DARBAS ATLIKTAS FARMOKOGNOZIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „KVAPIOJO MAIRŪNO (ORIGANUM MAJORANA L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ, ETERINIO ALIEJAUS IR

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS“. 1. Yra atliktas mano paties.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-21 Matas Gimbutas

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-21 Matas Gimbutas

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-21 Audronis Lukošius

KATEDROJE

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-21 Sonata Trumbeckaitė

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

MATAS GIMBUTAS

KVAPIOJO MAIRŪNO (ORIGANUM MAJORANA L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ

JUNGINIŲ, ETERINIO ALIEJAUS IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Doc. dr. Audronis Lukošius

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data:

KVAPIOJO MAIRŪNO (ORIGANUM MAJORANA L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ

JUNGINIŲ, ETERINIO ALIEJAUS IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. dr. Audronis Lukošius Data

Recenzentas Darbą atliko:

Magistrantas

Data Matas Gimbutas

Data

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1. Kvapiųjų mairūnų (Origanum majorana L.) morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 13

1.2. Kvapiųjų mairūnų biologiškai aktyvios medžiagos ... 14

1.3. Kvapiųjų mairūnų farmakologinės savybės ... 15

1.4. Fenolinių junginių apžvalga, klasifikacija ... 19

1.5. Flavonoidų apžvalga, klasifikacija ... 19

1.6. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 20

1.7. Kvapiųjų mairūnų žolės eterinis aliejus ... 21

1.8. Dujų chromatografija – masių spektometrija ... 22

1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 22

2. TYRIMO METODIKA ... 24

2.1. Tyrimo objektas ... 24

2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ... 24

2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ... 24

2.4. Tyrimų shema ... 25

2.5. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 25

2.6. Tiriamųjų ekstraktų paruošimas ... 26

2.7. Tyrimo metodai ... 26

2.7.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 26

2.7.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27

2.7.3.1. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu ... 27

2.7.3.2. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS katijonų - radikalų surišimo metodu ... 28

2.7.3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP redukcinio aktyvumo metodu ... 29

2.7.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 29

2.7.5. Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodu ... 30

2.8. Statistinė duomenų analizė ... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimas kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų augalinėms žaliavoms ... 31

3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 32

3.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 33

3.4. Kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 34

3.5. Kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų cheminė analizė ESC metodu ... 35

3.6. Kvapiųjų mairūnų žaliavų fenolinių junginių kiekybinės sudėties ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinių ryšių įvertinimas ... 38

3.7. Kvapiųjų mairūnų žolės eterinio aliejaus sudėties nustatymas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu ... 39

4. IŠVADOS ... 42

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43

SANTRAUKA

M. Gimbuto magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. Audronis Lukošius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Darbo tiriamasis objektas kvapusis mairūnas (Origanum majorana L.) – notrelinių (Lamiaceae) šeimos daugiametis, fenolinius junginius, flavonoidus bei eterinius aliejus kaupiantis vaistinis augalas.

Origanum majorana L. pasižymi virškinimą gerinančiu, uždegimą mažinančiu, raminančiu, kraujo

spaudimą mažinančiu poveikiu.

Tyrimo tikslas: nustatyti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekius, antioksidacinį aktyvumą ir eterinio aliejaus komponentus kvapiųjų mairūnų (Origanum majorana L.) augalinėje žaliavoje, palyginti šių junginių pasiskirstymą lapuose, stiebuose ir žieduose.

Tyrimo uždaviniai: parinkti kvapiųjų mairūnų žiedų, stiebų ir lapų fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas. Nustatyti bendrą fenolinių junginių, flavonoidų kiekį augalinės žaliavos lapų, stiebų ir žiedų ekstraktuose. Nustatyti laisvųjų radikalų surišimo gebą ir redukcinį aktyvumą kvapiųjų mairūnų žolės ekstraktų mėginiuose. Įvertini kvapiųjų mairūnų fenolinius junginius efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Identifikuoti Origanum majorana L. eterinio aliejaus komponentus dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

Tyrimo objektas ir metodai: objektas – kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų ėminiai. Bendras fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinis aktyvumas kvapiųjų mairūnų žieduose, stiebuose ir lapuose nustatytas UV–VIS spektrofotometriniu analizės metodu. Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių sudėties analizė atlikta taikant ESC metodą. Kvapiųjų mairūnų žolės eterinių aliejų sudėtis nustatyta dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

Tyrimo rezultatai ir išvados: optimalios ekstrakcijos sąlygos fenolinių junginių kiekio nustatymui kvapiųjų mairūnų žaliavoje, tai tirpiklis – 70 proc. (V/V) etanolis ir 30 min. ekstrakcijos trukmė veikiant ekstraktą ultragarsu. Didžiausias fenolinių junginių kiekis aptiktas kvapiųjų mairūnų žieduose yra 9,27 ± 0,41 mg GRE/g, panašus fenolinių junginių kiekis – 8,75 ± 0,34 mg GRE/g aptiktas lapuose, o mažiausias kiekis – stiebuose 4,13 ± 0,31 mg GRE/g (p<0,05). Nustatytas flavonoidų kiekis kvapiųjų mairūnų lapuose – 5,75 ± 0,65 mg RE/g, žieduose – 4,27 ± 0,261 mg RE/g, stiebuose – tik 2,13 ± 0,106 mg RE/g (p<0,05). Antioksidacinis aktyvumas stipriausiai pasireiškė vaistinės augalinės žaliavos lapuose, mažiausiai – stiebuose. Nustatytas stiprus koleriacinis ryšys tarp bendro fenolinių junginių kiekio, bendro flavonoidų kiekio ir redukcinio aktyvumo, įvertinto FRAP metodu (atitinkamai 0,948 ir 0,982). Taikant efektyviąją skysčių chromatografiją augalinėje žaliavoje identifikuoti šie junginiai: izokvercitrinas, rozmarino, chlorogeno, kavos, p-kumaro ir ferulo rūgštys. Visuose augalo tirtuose organuose nustatytas dominuojantis junginys – rozmarino rūgštis. Dujų chromatografijos – masių

spektrometrijos metodu kvapiųjų mairūnų žolėje identifikuoti eterinio aliejaus komponentai, kurių pagrindinis buvo terpinen-4-olis, kuris sudarė net 29,61 ± 1,09 % visos eterinio aliejaus sudėties.

SUMMARY

Marjoram (Origanum majorana L.) is a perennial medicinal plant of Labiatae (Lamiaceae) family. It accumulates many biologically substances such as phenolic compounds, flavonoids, essential oils.

Origanum majorana L. is a perspective herb for its antiinflammatory, hypotensive, sedative effect and

digestive benefits.

The title of the master thesis: Analysis of phenolic compounds, essential oil and antioxidant activity of marjoram (Origanum majorana L.)

The aim of the research: to determine the total phenolic compounds, flavonoid content, antioxidant activity and to identify components of essential oil in marjoram (Origanum majorana L.) raw material and to compare their distribution in leaves, stems and blooms.

The tasks of the research: to select the extraction conditions of phenolic compounds from the samples of leaves, stems and blooms of marjoram. To determine total phenolic compounds and total flavonoids content in the samples of leaves, stems and blooms of marjoram extracts. To determine the free radical scavenging and the fluorescence recovery after photobleaching of marjoram herb extracts. To evaluate phenolic compounds in leaves, stems and blooms of marjoram by high-performance liquid chromatography method. To identify Origanum majorana L. components of essential oil by gas chromatography – mass spectrometry.

The objectives of the research: object – sample of marjoram leaves, stems and blooms. The total phenolic compounds, flavonoid content, antioxidant activity in marjoram blooms, leaves and stems was determined by UV–VIS spectrophotometric analysis method. Qualitative and quantitative analysis of the phenolic compounds was performed using the ESC method. Composition of essential oil in marjorm was determined by gas chromatography – mass spectrometry method.

The results and conclusions of the research: optimal extraction conditions for the determination of phenolic compounds of marjoram raw material are solvent - 70 percent (V/V) ethanol and ultrasound effect for extract by duration of 30 min. The highest content of total phenolic compounds were determined in marjoram blooms 9,27 ± 0,41 mg GRE/g, in leaves there was similar amount of total phenolic compounds – 8,75 ± 0,34 mg GRE/g, and the lowest content were determined in stems 4,13 ± 0,31 mg GRE/g (p<0,05). Total amount of flavonoids of marjoram leaves – 5,75 ± 0,65 mg RE/g, blooms – 4,27 ± 0,261 mg RE/g and stems – 2,13 ± 0,106 mg RE/g (p<0,05). The strongest antioxidant activity was determined in extracts of leaves, the weakest – in stems. The strong correlation was determined between the total amount of phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity, which was measured by FRAP method (accordingly 0.948 and 0.982). The phenolic compounds (isoquercitrin, rosmarinic, chlorogenic, caffeic, p-coumaric and ferulic acids) were identified by high-performance liquid chromatography method. Rosmarinic acid was discovered to be the dominant compound of all

marjoram parts. Terpinen-4-ol – dominant compound accounting for 29,61 ± 1,09 % of all majoram essential oil, which was identified by gas chromatography – mass spectrometry method.

PADĖKA

Dėkoju darbo vadovui doc. dr. Audroniui Lukošiui už vertingus patarimus ir konsultacijas atliekant baigiamąjį magistro studijų darbą.

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, farmacijos fakulteto, analizinės ir toksikologinės bei farmokognozijos katedros dr. Mindaugui Marksai ir dr. Mindaugui Liaudanskui, už pagalbą, patarimus atliekant tyrimus, analizuojant duomenis.

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas;

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; EO – eterinis aliejus;

FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia; GRE – galo rūgšties ekvivalentas;

GS – MS – dujų chromatografija – masių spektrometrija; ORAC – deguonies radikalų absorbcijos galia;

RE – rutino ekivalentas; TE – trolokso ekvivalentas.

ĮVADAS

Augalai savyje kaupia įvairių veiklių ir gydomąją galią turinčių medžiagų. Tai yra eteriniai aliejai, mineralinės, skaidulinės ir rauginės medžiagos, fenoliai, flavonoidai, vitaminai, glikozidai bei daugelis kitų komponentų esančių augaluose. Vienos jų veikia ligų sukėlėjus, o kitos – veikia atskirus organus bei jų funkcijas, trečiosios – papildo organizmo atsargas vitaminais ar kitais mikroelementais. Vaistiniai augalai ganėtinai plati augalų grupė, kurios dalys yra naudojamos kaip žaliava vaistiniams preparatams. PSO duomenimis yra apie 35 tūkstančiai augalų rūšių, tinkančių naudoti gydymo tikslais [1]. Europoje, farmacijos pramonė apsiriboja 1200 vaistinių augalų, o Lietuvos tradicinėje bei liaudies medicinoje aptinkama žymiai mažiau, tik apie 460, augalų [2]. Iš augalinių žaliavų ir sintetintų veikliosios medžiagos atitikmenų yra pagaminama beveik trečdalis visų pasaulio vaistų rinkos. Vaistiniai augalai yra svarbūs farmacijoje ir medicinoje. Daugelis jų yra vartojami kaip maistiniai, prieskoniniai ar net nuodingieji augalai. Šiomis savybėmis pasižymintys augalai yra universalūs, tačiau riba tarp jų savybių sunkiai apibrėžiama ir priklauso nuo vartojimo aplinkybių.

Kvapusis mairūnas (Origanum majorana L.) – notrelinių (Lamiaceae) šeimos augalas, vartojamas ne tik farmacijoje, bet ir maisto pramonėje. Kvapiųjų mairūnų žolė gerina apetitą, mažina vidurių pūtimą, skatina skrandžio sulčių išskyrimą, o jo eterinis aliejus pasižymi atsikosėjimą lengvinančiu, kraujo apytaką gerinančiu ir kraujo spaudimą mažinančiu poveikiu [3]. Kvapiųjų mairūnų mišiniai su ramunėlėmis mažina galvos skausmą, slopina, gydo uždegimus. Kvapiųjų mairųnų žolės eterinis aliejus dėl aromato naudojamas degtinės ar likerių gamyboje, o išdžiovinta žolė yra vartojama kaip prieskonis maistui [4]. Lietuvoje auginamas ganėtinai retai, tačiau pasaulio mastu, tai itin svarbus vaistinis ir prieskoninis augalas.

Pasaulyje atlikta nemažai kvapiųjų mairūnų kiekybinės ir kokybinės sudėties ir jų farmakologinio poveikio tyrimų. Lietuvoje ši augalinė žaliava cheminiu požiūriu dar nėra išsamiai tyrinėta, o fenolinių junginių ir jų antioksidacinio aktyvumo bei eterinio aliejaus tyrimų trūksta. Tikslinga ištirti ir nustatyti kvapiųjų mairūnų žolės fenolinius junginius, eterinius aliejus bei antioksidacinį aktyvumą, o gauti rezultatai pateiks naujų žinių apie augalinės žaliavos kaupiamų junginių sudėties skirtumų įvairovę skirtingose jo organo dalyse.

Darbo tikslas – nustatyti fenolinių junginių kiekio, antioksidantinio aktyvumo įvairavimą ir eterinio aliejaus komponentus kvapiųjų mairūnų (Origanum majorana L.) žolės, lapų ir stiebų mėginiuose.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: nustatyti fenolinių junginių kiekio, antioksidantinio aktyvumo įvairavimą ir eterinio aliejaus komponentus kvapiųjų mairūnų (Origanum majorana L.) lapų, stiebų ir žiedų mėginiuose. Darbo uždaviniai:

1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių kiekio nustatymui kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų mėginiuose.

2. Nustatyti bendrą fenolinių junginių, flavonoidų kiekio įvairavimą kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų mėginiuose.

3. Nustatyti laisvųjų radikalų surišimo gebą ABTS ir DPPH metodais ir redukcinį aktyvumą FRAP metodu kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų ekstraktų mėginiuose.

4. Ištirti kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

5. Identifikuoti kvapiųjų mairūnų žolės eterinio aliejaus komponentus dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Kvapiųjų mairūnų (Origanum majorana L.) morfologiniai požymiai ir

paplitimas

Origanum majorana L. – augalas iš notrelinių (Lamiaceae)šeimos, dar kitaip vadinamas (sin.

Majorana hortensis Moench), paprastai žinomas kaip kvapusis mairūnas. Pavadinimas „Oregano“ kilo iš graikų kalbos žodžių óros – reiškia kalnus, o „ganos“ reiškia šviesą/ džiaugsmą, todėl dėl savo grožio ir gausumo Viduržemio jūros kalnų pakrantėse paprastai vadinamas „kalnų džiaugsmu“ [5]. Origanum

majorana L. yra daugiametis augalas. Tai šalčiui jautrus, aromatinis augalas, užaugantis iki 30–60 cm

aukščio. Stiebai statūs, šakoti, prie pagrindo sumedėję, tačiau ploni, todėl ganėtinai silpni bei turintys raudonas dėmes [6]. Lapai yra trumpakočiai, kiaušiniški arba elipsiški, pilkai žalios spalvos, išsidėstę vienas priešais kitą stiebe. Jie yra 0,5–1,5 cm ilgio ir 0,2–0,8 cm pločio, nepaprastai lygūs ir glotni dėl daugybės plaukelių esančių ant jų [7]. Mairūnai turi baltus ar šviesiai rausvus smulkius žiedus su pilkai žaliomis pažiedėmis. Jie ne didesni nei 0,3 cm ilgio ir susitelkę į žiedynus – tankias, apskritai ovališkas 1,3 cm ilgio varpas [8]. Sėklos yra mažos, ovalios, tamsiai rudos spalvos, kurios subręsta nuo rugpjūčio iki rugsėjo. Išorinis šaknies paviršius yra tamsiai rudas, o vidus yra šviesiai rudos spalvos su keliais ilgais šakniastiebiais.

Sėklos subręsta ganėtinai retai ir dažnai būna nedaigios, todėl mairūną reikia dauginti vegetatyviniu būdu. Vaistams ir prieskoniams dažniausiai naudojama žolė, kuri renkama žydėjimo pradžioje, lapai, rečiau žiedų pumpurai ar sėklos. Žaliava turi būti išdžiovinama ir laikoma tamsioje aplinkoje. Ji turi specifinį kvapą, gana aitroką bei truputį deginantį skonį. Nuo šviesos gali patamsėti, arba pajuoduoti visos žalios spalvos dalys, todėl žaliava gali prarasti ne tik prekinę išvaizdą, bet ir vertingąsias savybes. Kvapusis mairūnas yra kilęs iš Kipro, Antalijos (Turkija) ir Viduržemio jūros regiono dalių. Dėl savo skonio ir kvapo jis auginamas visame pasaulyje – skirtingose Indijos, Prancūzijos ir JAV dalyse [9]. Mairūnas, kurio kilmės šalis yra Azija, Europoje buvo atrastas kaip graikų

ir romėnų vienas mėgstamiausių augalų. Paprastai auginamas Indijoje ir plačiai paplitęs vidutinio klimato Himalajų regionuose 500–1200 m aukštyje. Lietuvoje dėl vėsoko klimato yra gana retas, tačiau auginamas soduose, daržuose [10].

1.2. Kvapiųjų mairūnų biologiškai aktyvios medžiagos

Mokslinėje literatūroje yra pateikta daug kvapiųjų mairūnų fitocheminės sudėties tyrimų. Biologiškai aktyvios medžiagos juose nustatytos taikant dujų chromatografijos, efektyviosios skysčių chromatografijos, atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodus. Apžvelgus literatūrą, įvertinta Origanum majorana L. fitocheminė sudėtis.

Origanum majorana L. pasižymi gausia, turinčia daugybę junginių, sudėtimi [11]. Atlikta

kvapiųjų mairūnų žolės ekstraktų fitocheminė analizė parodė, jog ekstraktuose yra flavonoidų, taninų, glikozidų, širdies glikozidų, sterolių, terpenoidų, o vandeniniame ekstrakte atitinkamai yra saponino ir angliavandenių [6]. Kvapiųjų mairūnų žolės pagrindiniai komponentai yra eteriniai aliejai, tokie kaip terpinen-4-olis, cist-sabineno hidratas, p-cimenas, sabinenas ir α-terpineolis, o svarbiausios šio vaistinio augalo žolės eterinio aliejaus sudedamosios dalys yra karvakrolis ir timolis [5]. Pagrindinę augalo dalį sudaro monoterpenoidai, seskviterpenoidai, linalilacetatas, terpenilo acetatas, granilacetatas 18 (terpeno esteris), oleanolio rūgštis ir ursolio rūgštis [9][12].

Galo rūgštis, kavos rūgštis, p-kumaro rūgštis, ferulo rūgštis, apigeninas, trans-2-hidro-cinaminė rūgštis – fenoliniai junginiai randami mairūnų žolėje [5]. Augalas kaupia didžiulį kiekį arbutino, 6-o-4-hidroksibenzoilo arbutino ir 2-hidroksi-3-(3,4-dihidroksifenil) propiono rūgšties. Katechinas, rutinas, kvercetinas taip pat gausiai aptinkami kvapiajame mairūne [5].

Kavos rūgštis, karnozolio rūgštis, karnosolis, labiato rūgštis ir rozmarino rūgštis – įvairių tipų taninai, randami kvapiųjų mairūnų žolėje [12][13]. Riebalų rūgštys, t. y. linolo rūgštis ir oleino rūgštis nustatytos mairūnų lapuose, o žolėje randama nemažai vitaminų A ir C [14].

Maistinė džiovintų lapų 100 g analizė: energija 271 kcal, angliavandeniai 60,56 g, riebalai 7,04 g, cholesterolis 0 mg, maistinės skaidulos 40,3 g; (vitaminai) folatai 274 μg, niacinas 0,902 mg, pantoteno rūgštis 0,209 mg, piridoksinas 1,190 mg, riboflavinas 0,316 mg, tiaminas 0,289 mg, vitaminas A 8058 UI, vitaminas C 51,4 mg, vitaminas E 1,69 mg, vitaminas K 621,7 μg; (elektrolitai) natrio 77 mg, kalio 1522 mg; (mineralai) kalcis 1990 mg, varis 1,133 mg, geležis 82,71 mg, magnis 346 mg, manganas 5,433 mg, cinkas 3,60 mg; (fitonutrientai) karotinas-ß 4806 μg, kriptoksantinas-ß 70 μg, liuteinas-zeaksantinas 1895 μg [15].

1.3. Kvapiųjų mairūnų farmakologinės savybės

Kvapusis mairūnas kaip vaistinis augalas vartotas jau nuo senų laikų. Hipokratas jį naudojo kaip antiseptinę priemonę. Senovės graikų jis buvo vadinamas „Amarakos“ – meilės, garbės ir laimės simbolis. Aristotelis jį laikė tarsi priešnuodį. Senovės Egipte mairūnai buvo naudojami dezinfekuoti ir konservuoti maistą, o jo aliejus buvo skirtas masažuoti kaktą ir stiprinti plaukus.

Tradiciškai kvapiųjų mairūnų lapai buvo vartojami diabetui, nemigai, kataraktai, astmai ir net nervingumui gydyti [16]. Šiandien jis dažniausiai aptinkamas Viduržemio jūros regione arba auginamas visuose pasaulio soduose. Kvapiųjų mairūnų eterinis aliejus gerina virškinimą, nes padidėja virškinimo fermentų ir seilių kiekis. Šis aliejus taip pat gerinana apetitą, slopinama pykinimą ir vidurių pūtimą, mažina žarnyno infekcijų riziką, lengvina vidurių užkietėjimą, tulžies akmenų susidarymą, vidurių pūtimą ir dujų susikaupimą virškinimo trakte bei mažina skrandžio spazmus [17][18]. Kvapusis mairūnas pasižymi antiseptinėmis, antibakterinėmis, priešgrybelinėmis ir antivirusinėmis savybėmis ir yra vartojamas daugeliui įprastų ligų gydyti, tokių kaip apsinuodijimas maistu, infekcijos, vidurių šiltinė, maliarija, gripas, peršalimas, kiaulytė ar tymai [10]. Mairūnas vartojamas širdies ir kraujagyslių ligų profilaktikai bei kraujotakos sistemos stiprinimui, taip pat gali būti skirtas kraujo spaudimui ar cholesterolio kiekiui kraujyje mažinti. Jis turi priešuždegiminį poveikį ir gali būti vartojamas, pavyzdžiui, astmos priepuoliams, raumenų spazmams, galvos skausmams, migrenai, karščiavimui ir kūno skausmams malšinti. Kvapusuis mairūnas skirtas ir vietiniam vartojimui – sąnarių, raumenų, sausgyslių patempimo, nugaros ir dantų skausmams malšinti [18]. Peršalus ir kosint gan efektyvios yra mairūnų inhaliacijos. Kvapusis mairūnas taipmpat vartojamas esant emociniams bei neurologiniams sutrikimams. Jis mažina nemigą, malšina stresą ir lengvus nervinės įtampos simptomus, didina seksualinio potraukio kontrolę [19]. Kai kurios moterys geria mairūno žolės arbatą tam, kad palengvintų menopauzės simptomus, nuotaikų svyravimus, susijusius su mėnesinėmis, padėtų mėnesinėms prasidėti ar net skatintų motinos pieno tekėjimą [20].

Antiseptinis poveikis. Antiseptikai tai yra antimikrobinės medžiagos, kurios yra naudojamos sumažinti infekcijos plitimo riziką. Jau senovėje Hipokratas aprašė mairūnų žolės antiseptinį poveikį, kurį sąlygoja sudėtyje esantys fenoliniai junginiai. Eteriniai aliejai, tokie kaip terpinen-4-olis, cis-sabineno hidratas, p-cimenas ir α-terpineolis, karvakrolis ir timolis yra svarbios sudedamosios dalys, atsakingos už antiseptinį aktyvumą [16]. Tyrimais nustatyta, kad kvapiųjų mairūnų žolės metanolinis ekstraktas pasižymi dideliu antimikrobiniu aktyvumu, nes veikia mikroorganizmus, tokius kaip

Aspergillus niger, Fusarium solani ir Bacillus subtilis. Šis metanolinis ekstraktas buvo aktyvesnis prieš Aspergillus niger nei polienų grupės antibiotikas nistatinas. Mokslininkai Farooqi ir Sreeramu (2004)

nustatė, kad mairūnų lapai veikia Bacillus anthracis, Proteus vulgaris, Salmonella stanley, S. newport,

mairūnų lapų išskirti eteriniai aliejai pasižymi antibakteriniu poveikiu įvairioms bakterijoms (Bacillus

cereus, Escherichia coli, Staphylococcus coagulase, Enterobacter spp., Proteus spp., Acinetobacter spp., S. aureus, E. coli, K .pneumoniae ir Pseudomonas spp.), taikant Kirby-Bauerio metodą. Įvertinus

koncentraciją, Origanum majorana L. etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai pasižymėjo antimikrobiniu poveikiu prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas. Etanoliniai ekstraktai, lyginant su vandeniniais ekstraktais, pasižymėjo efektyviu bakterijų dauginimąsį slopinančiu poveikiu [22]. Eteriniai aliejai, išskirti iš kvapiųjų mairūnų lapų, pasižymėjo priešgrybeliniu poveikiu Aspergillus

flavus ir A. parasiticus grybams. Augalinės žaliavos ekstraktų tyrimai in vitro parodė priešgrybelinį

poveikį šešioms Candida spp. mielių padermėms. Didžiausias mairūnų ekstraktų priešgrybelinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant n-hekseną kaip augalinės žaliavos ekstrahentą [23].

Antioksidantinis poveikis. Kvapiųjų mairūnų etanolio ekstraktas rodo antioksidantų ir laisvųjų radikalų aktyvumą, naudojant kolorimetrinius tyrimus. Stiebo ir šaknų etanoliniai ekstraktai parodė antioksidacinį aktyvumą in vitro, naudojant spektrofotometrinį metodą DPPH [24]. Nustatyta, kad IC50 vertės yra palyginamos su askorbo rūgštimi ir šaknies etanolinio ekstrakto redukciniu gebėjimu [25]. Mairūnų lapų etilo alkoholio, n-heksano ir vandeniniai ekstraktai parodė antioksidacinį poveikį in

vitro, kuriems buvo naudotas DPPH metodas. Origanum majorana L. stiebo ir šaknų etanoliniai

ekstraktai pasižymėjo stipriu antioksidaciniu aktyvumu, nes mažino laisvųjų radikalų aktyvumą ir metalų chelavimo savybes, buvo palyginti su tokiais standartais kaip askorbo rūgštis, kuri gali lemti flavonoidų, fenolių, taninų ir triterpenoidų buvimą [8].

Antiepileptinis poveikis. Nustatyta, kad vartojant kvapiųjų mairūnų ekstrakto 500 mg/kg kūno svorio dozę, pasireiškė reikšmingas antiepileptinis poveikis pentilenetetrazolio (PTZ) ir maksimalaus elektrošoko (MES) sukeltiems traukuliams. Populiariausi ir plačiausiai naudojami yra gyvūnų traukulių modeliai – tradicinis MES ir PTZ testas. Laikoma, kad MES testas yra tikėtino terapinio veiksmingumo prieš generalizuotus toninius – kloninius traukulius. Atvirkščiai, PTZ testas yra tinkamas pavyzdys žmogaus generalizuotiems miokloniniams priepuoliams. Taigi, rezultatai rodo, kad augalinės žaliavos ekstraktai gali būti veiksmingi nuo generalizuotų žmogaus miokloninių priepuolių. Taip pat, PTZ ir chemokonvulsantas sukelia traukulius, slopindamas chloro jonų kanalo funkciją, prisijungdamas prie pikrotoksino vietos gama amino sviesto rūgštį (GABA) receptorių komplekse. Nurodyta, kad PTZ sukeltus traukulius galima nuslopinti vaistais, kurie sustiprina GABAA receptorių inicijuotą slopinančią neurotransmisiją. Preliminari fitocheminė analizė, atlikta šiame tyrime, parodė, kad terpenoidai, steroidai ir flavonoidai yra pagrindiniai kvapiųjų mairūnų ekstraktų komponentai. Tyrimai su žiurkėmis, kurioms buvo duota 250 ir 500 mg/kg kūno svorio kvapiųjų mairūnų lapų ekstrakto bei taikant PTZ ir MES testus parodė, kad augalinės žaliavos ekstraktai pasižymėjo antiepileptiniu poveikiu [26].

Anksiolitinis poveikis. Tyrimo metu su žiurkėmis, taikant atvirojo labirinto modelį, į pilvaplėvės ertmę suleidus 200 mg/kg kūno svorio kvapiųjų mairūnų lapų ekstrakto pastebėta, kad ekstraktas sukėlė anksiolitinį poveikį. Nustatytas poveikis buvo panašus į diazepamo veikimą [27][28]. Insekticidinis aktyvumas. Iš kvapiųjų mairūnų lapų išskirti eteriniai aliejai pasižymėjo insekticidiniu poveikiu prieš Spodoptera littoralis ir Aphis fabae bei Aspergillus spp [29][30]. Eteriniai aliejai taip pat pasižymėjo kiaušinėlius galinčiu naikinti veikimu nuo insekticidams jautrių, bet piretroidams atsparių P.h.capitis. Eteriniai aliejai ir jo sudedamosios dalys, terpinen-4-olis ir r-terpineolis buvo tarsi fumigantai, turintys kontaktinį poveikį kontroliuojant P.h.capitis ir jos dedamiems kiaušinėliams [25].

Antipodagrinis poveikis. Ikiklinikinio tyrimo metu žiurkėms, kurioms kalio oksonatu buvo sukelta podagra, buvo duodama kvapiųjų mairūnų stiebų ir šaknų etanolinio ekstrakto (200 mg/kg kūno masės ir 400 mg/kg kūno masės atitinkamai). Rezultatai parodė, kad reikšmingai sumažėjo šlapimo rūgšties ir kreatino kiekis bei padidėjo sumažėjusi glutationo koncentracija [31].

Antidiabetinis poveikis. Kvapųjų mairūnų lapų metanoliniai ekstraktai parodė antidiabetinį poveikį pelėms, kurioms streptozotocinu buvo sukeltas cukrinis diebetas. Tyrimais in vitro ir in vivo nusatyta, kad Origanum majorana L. ekstraktas sėkmingai padėjo kontroliuoti graužikų cukraus kiekį kraujyje. Poveikis buvo stipresnis už aminoguanidino antidiabetinį poveikį [32].

Antimutageninis poveikis. Mairūnų antžeminės dalies etanolinis ekstraktas parodė antimutageninį poveikį pelių mutacijai sukeltai ciklofosfamido, vartojant mažiausią veiksmingą 125 mg/kg dozę. Buvo nustatyta, kad mairūnų ekstrakto poveikis apsaugo bet kokius RNR, DNR ir baltymų kiekio pokyčius pelių kepenyse ir sėklidėse [33].

Priešnavikinis poveikis. Kvapiųjų mairūnų ekstraktai reikšmingai slopino krūties vėžio ląstelių migraciją ir invaziją. Augalo ekstraktai mažina krūties vėžio ląstelių sukibimą su žmogaus virkštelės venų endotelio ląstelėmis. Tokiu būdu slopinančiai veikia vėžinių ląstelių migraciją per endotelyje esantį navikų nekrozės faktorių. Proceso metu slopindami tam tikrus reikšmingus faktorius, sumažina azoto oksido gamybą vėžinėse ląstelėse, todėl slopina auglių augimą ir jų metastazavimą [12].

Hepatoprotektinis poveikis. Nustatyta, kad makrofagų uždegiminis baltymas CCL4 žiurkėms sukelia kepenų pažeidimus. Tyrimo metu šiems graužikams buvo duota 200 mg/kg ir 400 mg/kg kūno svorio mairūnų žolės metanolinio ekstrakto, ko pasekoje buvo stebimas reikšmingas toksinio CCL4 poveikio sumažėjimas [34].

Analgezinis, priešuždegiminis ir antispazminis poveikis. Mokslininkas Okazaki ištyrė kvapiųjų mairūnų metanolinių ekstraktų poveikį žmogaus trombocitų aktyvumui, kuris yra susijęs su gerai žinomu NVNU (nesteroidinių vaistų nuo uždegimo) veikimo mechanizmu, slopinant prostaglandinų metabolizmo kelią. Jis nustatė, kad ekstraktai, priklausomai nuo dozės, slopina kolageno (2,0 μg/ml) arba ADP (adenozino difosfato) (2,0 μg/ml) sukeltą trombocitų agregaciją. [35][36].

Imunostimuliacinis, antimutageninis ir priešvėžinis poveikis. Anot mokslininko Krukowskio tyrimo, imunoglobulino (IgG) kiekio padidėjimas pastebėtas veršelius šeriant įprastiniu koncentratu, papildytu mineralinių žolelių mišiniu, kuriame yra kvapiojo mairūno ir jo vandeninių ekstraktų, kurie galėjo slopinti kepenų mutageniškumą [37]. Priešnavikinis aktyvumas arba citotoksinis poveikis in vitro skirtingoms naviko ląstelėms taip pat buvo priskiriamas Origanum majorana L. ekstraktams ar jų sudedamosioms dalims pagal kitus mokslininkus (Assaf ,Okuyama,Hirobe ir kt.). Tiriant citotoksinį poveikį, buvo vertinamas kvapiojo mairūno vandeninių – alkoholinių ekstraktų ir pavienių junginių (arbutino, metilarbutino ir jų aglikonų - hidrochinono ir hidrochinono monometilo eterio) poveikis [38].

Antiparazitinis poveikis. Kvapiųjų mairūnų eterinio aliejaus vartojimas gydant varozę, kurią sukelia V. jacobsoni erkės, sulaukė daugelio autorių dėmesio. Skruzdžių rūgšties ir mairūnų eterinio aliejaus derinys pasirodė esąs labai efektyvus prieš Varroa erkes tiek laboratoriniuose, tiek lauko eksperimentuose. Lauko eksperimentuose, kurie buvo atlikti atogrąžų (Vietnamas) ir vidutinio klimato (Vokietija) sąlygomis, skruzdžių rūgštis buvo užpilama ant marle uždengto padėklo ir dedama ant apatinės avilio lentynos, o eterinis aliejus buvo užpilamas ant dviejų medžio gabaliukų (po 1,5 ml kiekvienam), kurie buvo dedami ant viršaus. Eterinio aliejaus ir skruzdžių rūgšties derinys, kuriame skruzdžių rūgšties koncentracija buvo 15 %, sąlygojo 96,24–99,68 % erkių mirtingumą atogrąžų klimato sąlygomis ir 97,56–99,92 % vidutinio klimato sąlygomis. Dėl palyginti mažų skruzdžių rūgšties koncentracijų šis derinys neturėjo įtakos bičių mirtingumui ir buvo pasiūlytas kaip perspektyvus praktinis metodas erkių kiekiui kontroliuoti. Labai stiprus antiparazitinis poveikis buvo pastebėtas

Varroa erkėms, o eterinio aliejaus koncentracijos bitėms nebuvo kenksmingos. Veiksmingas

antiparazitinis poveikis taip pat buvo pastebėtas, kai ant bičių kolonijų, užkrėstų erkėmis, buvo purškiama eteriniu aliejumi. Nustatyta, kad eterinio aliejaus koncentracija (100 ppm) nepasižymėjo toksiniu poveikiu bitėms. Taip pat įrodyta, kad Origanum majorana L. eterinis aliejus pasižymėjo stipriu akaricidiniu poveikiu prieš Acarapis woodi – akarinarinę ligą sukeliantį parazitą, kuris žiemą ir ankstyvą pavasarį įsiskverbia į bičių trachėjos sistemą. Užkrėtimo procentas bičių šeimų, gydytų eteriniu aliejumi, reikšmingai sumažėjo jau po 15 gydymo dienų, o jau po 30 gydymo dienų tarp bičių užsikrėtimo nebuvo nustatyta [39].

Insekticidinis ir nematidinis poveikis. Tyrimais nustatyta, kad kvapiųjų mairūnų eterinis aliejus, kurio pagrindinis junginys yra 4-terpinenas, sėkmingai veikė fitonematodus (Rotylenchulus

reniformis, Criconemella spp., Hoplolaimus spp.). Rezultatas – net 80 % sumažėjęs kirmėlių

1.4. Fenolinių junginių apžvalga, klasifikacija

Fenoliniai junginiai yra didelė grupė biologiškai aktyvių medžiagų. Tai antriniai augalų metabolitai, atsakingi už pagrindines augimo, apsaugines ir organoleptines augalo savybes bei dalyvaujantys ląsteliniuose ar tarpląsteliniuose fiziologiniuose procesuose. Šie junginiai turi vieną ar daugiau hidroksilo grupių, prijungtų prie aromatinio žiedo. Fenoliniai junginiai, tai viena iš dažniausiai aptinkamų biologiškai aktyvių junginių grupių, kuri yra plačiai tyrinėjama mokslininkų dėl plataus poveikio spektro. Jie plačiai paplitę augalų karalystėje, tad randami beveik visuose augaluose bei augaliniame maiste. Dėl savo įvairių savybių jie svarbūs apsauginiuose žmogaus organizmo procesuose [42]. Atsižvelgiant į fenolinių grupių skaičių, junginiai skiriami į dvi dideles grupes: polifenolius ir paprastuosius fenolius. Fenoliniai junginiai pagal molekulės struktūrą yra skirstomi į: flavonoidus, fenolines rūgštis, ligninus, chinonus, kumarinus, stilbenus bei chromonus. Yra žinoma bei aprašyta daugiau kaip 10 000 šios grupės junginių [43].

1.5. Flavonoidų apžvalga, klasifikacija

Bendra flavonoidų apžvalga

Flavonoidai – natūralių medžiagų su įvairiomis fenolinėmis struktūromis grupė, sudaranti daugiau nei pusę visų fenolinių junginių [44]. Randami vaisiuose, daržovėse, vynuose, grūduose bei kitoje augalinėje žaliavoje [45]. Šie junginiai turi antioksidacinių, priešuždegiminių, antimutageninių, antibakterinių bei daugelį kitų savybių, todėl siejami su teigiamu poveikiu sveikatai ir naudojami farmacijos ir medicinos srityse. Flavonoidai anksčiau turėjo kitą pavadinimą ir buvo vadinami vitaminu P, kuris tobulėjant mokslo sritims, išaiškėjo esantis flavonoidas – rutinas [46].

Flavonoidų cheminė struktūra, klasifikacija

Flavonoidams yra būdinga C6-C3-C6 konfigūracija, jie yra sudaryti iš 15 anglies atomų [47].

Flavonoidų aglikono pagrindas susideda iš dviejų aromatinių žiedų A ir B, kurie yra sujungti trijų anglies atomų tilteliu ir kartu su deguonies atomu sudaro heterociklinį žiedą [48]. Flavonoidų klasifikacija pagrįsta propaninio fragmento oksidacijos laipsniu, šoninio fenilinio radikalo padėtimi, heterociklo dydžiu, prisijungusių cukrų molekulių kiekiu ir cukrų prisijungimo prie aglikono pobūdžiu [46][49]. Dėl struktūros skirtumų flavonoidai gali būti suskirstyti į šiuos poklasius: flavonolius, flavonus, flavanonus, antocianidinus, izoflavonus ir flavan–3–olius [50][46][49][51][52].

1.6. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai

Antioksidantai tai medžiagos, redukuojančios prooksidantą ir sudarančios mažai arba visiškai netoksiškus junginius ir taip apsaugančios ląsteles nuo žalingo ar kenksmingo poveikio [53]. Reaktyviojo deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formos skatina daugelio ligų atsiradimą (senėjimo procesai, širdies ir kraujagyslių ligos, depresija, katarakta, vėžys, reumatoidinis artritas, Alzhaimerio, Parkinsono, Hantingtono ligos ir kt.) [54]. Antioksidantai yra skirstomi į fermentinius ir nefermentinius. Fermentiniams priklauso superoksido dismutazė - fermentų ir kofermentų sistema, kurie katalizuoja superoksido anijonų skilimą. Jis randamas visose aerobinėse ląstelėse. Nefermentiniams antioksidantams priklauso egzogeniniai antioksidantai, tokie kaip vitaminas E, vitaminas C, selenas, karotinoidai, omega-3 ir omega-6 riebiosios rūgštys bei flavonoidai [55].

Antioksidantai reaktyvaus deguonies (ROS) ir reaktyvaus azoto (RNS) radikalus inaktyvina dviem pagrindiniais būdais. Vandenilio atomo perdavimo (HAT) ir elektronų perdavimo (SET), kurių atomo ir elektrono perdavimo reakcijos labai dažnai vyksta tuo pat metu. Tyrimo rezultatas – neutralizuotas prooksidantas, suteikiantis galimybę nustatyti antioksidantinį aktyvumą [56][57]. Taikant HAT nustatymo metodą, antioksidantas suriša laisvąjį radikalą, sudarydamas stabilų junginį, atiduodant vandenilio atomą. Reakcijos vyksta itin greitai, todėl mechanizmais paremtų nustatytų antioksidantinių savybių negalima pasikliauti pilnai, nes esant priemaišoms galimi klaidingi rezultatai. Iš visų žinomų vandenilio atomo perdavimo reakcijomis pagrįstų antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų, naudojama ORAC ir krocino bei β-karoteno blukinimo metodai [56].

Elektrono pernešimo reakcijų metu yra vertinamas antioksidanto gebėjimas atiduoti vieną elektroną ir redukuoti esantį oksidantą. Dažniausi taikomi metodai yra FRAP, CUPRAC, DPPH ir ABTS.

FRAP (geležies redukcijos antioksidacinė galia) suteikia galimybę įvertinti antioksidantų redukuojamą geležies kompleksą. Norint išvengti nuosėdų, reakcija yra vykdoma rūgštinėje terpėje, o gautos reikšmės lyginamos dažniausiai trolokso ar askorbo rūgšties tirpalu. Šiuo metodu junginių gebėjimas redukuoti Fe3+ į Fe2+ yra prilyginamas antioksidantiniam aktyvumui. Taip yra, nes dvivalentė geležis yra žinoma kaip prooksidantas, kuris gali surišti laisvuosius radikalus [57] [58] .

DPPH (2,2 -diphenyl-1-picrylhydrazyl) radikalo surišimo metodas yra vienas plačiausiai naudojamų antioksidantinio aktyvumo nustatymui. Reakcijos metu vyksta DPPH tirpalo spalvos pokytis dėl DPPH redukcijos reaguojant radikalui su antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčiu junginiu, tai yra iš violetinės spalvos pereina į šviesiai gelsvą. Metodas yra gana paprastas ir greitas, nereikalaujantis sudėtingos aparatūros [54][58].

ABTS (2,2`azino-bis(3-etilenbenzotiazolin-6-sulfono rūgštis) radikalo katijono surišimo metodas. ABTS radikalo katijonas turi būti generuojamas cheminiais reagentais arba fermentinių

reakcijų metu, todėl metodas yra šiek tiek sudėtingesnis ir ilgesnis nei DPPH. Tačiau radikalo katijonas gali būti ištirpintas organiniuose tirpikliuose ir vandenyje, todėl antioksidantinis aktyvumas gali būti vertinamas ir pagal hidrofilinius junginius [58][59].

CUPRAC (vario redukcijos antioksidantinė galia) šis metodas yra paremtas dvivalenčio vario – neokuproino komplekso redukcija į vienvalenčio vario – neokuproino kompleksą, kuriame reduktorius yra antioksidantas. Metodas, atliekamas neutralioje terpėje, yra pakankamai tikslus, nes medžiagos, kurios nėra tikrieji antioksidantai, CUPRAC reagentu neoksiduojamos [60].

1.7. Kvapiųjų mairūnų žolės eterinis aliejus

Eteriniai aliejai – sudėtingi įvairios cheminės struktūros bei sudėties biologinės kilmės medžiagų mišiniai [61][62]. Kvapiųjų mairūnų žolėje eterinio aliejaus yra aptinkama nuo 0,5 % iki 1 %. Mokslininkų teigimu, kvapiųjų mairūnų eterinio aliejaus tiek kokybinė, tiek kiekybinė sudėtis gali skirtis. E. Vagi ir kiti autoriai nustatė, kad terpinen-4-olis yra pagrindinis kvapiųjų mairūnų eterinio aliejaus sudėties komponentas, kurio rasta daugiau nei 20 %, taip pat nustatytas nemažas kiekis kitų eterinio aliejaus sudėtinių dalių, tokių kaip γ-terpineno ir -terpinoleno [63]. Pasak J. Novak bei kitų autorių, eterinio aliejaus sudėtyje randama taip pat didelė dalis karvakrolio 22 % [9]. Apžvelgus mokslinę literatūra bei tyrimus, matome įvairių kvapiųjų mairūnų eterinio aliejaus sudėties skirtumų, tačiau straipsniuose vyrauja ir bendri nustatyti šios augalinės žaliavos eterinio aliejaus komponentai: p-cimenas, α-tujenas, sabinenas, terpinenas, cis-sabineno hidratas, timolis, karvakrolis, terpinen-4-olis ir kt. [64]. Eterinių aliejų sudėtis priklauso nuo daugelio faktorių: augalo augimo stadijos, augimo vietos, grunto bei klimatinių sąlygų. Šio vaistinio augalo eterinio aliejaus sudėtis skirtingose jo organuose gali būti įvairi. Jų kiekis taip pat priklauso ir nuo paties augalo chemotipo, o kvapas, koncentracija bei spalva gali kisti priklausomai nuo paros laiko, saulės ar drėgmės.

Eteriniai aliejai pasižymi labai plataus poveikio spektru. Jiems būdingas antibakterinis, antivirusinis, antigrybelinis, antiparazitinis poveikis [65][66]. Taip pat jie pasižymi ir tokiomis savybėmis: stiprina imuninę sistemą, padeda nuraminti juntamą įtampą, atsipalaiduoti,, pagreitina žaizdų gijimą, suteikia energijos, mažina nuovargį ir nervinę įtampą bei gerina nuotaiką, atsikosėjimą, padidina sekreto išskyrimą, plečia kraujagysles, gerina apetitą ir skrandžio sulčių sekreciją, laisvina vidurius [66][67][68]. Kvapiųjų mairūnų kaupiamas eterinis aliejus pasižymi stipriu antiseptiniu poveikiu. Eteriniai aliejai, tokie kaip terpinen-4-olis, cis-sabineno hidratas, p-cimenas ir α-terpineolis, karvakrolis ir timolis yra svarbios sudedamosios dalys, atsakingos už antiseptinį aktyvumą [16]. Taip pat mairūnų eterinis aliejus gali gerinti virškinimą, nes padidėja virškinimo fermentų ir seilių kiekis, skatina apetitą, slopinama pykinimą, vidurių pūtimą, dujų susikaupimą virškinimo trakte ir tulžies pūslės akmenų susidarymą, mažina žarnyno infekcijų riziką ir vidurių užkietėjimą. [17][18].

1.8. Dujų chromatografija – masių spektometrija

Eterinio aliejaus ekstrakcija iš augalinės žaliavos yra labai svarbus procesas, kuriam taikomi įvairūs ekstrakcijos metodai. Šalto spaudimo metodas, distiliacija ir ekstrakcija organiniais tirpikliais – klasikiniai metodai. Šiuolaikiniai metodai, taikomi išgauti eterinį aliejų – kietafazė mikroekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija, mikrobangomis skatinama ekstrakcija, mikrodistiliacija, ultragarsu skatinama ekstrakcija, membraninė ekstrakcija ir kiti [69]. Priklausomai nuo taikomų metodų, eterinio aliejaus išeiga, kokybinė, kiekybinė sudėtis ar net biologinis aktyvumas gali kisti [55].

Naudojama daugelis metodų, kurie skirti tirti eterinius aliejus bei analizuoti jų sudėtį, tačiau dažniausiai pasitelkiamas dujų chromatografijos metodas. Dujų chromatografija su masių spektrometru yra instrumentinės analizės metodas, kai dujų chromatografas jungiamas su detektoriumi, kuris yra masių spektrometras. Metodo dėka sudėtinguose mišiniuose esantys individualūs komponentai atskiriami, identifikuojami bei kiekybiškai įvertinami. Šis metodas tinkamas lakiųjų junginių kokybei, kiekybei ir priemaišoms nustatyti, todėl yra ganėtinai universalus [65]. DC – MS esmė tai, kad mėginio tirpalas įleidžiamas į dujų chromatografo įleidimo angą, kur yra kaitinamas iki tol, kol virsta dujomis, tada dujas į kolonėlę nuneša kitos dujos – nešiklės (mobili fazė). Mišinio komponentai, judėdami per kolonėlę, adsorbuojasi prie sluoksnio, kuris dengia kolonėlę iš vidaus ir atsiskiria nuo vidinės kolonėlės sienelės skirtingu laiku, dėl to medžiagos, sudarančios mišinį, atsiskiria viena nuo kitos. Junginiai, išeidami iš kolonėlės yra paverčiami jonais. Jonizacijos metu elektronų spindulys jonizuoja mėginio molekules, dėl to šios praranda vieną elektroną, tai yra tampa jonu, kuris sukuria piką masių spektre ir nurodo molekulinę junginio masę. Gavęs didelį kiekį energijos šis molekulinis jonas gali suirti į mažesnius jonus, kurie suteikia tarsi „piršto antspaudą“, būdingą tam tikrai molekulinei struktūrai. Šio metodo pagalba galime nustatyti dominuojančius junginius ir išsiaiškinti nežinomų mišinių junginių struktūrą. Atlikus analizę yra gaunama chromatograma, iš kurios atliekama kokybinė ir kiekybinė analizė [70].

1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Prieš atliekant eksperimentinius tyrimus, buvo išanalizuoti anksčiau paskelbti įvairių užsienio šalių mokslininkų straipsniai. Literatūroje yra randama duomenų apie kvapiųjų mairūnų fenolinius junginius, antioksidacinį aktyvumą bei eterinių aliejų sudėties kokybinį ir kiekybinį įvertinimą. Užsienio mokslininkai daug dėmesio skiria kvapiojo mairūno farmakologinėms savybėms tirti. Randama augalinės žaliavos raminančių, uždegimą, kraujo spaudimą mažinančių ir daugybę kitų poveikių turinčio kvapiojo mairūno tyrimų. Gauti rezultatai leidžia atskleisti svarbą, teikiamą naudą bei populiarumą kvapiojo mairūno, tyrinėjamo pasauliniu mastu. Nors mokslinėje spaudoje publikuojama ne mažai

kvapiųjų mairūnų žolės tyrimų, tarp kurių galime rasti ir ganėtinai panašių rezultatų kalbant apie fenolinius junginius, eterinio aliejaus komponentus ar antioksidacinį aktyvumą, tačiau kai kurių mokslinių tyrimų rezultatai išlieka kontraversiški. Lietuvoje kvapiųjų mairūnų žolės mokslinių tyrimų nėra daug, todėl esame paskatinti ištirti Lietuvoje užaugintos kvapiųjų mairūnų žolės fenolinių junginių ir antioksidacinį aktyvumą bei atlikti kokybinį ir kiekybinį eterinių aliejų cheminės sudėties nustatymą.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Kvapiųjų mairūnų žolė (Origanum majorana L.) buvo surinkta žydėjimo metu Domeikavoje, Kauno raj. 2019 metais rugpjūčio ir rugsėjo mėnesiais. Tirti kvapiųjų mairūnų lapų, stiebų ir žiedų ėminiai. Surinkta vaistinė augalinė žaliava buvo džiovinama kambario temperatūroje gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinta žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25 °_{C temperatūroje, sausoje ir gerai vėdinamoje vietoje.}

2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai

Tyrimų metu naudoti reagentai: metanolis (99,9 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), rektifikuotas etilo alkoholis 96,3 proc. V/V (AB „Vilniaus degtinė“, Lietuva), Folin-Ciocalteu reagentas (Chempur, Lenkija), natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Prancūzija), galo rūgštis (Sigma-Aldrich, Kinija), natrio hidroksidas (Chempur, Lenkija), 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karbokslinės rūgšties standartas (Trolox, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Danija) heksametilentetraminas (Lachema, Čekija), aliuminio chloridas (Fluka, Vokietija), ABTS (2-2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis), vandenilio chlorido rūgštis (Sigma-Aldrich, Vokietija), rutino standartas (Extrasynthese, Prancūzija), natrio acetatas (Scharlau, Ispanija), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas), kalio persulfatas, TPTZ (Carl Roth, Karlsruhe, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas (Vaseline-Fabrik Themania, Vokietija), natrio molibdatas (Alfa Aesar, Vokietija), natrio nitritas (Sigma-Aldrich, Vokietija), išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV).

2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra

Kvapiųjų mairūnų žaliava susmulkinta elektriniu malūnėliu „Retsch GM 200” (Vokietija). Augalinė žaliava ir įvairūs reagentai buvo sveriami analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius Cp6M-0CE” (Vokietija). Ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje „Bandelin Sanorex Digital 10P“ (Vokietija). Ekstraktų filtravimui naudota vakuuminė pompa „Dry vacuum pump - compressor”, Welch, 2511C – 02 (JAV). Mikropipetės „Eppendorf Research” (JAV). Visi spektrofotometriniai tyrimai atlikti naudojant UV-VIS spektrofotometrą „CamSpec – M550“ (Jungtinė Karalystė). Fenolinių junginių kiekybinei ir kokybinei analizei naudotas efektyvusis skysčių chromatografas „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, JAV) su diodų matricos detektoriumi „Waters 2998 PDA“ („Waters“, Milfordas,

JAV). Eterinio aliejaus komponentai nustatyti GCMS-QP2010 dujų chromatografu su masių spektrometru (Shimadzu, Japonija). Naudotas automatinis injektorius AOC-5000 (Shimadzu, Japonija), kuris valdo kietafazės mikroekstrakcijos švirkštą su Stableflex pluošteliu, padengtu 50/30 µm DVB/CAR/PDMS sluoksniu (Supelco, JAV); elektronų jonizacijos detektoriaus kolonėlė RTX–5MS (Restek, JAV).

2.4. Tyrimų shema

2 pav. Tyrimų schema

2.5. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje

Kvapiųjų mairūnų žolės nuodžiūvis nustatytas pagal Europos farmakopėjos aprašytą metodą (Ph. Eur. 2.2.32). Tiriamoji žaliava yra smulkinama elektriniu malūnėliu, atsveriama po 1 g ir

Origanum majorana L. antžeminės augalo

dalies rinkimas

Fenoliniai junginiai lapuose, stiebuose ir žieduose

Ekstrakcija 70 % etanoliu

ESC Spektrofotometriniai _metodai

Bendras fenolinių junginių kiekis

Bendras flavonoidų kiekis

Antioksidacinis aktyvumas (ABTS, FRAP, DPPH)

Eterinis aliejus žolėje

džiovinama iki pastovios masės džiovinimo spintoje 100-105 °C temperatūroje 2 val. Džiovinimo pradžia laikoma, kada džiovinimo spintoje temperatūra siekia 100-105 °C. Pirmą kartą mėginiai sveriami po 2 val., o pastovioji masė nustatoma jei du paskutinieji svėrimai, praėjus 30 min. po džiovinimo ir 30 min. po vėsinimo eksikatoriuje, skiriasi ne daugiau kaip ± 0,001 g. Galutinis rezultatas apskaičiuojamas iš trijų svėrimų rezultatų išvedant vidurkį. Atlikus analizę kvapiųjų mairūnų žolės nuodžiūvis atitiko Europos farmakopėjoje reglamentuojamas ribas, t.y. ne daugiau kaip 12 %.

Nuodžiūvis skaičiuojamas, naudojant formulę:

𝑚1−𝑚2

𝑚0

× 100

m1 - žaliavos masė gramais prieš džiovinimą; m2 – žaliavos masė gramais po džiovinimo.

2.6. Tiriamųjų ekstraktų paruošimas

Tiriamieji ekstraktai buvo ruošiami atsveriant 1 g (0,001 g tikslumu) sausos susmulkintos

Origanum majorana L. lapų, stiebų ir žiedų vaistinės augalinės žaliavos, užpilant ją 30 ml 70 proc. V/V

etanoliu. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 30 min. sandariuose rudo stiklo buteliukuose. Ultragarso bangų dažnis 60 kHz. Gauti ekstraktai yra filtruojami per 0,2 µm porų dydžio filtravimo popierių ir praskiedžiami 70 proc. etanoliu iki 30 ml.

2.7. Tyrimo metodai

2.7.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. Mėgintuvėlyje 1 ml tiriamojo ekstrakto yra sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin-Ciocalteu reagento ir pridedama į juos paruošto 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo (matavimo kolboje distiliuotame vandenyje ištirpinama 7,5 g atsverto natrio karbonato ir gautas tirpalas yra praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 100 ml žymos). Mėginiai laikomi tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 1 val. Lyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj 1 ml tiriamojo ekstrakto pilama 1 ml parinktos koncentracijos etanolio. Spektrofotometru matuojama absorbcija esant 765 nm bangos ilgyje.

Kalibracinė kreivė (y = 1,9736x + 0,054; R² = 0,9932) sudaroma naudojant skirtingų koncentracijų galo rūgšties tirpalus. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu gramui sausos žaliavos (mg/g) ir yra apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑋 =𝐶×𝑉×𝑎

𝑚 ; 𝑚𝑔/𝑔

C – galo rūgšties koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

a – skiedimo faktorius; m – sausos žaliavos masė (g).

2.7.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Paruoštuose kvapiųjų mairūnų ekstraktuose buvo įvertinamas bendras flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu. Pagaminamas pradinis reagentas tyrimui atlikti. Jam pagaminti reikia 60 ml 99,6 proc. metanolio, kuris sumaišomas su 3 ml 33 proc. acto rūgštimi, 12 ml 5 proc. heksametilentetraminu ir 9 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalu ir į gautą mišinį pridedama 60 ml išgryninto vandens. Analizei naudojame 1920 µl paruošto tirpalo, kuris sumaišomas su 80 µl vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto. Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoj vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto yra pilama 80 µl 70 proc. etanolio. Mėginiai laikomi tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 30 min ir tada matuojama absorbcija 407 nm bangos ilgyje.

Bendram flavonoidų kiekio nustatymui sudaroma kalibracinė kreivė (y = 12,23x + 0,0299; R² = 0,9914). Jai sudaryti naudojami standartiniai rutino tirpalai. Bendras flavonoidų kiekis sausoje žaliavoje apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑋 =𝐶 × 𝑉

𝑚 ; 𝑚𝑔/𝑔 C - rutino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m - sausos žaliavos masė (g)

2.7.3. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas

2.7.3.1. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu

Etaloninis DPPH tirpalas buvo paruoštas atsisveriant 0,0012 g DPPH radikalo, kuris ištirpinamas 50 ml 80 proc. etanolyje. Paruošto tirpalo absorbcija buvo matuojama esant 517 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas 80 % V/V etanolis. Tiriamasis tirpalas ruošiamas

sumaišant 3 ml paruošto darbinio DPPH tirpalo su 20 µl tiriamojo kvapiųjų mairūnų ekstrakto. Gautas mišinys laikomas 30 min. kambario temperatūroje, tamsioje aplinkoje.

Kalibracinei kreivei (y = 7,345x + 0,1968; R² = 0,9903) sudaryti buvo naudojami skirtingų koncentracijų trolokso tirpalai (125–16000 µmol/l). Trolokso ekivalentu (TE) išreikšta laisvųjų radikalų surišimo geba.

TEDPPH = 𝐶×𝑉×𝑎

𝑚 µmol/g

C – trolokso koncentracija μmol nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris L;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.

2.7.3.2. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS katijonų - radikalų surišimo

metodu

Pradinio tirpalo paruošimas. 2 mmol/l koncentracijos motininis ABTS tirpalas: atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių, kurie ištirpinami 50 ml išgryninto vandens. Į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato, sumaišome ir gautas tirpalas laikomas tamsioje vietoje 16 val.

Darbinis tirpalas ruošiamas skiedžiant motininį ABTS tirpalą išgrynintu vandeniu iki kol nustatoma tinkama absorbcija (0,800 ± 0,03), esant 734 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Analizei atlikti imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir įpilama 20 µl tiriamojo ekstrakto ir gerai sumaišoma. Pagamintas tirpalas laikomas 1 val. tamsioje vietoje. Spektofotometru matuojamas absorbcijos pokytis, esant 734 nm bangos ilgiui.

Kalibracinės kreivės (y = 6,683x + 0,09044; R² = 0,9939) sudarymui naudojami trolokso skirtingų koncentracijų tirpalai. Trolokso koncentracijų ribos: (125 – 8000 µmol/l).

TEABTS = 𝐶×𝑉×𝑎

𝑚 µmol/g

C – trolokso koncentracija μmol nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris L;

a – skiedimo faktorius;

2.7.3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP redukcinio aktyvumo

metodu

Reagentų paruošimas, kurių reikės FRAP metodo analizei:

1) 300 mmol/l acetatinio buferio ruošimas: atsveriama 3,1 g natrio acetato ir suberiama į 1 litro talpos matavimo kolbą. Tada įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki reikiamos žymės.

2) 10 mmol/l TPTZ tirpalo ruošimas: į 50 ml išgryninto vandens įpilama 0,1695 ml koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties ir tada tirpale ištirpinami 0,1562 g TPTZ miltelių.

3) 20 mmol/l geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo ruošimas: atsvertų 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato miltelių ištirpinama 50 ml išgryninto vandens.

Darbinis FRAP reagentas gaunamas sumaišius pagamintus reagentus santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo). Tiriamajam tirpalui paruošti imama 3 ml darbinio FRAP reagento ir sumaišoma su 20 µl tiriamojo augalinės žaliavos ekstrakto. Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoj tiriamojo augalinės žaliavos ekstrakto pilamas parinktas ekstrahentas. Po 1 val. laikymo tamsoje, spektrofotometru yra matuojama absorbcija, esant 593 nm bangos ilgiui.

Kalibracinės kreivės (y = 3,2x + 0,056; R² = 0,9921) sudarymui naudojamas trolokso standartas. Trolokso koncentracijų ribos: (125–4000 µmol/l).

TEFRAP = 𝐶×𝑉×𝑎

𝑚 µmol/g

C – trolokso koncentracija μmol nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris L;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.

2.7.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika

Fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei buvo atliktas atvirkščių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. ESC optimizuotos chromatografinės metodikos eliuentų sistema yra sudaryta iš 2 %. (V/V) acto rūgšties tirpalo vandenyje (eliuentas A) bei 100 % (V/V) acetonitrilo (eliuentas B). Naudotas gradiento kitimas: 0–30 min. 3–15 % B, 30–45 min. 15–25 % B, 45–50 min. 25–50 % B, 50–55 min. 50–95 % eliuentas B. Naudotas eliuento tėkmės greitis – 1 ml/min. ir injekcijos tūris, kuris buvo 10 μl. Chromatografinių smailių identifikavimas yra atliekas lyginant analičių ir etaloninių junginių sulaikymo laikus bei UV absorbcijos spektrines charakteristikas. Identifikuotų

junginių tapatybė patvirtinta priedo metodu į tiriamąjį ekstraktą pridėjus etaloninio junginio, vertinant chromatografinių smailių formos ir spektrinių charakteristikų pokyčius. Identifikuotų fenolinių rūgščių kiekiai tiriamuosiuose ekstraktuose apskaičiuoti bangos ilgiui esant 320 nm, izokvercitrino kiekis – bangos ilgiui esant 360 nm.

2.7.5. Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos–masių spektrometrijos

metodu

Kvapiųjų mairūnų žolė susmulkinama elektriniu malūnėliu ir gaunami miltelių konsistencijos mėginiai, kuriuose nėra matoma aiškių heterodispersinių dalelių. Atsveriama 10 g tiriamojo vaistinės augalinės žaliavos, supilama į 1 l apvaliadugnę kolbą, užpilama 150 ml distiliuoto vandens, tada gerai išmaišoma ir prijungiama prie distiliacijai vandens garais naudojamo Klevendžerio aparato. Kolba kaitinama glicerolio vonelėje, palaikant 120 o_{C temperatūrą, procesas trunka apie 2-3 val., kol išsiskiria}

eterinis aliejus. Po to į surinktą distiliatą įpilama 1 ml heksano, kurio sluoksnis atskiriamas ir vėliau tiriamas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

Eterinio aliejaus cheminei analizei pasirinkta hidrodistiliacija, nes tai klasikinis, nesudėtingas bei tikslus metodas. Išskirto eterinio aliejaus kokybinė analizė atliekama naudojant dujų chromatografijos ir masių spektrometrijos sistemą su masių spektrometru. Dujos nešėjos, parinktos helio dujos.

Dujų chromatografijos metodo metu pradinė kolonėlės temperatūra yra 50 o_{C, injektoriaus}

temperatūra 260 o_{C, jonų srauto temperatūra 200} o_{C, sąsajos temperatūra 280} o_{C. Injekcija yra atliekama}

pagal metodą, kai temperatūra keliama palaipsniui nuo 50 o_{C iki 200} o_{C, naudojant 2} o_{C/min greitį. Nuo}

200 oC iki 315 oC, temperatūra keliama 15 oC/min greičiu.Atlikus chromatografinius tyrimus iš gautų chromatogramų identifikuojami išskirti junginiai pagal masių spektroskopijos bibliotekos duomenų bazę. Gauti bandiniai ištirti dujų chromatografu, chromatogramos buvo analizuojamos pagal specialią programą.

2.8. Statistinė duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė buvo atlikta „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir „SPSS 26.0“ („IBM“, JAV) programomis. Apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir gauti standartiniai nuokrypiai. Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas taikant Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą. Grafiškai rezultatai pavaizduoti, naudojant Microsoft Exel 2010 programą. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas taikant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimas kvapiųjų mairūnų lapų,

stiebų ir žiedų augalinėms žaliavoms

Norint nustatyti kokybinę bei kiekybinę fenolinių junginių sudėtį augalinės žaliavos ekstraktuose, labai svarbu tinkamai parinkti ekstrahentą ir ekstrakcijos trukmę. Optimalios ekstrakcijos sąlygos yra nustatomos vertinant tiek tipirklio koncentraciją, tiek ekstrakcijos trukmę. Tyrimui naudota Kauno raj., Domeikavoje rinkta kvapiųjų mairūnų vaistinė augalinė žaliava.

Ekstrahento koncentracijos parinkimas. Tyrimo metu pasirinkta įvertinti etanolio (40, 50, 70, 96 proc.), distiliuoto vandens bei metanolio (30, 50, 70, 85 proc.) įtaką kvapiųjų mairūnų fenolinių junginių ekstrakcijai. Atliktos ekstrakcijos optimizacijos metu nustatyta, jog ekstrakcijos metu naudojant etanolį, apskaičiuotas didesnis fenolinių junginių kiekis nei ekstrahuojant žaliavas metanoliu ar distiliuotu vandeniu. E. Vagi ir kt. atlikdami tyrimus nustatė, kad Origanum majorana L. žolės ekstrakcijos metu naudojant etanolį, apskaičiuotas didesnis fenolinių junginių kiekis. Taip pat, naudojant šį polinį tirpiklį nustatytas daug stipresnis kvapiųjų mairūnų žolės ekstraktų antioksidacinis aktyvumas [8].

Tyrimo metu nustatyta, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (8,85 ± 0,27 mg GRE/g) kvapiųjų mairūnų žolėje aptiktas ekstrakcijai naudojant 70 % (V/V) etanolį. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, šis ekstrakcijos tirpiklis pasirinktas tolimesniems tyrimams vykdyti (3 pav.).

3 pav. Ekstrahento koncentracijos nustatymas, naudojant skirtingus ekstrahentus atsižvelgiant į fenolinių junginių kiekio įvairavimą; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų ėminių (p<0,05). d c a e c c b e d 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Etanolis 40% Etanolis 50% Etanolis 70% Etanolis 96% Metanolis 30% Metanolis 50% Metanolis 70% Metanolis 85% Vanduo Fen olin ių ju n gin ių k iekis , mg /g GAE Ekstrahentas

Ekstrakcijos trukmės parinkimas. Nustatymui naudoti kvapiųjų mairūnų žolės ėminiai, paruošti naudojant 70 proc. (V/V) etanolį ir esant 60 kHz ultragarso vonelės dažniui. Ekstrakcijos laiko parinkimui kvapiųjų mairūnų augalinės žaliavos ėminiai ekstrahuoti skirtingais laiko intervalais 10, 20, 30, 40, 50 ir 60 min. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis, ekstrahuojant augalines žaliavas ultragarso vonelėje buvo ties 30 min. (9,77 ± 0,09 mg GRE/g, p<0,05). Atsižvelgiant į tai, tolimesniems tyrimams pasirinkta lapus, stiebus ir žiedus ekstrahuoti 30 min., norint atlikti kitus bandymus. Mohammad B. Hossain ir kt. (2013) atliktame tyrime kvapiųjų mairūnų augalinės žaliavos ekstrakcijos optimizavime gauti rezultatai šiek tiek skiriasi. Mokslininkai nurodo, jog didžiausias junginių kiekis augalinių žaliavų ekstraktuose nustatytas veikiant ekstraktus ultragarsu 15 minučių [71].

4 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas, esant skirtingai ekstrakcijos trukmei; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų ėminių (p<0,05).

3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas kvapiųjų mairūnų lapuose, stiebuose ir žieduose. Spektrofotometrijos metodu etanoliniuose skirtingų kvapiųjų mairūnų augalinių žaliavų ekstraktuose buvo nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis. Analizuoti kvapiųjų mairūnų lapai, žiedai ir stiebai. Bandymai kartoti 3 kartus ir išvestas aritmetinis matavimų vidurkis. Rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentu (mg GAE/g) orasausės žaliavos. Šiam tyrimui kvapiųjų mairūnų augalinė žaliava rinkta Domeikavoje, Kauno raj., 2019 m. Tyrimo metu gauti rezultatai pateikti 5 paveiksle. Bendras fenolinių junginių kiekis (p<0,05) kvapiųjų mairūnų augalinėje žaliavoje įvairuoja nuo 4,13 ± 0,31 mg GAE/g iki 9,27 ± 0,41 mg GAE/g. Daugiausiai fenolinių junginių kaupia kvapiųjų mairūnų

d b a c d e 0 2 4 6 8 10 12

10 min 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min

Fe n o lini ų ju n ginių k ie kis , mg/g G AE Ekstrakcijos laikas