DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE

(1)

DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio analizė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu“:

1. Yra atliktas manęs pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(2)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

SIMONA ADOMAVIČIŪTĖ

AMOKSICILINO, KLARITROMICINO IR OMEPRAZOLO

MIŠINIO ANALIZĖ EFEKTYVIOSIOS PLONASLUOKSNĖS

CHROMATOGRAFIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Doc. dr. Augusta Ževžikovienė

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr., Ramunė Morkūnienė Data

AMOKSICILINO, KLARITROMICINO IR OMEPRAZOLO

MIŠINIO ANALIZĖ EFEKTYVIOSIOS PLONASLUOKSNĖS

CHROMATOGRAFIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Doc. dr. Augusta Ževžikovienė

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė Simona Adomavičiūtė

(5)

TURINYS

SANTRAUKA 4

SUMMARY 5

SANTRUMPOS 7

ĮVADAS 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA 10

1.1. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vartojimo paplitimas 10 1.1.1 Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vartojimo paplitimas Lietuvoje 10 1.1.2 Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vartojimo Baltijos šalyse palyginimas 12

1.2 Bendros žinios apie tiriamas vaistines medžiagas 15

1.2.1 Amoksicilinas 15

1.2.2 Klaritromicinas 15

1.2.3 Omeprazolas 16

1.3 Falsifikuoti amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vaistiniai preparatai 17

1.4 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija 18

1.4.1 EPC klasifikacija ir stacionarios fazės 19

1.4.2 EPC mobilios fazės 20

1.4.3 Amoksicilino analizė EPC 21

1.4.4 Omeprazolo analizė EPC 22

1.4.5 Klaritromicino analizė EPC 23

2. TYRIMO OBJEKTAS, METODIKA IR METODAI 24

2.1. Tyrimo planavimas 24

2.2. Tyrimo objektas ir metodika 24

2.2.1. Tyrimo objektas 24

2.2.2. Kokybinė ir kiekinė analizė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu 24

2.2.3 Statistinė analizė 27

3. REZULTATAI IR APTARIMAS 28

3.1 Plonasluoksnės chromatografijos metodikos pasirinkimas 28

3.2 Pritaikytos efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos validacija 30 3.3 Vaistų mišinio analizė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu 33

IŠVADOS 35

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS 36

LITERATŪROS SĄRAŠAS 37

(6)

SANTRAUKA

AMOKSICILINO, KLARITROMICINO IR OMEPRAZOLO MIŠINIO ANALIZĖ EFEKTYVIOSIOS PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODU

S. Adomavičiūtės magistro baigiamasis darbas „Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio analizė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu“. Mokslinė vadovė doc. A.

Ževžikovienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020.

Šio darbo tikslas buvo atlikti amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio komponentų kokybinį bei kiekinį tyrimą efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu, po to jį validuoti.

Tyrimo tikslui pasiekti buvo išsikelti šie uždaviniai: modifikuoti ir pritaikyti literatūros šaltiniuose publikuotą efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodiką amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolio mišinio komponentų atskyrimui bei kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui; po pritaikytos metodikos atradimo ją validuoti; atlikti kokybinį ir kiekinį vaistų mišinio įvertinimą tabletėse bei kapsulėse, taikant validuotą efektyviosios plonasluoknės chromatografijos metodiką.

Rezultatai: sukurta EPC metodika, kurios tipriklių sistema yra etilacetatas-metanolis-acto rūgštis (45:50:5), ryškinama plokštelę kaitinant 160℃ 15 minučių ir po to naudojant UV 254 nm bangos ilgio šviesą. Sukurta ir validuota metodika galima sėkmingai ir patikimai identifikuoti amoksiciliną, klaritromiciną ir omeprazolą jų mišinyje bei įvertinti šias vaistines medžiagas kiekiškai.

Išvados: sukurta EPC metodika, kuri tinka amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio pagaminto iš tablečių bei kapsulių kiekinei bei kokybinei analizei.

(7)

SUMMARY

ANALYSIS OF AMOXICILLIN, CLARITHROMYCIN AND OMEPRAZOLE MIXTURE BY HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATHOGRAPHY

S. Adomavičiūtė‘s Master's thesis. Scientific supervisor doc. Augusta Ževžikovienė. Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and

Toxicological Chemistry Department. Kaunas, 2020.

The aim of this thesis was to create and validate a high-performance thin layer chromatography method which would be suitable for qualitative and quantitative assessment of an amoxicillin, clarithromycin and omeprazole mixture.

The three main tasks which were set to reach the goal were to: to modify and apply HPTLC methodology for a qualitative and quantitative assessment of components of the amoxicillin, clarithromycin and omeprazole mixture; validate the modified and applied methodology; perform a qualitative and quantitative assessment of mixture component using the validated HPTLC methodology.

Results: HPTLC methodology was developed using ethyl acetate-methanol-acetic acid (45:50:5) as a solvent system, to visualize the spots the plate was heated on 160 ℃ plate heater for 15 minutes and an UV light was used at 254 nm. The developed and validated methodology can successfully and reliably identify amoxicillin, clarithromycin and omeprazole in their mixture and quantify these active substances.

Conclusions: HPTLC methodology was developed that is suitable for quantitative and qualitative assessment of a mixture of amoxicillin, clarithromycin and omeprazole made from tablets and capsules.

(8)

PADĖKA

Noriu nuoširdžiai padėkoti už konsultacijas magistrinio baigiamojo darbo vadovei doc. A. Ževžikovienei ir už pagalbą bei patarimus vykdant eksperimentus lekt. M. Marksai.

(9)

SANTRUMPOS

ATC – anatominė-terapinė-cheminė (klasifikacija) CDSV - Clostridium difficile susijęs viduriavimas

DDD – (ang. Defined Daily Dose) per metus suvartota vaisto vidutinė dienos dozė EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija

Eur Ph – Europos farmakopėja

GERL – gastroezofaginio refliukso liga IN – inkstų nepakankamumas

LOD – (ang. Limit of detection) identifikavimo riba

LOQ – (ang. Limit of quantification) kiekinio nustatymo riba

LSMU MA – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademija MALT-limfoma – ekstranodalinė marginalinės zonos limfoma

MSK – minimali slopinamoji koncentracija PC – plonasluoksnė chromatografija

PPB – peniciliną prijungiantys baltymai

PPC – preparatyvinė plonasluoksnė chromatografija PSI – protonų siurblio inhibitorius

PSO – pasaulio sveikatos organizacija Rf – sulaikymo rodiklis

R2 – koreliacijos koeficientas SE – santykinė paklaida SD – standartinis nuokrypis

TLR – (ang. Toll-like receptors) Toll tipo receptoriai

UEG – (ang. United European Gastroenterology) Europos gastroenterologų asociacija ULAC – užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras

UPC – ultra plonasluoksnė chromatografija

ŪGEP – ūminė generalizuota egzanteminė pustuliozė ūIN – ūminis inkstų nepakankamumas

(10)

ĮVADAS

Pagal 2018 m. Didžiosios Britanijos ir Irano mokslininkų meta analizės duomenis Helicobacter pylori (H. pylori) bakterija infekuotų žmonių kiekis pasaulyje yra apie 44,3 proc. [53]. Epidemiologiniai tyrimai rodo, kad užsikrėtusiųjų skaičius priklauso nuo regiono socioekonominės padėties. Afrikos žemyne situacija prasčiausia – H. pylori bakteriją nešioja 79 proc. žmonių, tuo tarpu Europoje - apie 30 proc. [25] 2017 metais atlikti epidemiologiniai tyrimai įrodė, kad šia infekcija sergančiųjų skaičius mažėja, tačiau ji vis vien išlieka svarbi problema šiuolaikinėje medicinoje.[25] H. pylori infekcija yra viena pagrindinių priežasčių skrandžio vėžio, skrandžio opaligės ir ekstranodalinės marginalinės zonos limfomos (MALT-limfomos) atsiradimui.[42] Pagal naujausias Europos gastroenterologų ascociacijos UEG gaires amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo kombinacija yra standartinis (pirmos eilės) pasirinkimas gydant šią infekciją.[15]

Triguba terapija, kuri sudaryta iš protonų siurblio inhibitoriaus (PSI), klaritromicino ir amoksicilino H. pylori eradikacijos gydymui taikoma jau daugiau kaip 20 metų. [25] Vis dėlto didėjant antiobiotikų rezistensiškumui pasaulyje, daugelyje šalių užfiksuotas augantis H. pylori atsparumas ir klaritromicinui.[37] Jau po pirmos nesėkmingos šios bakterijos eradikacijos atsparumas klaritromicinui išauga 60 proc. Taip pat prie šių vaistų derinio prijungus metronidazolą gaunamas keturių vaistų derinys, kuris yra skiriamas kaip antraeilis H. pylori gydymas, patyrus nesėkmę po pirmojo šios bakterijos naikinimo.[15]

Atlikus literatūros analizę, nebuvo aptikta nė vienos plonasluoksnės ar efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos skirtos amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišiniui kiekiniam ir/ar kokybiniam įvertinimui. Dėl šios priežasties šiame darbe bus atliekama mišinio analizė pasirinktu efektyviuoju plonasluoksnės chromatografijos metodu, kuris turi plačias pritaikymo galimybes praktikoje ir geba tiksliai ir greitai įvertinti kokybinę bei kiekinę vaistinių medžiagų sudėtį.

Šis mokslinis darbas buvo pristatytas 2020 m. gegužės 8 dieną vykusioje tarptautinėje konferencijoje „International distance conference conttemporary pharmacy: Issues, challenges and expectation“ (1 priedas).

(11)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas - atlikti amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio komponentų kokybinį bei kiekinį tyrimą efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu, jį validuoti.

Uždaviniai:

1. Modifikuoti ir pritaikyti literatūros šaltiniuose publikuotas amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolio kokybinio ir kiekinio įvertinimo efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikas, šių medžiagų mišinio komponentų atskyrimui bei kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui.

2. Validuoti amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolio mišinio kokybinio ir kiekinio įvertinimo metodiką.

3. Atlikti kokybinį ir kiekinį amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo įvertinimą tabletėse bei kapsulėse, taikant validuotą efektyviosios plonasluoknės chromatografijos metodiką.

(12)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vartojimo paplitimas

Omeprazolo, klaritromicino ir amoksicilino kombinacija, pagal Europos gastroenterologijos asociacijos galiojančias gaires yra pirmojo pasirinkimo farmakoterapija gydant Helicobacter pylori infekciją [15]. Šios ligos paplitimas priklauso nuo geografinės padėties, paciento socialinio-ekonominio statuso, rasės ir geno TLR1 polimorfizmo. Taip pat pastebėtas su amžiumi susijęs ligos padažnėjimas. H. pylori bakterija turi būti išnaikinta, jei pacientas turi skrandžio ar dvylikapirštės žarnos opą, MALT limfomą, funkcinę dispepsiją ar kitų virškinimo sistemos ligų, o šios infekcijos gydymo kontraindikacijų nenustatyta. Vaistų suvartojimas Lietuvoje ir kitose pasaulio šalyse dažnai vertinamas ir lyginamas naudojant Pasaulines sveikatos organizacijos (PSO) sukurtą ATC-DDD metodologijją. Pagrindinis rodiklis - DDD, kuris yra skaičius rodantis vaisto suvartojimą. Jis pateikiamas vidutinės terapinės paros dozės skaičiumi, tenkančiu tūkstančiui gyventojų per dieną. DDD išvedamas vaistus suklasifikuojant pagal anatominę-terapinę-cheminę (ATC) klasifikaciją.[31]

1.1.1 Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vartojimo paplitimas Lietuvoje

Lietuvos vaistinių preparatų suvartojimo duomenis renka ir vertina Lietuvos Respublikos Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba prie Sveikatos apsaugos ministerijos (VVKT). Pagal VVKT vaistų suvartojimo 2019 m. ataskaitą virškinimo traktą ir metabolizmą veikiantys vaistai (ATC pirmojo lygmens – A grupė) užėmė trečią vietą ir nusileido tik širdies ir kraujagyslių sistemą bei nervų sistemą veikiantiems vaistams. Ši vaistų grupė sudarė 13 procentų visų parduotų vaistų. Bendras virškinimo traktą ir metabolizmą veikiančių vaistų DDD – 156,69. Vaistai nuo pepsinės opos ir gastroezofaginio refliukso ligos (pagal ATC trečiasis lygmuo – A02B) sudarė apie trečdalį (DDD – 46,45). Omeprazolas, vienas iš trijų šio darbo tiriamųjų vaistų, tarp A02B užėmė pirmąją vietą. Omeprazolo DDD – 24,254. Kiti du tiriamieji preparatai klaritromicinas ir amoksicilinas priklauso J grupei - sistemiškai veikiantiems priešinfekciniams vaistams. Ši grupė pagal suvartojimą užima kiek žemesnę - 9-ąją vietą, jos DDD – 17,99. Amoksicilinas J grupeje yra pirmoje vietoje (DDD – 4,823), klaritromicino DDD beveik tris kartus mažesnis – 1,735.[5]

Per paskutinius 5 metus virškinimo traktą ir metabolizmą veikiančių vaistų suvartojimas bendrai padidėjo (13,39%.). Sumažėjimas matomas tik nuo 2015 iki 2016 metų. 2019 m. J grupės vaistų suvartojimas mažiausias per pastaruosius 5 metus. Šių vaistų buvo išduota 17,69% mažiau lyginant su 2015-aisias. Didžiausias, nors ir neženklus, J grupės vaistų suvartojimo augimas pastebimas 2015-2016 metais (1 lentelė). [5]

(13)

1 lentelė. A ir J grupės vaistų suvartojimas 2015 – 2019 metais Lietuvoje [5] ATC 2015 metai 2016 metai 2017 metai 2018 metai 2019 metai Didėjimas A - Virškinimo traktą ir metabolizmą veikiantys vaistai 126,028 125,946 129,825 138,178 156,690 13,39% J - Sistemiškai veikiantys priešinfekciniai vaistai 21,134 21,652 21,622 21,857 17,99 -17,69%

2 Lentelė. Omeprazolo, klaritromicino, amoksicilino suvartojimas 2014–2019 m. Lietuvoje [5]

ATC Pavadinimas 2015 metai 2016 metai 2017 metai 2018 metai 2019 metai A02BC01 Omeprazolas (DDD 20 mg) 19,245 20,447 21,787 22,144 24,254 J01FA09 Klaritromicinas (DDD 0,5 g/O; 1 g/P) 1,477 1,590 1,680 1,712 1,735 J01CA04 Amoksicilinas (DDD 1 g) 7,822 7,848 7,968 7,764 4,823

2 lentelėje galima matyti omeprazolo, klaritromicino ir amoksicilino suvartojimo pokyčius pagal DDD nuo 2015 iki 2019 metų. Omeprazolo suvartojimas per pastaruosius 5 metus pastoviai augo ir bendrai padidėjo 20,65 procento. Didžiausias augimas stebimas 2018-2019 metais. Klaritromicino suvartojimas taip pat padidėjo, tačiau mažiau – 14,87 proc. Amoksicilino, vienintelio iš trijų vaistų, suvartojimas sumažėjo. Amoksicilino, kaip ir visos J grupės vaistų, 2019 m. suvartojimas mažiausias per paskutinius penkerius metus. 2015-2017 šio vaisto suvartojimas neženkliai augo, o nuo 2017 metų pradėjo mažėti. [5]

Apibendrinus galime teigti, kad virškinimo traktą ir metabolizmą veikiančių vaistų ir suvartojimas augo, o sistemiškai veikiančių priešinfekcinių vaistų - mažėjo. Didžiausias, iš tiriamųjų preparatų, augimas yra omeprazolo, antroje vietoje klaritromicinas. [5]

(14)

1.1.2 Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vartojimo Baltijos šalyse

palyginimas

Siekiant objektyviau įvertinti amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo suvartojimą, buvo įvertinti ir kitų šalių duomenys. Pasirinktos šalys lyginimui- Latvija ir Estija. Bendros sveikatos išlaidos sudarančios BVP Lietuvoje yra 5.7%, Latvijoje 6.3%, Estijoje 6,5%. Bendrosios sveikatos priežiūros išlaidos vienam gyventojui 2017 metais eurais buvo: Lietuvoje - 837, Latvijoje - 1543, Estijoje - 1006. Atsižvelgiant į tokius rodiklius galima sakyti, kad yra racionalu analizuoti ir lyginti šias šalis tarpusavyje ir tai leidžia patikimiau įvertinti vaistų suvartojimo tendencijas. [3]

Lietuvos, Latvijos ir Estijos vaistų suvartojimo duomenys lyginami pagal naujausią 2016-2018 metų Baltijos šalių vaistų suvartojimo suvestinę. Joje pateikiama statistika naudojant ATC/DDD metodologiją. Pagal vaistų suvartojimą Latvijoje ir Estijoje 2018 m. A grupė (virškinimo traktą ir metabolizmą veikiantys vaistai) užėmė antrąją vietą. Lietuvoje tais pačiais metais A grupė buvo trečia. Ją lenkė tik C (širdies ir kraujagyslių sistemą veikiantys vaistai) bei N grupės (nervų sistemą veikiantys vaistai). J grupė – 10 vietoje iš 14 vaistų grupių. [3]

3 Lentelė. A ir J grupės vaistų suvartojimas 2016–2018 m. Baltijos šalyse [3] ATC

kodas

ATC grupė DDD/1000/dieną Pokytis, %

2016 2017 2018

A Virškinimo traktą ir metabolizmą veikiantys vaistai

Lietuva 125.95 129.83 138.17 6

Latvija 117.83 122.50 124.38 2

Estija 137.83 141.56 149.80 6

J Sistemiškai veikiantys priešinfekciniai vaistai

(15)

Latvija 16.81 17.37 17.31

Estija 18.25 18.95 19.58 3

3 lentelėje pateikiami duomenys apie A ir J grupės vaistų suvartojimą 2016–2018 m. Baltijos šalyse. Iš statistikos matoma, kad visais metais A grupės vaistų suvartojimas buvo didesnis 4-6 kartus negu J grupės vaistų. A grupė Latvijoje visais metais turėjo mažiausią DDD, Estijoje - didžiausią. Iš visų 14 vaistų grupių A grupės vaistų suvartojimas per 2016-2018 metus augo labiausiai. Lyginant pagal 2015 metų suvartojimą Lietuvoje ir Estijoje jis išgaugo iki 8%, o Latvijoje – iki 4%. [3]

J grupės vaistų suvartojimas Lietuvoje ir Estijoje, nors neženkliai, tačiau taip pat augo. Lietuvoje jis siekia vos vieną procentą, o Estijoje – 3%, Latvijoje laikoma, kad augimo nebuvo. Tai geras ženklas, nes šis augimas kur kas mažesnis nei 2013-2015 metais. Minėtuoju periodu Lietuvoje J grupės vaistų suvartojimo augimas buvo– 6 proc., Latvijoje – 7 proc., o Estijoje – 4 proc. Iš to galima daryti prielaidą, kad Baltijos šalių gydytojai atsižvelgia į PSO rekomendacijas mažinti antibiotikų skyrimą. [3]

4 Lentelė. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo suvartojimas 2016–2018 m. Baltijos šalyse [3]

ATC kodas Pavadinimas DDD/1000/dieną Pokytis, %

2016 2017 2018 J01CA04 Amoksicilinas Lietuva 7.85 7.97 7.76 -3 Latvija 2.95 3.11 2.79 -10 Estija 1.69 1.64 1.65 1 J01FA09 Klaritromicinas Lietuva 1.59 1.68 1.71 2 Latvija 1.67 1.82 1.92 6 Estija 1.64 1.69 1.75 4

(16)

A02BC01 Omeprazolas

Lietuva 20.45 21.79 22.14 2

Latvija 26.73 27.41 28.17 3

Estija 27.36 26.90 28.27 5

4 lentelėje pateikiami duomenys apie amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo suvartojimą 2016–2018 m. Baltijos šalyse. Statistika rodo, kad Lietuvoje ir Latvijoje amoksicilino suvartojimas sumažėjo - 3 ir 10 procentų, atitinkamai. Estijoje, kuriuoje 2-3 kartais mažesnis amoksicilino suvartojimas nei kitose Baltijos šalyse, suvartojimas praktiškai nesikeitė.[3]

Klaritromicino suvartojimas visose Baltijos šalyse panašus. Lietuvoje, kaip ir kitose šalyse klairtromicino suvartojimas neženkliai augo kiekvienais metais. Didžiausias augimas užfiksuotas Latvijoje, kuris sieka 6 proc., o mažiausias Lietuvoje – 2 proc. Jau nuo 2015 metų Lietuva yra mažiausiai klaritromicino suvartojanti Baltijos šalis.[3]

Omeprazolo DDD Lietuvoje, Latvijoje ir Estijoje yra gana panašus ir pamažu augantis. Mažiausias suvartojimas ir augimas yra Lietuvoje, didžiausias - Estijoje. Omeprazolas lyginant su kitais PPI visose Baltijos šalyse yra populiariausias. Pantoprazolo ir esomeprazolo, kurie dalinasi 2-3 vietas, DDD yra apie tris kartus mažesnis visose šalyse. [3]

Iš visų duomenų matyti, kad virškinimo traktą ir metabolizmą veikiančių ir sistemiškai veikiančių priešinfekcinių vaistų suvartojimas Lietuvoje, Latvijoje ir Estijoje 2016-2018 metais augo. Visais metais A grupės vaistų suvartojimas buvo didžiausias Estijoje, bet J grupės – Lietuvoje. Amoksicilino suvartojimas Lietuvoje ženkliai didesnis nei kitų Baltijos šalių, bet matomas nedidelis prieaugio mažėjimas. Visose šalyse įsigijamas panašus omeprazolo ir klaritromicino kiekis, bet mažiausiai Lietuvoje.[3]

(17)

1.2 Bendros žinios apie tiriamas vaistines medžiagas

1.2.1 Amoksicilinas

Empirinė formulė: C16H19N3O5S

Molekulinė masė: 1365.404 g/mol.

IUPAC pavadinimas: (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-(4-hidroksifenil)acetil]amino]-3,3-dimetil-7-okso-4-tia-1-azabiciclo[3.2.0]heptano-2-karboksi rūgštis.

Savybės: baltos ar beveik baltos spalvos, silpno kvapo, kartaus skonio kristaliniai milteliai. Tirpūs vandenyje, metanolyje ir etanolyje, netirpūs ar beveik netirpūs benzene, acetonitrile, trichlormetane, etilacetate.

Prekiniai (firminiai) pavadinimai, registruoti Lietuvoje: Amoksiklav, Amoxicillin/Clavulanic acid Actavis, Amoxicillin/Clavulanic acid Ingen Pharma, Amoxicillin/Clavulanic acid Siromed, Amoxicillin/Clavulanic acid SUN, Augmentin, ENHANCIN, MEDOCLAV, MEDOCLAV FORTE, Betaklav (amoksicilinias derinyje su klavulano r.), BACTOX, Hiconcil, Ospamox, PAN-AMOXICILLIN.

Vaisto forma: plėvele dengtos tabletės, disperguojamosios tabletės, milteliai geriamajai suspensijai, milteliai injekciniam ar infuziniam tirpalui, milteliai geriamajai suspensijai, tabletės, kietosios kapsulės. Dozės: Nuo 125 iki 3000 mg per parą . [4]

(18)

Empirinė formulė: C38H69NO13.

IUPAC pavadinimas: (3R,4S,5S,6R,7R,9R,11R,12R,13S,14R)-6-[(2S,3R,4S,6R)-4-(dimetilamino)-3- hidroksi-6-metiloksan-2-il]oksi-14-etil-12,13-dihidroksi-4-[(2R,4R,5S,6S)-5-hidroksi-4-metoksi-4,6-dimetiloksan-2-il]oksi-7-metoksi-3,5,7,9,11,13-heksametil-oksaciclotetradekano-2,10-dionas

Savybės: balti arba beveik balti kristaliniai milteliai, beveik netirpūs vandenyje, tirpūs acetone ir metileno chloride, mažai tirpūs metanolyje.

Prekiniai (firminiai) pavadinimai, registruoti Lietuvoje: Clarithromycin Actiopharma, CLARITHROMYCIN GRINDEKS, Clarithromycin Hikma, Clarithromycin Ingen Pharma, Clarithromycin-Teva, Fromilid, Klacid, KLERIMED, Lekoklar, Maxilin.

Vaisto forma: plėvele dengtos tabletės, milteliai infuziniam tirpalui, granulės geriamajai suspensijai, milteliai infuziniam tirpalui, modifikuoto atpalaidavimo tabletės.

Dozės: Nuo 125 iki 1000 mg per parą. [4]

1.2.3 Omeprazolas

Empirinė formulė: C17H19N3O3S

IUPAC pavadinimas: 6-metoksi-2-[(4-metoksi-3,5-dimetilpiridin-2-il)metilsulfinil]-1H-benzimidazolas

Savybės: balti ar beveik balti kristaliniai milteliai, lengvai tirpūs metanolyje ir etanolyje, mažai tirpūs propanolyje ir acetone, beveik netirpūs vandenyje.

Prekiniai (firminiai) pavadinimai, registruoti Lietuvoje: DIOMPRAZ (derinyje su diklofenako natrio druska), Gasec, Omediprol, Omep, Omep Uno, Omeprazol Actavis, Omeprazol ratiopharm, Omeprazol Sandoz, Omeprazole Grindeks, Omeprazole Inteli, Omeprazole STADA, Omeprazole Teva, Omeprazole-ratiopharm, REMOSTAR, Ultop, Ulzac.

Vaisto forma: modifikuoto atpalaidavimo kietosios kapsulės, skrandyje neirios tabletės, skrandyje neirios kietosios kapsulės, milteliai infuziniam tirpalui, kietosios kapsulės.

(19)

1.3 Falsifikuoti amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo vaistiniai preparatai

Pagal LR Farmacijos įstatymą X-709 ,,falsifikuotais vaistiniais preparatais laikomi produktai, kurie yra sąmoningai apgaulės tikslu neteisingai paženklinti, atsižvelgiant į jų tapatybę ir (ar) kilmę.“ [1] Manoma, kad vakarų šalyse apie 1 procentas visų parduodamų vaistinių preparatų yra falsifikatai, tačiau kai kuriose besivystančiose šalyse šis skaičius sieka 50 procentų.[23]

Falsifikuoti vaistiniai preparatai yra laikomi augančia grėsme. PSO skaičiavimais apie pusę internetu parduodamų vaistinių preparatų yra falsifikuoti. Daugiausiai tokių preparatų yra gaminama Kinijoje, Indijoje bei Lotynų Amerikoje – šalyse kuriose gausu pigios darbo jėgos. Daugiausiai parduodama – Afrikoje, Azijoje ir Lotynų Amerikoje.[6]

Didžiausią grėsmę falsifikuoti vaistiniai preparatai kelia pacientams. Kokybės ir saugumo reikalavimų neatitinkančių vaistų vartojimas dažnai ne tik negydo paciento ligos, tačiau ir gali sukelti sunkių nepageidaujamų reiškinių. Tokių atvejų daug, vienas iš pavyzdžių yra 2016 metais Italijoje aprašyti klinikiniai atvejai, kuomet pacientams vartojusiems falsifikuotą maisto papildą, sudėtyje turinčio sildenafilo, atsirado laikina amnezija.[11] Kitas pavyzdys yra falsifikuoto alprazolamo atvejai 2016 metais JAV. Kalifornijoje gydytojai užfiksavo 16 klinikinių atvejų, kuomet vartojus nelegaliai įsigytą alprazolamą keli pacientai mirė, daliai pacientų buvo sukeltas ūmus inkstų nepakankamumas, rabdomiolizė ir/ar išeminė širdies liga. Šio preparato sudėtyje be alprazolamo buvo aptikta ir fentanilio bei etizolamo. Manoma, kad tai ir sukėlė sunkias nepageidaujamas reakcijas.[8]

2012 metų prancūzų mokslininkų vykdytame tyrime buvo tiriami falsifikuoti antibiotikai ir įvertintos dažniausios savybės susijusios su prasta preparatų kokybe. Rezultatai pateikti 1 paveiksle.[14]

1 pav. Falsifikuotų antibiotikų tyrimo rezultatai [14]

Beveik pusėjo tirtų falsifikuotų antibiotikų nebuvo aptikta veikliųjų medžiagų. Ketvirtadalis preparatų neatitiko kokybės reikalavimų. Penktadalis sudėtyje turėjo mažesnį nei pakuotėje nurodyta veikliosios medžiagos kiekį. 7 procentai falsifikuotų antibiotikų savo sudėtyje turėjo kitą veikliąją

Neaptika VM 43% Neatitinka kokybės reikalavimų 24% Per mažas VM kiekis 21%

Kita nei nurodyta pakuotėje VM

7%

Kita 5%

(20)

medžiagą nei nurodyta ant preparato. Tokiems vaistams patenkant į rinką kenkiama ne tik pacientų sveikatai, tačiau ir skatinamas antibiotikų rezistensiškumas.[14]

Rinkoje neretai pasirodo ir amoksicilino falsifikatų. Beta-laktamų grupės antibiotikai sudaro 50 procentų visų padirbtų antibiotikų. 2015 metais mokslininkų grupė vertino Ghanos, Nigerijos ir Didžiosios Britanijos vaistinėse įsigytų amoksicilino ir ko-trimoksazolo kokybę. 2 iš 20 PC metodu tirtų preparatų kokybės reikalavimų neatitiko.[20] Kur kas daugiau falsifikuotų ir kokybės reikalavimų neatitinkančių amoksicilino preparatų užfiksuota Papua Naujojoje Gvinėjoje.2011 metų tyrime imta 14 skirtingų mėginių, iš jų nustatyta: 3 preparatai yra falsifikatai, 9 netinkamos kokybės, likę 2 – netinkamos kokybės ir galimai falsifikatai.[39]

Klaritromicino falsifikatai yra kiek retesni lyginant su amoksicilinu. Manoma, kad makrolidai sudaro apie 1 procentą visų padirbtų antibiotikų.[20] Literatūros apžvalgos metu aptiktas tik vienas mokslinis darbas, įvardijantis klaritromicino ir kitų makrolidų grupės antibiotikų padirbinėjimo problemą šalyje. Tai 2005 metų Kinijos mokslininkų darbas, kuriame sukurtos dvi PC metodikos ir dvi spalvinės reakcijos falsifikuotų makrolidų nustatymui.[26]

2013 metų JAV mokslininkų tyrime tirta 20 atsitiktinių omeprazolo vaistinių preparatų ir nustatyta, kad 100 procentų jų atitinka FDA reikalavimus.[7] Tačiau ne visose šalyse situacija tokia puiki. Omeprazolo tabletės vienas iš kelių dažniausiai falsifikuojamų vaistinių preparatų Serbijoje.[23] Šiuose preparatuose dažniausiai nustatoma per mažai veikliosios medžiagos ir per didelis priemaišų kiekis. Japonijoje 2018 metais buvo atliktas tyrimas, kuriame lyginta internetu ir vaistinėse įsigytų omeprazolo vaistinių preparatų kokybė. Įrodyta, kad to paties gamintojo skirtingose rinkose platinami omeprazolo preparatai yra skirtingos kokybės.[45]

Pasaulyje augant falsifikuotų produktų kiekiui taip pat didėja ir patikimo, greito bei nebrangaus analizės metodo poreikis. Toks yra EPC metodas. Kuriama vis daugiau EPC metodikų skirtų falsifikuotų produktų identifikavimui ir kiekiniam VM bei priemaišų nustatymui.[33,40,48]

1.4 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija

Plonasluoksnė chromatografija (PC) yra farmakopėjinis metodas, kuris yra plačiai taikomas kiekiniuose ir kokybiniuose tyrimuose. Nors šis metodas ir buvo atrastas šeštąjame dešimtmetyje, dėl savo lengvo pritaikymo, nesudėtingo atlikimo ir nebrangios aparatūros vis dar yra vienas dažniausiai naudojamų metodų. Praktikoje plonasluoksnę chromatografiją baigia išstumti efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC). Nuo paprastos PC ji skiriasi tuo, kad efektyviojoje yra naudojamos plokštelės, turinčios kinetiškai optimizuotus sluoksnius, kurie leidžia greičiau atlikti analizę ir geriau atskirti

(21)

Šiame skyriuje bus nagrinėjama PC klasifikacija, EPC stacionarios ir mobilios fazės bei validuotos metodikos amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo veikliųjų medžiagų analizei.

1.4.1 EPC klasifikacija ir stacionarios fazės

EPC tai daugiakomponentinis išskirstymo procesas, kuris apima stacionarią fazę (sorbentą), mobilią fazę (eliuentą) ir tiriamųjų medžiagų molekules. Sorbento dalelių dydis apsprendžia plonasluoksnės chromatografijos tipą.[22]

Stacionari fazė EPC tai plokštelės su sorbentu. PC gali būti stiklinės, aliuminės ar plastikinės. Kaip sorbentas populiariausias silikagelis, tačiau naudojamos ir kitos medžiagos, tokios kaip celiuliozė, diatomitas ar aliuminis. EPC plokštelės būna iš stiklo arba aliuminio, o sorbentas – silikagelis arba celiuliozė.[2,51]

PC metodikos yra klasifikuojamos į klasikinę, efektyviąją, ultra (UPC) ir preparatyvinę PC (PPC). 5 lentelėje nurodyti šių metodikų stacionariosios fazės skirtumai.[22,43]

5 lentelė. PC, EPC, UPC ir PPC metodų stacionarių fazių palyginimas [22,43]

PC EPC UPC PPC

Sorbento vidutinis dalelių dydis, μm 12 5 - 25

Sorbento sluoksnio storis 250 μm 200 μm 10 μm 0.5–2 mm

Tipinis mėgino (dėmės) tūris 1-5 μl 0.1–0.5 μl 0.01-0.1μl 1-2 ml Maksimalus mėginio (dėmės) skersmuo, mm 3–6 1–1.5 0.5-1.0 -

PPC plokštelių sorbento vidutinis dalelių dydis yra apie 25 μm, klasikinės PC beveik perpus mažesnis - 12 μm, o EPC penkis kartus mažesnis - 5 μm. UPC dalelių neturi. Šios PC rūšies plokštelės sorbentas yra iš mikropluošto struktūros arba monolitinis sluoksnis su 1–2 μm makroporomis. PC ir EPC naudojamo silikagelio porų skersmuo dažniausiai būna 60 Å, o paviršiaus plotas - 500 m2_{/ g. [22,43]}

Sorbento sluoksniai tarp metodų taip pat skiriasi. Storiausiais sluoksnis yra PPC - 0.5-2 mm, PC ir EPC ženkliai plonesni - 250 ir 200 μm, atitinkamai. Ploniausias sorbento sluoksnis yra UPC plokštelių - 10 μm. [22,43]

Mėginių užnešimo tūris ir skersmuo tarp metodo rūšių taip pat turi skirtumų. Didžiausias tūris užnešamas PPC, kuris būna 1-2 ml, PC naudojami kur kas mažesni kiekiai 1-5 μl. EPC analizei įprastai pakanka 0.1–0.5 μl, o UPC mažiausiai iš visų - 0.01-0.1μl. [22,43]

(22)

Suprantama, kad esant skirtingam mėginio tūriui skiriasi ir mėginių dėmių skersmuo. PPC jis labai įvairus, todėl lentelėje nenurodytas, nepaisant to yra žinoma, kad PPC dėmių skersmuo lyginant su kitomis PC rūšimis būna didžiausias. Antrąją vietą užima PC, čia dėmių skersmuo dažniausiai yra apie 3-6 mm, kiek mažesnės dėmės EPC - 1-1.5 mm. Mažiausios, kur ir įprastai mažiausias mėginio tūris, tai - UPC. UPC mėginių dėmė įprastai yra 0.5-1 mm skersmens. [22,43]

Visuose nagrinėtuose moksliniuose straipsniuose, kur buvo atliekama amoksicilino, klaritromicino ar omeprazolo analizė EPC buvo naudotos aliuminio iš anskto padentos silikageliu 60F254 plokštelės. Toks pasirinkimas veikiausiai susijęs su mažesne šių plokštelių kaina, paprastesniu pjaustymu, taip pat jos nedūžta, priešingai nei stiklo plokštelės. Vis gi aliuminio plokštelės rezultatų kokybe šiek tiek nusileidžia stiklinėms. Aliuminės plokštelės nesunkiai lankstosi, dėl to gali atsirasti netikslumų analizės duomenyse. Aprašytuose darbuose naudotos įvairaus dydžio plokštelės: 10 x 5 cm, 10 x 10 cm ir 10 x 20 cm. [9,10,12,13,16,18,29,34,41,46,52]

1.4.2 EPC mobilios fazės

Tirpiklių sistema, dar kitaip žinoma kaip mobili fazė, yra būtinas ir ne ką mažiau svarbus, nei stacionari fazė, EPC elementas. Dažniausiai tai 3-4 organinių tirpiklių mišinys, svarbiausias reikalavimas – tirpikliai tarpusavyje turi maišytis ir sudaryti homogeninę sistemą. [50]

JAV mokslininkas L.R. Snyder 1978 m. sukūrė mobilios fazės klasifikaciją į kurią įtraukė virš 80 dažniausiai naudojamų tirpiklių ir juos suskirstė į 8 grupes.[51] Vėliau iš šių 80 tirpiklių buvo atrinkti 9, kurie gali būti naudojami vieni, vaistinių medžiagų mišinių atskyrimui naudojant silikagelio PC plokšteles. Šie tirpikliai buvo tokie: dietilo eteris, etanolis, tetrahidrofuranas, acto rūgštis, dichlormetanas, etilo acetatas, dioksana, toluenas, chloroformas. Jie pasižymi gera geba išskirstyti junginius. Išskirstymą charakterizuojantis faktorius yra Rf. Rekomenduojamas, kad jis būtų nuo 0.2 iki 0.8, nes įrodyta, kad tai optimalus intervalas, leidžiantis pasiekti gerą metodikos atkartojamumą.[49]

Sistemiškas mobiliosios fazės pasirinkimas ir optimizavimas atliekamas retai, dažniausiai mokslininkai remiasi ,,bandymų ir klaidų” principu, analitiko patirtimi ar atliekant literatūros apžvalgas.[50] Toliau šiame skyriuje bus nagrinėjamos literatūroje aptiktos metodikos, kur atliekama amoksicilino, klaritromicino ar omeprazolo analizė, kurios leis išsirinkti tinkamą mobilią fazę šių vaistų mišinio analizei.

(23)

1.4.3 Amoksicilino analizė EPC

Prieš pradedant eksperimentus būtina įvertinti jau atliktų mokslinių tyrimų rezultatus, susijusius su tiriamosiomis vaistinėmis medžiagomis. Literatūroje buvo aptiktos kelios pritaikytos ir validuotos EPC metodikos amoksicilino identifikavimui ir/ar kiekiniam nustatymui (6 lentelė).[13,16,41]

Renkantis mokslinius straipsnius ir publikacijas buvo naudojama mokslinės informacijos paieškos sistema ,,Google Scholar”. Naudoti tokie raktiniai žodžiai ir jų kombinacijos: ,,amoxicillin”, ,,hptlc”, ,,determination” ir ,,analysis”.

Visuose aptiktuose moksliniuose straipsniuose amoksicilinas yra mišinyje su atsikosėjimą lengvinančiais vaistais: bromheksino arba ambroksolio hidrochloridu. Juose naudotos tokios tirpiklių sistemos:

• butilo acetatas: ledinė acto rūgšis: metanolis: vanduo;

• etilo acetatas: metanolis: toluenas: vanduo: ledinė acto rūgšis; • n-butanolis: 1.0 M amonio acetatas: metanolis.[13,16,41]

Į visų jų sudėtis įeina metanolis, kuris sudaro bent ketvirtadalį tirpiklių sistemos tūrio. Pirmoji ir antroji tirpiklių sistemos gana panašios. Į jų abiejų sudėtį, be metanolio, taip pat įeina ledinė acto rūgštis ir etilo arba butilo acetatas. Todėl racionalu išbandyti šių tirpiklių sistemą amoksicilino, omeprazolo ir klaritromicino mišinio analizei. [13,16,41]

6 lentelė. Amoksicilino EPC analizės metodikos

Metodikos Nr.

Tirpiklių sistema Amoksicilino Rf

Ryškinimo metodas

VM mišynyje su amoksicilinu 1[16] Butilo acetatas: ledinė acto

rūgštis: metanolis: vanduo (5:2,5:2,5:1)

0.51 ± 0.05 Densitometrija prie UV 320 nm

Bromheksino hidrochloridas

2[13] Etilo acetatas: metanolis: toluenas: vanduo: ledinė acto rūgšis (6.0: 3.0: 2.0: 1.0: 0.5) 0.32 ± 0.04 Densitometrija prie UV 237 nm Ambroksolio hidrochloridas 3[41] N-butanolis: 1.0 M amonio acetatas: metanolis (7.5:2.0:1.5) 0.45 ± 0.02 Densitometrija prie UV 222 nm Ambroksolio hidrochloridas

(24)

Visuose nagrinėtuose straipsniuose amoksicilino ir kitų tiriamųjų vaistų analizei naudojama densitometrija prie tam tikro bangos ilgio UV šviesos. Pastarasis vyrauja nuo 222 nm iki 320 nm. Nustatyta, jog amoksicilino dėmės ryškinimui papildomų veiksmų imtis nereikia, o bangos ilgio intervalas platus ir nesudėtingas mišinio analizės pritaikymui. [13,16,41]

1.4.4 Omeprazolo analizė EPC

Ieškant omeprazolo analizei tinkančios EPC metodikos informacijos taip pat naudota paieškos sistema ,,Google Scholar”. Raktiniai žodžiai ir jų kombinacijos analogiški amoksicilinui: ,,omeprazole”, ,,hptlc”, ,,determination” ir ,,analysis”. Buvo aptikti šeši moksliniai straipsniai, kurių metodikos sąlygos pateiktos 7 lentelėje.[10,12,18,29,46,52]

7 lentelė. Omeprazolo EPC analizės metodikos Metodikos

Nr.

Tirpiklių sistema Omeprazolo Rf Ryškinimo metodas VM mišynyje su omeprazolu 1[12] Trichlormetanas: 2-propanolis: 25% amoniakas: acetonitrilas (10.8:1.2:0.3:4) 0.57±0.03 Densitometrija prie UV 309 nm Pantoprazolas 2[52] Trichlormetanas: metanolis (9:1) 0.45±0.02 Densitometrija prie UV 283 nm Ketoprofenas 3[46] Dichlormetanas: metanolis (9:1) 0.54±0.03 Densitometrija prie UV 309 nm Ondansetronas 4[29] Etilo acetatas: dichlormetanas:

ledinė acto rūgšis (8:2:0.1)

0.19±0.03 Densitometrija prie UV 241 nm Aspirinas 5[18] Trichlormetanas: etilo acetatas (3:7) 0.23±0.03 Densitometrija prie UV 302 nm Ketoprofenas

(25)

6[10] Toluenas: n-butanolis: 25% amoniakas (3:7:0.2)

0.67±0.02 Densitometrija prie UV 290 nm

Diklofenakas

7 lentelėje yra palyginamos omeprazolo analizės metodikos. Daugiausia mokslinių darbų yra yra atlikta su omeprazolo ir NVNU mišiniais (ketoprofenu, diklofenaku, aspirinu). Taip pat aptikta po vieną straipsnį kur omeprazolas yra mišinyje su antiemetiku osdansetronu ir mišinyje su kitu PSI pantoprazolu. Analizei EPC validuotos tirpiklių sistemos sudarytos iš tokių tirpiklių: trichlormetano, 2-propanolio, 25% amoniako, acetonitrilas, metanolis, dichlormetano, etilo acetato, ledinės acto rūgšies,toluenas ir n-butanolis. [10,12,18,29,46,52]

Į daugelį tirpiklių sistemų įeina trichlormetanas ir metanolis. Tai yra itin lakūs tirpikliai, kurie lemia greitą analizės eigą ir yra vieni populiariausių tirpiklių visose chromatografijos rūšyse. Kaip ir daugelyje amoksicilino tirpiklių sistemų, taip ir dalyje omeprazolo - naudojamas metanolis, ledinė acto rūgštis ir etilo acetatas. Iš to daroma išvada, kad šie tirpikliai gali tikti mišinio analizei EPC. [10,12,18,29,46,52]

Rf naudojant skirtingas metodikas labai skirtingi. Jie gali vyrauti nuo 0.19 iki 0.67. Omeprazolo dėmių ryškinimui taikoma densitometrija prie UV šviesos. Kaip ir amoksicilino, taip ir omeprazolo UV bangos ilgio intervalas yra platus - 241-309 nm. [10,12,18,29,46,52]

1.4.5 Klaritromicino analizė EPC

Klaritromicino, kaip ir omeprazolo bei amoksicilino EPC metodikos paieškoje buvo naudota paieškos sistema ,,Google Scholar”. Raktiniai žodžiai ir jų kombinacijos analogiški: ,,clarithromycin”, ,,hptlc”, ,,analysis” ir ,,determination”.

Buvo aptikti du moksliniai straipsniai, kuriuose vykdyta klaritromicino analizė EPC metodu. Abejuose straipsniuose pateiktos tos pačios tirpiklių sistemos kurių sudėtis yra etilo acetatas: metanolis: amonio hidroksidas (20:5:0.5) pH 10. Naudojant tokią metodiką amoksicilino Rf 0,62. Analizės metodikos, kur klaritromicinas yra mišinyje su kitais vaistiniais preparatais, neaptikta.[9,34]

Klaritromicinas turi kiek kitokį ryškinimo būdą, lyginant su amoksicilinu ir omeprazolu. Densitomerijos atlikti naudojant tik UV šviesą negalima. Vienas iš būdų išryškinti dėmės yra atlikti mėginio derivatizaciją ksantidrolio tirpalu ir tuomet naudoti UV 506 nm šviesą. [34] Kitą ryškinimo būdą 2017 m. sukūrė JAV mokslininkai. Ši ryškinimo metodika nereikalauja cheminių reagentų. Ji pagrįsta junginių fluorescencija, kuri aktyvuojama EPC plokštelę su mėginiais kaitinant 160°C 15 min. Po kaitinimo atliekama densitometrija prie 254 nm bangos ilgio UV šviesos.[9] Klaritromicino PC analizėje ryškinimui naudojamas plokštelės purškimas konc. sieros rūgšties:etanolio(1:3) tirpalu ir kaitinimas 100°C 5 min.[32]

(26)

2. TYRIMO OBJEKTAS, METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimo planavimas

1. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo išskyrimas iš vaistinių formų (tablečių ir kapsulių). 2. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio kokybinė analizė efektyviosios

plonasluoksnės chromatografijos metodu.

3. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio kiekinė analizė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu.

2.2. Tyrimo objektas ir metodika

2.2.1. Tyrimo objektas

Tiriamas amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinys, sudarytas iš „Ospamox 1000 mg“ (Sandoz), „Fromilid 500 mg“ (KRKA) tablečių ir “Omeprozole Inteli 20 mg” (Inteli Generics Nord) kapsulių, kuriant validuotą kokybinės ir kokybinės analizės metodiką, naudojant efektyviąją plonasluoksnę chromatografiją.

2.2.2. Kokybinė ir kiekinė analizė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos

metodu

Įranga

Merc HPTLC plokštelės padengtos silicio geliu 60F254 (10 cm x 5 cm, 10 cm x 10 cm 250 μm storio). Mėginių užnešimui naudojamas CAMAG Linomat 5 automatinis PC užnešiklis su CAMAG 100 μl adata. Mėginių užnešimo greitis 10 μl/s, naudojant azoto aspiratorių. Mėginiai dedami 10 mm nuo apačios atstumu. Mėginio ilgis – 10 mm. Ryškinimui naudota TLC plokštelių kaitlentė CAMAG TLC Plate Heater III. Tirpalų paruošimui – ultragarso vonelė WiseClean modelis WUC-A06H 50Hz.

Tirpikliai

Tirpiklių sistemai sudaryti buvo naudoti acto rūgštis (99.8-100.5%), metanolis (≥99.9%) ir etilo acetatas (≥99.5%). Tiriamųjų medžiagų tirpalai buvo ruošiami naudojant etilo alkoholį (96%) ir metanolį

(27)

Ryškikliai

Plonasluoksnės chromatografijos mėginių ryškinimui naudota UV šviesa (254 nm) ir plokštelės šildymas TLC plokštelių kaitlente. Tiriamų medžiagų Rf reikšmės nustatyos naudojant vizualizavimo prietaisą CAMAG TLC Visualizer kartu su programine įranga VideoScan.

Tiriamieji tirpalai

Tiriamųjų medžiagų tirpalai buvo paruošti iš Lietuvos visuomenės vaistinėje įsigytų vaistinių preparatų, kurių prekiniai pavadinimai nurodyti skisnyje 2.2.1.

Amoksicilino darbinis tirpalas (A1) buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Ospamox 1000 mg“ (Sandoz) 1000 mg stiprumo tablečių. 1 tabletė, kurios svoris 1.354 g, buvo disperguota grūstuvėje. Milteliai perkelti į analitinę kolbutę ir užpilti 50 ml metanolio. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 10 minučių. Pagamintas amoksicilino metanolinis tirpalas buvo naudojamas tolimesniems tyrimams.

Klaritromicino darbinis tirpalas (K1) buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Fromilid 500 mg“ (KRKA) tablečių, kuriose yra 500 mg klaritromicino. 1 tabletė, kurios svoris 1.027 g, buvo sutrinta grūstuvėje. Gauti milteliai, atitinkantys 500 mg klaritromicino perkelti į analitinę kolbutę ir užpilti 50 ml etanolio. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 10 minučių. Gautas etanolinis klaritromicino tirpalas naudojamas tolimesniems tyrimams.

Omeprazolo darbinis tirpalas (O1) buvo pagamintas iš vaistinio preparato “Omeprozole Inteli 20 mg” (Inteli Generics Nord) kapsulių, kuriose yra 20 mg omeprazolo. 1 kapsulės turinys, kurio svoris - 0.276 g, buvo sutrintas grustuvėje iki miltelių. Milteliai buvo perkleti į analitinę kolbutę ir užpilti 50 ml etanolio. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 10 minučių. Gautas etanolinis omeprazolo tirpalas naudojamas tolimesniems tyrimams.

Mišinys (M1) yra sudarytas iš A1, K1 ir O1 tirpalų, imant lygiomis dalimis po 10 ml. Šis mišinys toliau naudojamas kokybinei analizei. Kiekiniam tyrimui ir kalibracinės kreivės sudarymui, paruošiami šio mišinio skirtingų koncentracijų tirpalai, kurie nurodyti 8 lentelėje.

8 lentelė. Kiekinio tyrimo kalibracinės kreivės tirpalų koncentracijos

Vaistas Amoksicilinas, mg/ml Klaritromicinas, mg/ml Omeprazolas, mg/ml M1 20 10 0,4

(28)

Lentelėje nurodyti tirpalai (M2-M4) buvo ruošiami iš lygiomis dalimis A1, K1 ir O1 pagaminto mišinio M1 jį skiedžiant etanoliu.

Kokybinė analizė

Naudojami paruošti tiriamieji mėginiai. Ant silikageliu padengtos plokštelės, naudojant automatinį PC užnešiklį, užnešami A1, K1, O1 ir jų mišinio (M1) mėginiai. Visų šių tirpalų užnešama po 10 μl. Juostelių ilgis - 10 mm. Pastarosios išdėstytos 0.2 mm atstumu ant 5 x 10 cm EPC plokštelės. Paruošiama chromatografavimo kamera: supilami tirpikliai: etilo acetatas, metanolis ir acto rūgštis (45:50:5). Ji sandariai uždengiama ir paliekama 30 minučių, kad prisisotintų garais. Kai plokštelė su mėginiais išdžiūva, ji perkeliama į chromatografavimo kamerą, stabiliai įstatoma ir laikoma, kol tirpiklių sistema pakyla plokštele, iki nubrėžtos finišo linijos, kuri yra 7 cm nuo mėginių starto linijos. Tada plokštelė išimama, džiovinama ir keliama ant TLC plokštelių kaitlentės. Ten ji šildoma 160°C 15 min., po to apšviečiama UV šviesa (254 nm). Mėginių dėmės identifikuojamos ir apskaičiuojamos Rf reikšmės.

Kiekinė analizė

Naudojami prieš tai paruošti tiriamųjų vaistų mėginiai. Ant silikageliu padengtos plokštelės, naudojant automatinį PC užnešiklį, užnešami amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio mėginiai. Užnešama 6 skirtingų koncentracijų mišiniai (5 lentelė). Užneštų juostelių ilgis 10 mm, užnešamos 0,83 mm atstumu. Paruošiama chromatografavimo kamera: į ją supilama tirpiklių sistema susidedanti iš etilo acetato, metanolio ir acto rūgšties (45:50:5), kamera sandariai uždengiama ir paliekama 30 minučių, kad prisisotintų garais. Kai plokštelė su mėginiais išdžiūva, ji perkeliama į chromatografavimo kamerą, stabiliai įstatoma ir laikoma, kol tirpiklių sistema pakyla plokštele 7 cm nuo mėginių starto linijos. Tada plokštelė išimama, džiovinama ore ir kaitinama 160°C 15 min. Kai išryškėja tiriamųjų mėgnių dėmės, plokštelė dedama į CAMAG Scanner 3 ir skanuojama prie 254 nm skaneriu, naudojant absorbciją atspindintį režimą. Duomenys apdorojami pasitelkiant WINCATS programą.

M2 17,5 8,75 0,35

M3 15 7,5 0,3

M4 11,25 5,63 0,23

(29)

Naudojantis WINCATS programa gaunamos kiekvienos koncentracijos smailės, nustatomi jų plotai ir sudaromos kalibracinės kreivės, kuriose smailių plotai yra proporcingi tiriamųjų vaistinių medžiagų koncentracijai.

2.2.3 Statistinė analizė

Atlikus efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizę, gautos Rf reikšmės įvertinamos statistiškai. Apskaičiuojamas jų vidurkis, vidutinis kvadratinis nuokrypis, pasikliautinasis intervalas (pasikliovimo lygmuo – 0,95), vidurkio vidutinė kvadratinė paklaida. Statistiniams skaičiavimams naudojama programa – Microsoft Office Excel 2007.

(30)

3. REZULTATAI IR APTARIMAS

3.1 Plonasluoksnės chromatografijos metodikos pasirinkimas

Tirpiklių sistemos pasirinkimas

Vienas esminių faktorių apsprendžiantis sėkmingą plonasluoksnės chromatografijos analizę yra tinkamos tirpiklių sistemos pasirinkimas. Svarbu įvertinti, kad visos trys tiriamosios medžiagos pakankamai gerai atsiskirtų ir, kad jų dėmės būtų ryškiai matomos. Buvo atlikta literatūros analizė, kurios metu neaptikta jokia metodika ir tirpiklių sistema leidžianti nustatyti amoksiciliną, klaritromiciną ir omeprazolą mišinyje. Dėl šios priežasties eksperimentų metu buvo išmėgintos šios tirpiklių sistemos, kurios tinka atskirų vaistinių medžiagų PC analizei ir yra išvardintos 1.4.3-1.4.5 skirsniuose.

Buvo atlikti bandymai su visomis minėtomis sistemomis, keičiant tirpiklių santykius ir tirpiklius. Sistemos tinkamumo įvertinimui įvestas pagrindinis reikalavimas - kiekvienos tiriamosios medžiagos sulaikymo rodikliai (Rf) turi skirtis tiek, kad medžiagų dėmės nepersidengtų. Kiti reikalavimai buvo dėmės ilgis (ne didesnis kaip 2 cm) ir analizės trukmė (ne daugiau kaip 30 min). Pasirinkta geriausiai reikalavimus atitikusi sistema - etilo acetatas:metanolis:acto r. (45:50:5).

Eksperimento tikslumui įvertinti bandymai buvo pakartoti penkis kartus. Tuomet apskaičiuoti aritmetiniai gautų Rf reikšmių vidurkiai, standartiniai nuokrypiai (SD), santykinė paklaida (SE), pasikliautinasis intervalas (9 lentelė).

9 lentelė. Statistinis tiriamųjų junginių (amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo) Rf reikšmių vertinimas

Tirpiklių sistema

Vaistinė medžiaga Rf vidurkis Standartinis nuokrypis Paklaida Pasikliautinasis intervalas Etilo acetatas: Metanolis: Acto r. (45:50:5) Amoksicilinas (A1) 0,45 0,008 0,002 3,5-3,6 Klaritromicinas (K1) 0,16 0,004 0,002 1,2-1,3 Omeprazolas (O1) 0,75 0,004 0,002 5,9-6,0

Tiriamųjų junginių Rf reikšmių statistinio vertinimo metu, buvo nustatyta, kad paklaidos neviršija 0,05 ribos, kuri yra leistina. Tai įrodo, kad pasirinkta tirpiklių sistema yra tinkama kokybiniam amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo PC vertinimui.

(31)

Ryškiklio parinkimas

Ne ką mažiau svarbus žingsnis kuriant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodiką yra ryškiklio pasirinkimas. Vaistinių medžiagų dėmių išryškinimui naudojamas kelių skirtingų ryškinimo metodų kombinacija tam, kad būtų įmanomas visų trijų (amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo) vaistinių medžiagų identikavimas. Atlikus literatūros analizę[9,32,34] ir eksperimentinius tyrimus su tiriamuoju mišiniu nustatyta, jog klaritromicno dėmių išryškinimui būtina plokštelę purkšti cheminiais reagentais arba kaitinti. Galima purkšti ksantidrolio tirpalu ir naudoti 506 nm UV šviesą, purškti konc. sieros rūgšties ir etanolio mišiniu (1:4) ir kaitinti 100°C 5 min arba tiesiog kaitinti 15 min 160°C. Abejais atvejais išryškėja dėmės, kurios gerai matomos UV šviesioje prie 254 nm bagos.

2 pav. Dėmių ryškinimas, plokštelę purškiant sieros r. tirpalu ir apšviečiant UV šviesa

3 pav. Dėmių ryškinimas tik apšviečiant UV šviesa

Po eksperimentų buvo pasirinktas ryškinimo būdas, kuomet tik kaitinama, dėl mažesnio žingsnių skaičiaus ir geresnės vizualizacijos. Purškiant sieros rūgšties tirpalu tirpdoma silikagelio plokštelė ir atsiranda smulkios dėmės trukdančios kiekiniam vertinimui (2 pav.). Ryškinimui naudoti vien tik UV šviesą nepavyko, nes tuomet nematomas klaritromicinas (3 pav.).

(32)

3.2 Pritaikytos efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos validacija

Eksperimentinių bandymų metu nustatyta efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos sistema, kuria galima įvertinti amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo kokybinę ir kiekinę sudėtį. Ši metodika validuota pagal EMA ICH Q 2 (R1) gairių parametrus: specifiškumą, tiesiškumą, aptikimo ribą, kiekinio nustatymo ribą.[19]

Specifiškumas

Metodikos specifiškumas yra įrodomas lyginant skirtingų koncentracijų tiriamųjų vaistinių medžiagų sulaikymo rodiklius (Rf). Kad metodika specifiška įrodo gauti rezultatai, kurie nurodyti 10 lentelėje.

10 lentelė. Skirtingų koncentracijų amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo Rf reikšmės chromatogramoje Amoksicilinas VM koncentracija, mg/ml 20 17,5 15 11,25 6,33 Rf 0.45 0.45 0.45 0.43 0.45 Klaritromicinas VM koncentracija, mg/ml 10 8,75 7,5 5,63 3,16 Rf 0.16 0.16 0.16 0.15 0.16 Omeprazolas VM koncentracija, mg/ml 0,4 0,35 0,3 0,23 0,12 Rf 0.75 0.75 0.75 0.74 0,74

Vaistinių medžiagų sulaikymo rodikliai, kurie pateikti 10 lentelėje ir statistinis tiriamųjų junginių Rf reikšmių vertinimas 9 lentelėje rodo, jog paklaida yra priimtinose ribose ir metodas yra specifiškas.

Tiesiškumas

Metodo rezultatų tiesiškumui įrodyti ir kalibracinei kreivei sudaryti naudojami tiriamųjų vaistinių medžiagų tirpalai nurodyti 5 lentelėje. Tiesiškumui įvertinti buvo sudarytos kreivės rodančios smailės ploto priklausomybę nuo medžiagos koncentracijos (4,5,6 pav.)

(33)

4 pav. Amoksicilino kalibracinė kreivė

5 pav. Klaritromicino kalibracinė kreivė

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 0 1 2 3 4 5 6 Pl o ta s Koncentracija, mg/ml 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 0 2 4 6 8 10 12 Pl o ta s Koncentracija, mg/ml

(34)

6 pav. Omeprazolo kalibracinė kreivė

Pagrindinis tiesiškumo rodikls yra koreliacijos koeficientas (R2_{). Amoksicilino R}2_{– 0,9915,}

klaritromicino – 0,9955, o omeprazolo – 0,9911.

Vertinant koreliacijos koeficientą taip pat sudarytos ir kalibracinių kreivių lygtys, kurios nurodytos 11 lentelėje.

11 lentelė. Tiriamųjų vaistinių medžiagų kalibracinės kreivės lygtys ir koreliacijos koeficientai

Vaistinė medžiaga Kalibracinės kreivės lygtis R2

Amoksicilinas y = 3747.5x + 31915 R² = 0.9915

Klaritromicinas y = 1546.9x + 14375 R² = 0.9911

Omeprazolas y = 3754.4x + 6942.6 R² = 0.9955

Visų vaistinių medžiagų koreliacijos koeficientai yra didesni kaip 0,99 (R2_{>0,99), todėl metodika}

yra tinkama kiekinei analizei. Statstinis patikimumas p < 0,05.

Aptikimo ir kiekinio nustatymo ribos

Aptikimo riba yra apibūdinama kaip mažiausias medžiagos kiekis, kuris yra aptinkamas mėginyje, o nustatymo riba – mažiausias medžiagos kiekis, kuris gali būti kiekiškai įvertintas. Banymų

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 Koncentracija, mg/ml Pl o ta s

(35)

12 lentelė. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo aptikimo ir kiekinio nustatymo ribos

Vaistinė medžiaga LOD (mg/ml) LOQ (mg/ml)

Amoksicilinas 3,51 10,66

Klaritromicinas 0,97 2,95

Omeprazolas 0,08 0,25

Aptikimo ir kiekinio nustatymo ribos tiriamiesiems vaistams yra skirtingos. Mažiausios LOD ir LOQ rirbos yra omeprazolui, o didžiausios – amoksicilinui.

Įvertinus visus metodo kokybės parametrų gautus rezultatus, galima teigti, kad pasirinkta EPC metodika yra tinkama ir validuota kokybinei ir kiekinei amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio analizei. Pagal ją bus atliekama tiriamųjų vaistinių medžiagų analizė (žr. 3.3).

3.3 Vaistų mišinio analizė efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu

Darbo metu buvo sėkmingai validuotas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas skirtas amoksicilino, klaritromicno ir omeprazolo analizei. Šiuo metodu vaistines medžiagas išskirtas iš tablečių ir kapsulių galima įvertinti kokybiškai ir kiekiškai.

Nustačius tinkamą ryškinimo būdą ir tirpiklių sistemą, buvo paruošti darbiniai tirpalai: amoksicilinas (A1), klaritromicinas (K1), omeprazolas (O1) ir šių vaistinių medžiagų tirpalų pagaminti skiedimu mišiniai: M1, M2, M3, M4 ir M5, kurių koncentracijos nurodytos 5 lentelėje. Ryškinimui

plokštelė purškiama konc. sieros rūgšties ir etanolio (1:4) tirpalu, kaitinama 160०C 15 minučių ir naudojama UV spindulių lempa (254 nm) (7 pav.).

(36)

7 pav. Etilo acetato-Metanolio-Acto r. (45:50:5) sistema atskirtos ir kombinuotu ryškinimo metodu išryškintos amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinių (iš dešinės į kairę) M1, M2, M3, M4,

M5 dėmės

Analizės metu nustatytos tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės atitiko pasikliautinuosius intervalus.

Kiekiniam įvertinimui buvo pagamintas atskiras vaistų mišinys. Jis buvo gautas tabletes ir kapsulę ištirpinus identiškai taip pat kaip ir kokybinėje analizėje. Atlikus EPC, gauti plotai įvedami į kalibracinės kreivės lygtis ir taip apskaičiuojamos koncentracijos. Gauti rezultatai nurodyti 13 lentelėje.

13 lentelė. Amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo kiekinio tyrimo rezultatai. Vaistinė medžiaga Tyrimo metu gautas

kiekis, mg Pakuotės lapelyje nurodytas kiekis, mg Paklaida Amoksicilinas 1018 1000 1,8% Klaritromicinas 507 500 1,4% Omeprazolas 19,3 20 3,5%

Visi validuota metodika nustatyti veikliosios medžiagos kiekiai atitinka Europos farmakopėjos leidžiamą nuokrypį ±5%, todėl galima daryti prielaidą, kad tirti vaistiniai preparatai yra tinkamos kokybės.

(37)

IŠVADOS

1. Pasirinkta tirpiklių sistema etilo acetatas:metanolis:acto rūgštis (45:50:5) ir kompleksinis ryškinimo būdas (kaitinimas 160º C 15 minučių ir apšvietimas UV šviesa prie 254 nm) yra tinkami amoksicilino, klaritromicino ir omeprazolo mišinio komponentų atskyrimui, kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui.

2. EPC metodikos validacijai tinkami kriterijai yra: specifiškumas, tiesiškumas, aptikimo riba ir kiekinio nustatymo riba.

3. Validuota EPC metodika yra tinkama tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš ,,Ospamox 1000 mg“,

„Fromilid 500 mg“ tablečių ir “Omeprozole Inteli 20 mg” kapsulių, identifikavimui ir kiekiniam įvertinimui. Kokybinio identifikavimo metu nustatytos Rf rodiklių paklaidos yra priimtiname intervale. Kiekinio tyrimo metu gauti rezultatai yra Europos farmakopėjos leidžiamame paklaidų intervale ±5%. Rezultatai apskaičiuoti patikimumu p<0,05. Gauti duomenys įrodo, kad veikliosios medžiagos kiekis atitinka vaistų gamintojo pakuotės lapelyje nurodytą informaciją.

(38)

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Šio darbo metu validuota efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodika gali būti taikoma identifikuojant ir kiekiškai įvertinant tablečių sudėtį, praradus vaisto pakuotę arba įtariant vaistinių preparatų falsifikavimo atvejį. Tokiais atvejais galima greita ir nebrangi veikliųjų medžiagų identifikacija bei kiekinis nustatymas.

(39)

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Lietuvos Respublikos Seimas. LR Farmcijos įstatymas X-709. Galiojanti suvestinė redakcija [2020-01-01 - 2020-04-30]. [Prieiga per internetą] Vilnius, 2006. [cituojama pagal 2020 m. balandžio 29 d.]. Gauta: https://e-seimas.lrs.lt/portal/legalAct/lt/TAD/TAIS.280067

2. Matukaitytė I. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos optimizavimas antidepresantų mišinio skirstymui ir identifikavimui. Magistro baigiamasis darbas, 2013, p. 22. [Prieiga per internetą] [cituojama pagal 2020 m. kovo 28 d.]. Gauta:

https://lsmuni.lt/cris/handle/20.500.12512/100471

3. Trijų Baltijos šalių vaistų suvartojimo statistika 2016-2018 [Prieiga per internetą]. VVKT. 2020 [cituojama pagal 2020 m. balandžio 11 d.]. https://www.vvkt.lt/Triju-Baltijos-saliu-vaistu-suvartojimo-statistika

4. Vaistai [Prieiga per internetą]. VAPRIS. 2019 [cituojama pagal 2019 m. birželio 10 d.]. Gauta:

https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications

5. Vaistų suvartojimo 2018 m. ataskaita. [Prieiga per internetą]. VVKT. 2018 [cituojama pagal 2020 m. balandžio 20 d.]. Gauta: http://www.vvkt.lt/

6. Abdel Salam R, Hadad GM, Abo-El-Matty D, Abdel Shakour M. Pharmaceutical Counterfeit drugs:(The growing threat). Records of Pharmaceutical and Biomedical Sciences. [Internet] 2019 Mar 1;3(1):17-25. [cited 2020 Apr 29]. Available from:

https://rpbs.journals.ekb.eg/article_29452_d77073626f41ec4ba0188296d95d0dcf.pdf 7. Addo RT, Watkins EB, Owen JS, Davis KR, Bingham KC. End of supply chain screening to

assess drug product quality in the US market—omeprazole as a case study. Adv Anal Chem. [Internet] 2013;3(4):48-53. [cited 2020 Apr 29]. Available from:

http://www.academia.edu/download/54683421/10.5923.j.aac.20130304.02.pdf

8. Arens AM, van Wijk XM, Vo KT, Lynch KL, Wu AH, Smollin CG. Adverse effects from counterfeit alprazolam tablets. JAMA internal medicine. [Internet] 2016 Oct 1;176(10):1554-5. [cited 2020 Apr 29]. Available from:

https://jamanetwork.com/journals/jamainternalmedicine/article-abstract/2542417 9. Armour E, Sherma J. Transfer of silica gel TLC screening methods for clarithromycin,

azithromycin, and amodiaquine+ artesunate to HPTLC–densitometry with detection by reagentless thermochemical activation of fluorescence quenching. Journal of Liquid

Chromatography & Related Technologies. [Internet] 2017 Apr 3;40(5-6):282-6. [cited 2020 Apr 29]. Available from:

https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10826076.2017.1298029

10. Bhatt NM, Chavada VD, Sanyal M, Shrivastav PS. Optimization of a novel high-performance thin-layer chromatographic method for the concurrent estimation of three proton-pump inhibitors and diclofenac in their binary combinations. Journal of Planar Chromatography– Modern TLC. [Internet] 2015 Jun;28(3):234-40. [cited 2020 Apr 27]. Available from:

https://akjournals.com/view/journals/1006/28/3/article-p234.xml?rskey=NKH75j&result=5 11. Biondi F, Savoia G, Sasso M, Lanza A, Pacifici R. Serious Adverse Reactions Caused by

Counterfeit Drugs. A Clinical Case of Transient Global Amnesia Caused by Dietary

Supplement Containing a High Dose of Sildenafil. J Pharmacovigil. [Internet] 2016;4(212):2. [cited 2020 Apr 29]. Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Serious-Adverse-

Reactions-Caused-by-Counterfeit-A-a-Cardarelli/d8cebd8108499bb9a30ed07b86d3d11c7f4843c1

12. Bosch ME, Sánchez AR, Rojas FS, Ojeda CB. Analytical methodologies for the determination of omeprazole: an overview. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. [Internet] 2007 Aug 15;44(4):831-44. [cited 2020 Apr 29]. Available from:

(40)

13. Chitlange SS, Tawargeri SR, Bhole RP. Stability indicating HPTLC method for simultaneous estimation of Amoxicillin trihydrate and Ambroxol hydrochloride in bulk and pharmaceutical dosage form. Pharm Anal Acta. [Internet] 2013;4(261):2. [cited 2020 Apr 21]. Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Stability-Indicating-HPTLC-Method-for-Simultaneous-Chitlange-Tawargeri/7f6558437754d8d1cbc2fda0ce7eb17bbc04adf8 14. Delepierre A, Gayot A, Carpentier A. Update on counterfeit antibiotics worldwide; public

health risks. Medecine et maladies infectieuses. [Internet] 2012 Jun 1;42(6):247-55. [cited 2020 Apr 29]. Available from:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0399077X12000911

15. DGVS Guideline Committee. S2k guideline Helicobacter pylori and gastroduodenal ulcer disease. Journal of gastroenterology. [Internet] 2017 Feb; 55 (02): 167-206. [cited 2020 Feb 06]. Available from: https://www.ueg.eu/education/document/s2k-guideline-helicobacter-pylori-and-gastroduodenal-ulcer-disease/147694/

16. Dhoka MV, Gawande VT, Joshi PP. HPTLC determination of amoxicillin trihydrate and bromhexine hydrochloride in oral solid dosage forms. Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. [Internet] 2010 Aug 1;2(8):477. [cited 2020 Apr 27]. Available from:

https://www.semanticscholar.org/paper/HPTLC-Determination-of-Amoxicillin-Trihydrate-and-Dhoka-Gawande/37990d085bcf1829207fb1a320f6e6b5477c3ce7

17. Edhi AI, Hakim S, Shams C, Bedi D, Amin M, Cappell MS. Clarithromycin-Associated Acute Liver Failure Leading to Fatal, Massive Upper Gastrointestinal Hemorrhage from Profound Coagulopathy: Case Report and Systematic Literature Review. Case Reports in Hepatology. [Internet] 2020;2020. [cited 2020 Feb 06]. Available from:

https://www.hindawi.com/journals/crihep/2020/2135239/

18. El-Kimary E, Ragab M. A validated high-performance thin-layer chromatographic method for the assay of two binary mixtures containing omeprazole or its isomer esomeprazole in

pharmaceutical dosage forms. JPC-Journal of Planar Chromatography-Modern TLC. [Internet] 2015 Feb 1;28(1):74-82. [cited 2020 Apr 26]. Available from:

https://akademiai.com/doi/abs/10.1556/JPC.28.2015.1.12

19. European Medicines Agency (EMA). ICH Topic Q 2 (R1) validation of analytical procedures: text and methodology. [Internet] [cited 2020 Jan 16]. Available from:

https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q-2-r1-validation-analytical-procedures-text-methodology-step-5_en.pdf

20. Fadeyi I, Lalani M, Mailk N, Van Wyk A, Kaur H. Quality of the antibiotics—amoxicillin and co-trimoxazole from Ghana, Nigeria, and the United Kingdom. The American journal of tropical medicine and hygiene. [Internet] 2015 Jun 3;92(6_Suppl):87-94. [cited 2020 Apr 29]. Available from: https://www.ajtmh.org/content/journals/10.4269/ajtmh.14-0539

21. Fox JC, Szyjkowski RS, Sanderson SO, Levine RA. Progressive cholestatic liver disease associated with clarithromycin treatment. The Journal of Clinical Pharmacology. [Internet] 2002 Jun;42(6):676-80. [cited 2019 Jun 23]. Available

from:https://accp1.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1177/00970002042006011

22. Gocan S. Stationary phases for thin-layer chromatography. Journal of chromatographic science. [Internet] 2002 Nov 1;40(10):538-49. [cited 2020 Apr 27]. Available from:

https://academic.oup.com/chromsci/article/40/10/538/534455

23. Golocorbin-Kon S, Lalic-Popovic M, Pavlovic N, Vukmirovic S, Hogervorst JC, Maksimovic V, Mikov M. Counterfeit Drugs as A Common Risk For The Successful Treatment. Clinical Therapeutics. [Internet] 2017 Aug 1;39(8):e30. [cited 2020 Apr 29]. Available from: