekulinė masė padidina absorbciją per makšties gleivinę. Gleivinėms skirti preparatai pirmiausia yra absorbuojami pasyvios difuzijos būdu, todėl vietiniam poveikiui skirtų veikliųjų medžiagų lipofiliškumas turėtų būti ribotas, kad būtų užkirstas kelias sisteminiam veikimui [2,8].

1.2. Vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagrindai bei jų galima įtaka

preparatų biologiniam pasisavinimui

Vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagrindai yra skirstomi į dvi pagrindines kategorijas:

 Lipofiliniai (tirpūs riebaluose) pagrindai  Hidrofiliniai (tirpūs vandenyje) pagrindai

makšties gleivinės savybė savaime „išsivalyti“ per išskiriamus sekretus, tad vaginalinių žvakučių gamybai pasirinktų pagrindų adhezinės savybės turi didelę reikšmę šios vaisto formos veiksmingumui bei terapiniam efektyvumui [8]. Pagrindų adhezinės savybės gali būti modifikuojamos įterpiant pagalbinių medžiagų, tokių kaip polikarbofilas, hialurono natrio druska ar hidroksipropilmetilceliuliozė. Šios medžiagos yra biologiškai lipnūs polimerai, kurie sąveikaudami su makšties gleivine padeda vaisto formai ilgiau išsilaikyti vartojimo vietoje be jokio toksinio poveikio ar svarbių biologinių pokyčių, yra inertiškos aktyviesiems komponentams bei neturi įtakos jų atpalaidavimo kinetikai. Atlikti vaginalinių žvakučių gamyboje naudojamų pagalbinių medžiagų tyrimai parodė, kad šių trijų polimerų - polikarbofilo, hialurono natrio druskos bei hidroksipropilmetilceliuliozės adhezinės savybės yra tiesiogiai proporcingos jų koncentracijai vaginalinių žvakučių pagrinde [9].

Svarbu yra paminėti ir tai, kad vaginalinių žvakučių gamybai pasirinktas pagrindas turėtų būti nedirginantis makšties gleivinės bei nekenksmingas absorbcijos atveju. Tiek cheminiu, tiek fizikiniu atžvilgiu žvakučių pagrindas turėtų pasižymėti ilgu tinkamumo vartoti laiku, kad jis neturėtų neigiamos įtakos veikliosios medžiagos stabilumui. Atlikti biofarmaciniai žvakučių pagrindų tyrimai parodė, kad vaginalinių žvakučių gamyboje gali būti naudojami tokie patys pagrindai, kaip ir gaminant rektalines žvakutes [2].

Vaginalinių žvakučių gamybos procese pagrindams yra keliami šie reikalavimai:

 Pagrindui stingstant, jame neturi susidaryti nestabilių modifikacijų, dėl kurių stingimo taškas gali tapti žemesnis nei esant kambario temperatūrai (būdinga kakavos sviesto pagrindui).

 Sukietėjus, žvakutės masė (pagrindas + veiklioji medžiaga os) + pagalbinė medžiaga (-os)) turėtų šiek tiek susitraukti - tai palengvina žvakučių pašalinimą iš formos.

 Masės išpilstymo į formas metu žvakutės pagrindas turėtų būti pakankamai klampus, kad masėje išsklaidytos veikliosios medžiagos dalelės nesedimentuotų.

 Kambario temperatūroje žvakutės masė turi būti kieta ir išlaikyti savo formą.

1.2.1. Lipofiliniai vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagindai

1.2.1.1. Kakavos sviesto pagrindas

Kakavos sviestas (oleum Cacao) - tai kietieji riebalai, gaunami iš skrudintų tikrojo kakavmedžio (Theobroma cacao) sėklų. Yra žinoma, kad jau nuo XVIII a. vidurio jis yra naudojamas kaip pagrindas žvakučių gamyboje. Esant kambario temperatūrai, kakavos sviestas yra kietos konsistencijos, o kūno temperatūroje – lydosi. Ilgai laikomas kakavos sviestas pasižymi savybe apkarsti ir jam yra būdingas ryškus polimorfizmas [10]. Kakavos sviestas turi keturias polimorfines formas – alfa, beta, beta‘ ir gama, kurių lydymosi temperatūra atitinkamai yra 23°C, 34-36°C, 28°C bei 17°C. Beta forma yra pati stabiliausia [11].

Kakavos sviesto žvakutės gali būti gaminamos ritinimo (seniausias žinomas metodas), šalto presavimo bei liejimo būdais. Pirmojo ir antrojo metodų pranašumas yra tas, kad išvengiama kakavos sviesto kaitinimo ir tirpimo. Tokiu būdu išvengiamos masės stingimo problemos, kurias sukelia polimorfizmas [10]. Gaminant žvakutes abiem šiais metodais, tarkuotas kakavos sviestas sumaišomas su veikliąja medžiaga naudojant plastikinę mentelę. Rankiniu būdu ši masė valcuojama iki tampa vientisa, suformuojamas ritinys, kuris supjaustomas į atitinkamą skaičių dalių ir tuomet ritinama kiekviena atskira žvakutė taip, kad viename gale ji būtų cilindro formos, o link kito galo – nusmailėtų į kūgišką formą. Rankiniu būdu naudojant kompresines formas galima paįvairinti gaminamų žvakučių formą bei dydį, kiekvienos žvakutės formuoti atskirai rankomis nebereikia [2].

taip pat ir veikliosios medžiagos atpalaidavimą – tai gali turėti neigiamos įtakos vaistinio preparato kokybei bei efektyvumui. Priešingai nei kakavos sviesto trūkumai gaminant žvakutes liejimo būdu, šalto presavimo metodas turi pranašumą, kad presuojant žvakutes pagrindą sudarančios medžiagos nekaitinamos, o veikliosios medžiagos dalelės nesedimentuoja, tad yra pašalinama pagrindinė turinio vienodumo bei galimų modifikacijų susidarymo priežastis [2].

Kietieji riebalai, alternatyva kakavos sviestui, yra mažiau linkę apkarsti ir turi mažesnį kiekį modifikacijų [11]. Tai yra priežastis, kodėl kai kurių šalių (pvz., Olandijos) farmacijos praktikoje kietieji riebalai pakeitė kakavos sviestą ekstemporalių vaistų gamyboje, tačiau yra ir šalių (pvz., Lietuva), kuriose kakavos sviestas vis dar užima pirmąją vietą [2].

1.2.1.2. Kietųjų riebalų pagrindas

Kietieji riebalai (Adeps solidus) – tai bendras sintetinių ar pusiau sintetinių riebalų rūgščių C10 – C18 mono-, di- ir trigliceridų mišinys, kurio lydymosi intervalas gali būti nuo 33°C iki 36°C. Europos farmakopėja (Ph. Eur.) nenustato kietųjų riebalų stingimo taško ar diapazono. Kietųjų riebalų rūšys, atitinkančios Europos farmakopėjos (Ph. Eur.) reikalavimus ir turinčios tą patį lydymosi tašką, dėl skirtingos sudėties vis tiek gali turėti skirtingą stingimo intervalą. Trumpas intervalas tarp lydymosi ir stingimo taškų atrodo naudingas, nes tai sutrumpina laiką, per kurį dalelės galėtų sedimentuoti po to, kai žvakučių masė yra išpilstoma į formas. Priverstinis aušinimas sutrumpina stingimo laiką, tačiau jo negalima pritaikyti kiekvienai kietųjų riebalų rūšiai – žvakutė gali tapti trapi ir neatspari lūžiams. Skirtinga kietųjų riebalų sudėtis taip pat daro įtaką masės stingimo pobūdžiui ir gali sukelti (teigiamą) klampumo padidėjimą, kol masė visiškai sukietėja. Klampumo padidėjimas gali sumažinti į pagrindą įterptų veikliųjų medžiagų nusistovėjimą formų užpildymo metu ir taip pagerinti žvakučių turinio vienodumą [2,10].

su pagrindo laisvomis hidroksilo grupėmis arba laisvosiomis riebalų rūgštimis keičia vaisto formos lydymosi savybes ir tai gali turėti įtakos veikliosios medžiagos išsiskyrimui [2].

1.2.1.3. Veikliųjų medžiagų atpalaidavimas iš lipofilinių pagrindų

Biologinį vaistinių medžiagų pasisavinimą lemia pagrindo bei pagalbinių medžiagų tipas ir jų kiekis, naudojamas vaisto formai pagaminti. Vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagrindai ir į juos įterpiamos pagalbinės medžiagos atlieka svarbų vaidmenį kontroliuojant žvakutėse esančios veikliosios medžiagos biologinį prieinamumą [12]. Iš lipofilinių pagrindų, naudojamų vaginalinių žvakučių gamyboje, veikliosios medžiagos išsiskiria ir jų rezorbcija prasideda žvakutei išsilydžius aplikacijos vietoje (makšties gleivinėje). Tuo tarpu iš hidrofilinių pagrindų veikliosios medžiagos išsiskiria tik pagrindui ištirpus. Dėl šios priežasties, veikliosios medžiagos, esančios vaginalinėje žvakutėje, išsiskiria ir rezorbuojasi greičiau, jei jos buvo įterptos į lipofilinį pagrindą. Svarbu yra paminėti ir tai, jog riebaluose tirpioms (lipofilinėms) vaistinėms medžiagoms yra būdinga geresnė rezorbcija jas įterpus į hidrofilinius pagrindus, o vandenyje tirpioms (hidrofilinėms) vaistinėms medžiagoms – jas įterpus į lipofilinius pagrindus. Dėl šių ypatybių, siekiant greitesnio terapinio poveikio, lipofiliniai vaginalinių žvakučių pagrindai yra derinami su hidrofilinėmis veikliosiomis medžiagomis, o siekiant prolonguoto poveikio – su hidrofobinėmis. Biofarmaciniu požiūriu, riebaluose tirpių (hidrofobinių) veikliųjų medžiagų įterpimas į lipofilinius pagrindus nėra racionalus – šių medžiagų rezorbciją galima pagerinti derinant jas su hidrofiliniais žvakučių pagrindais [12,13].

1.2.2. Hidrofiliniai vaginalinių žvakučių gamyboje naudojami pagrindai

1.2.2.1. Želatinos-glicerolio pagrindas

farmakopėjose šių sudėtinių dalių santykiai skiriasi [10]. Europos farmakopėjoje (Ph. Eur.) nurodyta, kad „Suppositoria Gelatinosa“ pagrindas yra sudarytas iš 1 dalies želatinos, 5 dalių glicerolio ir 2 dalių vandens. Tuo tarpu Olandijos farmakopėjoje (Ph. Ned. VI) nurodyta, kad želatinos-glicerolio pagrindą, naudojamą vaginalinių žvakučių gamybai, sudaro 2 dalys želatinos, 5 dalys 85% glicerolio ir 4 dalys vandens. Šis santykis yra sutinkamas ir Didžiosios Britanijos bei Jungtinių Valstijų farmakopėjose [2]. Želatinos-glicerolio pagrindas ilgą laiką buvo naudojamas vaginalinių žvakučių gamyboje dėl jo gerų sukibimo su makšties gleivine savybių ir pacientui priimtinos minkštos konsistencijos, tačiau šiam pagrindui yra itin būdingas mikrobiologinis užterštumas laikant. Natūralios kilmės pradinės medžiagos (šiuo atveju - želatinos) naudojimas padidina mikrobiologinio užterštumo tikimybę. Vanduo, kuris taip pat įeina į žvakutės pagrindą, laikant gali kondensuotis pakuotėje, ir tuomet susiformuoja palanki terpė mikroorganizmams augti bei vystytis [10]. Fizinės su laikymu susijusios problemos yra masės drėgmės netektis žvakutes laikant sausomis sąlygomis, arba net iki 10% drėgmės sugertis, žvakutes laikant drėgnomis sąlygomis. Nepaisant to, daugelyje šalių šis pagrindas vis vien yra naudojamas vaginalinių žvakučių gamyboje. Dėl anksčiau minėtų priežasčių, želatinos-glicerolio pagrindo žvakutės turi būti laikomos gerai uždarytose talpyklėse, vėsioje vietoje. Norint prailginti žvakučių tinkamumo laiką, į pagrindą reikia įterpti konservantų, tokių kaip metil-parahidroksi-benzoatas ar propil-parahidroksi-metil-parahidroksi-benzoatas, arba jų abiejų. Priešingu atveju, žvakučių tinkamumo laikas turėtų būti ribotas iki 1-os arba 2-jų savaičių [2].

1.2.2.2. Polietilenglikolių (PEG) pagrindas

Polietilenglikoliai (PEG), dar vadinami makrogoliais, yra etileno oksido polimerai. Jie ganėtinai dažnai yra pasirenkami kaip pagrindas vaginalinių žvakučių gamyboje. Norimą žvakutės pagrindo kietumą galima modifikuoti pasirenkant molekulinę masę ir tinkamus koeficientus [14]. Netgi polietilenglikolis 1500 yra per minkštos konsistencijos, jei naudojamas pats vienas. Dažniausiai vaginalinių žvakučių gamybai pasirenkama bazė gamybinėse vaistinėse yra sudaryta iš 1 dalies polietilenglikolio 1500 ir 2 dalių polietilenglikolio 4000. Jei žvakutės gaminamos šiuo santykiu vis vien gaunamos per minkštos - naudojamas didesnės molekulinės masės makrogolis [2].

sutrumpėjimas yra šiek tiek pervertinami, kadangi polietilenglikolio tirpimas makšties gleivinės skysčiuose taip pat reikalauja laiko. Polietilenglikoliui ištirpus, veiklioji medžiaga išsiskiria greičiau nei iš hidrofobinio pagrindo, nes pastarajame veiklioji medžiaga pirmiausiai turi pereiti iš riebalinės fazės į vandeninę. Be to, veiklioji medžiaga, įterpta į polietilenglikolio pagrindą, gali ištirpti makšties gleivinės skysčiuose kartu su juo. Nepaisant privalumų, šis pagrindas, kaip ir visi kiti, turi kelis esminius trūkumus – cheminį nesuderinamumą su ganėtinai dideliu skaičiumi veikliųjų medžiagų bei dirginantį poveikį gleivinei [2,15].

Polietilenglikoliai yra chemiškai nesuderinami su daug daugiau veikliųjų medžiagų, lyginant su hidrofobiniais pagrindais. Laikymo metu polietilenglikoliai gali sudaryti peroksidus, todėl jie nėra tinkami lengvai oksiduojamoms medžiagoms įterpti. Nesuderinamumą taip pat gali sukelti kompleksų susidarymas ir transesterinimas. Dėl aukštos lydymosi temperatūros polietilenglikolio pagrindą dažnai rekomenduojama rinktis esant atogrąžų klimatinėms sąlygomis, tačiau jo naudojimą riboja cheminis nesuderinamumas bei higroskopiškumas [2].

Iš polietilenglikolio pagrindo veiklioji medžiaga yra atpalaiduojama ne tik pagrindui tirpstant, bet pirmiausiai ištirpinant pagrindą makšties gleivinės skysčiuose. Dėl didelės ištirpusio makrogolio osmosinės vertės vanduo yra pašalinamas iš aplinkinių audinių - tai gali sudirginti gleivinę [16]. Norint išvengti sudirginimo, patariama prieš įterpiant žvakutę sudrėkinti ją vandeniu - tai palengvins žvakutės įterpimą, tačiau poveikis dirginimui yra abejotinas, nes žvakutei ištirpti vandens prireiks kur kas daugiau [2].

1.3. Vaistinės medetkos pritaikymas ginekologijos praktikoje

Terpenoidai taip pat slopina baltųjų kraujo kūnelių migraciją į uždegimo vietą sukeldami priešuždegiminį poveikį, o likopenas mažina priešuždegiminių citokinų transkripcijos lygį [3]. Augalo sudėtyje esantys polisacharidai padeda palaikyti gleivinių drėgmės balansą bei saugo gleivinės paviršius nuo žalingų aplinkos veiksnių. Ekstraktuose aptinkami kvercetinas, β-karotinas, 1,8-cineolis ir α-pinenas pasižymi laisvuosius radikalus surišančiu aktyvumu, suteikdami ekstraktams gerą antioksidacinį potencialą [3]. Visos šios savybės, kurias apsprendžia vaistinės medetkos augalinėje žaliavoje esantys aktyvieji komponentai, gali būti pritaikomos siekiant išlaikyti makšties gleivinės drėgmės balansą bei apsaugoti gleivinės paviršių nuo žalingų aplinkos veiksnių, skatinti mechaninių bei mikrobiologinių gleivinės pažeidimų gijimo procesus bei epitelio regeneraciją, slopinti uždegimą, palaikyti gleivinės mikrofloros balansą bei siekiant užkirsti kelią infekcijos plitimui [3,17,18].

1.3.1. Vaistinė medetka – farmakologinės savybės

Vaistinė medetka (Calendula Officinalis L.) – tai astrinių (Asteraceae) šeimai priklausantis vienmetis augalas, turintis ryškius geltonai oranžinės spalvos žiedus. Medetkos pavadinimas yra kilęs iš lotyniško žodžio calends, kuris reiškia pirmąją kiekvieno mėnesio dieną, dėl augalui būdingo ilgo žydėjimo periodo. Kultivuojama egiptiečių, arabų, graikų bei induistų, vaistinė medetka buvo atgabenta ir į Europietiškus sodus ir medicinos (ypač – fitoterapijos), kulinarijos tikslais, taip pat kaip dažanti žaliava audinių pramonėje bei kosmetikoje pradėta naudoti nuo XII a. Kadangi augalo žiedams yra būdinga suktis į saulę, viduramžiais buvo tikima, kad medetka yra tinkama karščio sukeltiems negalavimams, širdies ligoms, vėžiui gydyti, menstruacijoms skatinti. Kiek vėliau, iš augalo žiedų pradėta gaminti nuovirus, tinktūras bei ekstraktus, kurie išoriškai buvo naudojami žaizdų gijimui skatinti, vietiniam uždegimui slopinti, sudirgusiai odai nuraminti, taip pat uždegiminėms odos bei gleivinių ligoms gydyti. Dėl šimtmečius siekiančios vartojimo medicinos praktikoje istorijos, šiai dienai vaistinė medetka yra oficialiai pripažinta kaip augalas, pasižymintis antioksidacinėmis, antiseptinėmis, priešuždegiminėmis bei kitomis farmakologinėmis savybėmis ir yra naudojama užpilų, tinktūrų, skystųjų ekstraktų, šalto spaudimo aliejaus bei tepalų pavidalu, siekiant palengvinti odos bei gleivinių uždegiminius procesus, skatinti žaizdų, nudegimų, sumušimų bei kitų odos pažeidimų gijimą bei siekiant užkirsti kelią infekcijos plitimui. Visas minėtas gydomąsias savybes lemia gausi žaliavoje kaupiamų cheminių junginių sudėtis [4,5].

 Eterinių aliejų (juose gausu lakiųjų junginių, tokių kaip α-pinenas, δ-kadinenas, γ-kadinenas, α-tujenas , α-kadinolis, γ-murolenas ir kt., kurie žaliavai suteikia jai būdingą kvapą ir skonį) [4];

 Karotinoidų (α-karoteno, β-karoteno, neoksantino, liuteoksantino, violaksantino, liuteino, flavoksantino, likopeno ir kt.) [19];

 Fenolinių junginių – flavonoidų (kvercetino, izokvercetino, izoramnetino, narcizino, kalendoflazido, kalendoflavozido, rutino ir kt.) [20];

 Terpenoidų (sitosterolių, stigmasterolių, eritrodiolio, ursadiolio, lupeoplio) [4];  Kumarinų (skopoletino, umbeliferono, eskuletino) [4];

 Kvinonų (plastokvinono, filokvinono, α-tokoferolio) [4];

 Aminorūgščių (asparagino, apsarto rūgšties, arginino, alanino, valino, histidino gliutamo rūgšties, leucino, lizino, prolino, serino, tirozino, treonino, metionino, fenilalanino) [4];

 Angliavandenių [4];  Lipidų [4];

Farmakologiniai tyrimai patvirtino, kad vaistinė medetka pasižymi plačiu biologiniu poveikiu. Kai kurie iš šių poveikių yra labai įdomūs galimai plėtrai ateityje.

1.3.1.1. Antioksidacinis poveikis

ir kt.) pasižymi laisvuosius radikalus surišančiu aktyvumu, taip pagerindami žaizdų gijimą, slopindami uždegimą [4].

1.3.1.2. Priešuždegiminis poveikis

Vaistinė medetka pasižymi ne tik antioksidaciniu, bet ir uždegimą slopinančių bei edemas mažinančiu poveikiu. Šiuos poveikius stipriausiai lemia oleanano tipo triterpeno glikozidai, randami augale. Della ir kt., 1994 metais atliktame tyrime vandeniniai-etanoliniai medetkų augalinės žaliavos ekstraktai buvo veiksmingi net iki 20% slopindami edemą pelių ausyse, dirbtinai sukeltą joms į ausis įlašinus krotonmedžio aliejaus. Šis poveikis buvo priskirtas būtent triterpenoidams, iš kurių trys aktyviausi junginiai buvo faradiol-3-miristinės rūgšties, faradiol-3-palmitino rūgšties ir 4-taraksasterolio esteriai [21,22].

1.3.1.3. Žaizdų gijimą skatinantis poveikis

1.3.1.4. Antibakterinis, priešgrybelinis poveikis

Vaistinės medetkos žiedų ekstraktams yra būdingas antibakterinis bei priešgrybelinis poveikiai. Iauk 2003 metais atliko tyrimą, kurio metu buvo vertinamas metanolinio vaistinės medetkos žiedų ekstrakto bei 10% augalo žiedų nuoviro aktyvumas prieš anaerobines bei aerobines periodonto bakterijas (Porphyromonos gingivalis, Prevotella spp., Furobacterium nucleatum, Caphocytophaga gingivalis, Veilonella parvula, Eikenella corrodens, Peptostostrepto). Gauti rezultatai parodė ryškų visų tirtų mikroorganizmų padermių slopinimą [24]. Kiek vėliau (2008m.) Roopashree ir kt., nustatė, kad vandeniniai vaistinės medetkos žiedų ekstraktai pasižymi geresniu antibakteriniu poveikiu nei metanoliniai ar etanoliniai ekstraktai. Tarp tirtų organizmų padermių S. aureus buvo jautresnė būtent jiems [4]. Mathur 2011 metais atliko eksperimentą, kurio metu buvo tiriamas vaistinės medetkos lapų, stiebų, šaknų ir žiedų ekstraktų, pagamintų n-butanolyje, etanolyje ir distiliuotame vandenyje, antimikrobinis aktyvumas. Tyrime buvo naudojami žmogaus patogeniniai mikroorganizmai (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus sp., Cogulase (+) Staphylococcus sp., Cogulase (-) Staphylococcus sp., Candida albicans ir Candida parapsilosis). Visų trijų tirpiklių ekstraktai buvo veiksmingi prieš daugelį šių mikroorganizmų. Manoma, kad tokį poveikį nulėmė oleanolio rūgštis bei jos glikozidai [4].

1.4. Biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija ir jai taikomi metodai

Vaistinės augalinės žaliavos yra natūralių veikliųjų junginių, naudojamų tiek medicinos, tiek kitose srityse, šaltinis. Augalai kaupia daug aktyvių cheminių komponentų, tokių kaip flavonoidai, fenoliniai junginiai, alkaloidai, steroidai, lakieji ir nelakieji aliejai bei kitų, kurių lokacija ir kiekis tam tikrose augalo dalyse (lapuose, žieduose, žievėje, sėklose, vaisiuose, šaknyse) yra individualus kiekvienam augalui. Šių veikliųjų junginių išskyrimui yra taikomi įvairūs ekstrakcijos metodai, kurie yra skirstomi į tradicinius (maceracija, perkoliacija, ekstrakcija Soksleto aparate ir kt.) ir naujuosius (ekstrakcija ultragarsu, ekstrakcija mikrobangomis, superkritinių skysčių ekstrakcija, kietos fazės ekstrakcija ir kt.) metodus. Kiekvienas šių metodų pasižymi jam būdingais privalumais bei trūkumais. Idealiu atveju ekstrakcijos metodas turėtų būti išsamus išskiriamų komponentų atžvilgiu, paprastas, greitas ir nebrangus [26]. Žemiau pateikiami metodai, taikyti šio darbo tiriamojoje dalyje.

1.4.1. Maceracija

Maceracija – tai vienas seniausių ir plačiausiai naudojamų metodų veikliesiems junginiams iš augalinių žaliavų išgauti. Taikant maceracijos metodą, vaistinė augalinė žaliava yra užpilama tirpikliu ir mirkoma mažiausiai tris dienas sandariai uždarytame inde, esant kambario temperatūrai, dažnai maišant. Kuo maceracijos procese naudojama augalinė žaliava yra labiau susmulkinta – tuo didesnis sąlyčio su tirpikliu paviršiaus plotas - tuo efektyviau vyksta procesas. Ekstrakcijai naudojamas tirpiklis pasirenkamas pagal norimo išgauti junginio tipą. Būtent jis lemia išgaunamų ekstraktų sudėtį bei veikliųjų junginių kiekį jame. Procesui pasibaigus, tirpiklio ir augalinės žaliavos mišinys yra nufiltruojamas, o žaliavos liekanos – kruopščiai nuspaudžiamos, siekiant išgauti kuo didesnį išekstrahuotų veikliųjų junginių frakcijos kiekį [27,28].

1.4.2. Ekstrakcija ultragarsu

Ekstrakcija ultragarsu – tai didelio intensyvumo ir dažnio (nuo 20 iki 2000 kHz) ultragarso bangų taikymas bei jų sąveika su ekstrahuojama medžiaga. Šis ekstrakcijos metodas yra potencialiai naudingas, kadangi yra nebrangus ir nereikalauja sudėtingos įrangos. Ekstrakcija ultragarsu gali būti taikoma tiek smulkiu, tiek dideliu mastu. Taikant šį metodą, augalinė žaliava ekstrahuojama tirpikliu stikliniame inde, uždengtoje ultragarso vonelėje didelio dažnio ultragarso bangomis. Esant tokioms sąlygoms sumažėja ekstrakcijos laikas bei padidėja ekstrakcijos išeiga dėl mechaninio įtempimo, kuris sukelia žaliavos ląstelių skilimą. Žaliavos ir tirpiklio mišinį veikiant ultragarso bangomis, tiek skystosios, tiek kietosios fazės dalelės ima vibruoti, todėl ištirpusios veikliosios medžiagos greitai pereina iš kietosios fazės į tirpiklį. Dėl ultragarso bangų sukeliamos mechaninės kavitacijos (dujų burbuliukų susidarymo skystoje fazėje) poveikio padidėja sąlyčio paviršius tarp mėginio ir tirpiklio, taipogi ląstelių sienelių pralaidumas. Augalinę žaliavą veikiant ultragarsu pasikeičia jos fizikinės bei cheminės savybės, suardomos augalo ląstelių sienelės. Tai palengvina veikliųjų junginių išskyrimą bei perėjimą į tirpiklį [26,29].

Ekstrakcijos ultragarsu metodas yra inovatyvus ir plačiai taikomas šiomis dienomis. Vienas pagrindinių metodo privalumų yra tas, kad jį galima taikyti termiškai labiliems junginiams (pvz., antocianinams, lakiesiems eterinio aliejaus komponentams) išgauti, kadangi ekstrakcijos ultragarsu metu išvengiama ilgo ekstrahavimo laiko bei aukštos temperatūros rėžimo. Šis metodas taip pat pasižymi geru efektyvumu flavonoidų, fenolinių junginių, karotinoidų išskyrime. Tarp visų metodo privalumų svarbu yra paminėti tai, kad ekstrakcijos metu taikant didesnę nei 20 kHz ultragarso energiją gali įvykti aktyvių natūralių junginių pokyčiai, susidaryti laisvieji radikalai [27,29].

1.4.3. Ekstrakcijos metodų privalumai bei trūkumai

bei gausus organinių atliekų susidarymas. Lyginant su maceracija, ekstrakcija ultragarsu yra inovatyvesnis ekstrahavimo metodas. Taikant šį automatizuotą metodą yra sutrumpinamas ekstrahavimo laikas, išvengiama papildomų mėginių koncentravimo bei valymo etapų, mažiau sunaudojama organinių tirpiklių. Yra teigiama, kad šio metodo efektyvumas yra didesnis nei maceracijos atveju, tačiau šiam metodui taikyti yra reikalinga papildoma įranga – ultragarso vonelė bei tam tikros metodinės žinios [26,27].

Siekiant nustatyti, kuris iš ekstrakcijos metodų – ekstrakcija ultragarsu ar maceracija yra efektyvesnis, yra atliktas ne vienas tyrimas. Jovanovic A. A. ir kt. 2017 metais atliktame fenolinių junginių ekstrakcijos iš vaistinio čiobrelio (Thymus serpyllum) augalinės žaliavos tyrime buvo lyginamas maceracijos bei ekstrakcijos ultragarsu efektyvumas. Pagal tyrimo rezultatus buvo padaryta išvada, kad bendrojo fenolinių junginių kiekio išeiga buvo didesnė ekstrahuojant augalinę žaliavą ultragarso metodu. Taip pat buvo nustatyta, kad dalelių dydis, kietosios medžiagos ir tirpiklio santykis bei tirpiklio tipas daro didelę įtaką bendram išekstrahuojamų fenolinių junginių kiekiui [30]. Safdar M. N. ir kt. 2016 metais atliko labai panašaus pobūdžio tyrimą, siekdami išsiaiškinti, kuriuo metodu – maceracija ar ultragarsu ekstrahuojant mandarininio citrinmedžio (Citrus reticulata) vaisių žieveles yra gaunamas didesnis bendras fenolinių junginių kiekis. Gauti rezultatai sutapo su anksčiau minėto tyrimo rezultatais – didesnis bendras fenolinių junginių kiekis buvo gautas vykdant esktrakciją ultragarsu [31].

1.5. Ekstrakcijoje naudojami tirpikliai

nėra universalios ekstrakcijos procedūros, tinkamos visiems augalinės žaliavos antioksidaciniu poveikiu pasižymintiems junginiams ekstrahuoti. Priklausomai nuo ektrakcijos procese naudojamo tirpiklio, iš augalinės žaliavos bus išgaunamas antioksidacinio poveikio junginių mišinys, tirpus būtent šiame tirpiklyje. Svarbu atkreipti dėmesį yra ir į tai, kad gautame ekstrakte gali būti ir kitų komponentų, tokių kaip organinės rūgštys, riebalai, cukrus [32,33]. Tirpikliai, tokie kaip metanolis, acetonas, etilo acetatas bei jų deriniai skirtingame santykyje su vandeniu daugybę metų buvo naudojami įvairiems veikliesiems junginiams iš augalinių žaliavų išgauti. Nors jiems yra būdinga gera ekstrakcijos išeiga, šie organiniai junginiai nėra „draugiški“ nei žmogui, nei aplinkai – jų taikymas veikliųjų junginių ekstrakcijos procesuose didina organinių atliekų sąnaudas bei susidarymą [32]. Atsižvelgiant į didėjantį šių dienų visuomenės poreikį tausoti gamtą, šiame darbe ekstrakcijai naudoti tirpikliai (išgrynintas vanduo, etanolis, linų sėmenų aliejus) buvo atrinkti pagal jų prieinamumą, ekstrakcines savybes bei saugumą vartoti žmogui.

1.5.1. Ekstrakcija etilo alkoholiu

Etanolis – tai vienas seniausių, geriausiai žinomų ir plačiausiai taikomų tirpiklių veikliųjų junginių ekstrakcijoje. Šis tirpiklis yra naudojamas tiek grynas (96%), tiek įvairių santykių deriniuose su vandeniu (70%, 60%, 50%). Etanolis pasižymi dideliu išekstrahuojamų antioksidacinio poveikio junginių (pvz., polifenolių, flavonoidų, karotinoidų ir kt.) kiekiu, yra saugus vartoti žmogui bei nekenkia aplinkai. Papildomas tirpiklio privalumas yra tas, kad etanolis yra natūralus konservantas – ekstraktų gamybai pasirinkus šį tirpiklį yra išvengiama mikrobiologinio užterštumo [33,34].

1.5.2. Ekstrakcija išgrynintu vandeniu

puiki terpė mikroorganizmams daugintis bei vystytis. Ši ypatybė gali neigiamai paveikti gaminamų ekstraktų stabilumą bei kokybę, dėl to atsiranda papildomų pagalbinių medžiagų – konservantų įterpimo poreikis [34].

1.5.3. Ekstrakcija augaliniais aliejais

Ekstrakcija augaliniais aliejais, dar žinoma kaip „žalioji ekstrakcija“, yra inovatyvus bei ekologiškas būdas veikliesiems junginiams iš augalinių žaliavų išgauti. Taikant šį metodą, kaip tirpikliai gali būti naudojami įvairūs augaliniai aliejai - saulėgrąžų, sojų pupelių, alyvuogių, linų sėmenų, kokosų, ryžių sėlenų bei kiti [35]. Augalinio aliejaus, kaip alternatyviojo tirpiklio naudojimas ekstrakcijos procesuose padeda sumažinti ekstrakcijos procesui reikalingos energijos ir tirpiklio sąnaudas, užtikrinti natūralių atsinaujinančiųjų išteklių vartojimą bei saugumą tiek aplinkai, tiek žmogui. Vykdant ekstrakciją augaliniais aliejais yra gaunamas aukštos kokybės, saugus produktas - ekstraktas, kurio sudėtyje nėra denatūravusių veikliųjų junginių ar papildomų teršalų [36]. Svarbu yra paminėti ir tai, kad augaliniai aliejai pasižymi barjerinėmis funkcijomis prieš deguonį - dėl to prailgėja ekstrakte esančių aktyviųjų junginių oksidacijos laikas bei sumažėja jų skilimo greitis. Pagrindinis augalinių aliejų minusas yra jų didelis klampumas, dėl kurio augaliniai aliejai pasižymi mažu difuziškumu ir maža ekstrahavimo išeiga net esant aukštai temperatūrai. Siekiant šią problemą išspręsti, ekstrakcija augaliniais aliejais dažniausiai yra vykdoma pasirinkus ekstrakcijos ultragarsu metodą [35].

2. TYRIMO METODAI IR METODIKA

2.1. Naudojamos medžiagos bei įranga

2.1.1. Naudojamos medžiagos

 Medetkų žiedai („Dr. Benedictus“, Lietuva)

 Išgrynintas vanduo (Ph. Eur. 01/2009:0008, LSMU laboratorija)  Etanolis 96% („AB Vilniaus degtinė“)

 Linų sėmenų aliejus, šalto spaudimo (Carl roth, Vokietija)  Follin – Ciocalteau reagentas (Sigma–Aldrich, Šveicarija)  Natrio karbonatas Na2CO3 (Aldrich, Vokietija)

 Aliuminio chloridas AlCl3 (Sigma–Aldrich, Vokietija)

 Acto rūgštis (Sigma–Aldrich, Vokietija)  Želatina (Sigma-Aldrich, Vokietija)  Glicerolis (Sigma-Aldrich, Vokietija)

 Kakavos sviestas (Henry Lamotte GmbH, Vokietija)  Lanolinas, bevandenis (Sigma-Aldrich, Vokietija)  Bičių vaškas, valytas (UAB „Bičių korys“, Lietuva)  Propilenglikolis (Carl Roth GmbH, Vokietija)

 Polietilenglikolis 400, 4000 (Applichem GmbH, Vokietija)  Celiuliozės membranos (Sigma–Aldrich, JAV)

2.1.2. Naudojama įranga

 Analitinės svarstyklės SBC–31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)  Ultragarso vonelė (VWR ultrasonic cleaner USC–THD)

 Magnetinė maišyklė (Wise Stir MSH-20D)  Vandens vonelė

 Vertikalios modifikuotos celės

2.2. Ekstraktų gamyba

2.2.1. Etanolinių ekstraktų gamyba

Etanoliniai ekstraktai gaminami iš medetkų žiedų augalinės žaliavos, užpilant ją skirtingos koncentracijos – 50%, 70% bei 96% etanoliu, santykiu 1:10 (5 g augalinės žaliavos ir 50 ml atitinkamos koncentracijos etanolio). Ekstraktai gaminti dviem būdais: maceracijos bei ekstrakcijos ultragarsu. Taikant šias skirtingas metodikas, svarbu atkreipti dėmesį į ekstrakcijos procesui taikytas sąlygas (temperatūrą, ekstrakcijos laiką).

1 lentelė. Ekstrakcijos metodų parametrai

Maceracija Ekstrakcija ultragarsu

Temperatūra Kambario temperatūra 30°C

Trukmė 1 savaitė 30, 40, 50 ir 60 min.

Papildomos sąlygos - Ultragarso vonelės dažnis: 9 W

2.2.1.1. Ekstrakcija maceracijos metodu

savaitei paliekamas stovėti kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Po savaitės ekstraktas nufiltruojamas naudojant dvigubos marlės filtrą (siekiant išvengti priemaišų), sandariai uždengiamas ir laikomas tamsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje, esant kambario temperatūrai.

2.2.1.2. Ekstrakcija ultragarso metodu

Ekstrakto paruošimui taikant ekstrakcijos ultragarsu metodą, tikslus susmulkintos augalinės žaliavos svėrinys yra dedamas į stiklinį indą su kaitinimo žyme ir užpilamas etanoliu (50% koncentracijos). Mišinys sumaišomas, kad etanolis tolygiai apsemtų augalinę žaliavą, patalpinamas į ultragarso vonelę VWR ultrasonic cleaner USC–THD ir vykdoma ekstrakcija 30°C temperatūroje, atitinkamai 30, 40, 50 ir 60 min. Ultragarso vonelės dažnis – 9 W. Po to, kaip ir vykdant ekstrakciją maceracijos metodu, ekstraktas yra nufiltruojamas naudojant dvigubos marlės filtrą, sandariai uždengiamas ir laikomas tamsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje, esant kambario temperatūrai.

1 pav. Etanoliniai ekstraktai, pagaminti maceracijos metodu

2.2.2. Aliejinio ekstrakto gamyba

Aliejinius ekstraktus gaminant ekstrakcijos ultragarsu metodu, tikslus medetkos žiedų augalinės žaliavos svėrinys patalpinamas į stiklinį indą su kaitinimo žyme ir užpilamas linų sėmenų aliejumi. Mišinys sumaišomas, kad aliejus tolygiai apsemtų augalinę žaliavą, patalpinamas į ultragarso vonelę VWR ultrasonic cleaner USC-THD ir vykdoma ekstrakcija 30°C temperatūroje, atitinkamai 20, 30, 40, 50 ir 60 min. Ultragarso vonelės dažnis – 9 W. Po to, ekstraktas yra nufiltruojamas naudojant dvigubos marlės filtrą, sandariai uždengiamas ir laikomas tamsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje, esant kambario temperatūrai.

.

2.2.3. Vandeninio ekstrakto gamyba

Vandeninis ekstraktas buvo gaminamas pasirinkus ekstrakcijos ultragarsu metodą. Medetkų žiedų augalinė žaliava užpilama išgrynintuoju vandeniu, santykiu 1:10 (5 g augalinės žaliavos ir 50 ml išgrynintojo vandens), siekiant palyginti išekstrahuojamų junginių kiekybinius rezultatus su kitų tiriamųjų ekstraktų rezultatais.

Tikslus medetkų žiedų augalinės žaliavos svėrinys patalpinamas i stiklinį indą su kaitinimo žyme ir užpilamas išgrynintuoju vandeniu. Mišinys sumaišomas, kad vanduo tolygiai apsemtų augalinę žaliavą, patalpinamas į ultragarso vonelę VWR ultrasonic cleaner USC-THD ir vykdoma ekstrakcija 30°C temperatūroje, atitinkamai 20, 30, 40, 50 ir 60 min. Ultragarso vonelės dažnis – 9 W. Po to, ekstraktas yra nufiltruojamas naudojant dvigubos marlės filtrą į sterilų indą, sandariai uždengiamas ir laikomas vėsioje (4°C), nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje.

Bendram karotinoidų kiekiui nustatyti yra imama po 1 ml medetkų žiedų etanolinio ekstrakto (50%, 70% bei 96% koncentracijos etanolio), tos pačios koncentracijos etanoliu 5 ml matavimo kolbutėje skiedžiama iki žymės, išmaišoma ir Aligent 8453 UV–Vis spektrofotometru matuojama bangos sugertis prie 664 nm (chlorofilui a), 649 nm (chlorofilui b) bei 470 nm (karotinoidams) bangos ilgių. Palyginamasis tirpalas – atitinkamos ekstraktui koncentracijos etanolis [39]. Visi mėginiai buvo tiriami 3 kartus, vedamas rezultatų aritmetinis vidurkis. Pagal gautus rezultatus chlorofilui a, chlorofilui b, bei bendram karotinoidų kiekiui nustatyti (μg/ml) buvo naudojamos žemiau pateiktos formulės:

𝐶𝑎= 13,36 × 𝐴664 − 5,19 × 𝐴649

𝐶_𝑏 = 27,43 × 𝐴₆₄₉− 8,12 × 𝐴₆₆₄

𝐶_{𝑘𝑎𝑟𝑜𝑡𝑖𝑛𝑜𝑖𝑑𝑎𝑖} =1000 × 𝐴470− 2,13 × 𝐶𝑎− 97,63 × 𝐶𝑏 209

2.4. Fenolinių junginių kiekio nustatymas ekstraktuose

Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti yra naudojamas standartinis Follin-Ciocalteau metodas. Į stiklinį indą įpilama 2,5 ml distiliuoto vandens, 0,1 ml tiriamojo ekstrakto, 0,1 ml 2 N Follin-Ciocalteau reagento ir išmaišoma. Praėjus 6 min įpilama 0,5 ml 20% vandeninio Na2CO3 tirpalo

ir paliekama 30 min stovėti kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Įvykus reakcijai, Aligent 8453 UV–Vis spektrofotometru matuojama absorbcija prie 765 nm bangos ilgio. Tuščias bandinys ruošiamas su 0,1 ml atitinkamo ekstrakcijai naudoto tirpiklio vietoje ekstrakto [40]. Visi mėginiai tiriami 3 kartus, vedamas rezultatų aritmetinis vidurkis. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas naudojant galo rūgšties kalibracinį grafiką ir išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) mg/ml.

šios dvi fazės atskiriamos ir tyrimuose naudojama etanolinė fazė. Vandeninių ir etanolinių ekstraktų atveju, prieš atliekant bendrojo fenolinių junginių kiekio tyrimą, papildomų veiksmų atlikti nereikia.

2.5. Flavonoidų kiekio nustatymas ekstraktuose

Bendras flavonoidų kiekis yra nustatinėjamas AlCl3 kolorimetriniu metodu. 5 ml tiriamojo

ekstrakto patalpinami į 25 ml matavimo kolbutę ir skiedžiami atitinkamu ekstrakcijai naudotu tirpikliu iki žymės. Imamas 1 ml šio tirpalo, dar kartą skiedžiamas 10 ml tuo pačiu ekstrakcijai naudotu tirpikliu, pilami 2 ml 2% AlCl3 etanolinio tirpalo ir 1 lašas praskiestos acto rūgšties (30%), išmaišoma.

Gautas mišinys paliekamas 20 min stovėti kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Po to, šis mišinys skiedžiamas atitinkamu ekstrakcijai naudotu tirpikliu iki žymės (25 ml) ir tuomet Aligent 8453 UV–Vis spektrofotometru matuojama bangos sugertis prie 407 nm bangos ilgio [41]. Visi mėginiai tiriami 3 kartus, vedamas rezultatų aritmetinis vidurkis. Bendras flavonoidų kiekis nustatomas naudojant rutino kalibracinį grafiką ir išreiškiamas rutino ekvivalentu (RE) mg/ml.

2 pav. Atliekami tiriamųjų ekstraktų skiedimai prieš matuojant šviesos sugertį

2.6. Vaginalinių žvakučių gamyba

2.6.1. Kakavos sviesto pagrindo vaginalinių žvakučių gamyba

3 pav. Lipofilinio pagrindo vaginalinės žvakutės, pagamintos liejimo būdu Nr. 1 - KS1, Nr. 2 - KS2, Nr. 3 - KS3, Nr. 4 - KS4

Kakavos sviesto žvakutės buvo gaminamos pasirinkus 4 skirtingas formuluotes, siekiant įvertinti pagalbinių medžiagų įtaką veikliosios medžiagos (šiuo atveju – vandeninio medetkos žiedų augalinės žaliavos ekstrakto) atpalaidavimui.

2 lentelė. Vaginalinių kakavos sviesto žvakučių sudėtys

Formuluotė Kakavos sviestas Ekstraktas Lanolinas (bevandenis) Bičių vaškas (valytas) KS1 95% 5% - - KS2 94% 5% - 1% KS3 94% 5% 1% - KS4 93% 5% 1 % 1%

2.6.2. Želatinos-glicerolio pagrindo vaginalinių žvakučių gamyba

augalinės žaliavos ekstrakto, lėkštelė nukeliama nuo vandens vonios, masė kruopščiai išmaišoma. Gamyboje naudojamas vandeninio ekstrakto kiekis yra išskaičiuojamas iš gamybos procesui reikalingo išgryninto vandens kiekio (siekiant išlaikyti žvakučių pagrindui būdingas savybes). Masės netektis (dėl nugaravimo šildant) yra kompensuojama išgrynintu vandeniu. Masei atvėsus ir pakankamai sutirštėjus, ji yra išpilstoma į žvakučių liejimo formas ir paliekama stingti šaldytuve (4°C temperatūroje). Kaip ir gaminant kakavos sviesto žvakutes, į žvakučių masės pagrindą įterpiama 5% vandeninio medetkų žiedų augalinės žaliavos ekstrakto, siekiant palyginti, iš kurio pagrindo atsipalaiduoja didesnis veikliosios medžiagos kiekis.

2.6.3. Želatinos-glicerolio-propilenglikolio pagrindo vaginalinių žvakučių gamyba

Želatinos-glicerolio-propilenglikolio žvakutės yra gaminamos liejimo būdu. Šį pagrindą sudaro 14% želatinos, 6% glicerolio, 40% propilenglikolio bei 40% išgryninto vandens [42]. Gamybos technologija yra labai panaši kaip ir želatinos-glicerolio žvakučių atveju. Pasveriamas tikslus želatinos kiekis yra dedamas į porcelianinę lėkštelę, užpilamas dalimi išgryninto vandens ir pusvalandžiui paliekama brinkti. Želatinai išbrinkus, į porcelianinę lėkštelę supilamas reikiamas kiekis glicerolio, propilenglikolio bei likusi dalis išgryninto vandens. Mišinys dedamas šildyti ant vandens vonios, esant 70°C temperatūrai, maišoma. Kuomet medžiagos išsilydo ir gaunamas skaidrus, klampus skystis – automatine pipete atmatuojamas ir supilamas tikslus kiekis vandeninio medetkų žiedų augalinės žaliavos ekstrakto, lėkštelė nukeliama nuo vandens vonios, masė kruopščiai išmaišoma. Gamyboje naudojamas vandeninio ekstrakto kiekis yra išskaičiuojamas iš gamybos procesui reikalingo išgryninto vandens kiekio. Masės netektis (dėl nugaravimo šildant) yra kompensuojama išgrynintu vandeniu. Masei atvėsus ir pradėjus tirštėti ji yra išpilstoma į žvakučių liejimo formeles ir paliekama šaldytuve sustingti. Kaip ir visų kitų anksčiau minėtų formuluočių atveju – į pagrindą buvo įterpiama 5% vandeninio medetkų žiedų augalinės žaliavos ekstrakto.

Polietilenglikolio (PEG) žvakutės yra gaminamos liejimo būdu. Žvakučių gamybai buvo pasirinkti PEG 400 ir PEG 4000, santykiu 1:1. Analitinėmis svarstyklėmis pasveriami tikslūs PEG 400 ir PEG 4000 kiekiai, medžiagos dedamos į porcelianinę lėkštelę ir šis mišinys šildomas ant vandens vonios, esant 70°C temperatūrai. Pagrindui išsilydžius iki skystos, bespalvės, skaidrios masės, į jį įterpiama 5% vandeninio medetkų žiedų augalinės žaliavos ekstrakto, porcelianinė lėkštelė nukeliama nuo vandens vonios ir joje esantis turinys kruopščiai išmaišomas. Masei atvėsus ir pakankamai sutirštėjus, ji išpilstoma į žvakučių liejimo formeles, siekiant išlaikyti tolygų veikliosios medžiagos pasiskirstymą pagrinde. Gautos žvakutės paliekamos stingti šaldytuve (4°C temperatūroje).

4 pav. Hidrofilinio pagrindo vaginalinės žvakutės, pagamintos liejimo būdu Nr. 1 - ŽG, Nr. 2 - ŽGP, Nr. 3 - PEG

Vaginalinės žvakutės hidrofiliniais pagrindais buvo gaminamos pasirinkus 3 skirtingas formuluotes, siekiant įvertinti pagrindo medžiagų įtaką veikliosios medžiagos (vandeninio medetkos žiedų augalinės žaliavos ekstrakto) atpalaidavimui.

3 lentelė. Hidrofilinio pagrindo vaginalinių žvakučių sudėtys

Formuluotė Ekstraktas Želatina Glicerolis Išgrynintas

2.7. Vaginalinių žvakučių kokybės vertinimas taikant biofarmacinius tyrimus in

vitro

2.7.1. Masės vienodumo tyrimas

Vaginalinių žvakučių masės vienodumo tyrimas atliekamas taikant farmakopėjinį vienadozių preparatų masės vienodumo tyrimą (Ph. Eur. 01/2008, 2.9.5.). Šis tyrimas yra skirtas kietų vienadozių vaistinių preparatų kokybei įvertinti. Analitinėmis svarstyklėmis pasveriama 20-ties atsitiktinai parinktų vaginalinių žvakučių bendra masė, apskaičiuojamas 1 žvakutės masės aritmetinis vidurkis ir kiekviena tiriamoji vaginalinė žvakutė sveriama atskirai. Tiriamosios vaginalinės žvakutės yra kokybiškos, jeigu ne mažiau kaip 18-os žvakučių individuali masė neviršija 5% masės nuokrypio ir jeigu nei viena žvakutė neviršija daugiau nei 10% masės nuokrypio nuo bendros žvakučių masės aritmetinio vidurkio.

2.7.2. Vaginalinių žvakučių suirimo ir fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimas in

vitro

mėginio tūris – 1 ml, kuris po to kompensuojamas tokiu pat tūriu šviežios akceptorinės terpės. Atpalaiduotų fenolinių junginių kiekis mėginiuose nustatomas taikant standartinį Follin-Ciocalteau metodą, kaip ir nustatinėjant fenolinių junginių kiekį ekstraktuose.

Vaginalinių žvakučių suirimo tyrimas in vitro atliekamas taikant farmakopėjinį supozitorijų ir ovulių suirimo testą (Ph. Eur. 01/2008, 2.9.2.). Šiam tyrimui atlikti taip pat gali būti naudojamas dializės vertikaliose modifikuotose celėse per pusiau pralaidžią membraną metodas. Atliekant tyrimą, fiksuojamas laiko intervalas tarp vaginalinės žvakutės patalpinimo į difuzinę celę ir vaginalinės žvakutės suirimo. Žvakutė laikoma suirusia, kuomet dializės vamzdelyje nebelieka akimi matomų dalelių. Remiantis Europos Farmakopėja (Ph. Eur. 01/2008, 2.9.2.), žvakutės lipofiliniu pagrindu turi suirti ne ilgiau kaip per 30 min., hidrofiliniu – ne ilgiau kaip per 60 min.

2.8. Statistinė rezultatų analizė

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Ekstrakcijos metodo bei tirpiklio parinkimas. Skirtingų ekstraktų palyginimas

3.1.1. Karotinoidų kiekio ekstraktuose priklausomybės nuo ekstrakcijai

naudojamo tirpiklio koncentracijos vertinimas

Bendras karotinoidų kiekis buvo tiriamas ekstraktuose, kurių gamybai kaip ekstrahentas buvo naudojamas skirtingų koncentracijų etanolis (50%, 70% ir 96%). Tyrimo tikslas buvo nustatyti, kokios koncentracijos etanolis išekstrahuoja didesnį bendrąjį karotinoidų kiekį, gaminant ekstraktus maceracijos metodu. Atliekant šį tyrimą, taip pat yra nustatomas ir chlorofilo a bei chlorofilo b kiekis. Nustatymas atliekamas spektrofotometriškai matuojant šviesos sugertį, esant skirtingiems bangos ilgiams (chlorofilui a – 664 nm, chlorofilui b – 649 nm, bendram karotinoidų kiekiui – 470 nm).

4 lentelė. Karotinoidų kiekio ekstraktuose priklausomybė nuo ekstrakcijos tirpiklio (etanolio) koncentracijos

Ekstrahentas Karotinoidų kiekis pagaminus ekstraktą Karotinoidų kiekis po mėnesio

Ca, μg/ml Cb, μg/ml Ckarotinoidai, μg/ml Cb, μg/ml Ca, μg/ml Ckarotinoidai, μg/ml

96% etanolis 7,57 3,66 6,09 6,94 2,49 4,26

70% etanolis 3,34 2,97 6,36 3,6 2,82 5,22

50% etanolis 2,54 4,76 7,66 1,88 3,36 7,28

3.1.2. Bendrojo fenolinių junginių kiekio palyginimas ekstraktuose, pagamintuose

skirtingais ekstrakcijos metodais

Bendras fenolinių junginių kiekis buvo tiriamas etanoliniuose ekstraktuose, pagamintuose dviem skirtingais metodais – maceracijos ir ekstrakcijos ultragarsu. Tyrimo tikslas buvo nustatyti, kurio iš ekstrakcijos metodų pagalba yra gaunamas didesnis bendras fenolinių junginių kiekis. Vykdant ekstrakciją maceracijos metodu, kaip ekstrahentas buvo naudojamas skirtingų koncentracijų etanolis (50%, 70% ir 96%), kad papildomai būtų galima įvertinti, kuris iš jų išekstrahuoja didesnį kiekį fenolinių junginių. Vykdant ekstrakciją ultragarso metodu, kintamasis buvo ekstrakcijos ultragarsu laikas, kad būtų galima nustatyti, kiek laiko medetkos žiedų augalinės žaliavos ir etanolio mišinį veikiant ultragarsu yra išekstrahuojamas didesnis fenolinių junginių kiekis. Kaip ekstrahentas buvo pasirinktas 50% etanolis, kadangi gaminant ekstraktus maceracijos metodu jis pasižymėjo didesniu išekstrahuojamų junginių kiekiu. Bendras fenolinių junginių kiekis pagamintuose ekstraktuose nustatinėjamas spektrofotometriškai prie 765 nm bangos ilgio bei išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) mg/ml., naudojant galo rūgšties kalibracinę kreivę.

5 pav. Bendrojo fenolinių junginių kiekio ekstraktuose priklausomybė nuo ekstrakcijos metodo. n=3

3,18 2,31 2,95 3,07 3,55 2,24 1,72 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Maceracija EU 30 min EU 40 min EU 50 min EU 60 min

Analizuojant maceracijos metodu pagamintų etanolinių ekstraktų rezultatus matoma, kad ekstrahentas 50% etanolis išekstrahuoja didesnį kiekį (3,18 mg/ml) fenolinių junginių, lyginant su 70% (2,24 mg/ml) ir 96% (1,72 mg/ml) etanoliu. Pastebimas dėsningumas, kad didėjant etanolio koncentracijai išekstrahuojamų fenolinių junginių kiekis mažėja. Analizuojant ultragarso metodu pagamintų etanolinių ekstraktų rezultatus matoma, kad vykdant ekstrakciją ultragarsu 60 min., yra išekstrahuojamas didesnis bendras fenolinių junginių kiekis (3,55 mg/ml), lyginant su kitais laiko intervalais (30, 40 ir 50 min). Lyginant maceracijos ir ekstrakcijos ultragarsu metodus tarpusavyje matoma, kad etanolinių ekstraktų gamybai taikant ekstrakcijos ultragarsu metodą 60 min., yra gaunamas panašus, visgi didesnis (3,55 mg/ml) kiekis fenolinių junginių, nei 50% etanoliniame ekstrakte, pagamintame maceracijos metodu (3,18 mg/ml). Tai leidžia daryti prielaidą, kad abiejų metodų – tiek maceracijos, tiek ekstrakcijos ultragarsu efektyvumas yra panašus (šiuo atveju ekstrakcijos ultragarsu - didesnis).

Rezultatų aptarimas. Both S. ir kt. 2013 metais atliko panašaus pobūdžio tyrimą, kurio tikslas buvo palyginti maceracijos bei ekstrakcijos ultragarsu efektyvumą, vykdant fenolinių junginių ekstrakciją iš juodosios arbatos žaliavos. Tyrimo rezultatai parodė, kad ultragarso metodu pagaminti 96% ir 10% etanoliniai ekstraktai pasižymėjo reikšmingai didesniu (p<0,05) kiekiu fenolinių junginių, lyginant su maceracijos metodu pagamintais ekstraktais, atitinkamai naudojant tuos pačius tirpiklius. Lyginant tirpiklių efektyvumą, didesne ekstrakcijos geba pasižymėjo etanolio ir išgryninto vandens mišinys (10% etanolis) [43]. Šie rezultatai atspindi panašias fenolinių junginių ekstrakcijos tendencijas tarp maceracijos ir ekstrakcijos ultragarsu kaip ir šiame tiriamajame darbe. Tai leidžia pagrįsti faktą, kad fenolinių junginių ekstrakcijai taikant ekstrakcijos ultragarsu metodą yra išekstrahuojamas didesnis kiekis fenolinių junginių, nei maceracijos atveju.

3.1.3. Bendrojo flavonoidų kiekio palyginimas ekstraktuose, pagamintuose

skirtingais ekstrakcijos metodais

galima nustatyti, kiek laiko medetkos žiedų augalinės žaliavos ir etanolio mišinį veikiant ultragarsu yra išekstrahuojamas didesnis flavonoidų kiekis. Kaip ekstrahentas buvo pasirinktas 50% etanolis, kadangi gaminant ekstraktus maceracijos metodu jis pasižymėjo didesniu išekstrahuojamų junginių kiekiu. Bendras flavonoidų kiekis nustatomas spektrofotometriškai prie 407 nm bangos ilgio bei išreiškiamas rutino ekvivalentu (RE) mg/ml., naudojant rutino kalibracinę kreivę.

6 pav. Bendrojo flavonoidų kiekio ekstraktuose priklausomybė nuo ekstrakcijos metodo. n=3

Analizuojant maceracijos metodu pagamintų etanolinių ekstraktų rezultatus matoma, kad ekstrahentas 50% etanolis išekstrahuoja didesnį kiekį (0,31 mg/ml) flavonoidų, lyginant su 70% (0,25 mg/ml) ir 96% (0,10 mg/ml) etanoliu. Pastebimas dėsningumas, kad didėjant etanolio koncentracijai išekstrahuojamų flavonoidų kiekis mažėja. Analizuojant ultragarso metodu pagamintų etanolinių ekstraktų rezultatus matoma, kad vykdant ekstrakciją ultragarsu 50 min., yra išekstrahuojamas didesnis bendras flavonoidų kiekis (0,25 mg/ml), lyginant su kitais laiko intervalais (30, 40 ir 60min.). Lyginant maceracijos ir ekstrakcijos ultragarsu metodus tarpusavyje matoma, kad etanolinių ekstraktų gamybai taikant ekstrakcijos ultragarsu metodą 50 min., yra gaunamas panašus, visgi mažesnis (0,25 mg/ml) bendras flavonoidų kiekis, nei 50% etanoliniame ekstrakte, pagamintame maceracijos metodu (0,31 mg/ml). Tai leidžia daryti prielaidą, kad abiejų metodų – tiek maceracijos, tiek ekstrakcijos ultragarsu efektyvumas yra panašus (šiuo atveju maceracijos - didesnis).

0,31 0,17 0,21 0,25 0,24 0,25 0,1 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Maceracija EU 30 min EU 40 min EU 50 min EU 60 min