PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ERŠKĖČIŲ VAISIŲ IR JŲ PREPARATŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-18 EDVINAS VARVARINAS
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-18 EDVINAS VARVARINAS
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-19 VALDAS JAKŠTAS
KATEDROJE
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020–05–21 Prof. Sonata Trumbeckaitė
(aprobacijos data ) (katedros vadovės vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
EDVINAS VARVARINAS
ERŠKĖČIŲ VAISIŲ IR JŲ PREPARATŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES
ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Valdas Jakštas
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
ERŠKĖČIŲ VAISIŲ IR JŲ PREPARATŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES
ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Valdas Jakštas Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantas Edvinas Varvarinas Data
KAUNAS, 2020
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Paprastojo ir miškinio erškėčių apibūdinimas ... 12
1.2 Paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) vaisių fitocheminė sudėtis ... 13
1.3 Erškėčių (Rosa L.) vaisių medicininis panaudojimas ... 15
1.4 Fenoliniai junginiai ir jų nustatymo metodai... 18
1.5 Erškėčių (Rosa L.) genties vaisių preparatai... 21
2. TYRIMO METODIKOS ... 22
2.1 Tyrimų objektas ... 22
2.2 Naudoti reagentai ir aparatūra ... 23
2.3 Tiriamojo ekstrakto paruošimas ... 24
2.4 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 25
2.5 Bendras flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 26
2.6 Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 27
2.7 Fenolinių junginių nustatymas UESC-MS metodu ... 28
2.8 Duomenų analizės metodai ... 29
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1 Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas tiriamuosiuose mėginiuose ... 30
3.2 Flavonoidų kiekio įvairavimas tiriamuosiuose mėginiuose ... 31
3.3 Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas tiriamuosiuose mėginiuose ... 33
3.4 Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė tiriamuosiuose mėginiuose UESC-MS/MS metodu ... 35
3.5 Rezultatų apibendrinimas ... 40
4. IŠVADOS ... 42
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43
E. Varvarino magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. V. Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Erškėčių vaisių ir jų preparatų fenolinių junginių sudėties įvairavimo tyrimas. Tikslas: nustatyti skirtingose Lietuvos augimvietėse surinktų paprastųjų ir miškinių erškėčių vaisių mėginių bei erškėčių preparatų fenolinių junginių sudėties įvairavimą ir jų antiradikalinį aktyvumą in vitro.
Uždaviniai: Ištirti paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) ir miškinių erškėčių (Rosa majalis Herrm.) vaisių ėminių bei jų preparatų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą; išanalizuoti erškėčių vaisių bei jų preparatų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą UV-regimosios šviesos spektrofotometrijos ABTS metodu; ultra– efektyviosios skysčių chromatografijos–tandeminės masių spektrometrijos metodu nustatyti ir palyginti erškėčių vaisių bei jų preparatų ištraukų komponentus.
Objektas ir metodai: skirtinguose Lietuvos regionuose rinkti Rosa canina L. ir Rosa majalis Herrm. vaisiai bei Lietuvos vaistinėse įsigyti preparatai, kurių sudėtyje yra Rosa canina L. ar Rosa majalis Herrm. milteliai arba ekstraktas. Bendras fenolinių junginių kiekis, flavonoidų kiekis bei antiradikalinis aktyvumas nustatytas UV spektrofotometriniu metodu. Fenoliniai junginiai identifikuoti bei kiekybiškai įvertinti UESC-MS/MS metodu.
Rezultatai ir išvados: Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas paprastųjų erškėčių vaisiuose rinktuose Šakių mieste (22,45 mg GRE/g), miškinių erškėčių vaisiuose - Jurbarke rinktuose vaisiuose (24,41 mg GRE/g), o maisto papilduose - mėginyje P4 (31±2,31 mg GRE/RVP). Didžiausias flavonoidų kiekis ištyrus Rosa canina L. mėginius nustatytas Šakių mieste rinktuose vaisiuose (1,6 mg RE/g). Rosa majalis Herrm. vaisiuose - Jurbarko augimvietės vaisiuose (1,62 mg RE/g), o maisto papilduose - mėginyje P2 (8,8±1,06 mg RE/RVP). Didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu iš paprastųjų erškėčių vaisių pasižymėjo Šakiuose rinkti vaisiai (127,1 µmol TE/g), miškinių erškėčių mėginiuose - Liudvinave, Marijampolės raj. rinkti vaisiai (132,44 µmol TE/g), o maisto papilduose - mėginyje P4 (773,6±30,73 µmol TE/RVP). Atlikus fenolinių junginių kokybinę analizę UESC-MS/MS metodu, tirtuose mėginiuose identifikuoti šie 9 fenoliniai junginiai: chlorogeno rūgštis, kemferol-3-O-gliukozidas, hiperozidas, izokvercitrinas, rutinas, neochlorogeno rūgštis, kvercitrinas, tilirozidas, kvercetinas.
E. Varvarinas master‘s thesis. Supervisor Prof. dr. V. Jakštas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas.
The title: The research of phenolic compounds composition variability of rosehips and their products.
The aim: to evaluate the variation of phenolic compounds‘ composition and antiradical activity in vitro in samples of dog rose and cinnamon rose fruits collected from various natural habitats of Lithuania and their products.
Objectives: to determine quantitative composition of phenolic compounds in samples of dog rose (Rosa canina L.) and cinnamon rose (Rosa majalis Herrm.) fruits and their products using UV spectrophotometric method; to analyse antiradical activity in extracts of rosehips and their products using spectrophotometric ABTS method; to determine and compare the components in extracts of rosehip fruits and their products using UHPLC-MS/MS method.
Object and methods: Rosa canina L. and Rosa majalis Herrm. fruits collected from various regions of Lithuania and their products containing Rosa canina L. and Rosa majalis Herrm. powder or extract. The total content of phenolic compounds, content of flavonoids and antiradical activity has been evaluated using UV spectrophotometric method. Phenolic compounds has been identified and evaluated using UHPLC-MS/MS method.
Results and conclusions: The highest content of phenolic compounds was determined in dog rose fruits collected in Šakiai (22.45 mg GAE/g), in cinnamon rose fruits – collected in Jurbarkas (24.24 mg GAE/g), in food supplement sample P4 (31±2,31 mg GRE/RVP). The highest content of flavonoids was determined in Rosa canina L. fruits collected in Šakiai (1.6 mg RE/g), in Rosa majalis Herrm. fruits – collected in Jurbarkas (1.62 mg RE/g), in food supplement sample P2 (8,8±1,06 mg RE/RVP). The highest antiradical activity was assessed in dog rose fruits collected in Šakiai (127.1 µmol TE/g), in cinnamon rose fruits – collected in Liudvinavas, Marijampolė region (132.44 µmol TE/g), in food supplement sample P4 (773,6±30,73 µmol TE/RVP). Qualitative analysis of phenolic compounds by UHPLC-MS/MS method identified the following 9 phenolic compounds in studied samples: chlorogenic acid, kemferol-3-O-glucoside, hyperoside, isoquercitrin, rutin, neochlorogenic acid, quercitrine, tiliroside, quercetin.
PADĖKA
Dėkoju lekt. Mindaugui Marksai už pagalbą ir išsamias konsultacijas atliekant magistrinio darbo tyrimus.
COX-2 – ciklooksigenazė-2 GAE – galo rūgšties ekvivalentas RE – rutino ekvivalentas
RVP – rekomenduojama vartojimo porcija TE – trolokso ekvivalentas
UESC-MS/MS – ultra efektyvioji skysčių chromatografija – tandeminė masių spektrometrija UV – ultravioletinė spinduliuotė
ĮVADAS
Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, 4 milijardai žmonių (apie 80 % pasaulio populiacijos) naudoja augalines žaliavas sveikatos sutrikimams gydyti. Nustatyta, kad apie 70 % visų gydytojų Vokietijoje ir Prancūzijoje reguliariai skiria vaistinius augalinius preparatus. Taip pat eksponentiškai didėja ir skaičius tų pacientų, kurie ieško tradicinės medicinos terapijos, kuri būtų atliekama taikant iš augalų gaunamas žaliavas. Atsižvelgiant į ekonominį aspektą, augalinių preparatų rinka sudaro daugiau nei 60 milijardų JAV dolerių per metus. Taigi, augalai išlieka potencialiu bioaktyvių junginių, tokių kaip fenoliniai junginiai, šaltiniu, todėl svarbu atlikti augalinių žaliavų veikliųjų medžiagų sudėties variacijos tyrimus, siekiant pritaikyti šiuos junginius įvairių ligų gydyme [66].
Fenoliniai junginiai, pavyzdžiui flavonoidai ir fenolinės rūgštys, vertinami dėl savo antioksidacinių savybių [46]. Dėl aplinkos poveikio augalai šiuos junginius kaupia kaip antrinius metabolitus, tačiau jie nėra būtini augalų ar jų dalių gyvybingumui, bet susintetinti jie dalyvauja įvairiuose biocheminiuose procesuose. Fenoliniai junginiai aptinkami ir erškėčių vaisiuose. Pastebėta, kad paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) vaisių ekstraktai ir iš jų išskirti konkretūs fenoliniai junginiai gali pasižymėti antioksidantiniu aktyvumu, taip pat priešuždegiminiu, antimikrobiniu veikimu, be to jie gali turėti įtakos kūno riebaliniam sluoksniui, kraujo lipidų ir gliukozės lygiui [65].
Darbo aktualumas. Galima rasti duomenų apie Lietuvos klimato sąlygomis augančių paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) ir miškinių erškėčių (Rosa majalis Herrm.) vaisių fitocheminę sudėtį ir jos pokytį skirtingais augimo laikotarpiais, tačiau randama mažai duomenų apie fenolinių junginių profilio variaciją šiose žaliavose. Taip pat nerandama duomenų apie Lietuvos vaistinėse pardavinėjamų erškėčių vaisių preparatų fitocheminę sudėtį bei fenolinių junginių profilio variaciją. Remiantis šių duomenų stoka, nuspręsta ištirti skirtingose Lietuvos augimvietėse augančių Rosa canina L., Rosa majalis Herrm. vaisių bei Lietuvos vaistinėse pardavinėjamų erškėčių vaisių preparatų fitocheminę sudėtį, fenolinių junginių profilio variaciją ir antiradikalinį aktyvumą.
Darbo tikslas. Nustatyti skirtingose Lietuvos augimvietėse surinktų paprastųjų ir miškinių erškėčių vaisių mėginių bei erškėčių preparatų fenolinių junginių sudėties įvairavimą ir jų antiradikalinį aktyvumą in vitro.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti skirtingose Lietuvos augimvietėse surinktų paprastųjų ir miškinių erškėčių vaisių mėginių bei erškėčių preparatų fenolinių junginių sudėties įvairavimą ir jų antiradikalinį aktyvumą in vitro.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) ir miškinių erškėčių (Rosa majalis Herrm.) vaisių mėginių bei jų preparatų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą.
2. Išanalizuoti erškėčių vaisių bei jų preparatų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą UV-regimosios šviesos spektrofotometrijos ABTS metodu.
3. Ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos–tandeminės masių spektrometrijos metodu nustatyti ir palyginti erškėčių vaisių bei jų preparatų ištraukų komponentus.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Paprastojo ir miškinio erškėčių apibūdinimas
Erškėčių (Rosa L.) genties augalai priklauso erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimai. Galima išskirti nuo 100 iki 250 skirtingų erškėčių rūšių [57]. Pasaulyje erškėčių (Rosaceae Juss.) šeimos augalai yra labiausiai paplitę šiaurės pusrutulio regionuose [57]. Lietuvoje dažnai randamos šios savaime paplitusios erškėčių rūšys: paprastasis erškėtis (Rosa canina L.), miškinis erškėtis (Rosa majalis Herrm.), raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.), kiek rečiau – rūdėtasis erškėtis (Rosa rubiginosa L.) ir švelnialapis erškėtis (Rosa mollis Smith.) [55].
Paprastasis erškėtis (Rosa canina L.) – iki 3 metrų užaugantis dygliuotas krūmas. Paprastai randamas pakelėse, pamiškėse, šlaituose [55, 56]. Žiedai gali būti balti arba rožiniai, o jų skersmuo svyruoja nuo 2 cm iki 8 cm. Sunokę netikri vaisiai pasižymi raudona arba tamsiai raudona spalva ir rutulio ar ovalia forma [56]. Paprastasis erškėtis pradeda žydėti birželio mėnesį, rečiau – liepos mėnesį. Vaisynai paprastai parausta rugsėjo mėnesį, retesniais atvejais – rugpjūčio mėnesio antroje pusėje [55, 56].
Miškinis erškėtis (Rosa majalis Herrm.) – žiedais apaugęs dygliuotas krūmas, kuris užauga iki 2 metrų aukščio. Žiedai įprasti, dideli, 4-5 cm skersmens, rožinės spalvos [57, 58]. Netikri vaisiai be plaukelių, rutuliški arba kiaušinio formos, raudonos arba tamsiai raudonos spalvos [57]. Miškinis erškėtis paprastai žydi gegužės-birželio mėnesį. Miškinių erškėčių vaisiai prinoksta rugsėjo mėnesį [58].
1.2 Paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) vaisių fitocheminė sudėtis
Paprastųjų erškėčių vaisiai pasižymi plačiu spektru medžiagų. Geriausiai šie vaisiai žinomi dėl vaisiuose esančio ypatingai didelio vitamino C kiekio. Be to, juose galima rasti karotenoidų, įskaitant likopeną ir pektinus. Fenoliniai junginiai yra ne mažiau svarbi biologiškai aktyvių junginių grupė, kuri yra aptinkama erškėčių vaisiuose. Šią grupę sudaro tokie junginiai kaip taninai, flavonoidai, fenolinės rūgštys ir antocianai [8].
Vitamino C koncentracija paprastųjų erškėčių vaisiuose gali kisti priklausomai nuo žaliavos kilmės ir nustatymo metodo. Tiriant vandeninius paprastųjų erškėčių vaisių ekstraktus vitamino C koncentracija gali svyruoti nuo 1,01 mg/g iki 10,6 mg/g [3, 5, 6, 10]. Metanoliniuose ekstraktuose vitamino C koncentracija nustatoma nuo 1,83 mg/g iki 7,54 mg/g [2, 5]. Paprastųjų erškėčių vaisių tyrėje vitamino C koncentracija 3,73 mg/g, o džeme – 0,56 mg/g [5]. Išskiriant vitamino C frakciją kietafaze chromatografija buvo gauta 0,101 mg/g vitamino C koncentracija [1].
Bendras fenolinių junginių kiekis tirtuose erškėčių vaisiuose skiriasi, priklausomai nuo taikomų tyrimo sąlygų. Etanoliniuose ekstraktuose fenolinių junginių kiekis gali svyruoti nuo 3,62 mg GAE/g iki 62,98 mg GAE/g [2, 6, 9, 10]. Vandeniniuose erškėtuogių ekstraktuose bendras vyraujantis fenolinių junginių kiekis yra nuo 2 mg GAE/g iki 74,6 mg GAE/g [5, 9]. Fenolinių junginių koncentracija metanoliniuose ekstraktuose būna nuo 50,3 mg GAE/g iki 50,9 mg GAE/g, tyrėje – 96,2 mg GAE/g, o džeme – 11,9 mg GAE/g [5].
Bendras flavonoidų kiekis etanoliniuose ekstraktuose priklausomai nuo tyrimų sąlygų skiriasi. Artur Adamczak ir kiti mokslininkai savo tyrime nustatė 0,52 mg QE/g flavonoidų koncentraciją [3]. Turkijos mokslininkai savo tyrime erškėtuogių vaisiuose nustatė 9,48 mg RE/g koncentracijos flavonoidų kiekį [6]. Metanoliniuose ekstraktuose flavonoidų koncentracija vyrauja nuo 0,63 mg QE/g iki 0,65 mg QE/g, vandeniniuose ekstraktuose – nuo 1,14 mg QE/g iki 1,22 mg QE/g, tyrėje – 2,94 mg QE/g, o džeme – 0,61 mg QE/g [5].
Z. T. Murathan ir kiti mokslininkai savo tyrime vertindami organinių rūgščių koncentracijas paprastųjų erškėčių vaisiuose nustatė oksalo r. (0,38 mg/100g), vyno r. (0,65 mg/100g), obuolių r. (0,48 mg/100g), citrinų r. (0,94 mg/100g), gintaro r. (0,010 mg/100g) ir fumaro r. (0,033 mg/100g) [2]. Lenkijos mokslininkų tyrime citrinų rūgšties koncentracija įvairavo nuo 0,2 iki 5,37 g/100g, o Turkijos mokslininkai paprastųjų erškėčių vaisiuose nustatė 9,12 g/100g citrinų rūgšties bei 0,98 g/100g malo rūgšties koncentracijas [3,6].
Deniz Erogul ir H. Ibrahim Oguz savo atliktame tyrime išanalizavo bendrą cukraus kiekį, kuris vyravo nuo 30,63 g/100g iki 43,14 g/100g. Tarp šių cukrų, fruktozės koncentracija buvo 16,86-22,93 g/100g, gliukozės – 13,77-20,22 g/100g, sacharozės – iki 0,9 g/100g [10]. Turkijos mokslininkų nustatyta bendra cukrų koncentracija paprastųjų erškėčių vaisiuose – 18,78 mg/100g, iš kurių
išskiriamos sacharozė – 0,55 mg/100g; gliukozė – 8,05 mg/100g; fruktozė – 5,03 mg/100g ir sorbitolis – 5,15 mg/100g [2]. N. Demir ir kitų mokslininkų tirtose erškėtuogėse nustatyta gliukozės koncentracija yra 17,11 g/100g, o fruktozės – 18,84 g/100g [6].
Ispanijos mokslininkai (2017) savo atliktame tyrime išskyrė įvairių rūšių erškėčių vaisius į tris frakcijas: vitamino C, polifenolių ir fenolinių rūgščių. Jie nustatė, jog bendra polifenolių koncentracija yra 40,8 mg/g, iš kurių išskiriami miricetinas (5,4 mg/g), rutinas (22 mg/g), katechinas (11,9 mg/g) ir kvercetinas (1,5 mg/g). Bendra fenolinių rūgščių koncentracija yra 0,96 mg/g, iš kurių išskiriamos šios rūgštys: vanilo r. – 0,26 mg/g; kavos r. – 0,002 mg/g; siringo r. – 0,11 mg/g; galo r. – 0,298 mg/g; elago r. – 0,08 mg/g; protokatechino r. – 0,21 mg/g [1].
Turkijoje (2016) atlikto tyrimo metu paprastųjų erškėčių vaisiuose bendra antocianinų koncentracija nustatyta 2,75 mg/100g [2].
Rafaela Guimaraes ir kiti mokslininkai atliko tyrimą, kurio tikslas buvo identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti fenolinius junginius, esančius įvairių rūšių erškėčių uogose. Jiems pavyko kiekybiškai įvertinti flavan-3-olių koncentraciją paprastųjų erškėčių vaisiuose, kuri buvo 19,90 mg/100g. Tarp jų identifikuoti (+)-katechinas, (+)-katechino heksozidas, procianidino B1 ir B3 dimerai. Vertinant antocianus nustatyta, jog cianidino 3-O-gliukozidas yra labiausiai dominuojantis antocianas ir jo koncentracija yra 0,68 µg/100g. Vertinant fenolines rūgštis ir flavonus bei flavonolius, jų bendra koncentracija yra 5,50 mg/100mg. Iš šių junginių identifikuoti taksifolino pentozidas, eriodiktiolio heksozidas, kvercetino 3-O-gliukozidas, kvercetino 3-O-rutinozidas, kvercetino gliukoronidas, kvercetino heksozidas, kvercetino pentozidas, izoramnetino 3-O-rutinozidas, kvercetino ramnozidas bei kemferolio ramnozil-heksozidas [4].
Serbijos mokslininkai atlikto tyrimo metu iš fenolinių rūgščių identifikavo p-hidroksibenzoinę r., vanilo r., galo r., protokatechino r., p-kumaro r. Iš flavonoidų identifikuoti buvo kemferolio 3-O-gliukozidas, kvercitrinas, kvercetino 3-O-3-O-gliukozidas, hiperozidas, epikatechinas, katechinas [5].
N. Demir ir kiti mokslininkai ištyrė įvairių erškėtuogių rūšių fitocheminę sudėtį. Šiame tyrime jie nustatė įvairių fenolinių junginių koncentraciją. Didžiausia koncentracija pasižymėjo katechinas (19,96 µg/g), chlorogeno rūgštis (12,11 µg/g), galo rūgštis (12,67 µg/g), ferulo rūgštis (10,55 µg/g) ir 2,5-dihidroksi benzoinė rūgštis (10,40 µg/g). Taip pat tyrimo metu identifikuoti įvairios struktūros alkoholiai, aldehidai, ketonai, monoterpenai, seskviterpenai, esteriai bei kiti lakūs junginiai [6].
Norvegijos mokslininkas Erlend Kvattum savo tyrimo metu sugebėjo identifikuoti keletą konjuguotų ir nekonjuguotų fenolinių junginių, tarp kurių svarbiausi buvo cianidin-3-O-gliukozidas, keletas kvercetino, taksifolino bei eriodiktiolio gliukozidų, metilgalat-rutinozidas, katechinas ir kvercetinas [7].
1.3 Erškėčių (Rosa L.) vaisių medicininis panaudojimas
Erškėčių vaisiai pasižymi įvairiomis savybėmis, kurias jiems suteikia juose esantis platus medžiagų spektras. Vitaminas C, polifenoliniai junginiai, fenolinės rūgštys, terpenoidai, karotenoidai, riebalų rūgštys suteikia šiems vaisiams antioksidantines savybės, dėl kurių ši žaliava pasižymi ir kitomis svarbiomis savybėmis [16, 18]. Vartojant erškėtuogių preparatus pastebimas priešuždegiminis veikimas, kuris pasireiškia įvairiais mechanizmais [16, 17, 18]. Plačiai aprašoma erškėčių vaisių nauda gydant reumatoidinį artritą ir osteoartritą [16, 18]. Randama įrodymų ir apie hipoglikeminį erškėčių vaisių preparatų veikimą [29]. Pastaruoju metu intensyviai tiriamas erškėčių vaisių priešvėžinis veikimas [17]. Nustatyta, kad erškėčių vaisių vartojimas padeda reguliuoti riebalų kaupimąsi, kas gali būti naudinga siekiant išvengti nutukimo bei įvairių ligų [18]. Vartojant erškėčių vaisius mažėja rizika susirgti kardiovaskulinėmis ligomis [17, 43, 44].
Erškėčių vaisiai dėl juose esančių įvairių medžiagų pasižymi antioksidacinėmis savybėmis [16]. Jaime Guerrero C. ir kiti mokslininkai savo tyrime nustatė, jog vyrauja stipri koreliacija žaliavoje tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo. Jie taip pat nustatė, kad iš tirtų laukinių uogų, kurios auga Čilėje, erškėtuogės turi didžiausią fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą [28]. Bulgarijos mokslininkų atliktas tyrimas patvirtina tai, kad tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo yra stipri koreliacija [25]. George Angelov ir kiti mokslininkai nustatė, kad didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi vandeniniai erškėtuogių ekstraktai, išgauti esant 100 ºC temperatūrai [26]. Švedijoje atliktas tyrimas su eritrocitais patvirtino didžiausias vandeninių ekstraktų antioksidacines savybes. Jo metu taip pat nustatyta, kad antioksidacines savybes erškėtuogėms suteikia daugybė įvairių medžiagų [27]. Erškėčių vaisių ekstraktai gali veikti ne tik kaip antioksidantai, bet ir kaip prooksidantai, priklausomai nuo jų koncentracijos [24].
Įvairūs in vivo ir in vitro tyrimai rodo, jog erškėtuogėms būdingos priešuždegiminės savybės [16, 17, 18]. Šiuo metu manoma, jog svarbiausios priešuždegiminės medžiagos, esančios erškėčių vaisiuose, yra flavonoidai, galaktolipidas ir nesočiosios riebalų rūgštys [21]. Francesca Lattanzio ir kiti mokslininkai atliko tyrimą su žiurkėmis, kurioms buvo duotas erškėtuogių ekstraktas. Tyrimo metu jie nustatė, kad ekstraktas pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis in vivo gyvūno modelyje. Taip pat jie teigia, kad jų tyrime in vitro nustatytos antioksidacinės erškėtuogių savybės yra atsakingos už sukeliamą priešuždegiminį veikimą [20]. Kitas tyrimas atliktas su žiurkėmis taip pat patvirtina, jog erškėtuogių alkoholinis ekstraktas malšina uždegiminį skausmą bei gali būti naudojamas naujų medžiagų uždegiminėms ligoms gydyti vystymui [22]. Trečiojo atlikto tyrimo su žiurkėmis rezultatai patvirtina praeitų tyrimų rezultatus. Taip pat šiame tyrime teigiama, jog erškėtuogių sukeliami priešuždegiminiai mechanizmai gali būti susiję su COX-2, naviko nekrozės faktoriaus-α, interleukino-1β ir interleukino-6 kiekio sumažėjimu bei azoto oksido ir malondialdehido inhibicija [23]. Pastebėta,
kad ilgalaikis erškėtuogių preparatų vartojimas sukelia daug mažiau virškinimo sistemos sutrikimų palyginus su nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo ir acetilsalicilo rūgštimi [19].
Osteoartritas ir reumatoidinis artritas yra dažniausios artritų formos. Tyrimais nustatyta, jog erškėčių vaisių preparatai turi įtakos šių ligų simptomų lengvinimui [16, 18]. Kinijos mokslininkai, atlikę tyrimus su žiurkėmis, nustatė, jog erškėčių vaisių benzino ekstraktas mažina audinių uždegimą ir sąnarių kremzlių irimą. Šis preparatų poveikis gali būti susijęs dėl uždegimą skatinančių citokinų slopinimo [14]. S. N. Willich ir kiti mokslininkai savo tyrime analizavo erškėčių vaisių preparatų veiksmingumą gydant pacientus, kurie serga reumatoidiniu artritu. Jie stebėdami nepageidaujamas reakcijas ir skausmo skalių dėka nustatė, jog erškėčių vaisių preparatai gali pagelbėti kaip papildoma priemonė pacientams, sergantiems reumatoidiniu artritu [11]. Atlikus in vitro tyrimus su erškėčių vaisių organinių tirpiklių ekstraktais, nustatyta, kad jie puikiai inhibuoja COX-1 ir COX-2. Iš visų ekstraktų labiausiai šiuo poveikiu pasižymėjo ekstraktas, kurio gamybai naudotas tirpiklis buvo metanolis [12]. Danijos mokslininkai nustatė, jog erškėčių vaisių vartojimas malšina osteoartritu sergančių pacientų skausmą. Taip pat šių preparatų vartojimas sumažina poreikį vartoti skausmą malšinančius vaistus gydantis osteoartritą, tokius kaip paracetamolis, kodeinas ar tramadolis [13]. Korėjos mokslininkai atlikto tyrimo metu su žiurkėmis nustatė erškėčių vaisių vartojimo potencialiai sukeltą apsauginį sąnario kremzlės poveikį nuo progresuojančio osteoartrito [15].
Cukrinis diabetas yra lėtinė metabolinė liga, kuri turi stiprią įtaką ja sergančių žmonių sveikatai ir gyvenimo būdui. Sergamumas cukriniu diabetu tik didėja, todėl nuolat ieškoma priemonių šiai ligai kontroliuoti, įskaitant ir augalinės kilmės vaistus [32]. Atlikus tyrimą su žiurkėmis, pastebėta, kad po erškėčių vaisių ekstrakto pavartojimo gliukozės kiekis kraujyje žymiai sumažėjo lyginant su kontroline grupe [30]. Mohsen Taghizadeh ir kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu nustatyta, kad mažesnės koncentracijos erškėčių vaisių ekstraktai turi didesnį gliukozės kiekio mažinantį veikimą [33]. Išskyrus erškėčių vaisių aktyvius junginius į frakcijas, nustatyta, kad didžiausią gliukozės kiekį mažinantį veikimą turi vandeninė frakcija, kurioje būdingi monosacharidai, oligosacharidai ir pektinai. Manoma, kad šie junginiai ir yra atsakingi už antidiabetinį efektą [29]. Tyrimo metu su pacientais, sergančiais antro tipo cukriniu diabetu, nustatyta, kad po 3 mėnesių erškėčių vaisių preparatų vartojimo pacientų gliukozės kiekis žymiai nepakito, tačiau šis gydymas nesukėlė jokių šalutinių reiškinių [31]. Ali Fattahi ir kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu nustatyta, jog erškėčių ekstraktas turi didelę įtaką kasos β-ląstelių augimui. Tai gali būti mechanizmas, apibrėžiantis antidiabetinį erškėčių vaisių preparatų veikimą [32].
Vėžys yra patologinė būklė pasižyminti padidėjusiu ląstelių augimu ir išsivystanti dėl ląstelių natūralaus ciklo sutrikimo arba sumažėjusios apoptozės [35]. Erškėčių vaisių ekstraktai pasižymi telomerazės, kuri atlieka svarbų vaidmenį vėžio ląstelių pasidalijame, slopinimu. Telomerazės slopinimas gali sąlygoti vežio ląstelių mirtį [35]. Spėjama, kad erškėtuogių priešvėžinis veikimas yra
susijęs su jų antioksidantiniu bei anti-proliferaciniu poveikiais [39]. Įrodyta, jog erškėčių vaisių ekstraktas gali būti naudojamas inaktyvinti plaučių, prostatos, storosios žarnos, krūtų ir gimdos kaklelio vėžio ląsteles [34, 35, 36]. Tyrimo metu ištirta, kad didžiausią priešvėžinį veikimą sukelia erškėtuogėse esantys flavonoidai ir fenolinės rūgštys, iš kurių labiausiai pasižymi elago rūgštis ir kvercetinas [34]. Kito tyrimo rezultatai parodė, jog be polifenolinių junginių priešvėžinį veikimą taip pat suteikia ir vitaminas C [37]. Fang Wang ir kiti mokslininkai savo tyrime nustatė, jog eriodiktiolis, erškėtuogių sudėtyje esantis flavanonas, pasižymėjo stipriu, nuo dozės priklausomu ir selektyviu veikimu prieš kepenų vėžio ląsteles [38]. Patrice Cagle ir kiti mokslininkai savo tyrime ištyrė erškėčių ekstraktų poveikį žmogaus smegenų naviko ląstelėms ir nustatė, jog erškėčių vaisių ekstraktai padeda išvengti šių ląstelių proliferacijos be skatinamos apoptozės. Jų tyrimo rezultatai taip pat parodė, kad tiriamieji ekstraktai pasižymi didesniu anti-proliferaciniu poveikiu nei dažnai naudojamas priešvėžinis vaistas, temozolomidas [39].
Paprastasis erškėtis ir tilirozidas, pagrindinė erškėčio sėklų sudedamoji dalis, pasižymi lipidų kaupimą mažinančiu veikimu skatindami riebalų rūgščių oksidaciją kepenyse ir raumenyse [41]. Atliktų tyrimų rezultatai rodo, jog erškėtuogės lėtina kūno masės augimą paskatindama energijos išeikvojimą ir baltojo riebalinio audinio rudavimą [42]. Erškėčių vaisių ekstraktų įtaka baltajam riebaliniam audiniui yra susijusi su periksomos proliferatorių-aktyvuojamųjų receptorių ekspresijos slopinimu. Tyrimo su žiurkėmis metu nustatyta, kad erškėtuogių ekstraktai sumažina bendrą kepenų lipidų ir trigliceridų kiekį bei kūno masės ir vidaus organų riebalų kiekio augimą [41]. Po 12 savaičių trukusio, randomizuoto, dvigubai aklo, placebo kontroliuojamo klinikinio tyrimo nustatyta, jog 100 mg per dieną erškėčių vaisių vartojimas gali padėti išvengti nutukimo. Ilgalaikis erškėtuogių preparatų vartojimas neparodė jokių ryškių šalutinių reiškinių [40].
U. Andersson ir kiti mokslininkai savo tyrime su pacientais tyrė erškėčių vaisių įtaką prevencijai nuo kardiovaskulinių ligų. Per 6 savaites vartojant po 40 g erškėčių vaisių miltelių per dieną pacientų sistolinis kraujo spaudimas sumažėjo 3,4 %, bendras cholesterolio kiekis – 4,9 %, mažo tankio lipoproteinų kiekis – 6 % bei mažo tankio lipoproteinų ir didelio tankio lipoproteinų santykis – 6,5 %. Kiti rodikliai žymiai nekito. Šie rezultatai parodo, kad kasdieninis erškėtuogių miltelių vartojimas gali sumažinti kardiovaskulinę riziką [43]. Kito tyrimo metu nustatyta, kad erškėtuogių vartojimas 2 tipo cukriniu diabetu sergantiems pacientams sumažina bendro cholesterolio ir didelio tankio lipoproteinų santykį bei kad toks vartojimas yra saugus [31]. Švedų mokslininkai atliko tyrimą su žiurkėmis ir erškėtuogėmis, kurio tikslas buvo nustatyti antiaterosklerotinį efektą. Jų rezultatai parodė, jog erškėtuogių vartojimas padeda išvengti aterosklerotinių apnašų formavimąsi moduliuojant sisteminį kraujo spaudimą ir atvirkštinio cholesterolio transporto bei uždegimo genų ekspresiją [44]. Taip pat yra įrodyta, jog erškėčių vaisiai mažina trigliceridų kiekį žiurkėse [30].
1.4 Fenoliniai junginiai ir jų nustatymo metodai
Fenoliniai junginiai yra labai įvairios struktūros medžiagos. Didelei daliai šių junginių būdingas aromatinis žiedas su viena ar daugiau hidroksilo grupe [45, 46]. Fenoliniai junginiai yra susintetinami kaip antriniai metabolitai įprasto augalo vystymosi metu bei įvairiose situacijose, tokiose kaip UV radiacija, vabzdžio užpuolimas, organų pažeidimas [45, 48]. Šios medžiagos pasižymi antioksidantiniu poveikiu, kuris padeda apsisaugoti nuo širdies ligų, slopinti uždegiminius procesus, mažinti vėžio ir diabeto susirgimo tikimybę bei sumažinti mutagenezės dažnumą žmogaus ląstelėse [45]. Pagrindines fenolinių junginių grupes sudaro flavonoidai, fenolinės rūgštys, taninai, stilbenai ir lignanai (1 lentelė).
Flavonoidai yra pati dažniausia fenolinių junginių grupė. Jie kartu su karotenoidais ir chlorofilais yra atsakingi už augalo spalvas. Paprastai flavonoidus sudaro trijų žiedų struktūra [45]. Augaluose flavonoidai gali būti randami kaip flavonoidų glikozidai, esteriai arba aglikonai. Pastebėta, jog glikolizuoti flavonoidai pasižymi mažesniu antioksidantiniu aktyvumu už jų aglikonus [48]. Flavonoidai yra skirstomi į flavonolius, flavonus, izoflavonus, flavanonus, antocianidus, flavan-3-olius, flavanololius bei dihidrochalkonus [45. 46, 47, 48].
Antra svarbiausia fenolinių junginių grupė yra fenolinės rūgštys. Jos augaluose randamos esterių, glikozidų ar amidų formose bei retais atvejais laisvoje formoje. Fenolinių rūgščių variacija priklauso nuo hidroksilo grupių skaičius bei vietos aromatiniame žiede [45]. Priešingai nuo kitų fenolinių junginių, fenolinės rūgštys dėl savo struktūroje esančios karboksilo grupės pasižymi rūgštinėmis savybėmis [48]. Jos pagal struktūrą yra skirstomos į hidroksibenzoines rūgštis bei hidroksicinamonines rūgštis [45, 48, 49].
Trečiąją fenolinių junginių grupę sudaro taninai. Tai yra karčios medžiagos ir pasižymi sutraukiančiu poveikiu. Jie turi savybę sudaryti oksidacines jungtis su kitomis augalų molekulėmis bei nusodinti baltymus [45, 48]. Pagrindiniai du taninų tipai yra kondensuotieji taninai ir hidrolizuoti taninai. Hidrolizuoti taninai yra tirpūs vandenyje ir yra randami vaisiuose. Kondensuotieji taninai (proantocianidinai) yra pagrindiniai fenoliniai junginiai, randami vynuogėse [45, 48].
Stilbenams yra būdinga 1,2-difeniletileno struktūra [48]. Pagrindinis šios grupės atstovas yra resveratrolis. Šios medžiagos galima rasti vynuogėse, iš kurių didžiausias kiekis randamas raudonųjų vynuogių žievelėse. Šis junginys jose sintetinamas kaip atsakas į pažeidimus ar grybelinės kilmės infekcijas. Tyrimais įrodyta, jog resveratrolis pasižymi savybe apsaugoti nuo vežio, vainikinių, neurologinių bei degeneracinių ligų [48].
Lignanų struktūrai dažniausiai būdingos dvi fenilpropanoidų dalys sujungtos anglies atomais. Šie junginiai sudaro vieną pagrindinių fitoestrogenų klasę. Virškinamajame trakte šios medžiagos
1 lentelė. Fenolių junginių grupės
Fenoliniai junginiai Fenolinių junginių
grupės pavadinimas
Struktūros pagrindas Atstovai
Flavonoidai Kvercetinas Kemferolis Miricetinas Rutinas Katechinas Fenolinės rūgštys Vanilo rūgštis Siringo rūgštis p-kumaro rūgštis Kavos rūgštis Ferulo rūgštis Taninai Galotaninai Elagotaninai Stilbenai Resveratrolis Lignanai Enterodiolis Enterolaktonas
verčiamos į junginius, kurie turi estrogeninių ir anti-estrogeninių savybių. Didžiausias kiekis šių medžiagų randamas linų sėmenyse [48].
Norint tinkamai nustatyti fenolinių junginių kiekį, svarbu yra pasirinkti tinkamą ekstrakcijos metodą. Vienas iš tinkamų metodų yra ultragarsu skatinama ekstrakcija, kurios pagalba, esant dažniui aukštesniam už 20 kHz, vyksta organinių ir neorganinių junginių ekstrahavimas iš kietų medžiagų naudojant skystus tirpiklius. Taip pat naudojama mikrobangų skatinama ekstrakcija, kuri pasižymi sunaudojamu mažu kiekiu organinių tirpiklių, trumpu ekstrakcijos laiku ir didele ekstrakcijos išeiga. Randama tyrimų, kurių metu panaudota kombinuota ultragarso ir mikrobangų skatinama ekstrakcija. Ši kombinacija sumažino ekstrakcijos laiką, panaudoto tirpiklio kiekį bei padidino gautų junginių išeigą lyginant su atskirais metodais. Ekstrakcijai superkritiniais skysčiais būdinga mažesnis mėginių užteršimas tirpikliu bei mažesnė ekstrahuojamų junginių degradacija, tačiau didžiausias šio metodo trūkumas yra brangi įranga. Didžiausi ekstrakcijos subkritiniu vandeniu privalumai lyginant su kitais metodais yra metodo paprastumas, ekstrakcijos kokybė bei maža tarša aplinkai. Be išvardintų metodų taip pat naudojama aukšto hidrostatinio slėgio ekstrakcija, pagreitinta ekstrakcija tirpikliais bei naudojami fermentai ir pulsuojantis elektrinis laukas [45, 50].
Nors randama labai daug tyrimų, kurių tikslas yra ištirti fenolinių junginių kiekį, tačiau efektyviai įvertinti atskirų struktūrinių grupių kiekį vis dar yra problematiška. Pagrindiniai metodai įvertinti šių junginių kiekiui yra spektrofotometrija, dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija ir pastarųjų dviejų kombinacijos su masių spektrometrija [51, 53, 54].
Spektrofotometrijos tyrimas pasižymi paprastumu tiriant augalinės kilmės fenolinius junginius. Dažniausiai šiam tikslui yra naudojami Folin-Denis arba Folin-Ciocalteu metodai. Bendras fenolinių junginių kiekis įvertinamas esant 760 nm bangos ilgiui. Taip pat įmanoma įvertinti flavonoidų kiekį etanoliniuose ir metanoliniuose augalų ekstraktuose sumaišius juos su aliuminio (III) chloridu, esant bangos ilgiui 410-423 nm. Rasta įvairių metodų norint nustatyti antocianų ir proantocianidinų kiekius mėginiuose panaudojant spektrofotometriją [54].
Dujų chromatografija taip pat yra veiksmingas metodas, norint įvertinti fenolinių junginių, tokių kaip flavonoidai, fenolinės rūgštys ir kondensuoti taninai, kiekį. Pagrindinis šio metodo trūkumas yra fenolinių junginių stabilumas, dėl kurio gali reikėti chemiškai transformuoti juos į labiau kintamus junginius ar išlaisvinti fenolius nuo glikozidinių ir esterinių ryšių fermentinėse, rūgštinėse ir šarminėse terpėse. Įrodyta, jog naudojant masių spektrometriją kartu su dujų chromatografijos metodu, padidėja tyrimo jautrumas ir selektyvumas [53].
Labiausiai paplitęs fenolinių junginių tyrimo metodas yra efektyvioji skysčių chromatografija. Šio metodo metu dažnai yra naudojama atvirkštinių fazių C18 kolonėlė, UV-Vis diodų matricos detektorius ir dviguba tirpiklių sistema, kurią sudaro rūgštintas vanduo ir polinis organinis tirpiklis.
Taip pat efektyvesniam nustatymui šis metodas kombinuojamas su diodų matricos detektoriumi, masių arba tandemine masių spektrometrija [51, 52, 53].
1.5 Erškėčių (Rosa L.) genties vaisių preparatai
Lietuvos vaistinėse galima rasti įvairių preparatų, kurių sudėtyje yra erškėčių vaisių miltelių ar jų ekstraktų. Danijos įmonė „Orkla Care As“ leidžia į rinką „Litozin“ maisto papildų liniją, kurios išskirtinumas yra sudėtyje esantis erškėtuogių ekstraktas ar jų milteliai. „Litozin Kolagenas“, kurio sudėtyje randamas paprastųjų erškėčių vaisių ekstraktas, skirtas sąnarių lankstumui, jungiamojo audinio būklei ir kremzlių bei kaulų funkcijai gerinti. „Litozin Strong“ maisto papildas, skirtas išlaikyti lanksčius ir sveikus sąnarius bei palaikyti kremzlių ir kaulų funkciją, savo sudėtyje turi 2250 mg erškėčių vaisių miltelių. „Litozin Active“, į kurio sudėtį įeina paprastųjų erškėtuogių ekstraktas, vartojant padeda sąnarių lankstumui, nuovargiui mažinti, energijai, raumenų ir kremzlių funkcijai palaikyti. Čekijoje „Walmark“ įmonė tiekia maisto papildą „Walmark super vitaminas C 600 mg“, kuris papildytas 30 mg paprastųjų erškėčių vaisių milteliais. Ta pati įmonė leidžia į rinką ir kitą maisto papildą: sirupą vaikams „Marsiečiai Prolmun Defend, 150 ml“, kurio 10 ml randama 100 mg paprastųjų erškėčių vaisių 10:1 ekstrakto ir kurio paskirtas yra palaikyti normalią imuninės sistemos veiklą. Lenkijos įmonė „Sanofi-Aventis“ leidžia į rinką pastiles skirtas palaikyti imuninės sistemos veiklą „Propolki“, kuriose yra 18 mg sausojo erškėtuogių ekstrakto. Lietuvoje įmonės „Valentis“ maisto papildo „Propodezas“ sudėtyje yra 50 mg paprastųjų erškėčių vaisių ekstrakto.
2. TYRIMO METODIKOS
2.1 Tyrimų objektas
Tyrimų objektas – paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) ir miškinių erškėčių (Rosa majalis Hermm.) vaisiai bei jų preparatai (2 lentelė).
2 lentelė. Duomenys apie tyrimų objektą
Rosa canina L.
Mėginio numeris Surinkimo vieta Surinkimo data
1. Šakiai, Šakių raj. 2019.09.01
2. Valakbūdis, Šakių raj. 2019.09.10
3. Griškabūdis, Šakių raj. 2018.08.28
4. Klaipėda, Klaipėdos raj. 2018.08.30
Rosa majalis Herrm.
Mėginio numeris Surinkimo vieta Surinkimo data
5. Marijampolė, Marijampolės raj. 2019.08.16
6. Liudvinavas, Marijampolės raj. 2018.08.23
7. Jurbarkas, Jurbarko raj. 2019.08.19
8. Tauragė, Tauragės raj. 2019.08.19
9. Lukšiai, Šakių raj. 2018.08.28
10. Šilalė, Šilalės raj. 2018.08.30
11. Raudonė, Jurbarko raj. 2018.08.30
Preparatai Mėginio
numeris
Preparato pavadinimas
Sudėtis (pagal rekomenduojamą vartojimo porciją) Rekomenduojama vartojimo porcija (RVP)
P1. LITOZIN
ACTIVE
1. Paprastųjų erškėtuogių (Rosa canina L.) ekstraktas (280 mg), atitinkantis 2250 mg erškėtuogių vaisių be sėklų 2. Vitaminas C – 80 mg 3. Vitaminas B6 – 1.4 mg 4. Tiaminas – 1,1 mg 5. Magnis – 200 mg 6. Varis – 150 µg 1 tab.
P2. LITOZIN STRONG 1. Erškėtuogių milteliai – 2250 mg 2. Vitaminas C – 80 mg 3 kaps. P3. LITOZIN KOLAGENAS 1. Hidrolizuotas kolagenas – 500 mg
2.Paprastųjų erškėtuogių (Rosa canina L.) ekstraktas (140 mg), atitinkantis 1120 mg erškėtuogių vaisių be sėklų 3. Vitaminas C – 12 mg 4. Varis – 150 µg 1 tab. P4. PROPODEZAS su erškėtuogėmis 6 tabletėse yra: 1. Vitaminas C – 300 mg 2. Propolis – 124.8 mg
3. Paprastųjų erškėčių (Rosa canina L.) vaisių ekstraktas (11,1%) – 300 mg
4-6 tab.
Erškėčių vaisiai rinkti 2018 metų rugpjūčio - rugsėjo mėnesiais bei 2019 metų rugpjūčio - rugsėjo mėnesiais. Jie buvo džiovinami kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje patalpoje. Išdžiovinti erškėčių vaisiai buvo laikomi popieriniuose maišeliuose, sausoje, vėsioje, nuo saulės spindulių apsaugotoje vietoje.
Tyrimuose naudojami preparatai įsigyti vaistinėje. Jie buvo laikomi sausoje, vėsioje, tamsioje vietoje. Atliekant tyrimus visų preparatų galiojimo terminas buvo nepasibaigęs.
Rekomenduojama vartojimo porcija – preparato ženklinime nurodytas rekomenduojamas vartojimo kiekis tablečių ar kapsulių vienetais per dieną.
2.2 Naudoti reagentai ir aparatūra
Naudoti reagentai:
• Etanolis 96% (V/V) („Vilniaus degtinė“);
• Distiliuotas vanduo (vandens gryninimo sistema MILLIPORE (Darmstadt, Vokietija)); • Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
• Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98%, “ACROS ORGANICS”); • Ledinė acto rūgštis (99,5% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); • Aliuminio chloridas (99,99% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); • Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija);
• ABTS (2,2'–azino–bis–(3–etilbenztiazolin–6–sulfono rūgšties) reagentas („Alfa Aesar“, Karlsrūjė, Vokietija);
• Kalio persulfatas (,,Alfa Aesar“, Karlsrūjė, Vokietija);
• Troloksas ((±)–6–hidroksi–2,5,7,8–tetrametilchromano–2–karboksilinė rūgštis) (,,Sigma– Aldrich“, Sent Luisas, JAV).
Naudota aparatūra:
• Vandens gryninimo sistema MILLIPORE (Darmstadt, Vokietija) – naudotas išgryninto vandens gamybai;
• Elektrinis malūnėlis “D-47906 Clatronic” (Kempen, Vokietija) – naudotas susmulkinti tiriamąjai augalinei žaliavai prieš svėrimus;
• Analitinės svarstyklės Shimadzu AUW120D (Bellingen, Vokietija) – naudotos pasverti susmulkintą augalinę žaliavą;
• Ultragarso vonelė („WiseClean“) – naudota paruošti tiriamuosius augalinės žaliavos ir maisto papildų mėginių ekstraktus;
• Automatinės pipetės „Eppendorf” (Hamburgas, Vokietija) – naudotos paimti tikslų reagentų kiekį tyrimų metu;
• Spektrofotometras (Dynamica, HALO DB-20) – naudotas ištirti tiriamųjų mėginių absorbcijos dydžius;
• Skysčių chromatografas Acquity H-class („Waters“, Milfordas, MA, JAV) su masių spektrometru Xevo TQD („Waters“, Milfordas, MA, JAV) – naudoti identifikuoti fenolinius junginius jei atlikti kiekybinę jų analizę.
• Kolonėlė su prieškolonėle YMC Triart C18 (100 Å, 1,9 µm 100 × 2,0 mm) („YMC“, Kiotas, Japonija) – naudota chromatografiniam skirstymui.
2.3 Tiriamojo ekstrakto paruošimas
Vaistinė augalinė žaliava susmulkinama elektriniu malūnėliu. Tuomet atsveriama 4 g susmulkintų erškėčių vaisių miltelių. Atsverta žaliava suberiama į 20 ml kolbutę. Milteliai užpilami etanoliu 70% V/V iki žymės, atsargiai supurtoma. Erškėčių vaisių ekstraktai dedami į ultragarso vonelę, kurioje jie ekstrahuojasi kambario temperatūroje 20 min. Po ekstrahavimo ekstraktai filtruojami pro 0,22 µm filtrus į rudo stiklo buteliukus ir laikomi tolimesniems tyrimams.
Maisto papildų mėginių ekstraktai paruošti atsižvelgiant į ženklinime nurodytą rekomenduojamą vartojimo porciją (RVP). Mėginiui P1 paruošti imta 1 tabletė, mėginiui P2 – 3 kapsulės, mėginiui P3 – 1 tabletė, mėginiui P4 – 6 tabletės. Tabletės sutrinamos grūstuvėlėje ir
suberiamos į 20 ml kolbutę, o kapsulės turinys beriamas į 20 ml kolbutę. Toliau ekstrakto gamybai naudojama tokia pati metodika kaip ir su augaline žaliava.
2.4 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendram fenolinių junginių kiekiui įvertinti tiriamuose ekstraktuose naudojamas Folin-Ciocalteu metodas. Pasigaminamas 7 % natrio karbonato tirpalas (17,5 g natrio karbonato ištirpinama 250 ml distiliuoto vandens). Į 25 ml kolbutę įpilama 1 ml 5 kartus praskiesto tiriamojo mėginio ekstrakto, 1 ml Folin-Ciocalteu reagento ir 9 ml distiliuoto vandens, atsargiai sumaišoma. Po 5 min. įpilama 10 ml pagaminto natrio karbonato tirpalo ir distiliuoto vandens iki žymės, atsargiai išmaišoma. Gaminant lyginamąjį tirpalą ir etaloninius galo rūgšties tirpalus, naudojama ta pati metodika, tik lyginamojo tirpalo atveju vietoje tiriamojo ekstrakto naudojama 1 ml distiliuoto vandens, o etaloninių galo rūgšties tirpalų atveju – 1 ml skirtingų koncentracijų galo r. tirpalai (0,5 - 2,5 mg/ml).
Visi pagaminti tirpalai laikomi tamsioje vietoje 90 min. kambario temperatūroje inkubaciniam laikotarpiui. Praėjus šiam laikotarpiui, išmatuojama tirpalų absorbcija esant 750 nm bangos ilgiui.
Iš etaloninių galo rūgšties tirpalų rezultatų sudaromas kalibracinis grafikas. Tiriamųjų mėginių ekstraktų rezultatai vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:
𝒚 = 𝟎, 𝟗𝟎𝟔𝟖𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟔𝟏𝟕 ; R2 = 0,996
Lyginant augalinės žaliavos ekstraktų mėginius, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais (GRE) gramui sausos augalinės žaliavos:
𝑿 =𝒄 × 𝑽 × 𝒂
𝒎 (𝒎𝒈 𝑮𝑹𝑬 𝒈⁄ ) X – bendras fenolinių junginių kiekis (mg GRE/g)
c – galo r. koncentracija (mg/ml) V – ištraukos tūris (ml)
a – skiedimas
m – sausos žaliavos masė (g)
Lyginant maisto papildų ekstraktų mėginius, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais (GRE) rekomenduojamoje vartojimo porcijoje (RVP):
𝑿 = 𝒄 × 𝑽 × 𝒂 (𝒎𝒈 𝑮𝑹𝑬 𝑹𝑽𝑷⁄ ) X – bendras fenolinių junginių kiekis (mg GRE/RVP)
c – galo r. koncentracija (mg/ml) V – ištraukos tūris (ml)
2.5 Bendras flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti naudojamas spektrofotometrinis metodas. Prieš tyrimą pasigaminama 33% ledinės acto rūgšties tirpalas (33 ml ledinės acto rūgšties praskiedžiama iki 100 ml distiliuotu vandeniu), 10 % aliuminio chlorido tirpalas (10 g aliuminio chlorido ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens) ir 5 % heksametilentetramino tirpalas (5 g heksametilentetramino miltelių ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens).
Tiriamasis tirpalas pagaminamas į 10 ml kolbutę įpilant 4 ml 96 % etanolio, 0,2 ml 33 % ledinės acto rūgšties tirpalo, 0,6 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo, 0,8 ml 5 % heksametilentetramino tirpalo, 0,2 ml tiriamojo mėginio ekstrakto ir distiliuoto vandens iki žymės. Tirpalas gerai išmaišomas.
Gaminant lyginamąjį tirpalą ir etaloninius rutino tirpalus, naudojama ta pati metodika, tik lyginamojo tirpalo atveju vietoje tiriamojo ekstrakto naudojama 0,2 ml 70 % etanolio, o etaloninių rutino tirpalų atveju – 0,2 ml skirtingų koncentracijų rutino tirpalai (0,2 - 1,0 mg/ml).
Visi pagaminti tirpalai laikomi tamsioje vietoje 30 min. kambario temperatūroje inkubaciniam laikotarpiui. Praėjus šiam laikotarpiui, išmatuojama tirpalų absorbcija esant 407 nm bangos ilgiui.
Iš etaloninių rutino tirpalų rezultatų sudaromas kalibracinis grafikas. Tiriamųjų mėginių ekstraktų rezultatai vertinami pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:
𝐲 = 𝟎, 𝟗𝟒𝟔𝟓𝐱 − 𝟎, 𝟎𝟗𝟓𝟎; 𝐑𝟐= 𝟎, 𝟗𝟗𝟔𝟎
Lyginant augalinės žaliavos ekstraktų mėginius, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais (RE) gramui sausos augalinės žaliavos:
𝑿 =𝒄 × 𝑽 × 𝒂
𝒎 (𝒎𝒈 𝑹𝑬 𝒈⁄ ) X – bendras flavonoidų kiekis (mg RE/g)
c – rutino koncentracija (mg/ml) V – ištraukos tūris (ml)
a – skiedimas
m – sausos žaliavos masė (g)
Lyginant maisto papildų ekstraktų mėginius, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais (RE) rekomenduojamoje vartojimo porcijoje (RVP):
𝑿 = 𝒄 × 𝑽 × 𝒂 (𝒎𝒈 𝑹𝑽𝑷⁄ ) X – bendras flavonoidų kiekis (mg RE/RVP)
c – rutino koncentracija (mg/ml) V – ištraukos tūris (ml)
2.6 Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu
Antiradikalinis aktyvumas įvertinamas naudojant ABTS radikalų-katijonų surišimo metodą. Pasigaminamas 2 mmol/l motininis ABTS+ tirpalas: atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių, suberiama į tamsaus stiklo buteliuką, įpilama 50 ml distiliuoto vandens ir įdedama 0,0095 g kalio persulfato, tirpalas išmaišomas. Gautas mišinys laikomas 16 val. tamsioje vietoje. Po šio laikotarpio tirpalas išlieka stabilus 2 paras kambario temperatūroje tamsioje vietoje. Iš motininio ABTS tirpalo gaminamas darbinis ABTS tirpalas: motininis tirpalas skiedžiamas distiliuotu vandeniu ir esant 734 nm bangos ilgiui matuojamas jo absorbcijos dydis tol, kol pasiekiamas 0,8±0,03.
Gaminant tiriamąjį tirpalą, 3 ml darbinio ABTS tirpalo sumaišoma su 10 µl erškėčių vaisių tiriamojo mėginio ekstrakto. Šis tirpalas paliekamas tamsioje vietoje 1 valandą kambario temperatūroje. Po šio laikotarpio spektrofotometru išmatuojamas mėginių absorbcijos dydis esant 734 nm bangos ilgiui. Atlikus matavimus gauti absorbcijos rezultatai atimami iš darbinio ABTS tirpalo absorbcijos dydžio (0,786-A).
Naudotas lyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo. Kalibravimo grafikas sudarytas naudojant 8000 - 24000 µmol/l etaloninius trolokso tirpalus. Tiriamųjų mėginių rezultatai vertinti pagal gautą trolokso kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:
𝒚 = 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟑𝒙 − 𝟎, 𝟎𝟎𝟑𝟔𝟎; 𝑹𝟐= 𝟎, 𝟗𝟕𝟏𝟒
Lyginant augalinės žaliavos ekstraktų mėginius, rezultatai išreikšti trolokso ekvivalentais (TE) gramui sausos augalinės žaliavos:
𝑿 = 𝒄 × 𝑽 × 𝒂
𝒎 × 𝟏𝟎𝟎𝟎 (µ𝒎𝒐𝒍 𝑻𝑬 𝒈⁄ ) X – antiradikalinis aktyvumas (µmol TE/g)
c – trolokso koncentracija (µmol/l) V – ištraukos tūris (ml)
a – skiedimas
m – sausos žaliavos masė (g)
Lyginant maisto papildų ekstraktų mėginius, rezultatai išreikšti trolokso ekvivalentais (TE) rekomenduojamoje vartojimo porcijoje (RVP):
𝑿 =𝒄 × 𝑽 × 𝒂
𝟏𝟎𝟎𝟎 (µ𝒎𝒐𝒍 𝑻𝑬 𝑹𝑽𝑷⁄ ) X – antiradikalinis aktyvumas (µmol TE/RVP)
c – trolokso koncentracija (µmol/l) V – ištraukos tūris (ml)
2.7 Fenolinių junginių nustatymas UESC-MS metodu
Pusiau kiekybinė fenolinių junginių analizė erškėčių vaisių etanoliniuose ekstraktuose atlikta UESC metodu. Kolonėlė laikoma 40 °C temperatūros termostate. Mobili fazė yra sudaryta iš eliuento A, kurį sudaro 0,1 % vandeninis skruzdžių rūgšties tirpalas, bei eliuento B, kurį sudaro acetonitrilas. Eliucija trunka 10 min, eliuento tėkmės greitis – 0,5 ml/min, injekcijos tūris – 1 µl (2 lentelė). Po paskutinės eliucijos stadijos sąlygos grįžta į pradines sąlygas.
2 lentelė. Eliucijos sąlygos
Laikas Eliuentas A Eliuentas B
1 min 95% 5%
Iki 5 min 70% 30%
7 min 50% 50%
7,5 – 8 min 0 % 100%
Masių spektrometro parametrai: jonizacijos tipas – elektropurkštuvinė neigiama, kapiliaro įtampa – 2500 V, kūgio įtampa 30 V, skanavimo intervalas - nuo 90 m/z iki 1000 m/z, skanavimo dažnis – 4 taškai per sekundę, jonų šaltinio temperatūra – 150 °C, eliuento išgarinimo temperatūra – 500°C, eliuento išgarinimo dujų tėkmės greitis – 800 l/val. Fenolinių junginių smailės buvo analizuojamos MRM režimu (3 lentelė).
3 lentelė. Masių spektrometro nustatymo duomenys taikyti atskiriems fenoliniams junginiams Junginio pavadinimas MRM perėjimas Kūgio įtampa, V Ardymo kameros energija, eV Sulaikymo laikas, min Kvercetinas 301>151 48 20 6,86 Chlorogeno rūgštis 353>191 32 14 3,52 Neochlorogeno rūgštis 353>191 32 14 2,04 Kemferol-3-O-gliukozidas 447>284 54 28 5,64 Kvercitrinas 447>300 50 26 5,68 Hiperozidas 463>300 50 26 5,22 Izokvercitrinas 463>301 52 28 5,28 Tilirozidas 593,1>285 64 30 6,84 Rutinas 609>300 70 38 5,06
Chromatografinės smailės identifikuotos pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką ir masių spektrometriniu detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių masių spektrus (2 pav.). Kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas atliktas lyginant analizuotų mėginių smailių plotus kaip kiekio rodiklius, remiantis prielaida, kad šis rodiklis turi įtakos analizuojamų junginių koncentracijai. Analizuojant specifinį fenolinį junginį, mėginys su didžiausia kiekio rodiklio reikšme prilygintas kaip turintis 100% junginio, o kitų mėginių procentinės išraiškos apskaičiuotos atsižvelgiant į šią reikšmę. Gauti Rosa canina L. ir Rosa majalis Herrm. analičių smailių plotų duomenys buvo perskaičiuoti atsižvelgiant į rekomenduojamą vartojamą kiekį, kad būtų galima palyginti visų tirtų mėginių duomenis pagal jų vartojimo pobūdį [59].
2 pav. Masių spektrometrijos metodu gautos chromatogramos pavyzdys
2.8 Duomenų analizės metodai
Gauti tyrimų duomenys apdoroti naudojantis kompiuterine programa „Microsoft Office Excel 2019“ (Microsoft, JAV). Analizuojant spektrofotometrijos metodu gautus duomenis vertinta tyrimų rezultatų vidurkis, standartinis nuokrypis, kuris išreikštas paveiksluose paklaidų juostomis, bei statistinis reikšmingumas. Spektrofotometrijos metodu gautų rezultatų palyginimas atliktas naudojant ANOVA analizės išskaičiuotus vidurkius. Gauti rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05. Spektrofotometriniai tyrimai buvo atlikti 3 kartus.
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas tiriamuosiuose mėginiuose
Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti buvo naudotas UV spektrofotometrijos Folin-Ciocalteu metodas. Šiuo metodu atliktas paprastųjų erškėčių ir miškinių erškėčių bendro fenolinių junginių kiekio tyrimas (3 pav.). Fenolinių junginių kiekis tirtuose paprastųjų erškėčių vaisiuose įvairuoja nuo 15,31 mg GRE/g iki 22,45 mg GRE/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Šakiuose augančiuose paprastųjų erškėčių vaisiuose (22,45±0,61 mg GRE/g) bei Klaipėdoje augančiuose paprastųjų erškėčių vaisiuose (20,3±0,29 mg GRE/g). Mažiausias kiekis nustatytas Valakbūdžio (Šakių raj.) augimvietės paprastųjų erškėčių vaisiuose (15,31±0,74 mg GRE/g). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, p < 0,05.
3 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg GRE/g) įvairavimas paprastųjų erškėčių ir miškinių erškėčių vaisių mėginiuose
Miškinių erškėčių vaisiuose fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 18,81 mg GRE/g iki 24,41 mg GRE/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis rastas Jurbarke surinktuose Rosa majalis Herrm. vaisiuose (24,41±0,16 mg GRE/g), taip pat Lukšiuose, Šakių rajone augančiuose miškinių erškėčių vaisiuose (23,2±0,18 mg GRE/g) ir Šilalėje surinktuose R. majalis Herrm. vaisiuose (21,76±0,17 mg GRE/g). Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Tauragės ir Liudvinavo (Marijampolės raj.) augimviečių miškinių erškėčių vaisiuose (20,52±0,67 mg GRE/g ir 18,81±0,22 mg GRE/g, atitinkamai). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, p < 0,05.
Taip pat fenolinių junginių kiekis nustatytas 4 skirtinguose maisto papilduose, kurių sudėtyje yra erškėčių vaisių miltelių arba erškėčių vaisių ekstrakto (4 pav.). Didžiausias fenolinių junginių
0 5 10 15 20 25 30 B en d ras f en oli n ių jun g. k ieki s, m g G RE/ g
Rosa majalis Herrm. Rosa canina L.
kiekis rastas mėginiuose P4 (31±2,31 mg GRE/RVP) ir P2 (20,2±1,97 mg GRE/RVP). Mažesnis fenolinių junginių kiekis nustatytas mėginyje P1 (11±1,22 mg GRE/RVP), o mažiausias kiekis – mėginyje P3 (5,6±0,53 mg GRE/RVP).
4 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg GRE/RVP) įvairavimas maisto papildų mėginiuose
N. Demir ir kiti Turkijos mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu ištyrė Turkijoje augančių 5 skirtingų rūšių erškėčių vaisius. Jų tyrimo metu nustatytas vidutinis bendras fenolinių junginių kiekis paprastųjų erškėčių vaisiuose - 31,08 mg GRE/g [6]. Šiame tyrime nustatyta, jog Lietuvoje augančių paprastųjų erškėčių vaisių bendro fenolinių junginių kiekio vidurkis yra mažesnis - 19,56 mg GRE/g. Kito Turkijos mokslininkų atlikto tyrimo metu tirti Adijamano provincijoje augantys erškėčių vaisiai. Jų tyrimo metu nustatyta, jog bendras fenolinių junginių kiekis varijuoja nuo 3,62 mg GRE/g iki 5,42 mg GRE/g [10]. Šiame atliktame tyrime su Lietuvoje augančiais erškėčių vaisiais nustatytas didesnis fenolinių junginių kiekis - nuo 15,31 mg GRE/g iki 24,41 mg GRE/g. Gauti rezultatai nuo kitų mokslininkų atliktų tyrimų rezultatų galėjo skirtis dėl geografinės padėties, surinkimo laiko, laikymo sąlygų bei tyrimo metodo pasirinkimo.
3.2 Flavonoidų kiekio įvairavimas tiriamuosiuose mėginiuose
Flavonoidų kiekiui surinktuose erškėčių vaisiuose ir preparatuose nustatyti panaudotas UV spektrofotometrinis metodas. Tirti erškėčių vaisiai surinkti iš 11 skirtingų Lietuvos augimviečių (5 pav.). Flavonoidų kiekis paprastųjų erškėčių vaisiuose iš Lietuvoje surinktų augimviečių varijuoja nuo 1,04 mg RE/g iki 1,6 mg RE/g. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas Šakiuose ir Valakbūdyje (Šakių raj.) surinktų Rosa canina L. vaisiuose (1,6±0,06 mg RE/g ir 1,17±0,05 mg RE/g, atitinkamai). Mažesnis flavonoidų kiekis rastas Griškabūdžio (Šakių raj.) augimvietės paprastųjų erškėčių vaisiuose (1,11±0,03 mg RE/g), o mažiausias kiekis – Klaipėdoje augančių paprastųjų erškėčių vaisiuose (1,04±0,03 mg RE/g). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, p < 0,05.
0 5 10 15 20 25 30 35 P1 P2 P3 P4 B en d ras f en oli n ių jun gin ių ki eki s, m g G R E/ R V P
5 pav. Flavonoidų kiekio (mg RE/g) įvairavimas paprastųjų erškėčių ir miškinių erškėčių vaisių mėginiuose
Lietuvoje augančiuose Rosa majalis Herrm. vaisiuose flavonoidų kiekis varijuoja nuo 1,28 mg RE/g iki 1,62 mg RE/g. Didžiausias flavonoidų kiekis randamas Jurbarke augančiuose miškinių erškėčių vaisiuose (1,62±0,07 mg RE/g) ir Liudvinave (Marijampolės raj.) rinktuose miškinių erškėčių vaisiuose (1,56±0,07 mg RE/g). Toks pat flavonoidų kiekis nustatytas Šilalės ir Raudonės (Jurbarko raj.) augimviečių miškinių erškėčių vaisiuose (1,54±0,08 mg RE/g ir 1,54±0,07 mg RE/g, atitinkamai). Mažiausias flavonoidų kiekis aptinkamas Tauragėje surinktuose miškinių erškėčių vaisiuose (1,28±0,03 mg RE/g). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, p < 0,05.
Flavonoidų kiekis ištirtas ir 4 Lietuvoje įsigytuose preparatuose (6 pav.). Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas mėginyje P2 – 8,8±1,06 mg RE/RVP. Mažesnis flavonoidų kiekis randamas maisto papildo mėginyje P4 – 6,6±0,92 mg RE/RVP, o mažiausias kiekis – mėginiuose P1 (4,2±0,72 mg RE/RVP) ir P3 (2,2±0,35 mg RE/RVP).
Turkijos mokslininkai atlikdami tyrimą su 5 skirtingomis erškėčių vaisių rūšimis, išanalizavo flavonoidų kiekį tiriamuose vaisiuose. Jų tyrimo metu nustatyta, kad erškėčių vaisiuose flavonoidų kiekis varijuoja nuo 9,31 mg RE/g iki 10,81 mg RE/g. Taip pat jie nustatė, jog Turkijoje surinktų Rosa canina L. vaisiuose flavonoidų kiekis yra 9,48 mg RE/g [6]. Šiame atliktame tyrime su Lietuvoje užaugusiais erškėčių vaisiais nustatytas mažesnis flavonoidų kiekio įvairavimas (nuo 1,04 mg RE/g iki 1,62 mg RE/g), o paprastųjų erškėčių vaisiuose nustatytas mažesnis flavonoidų kiekio vidurkis – 1,23 mg RE/g. Rezultatų skirtumams tarp šių tyrimų įtakos galėjo turėti žaliavos užaugimo vieta, užaugimo bei surinkimo sąlygos, laikymas bei panaudotas tyrimo metodas.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 F lavonoid ų k ie ki s, m g R E/ g
6 pav. Flavonoidų kiekio (mg RE/RVP) įvairavimas maisto papildų mėginiuose
3.3 Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas tiriamuosiuose mėginiuose
Norint nustatyti antiradikalinį aktyvumą tiriamuosiuose mėginiuose buvo panaudotas spektrofotometrinis ABTS+ metodas. Iš viso ištirti 4 paprastųjų erškėčių ir 7 miškinių erškėčių vaisių mėginiai (7 pav.). Rosa canina L. mėginiuose antiradikalinis aktyvumas varijuoja nuo 125,6 µmol TE/g iki 127,1 µmol TE/g. Didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi Šakiuose augantys paprastųjų erškėčių vaisiai (127,1±2,82 µmol TE/g) ir Klaipėdoje surinkti paprastųjų erškėčių vaisiai (126,94±0,16 µmol TE/g). Mažesniu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi Griškabūdžio (Šakių raj.) augimvietėje surinkti Rosa canina L. vaisiai (126,27±0,94 µmol TE/g), o mažiausiu – Valakbūdžio (Šakių raj.) augimvietės paprastųjų erškėčių vaisiai (125,6±0,74 µmol TE/g). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, p < 0,05.
7 pav. Antiradikalinio aktyvumo (µmol TE/g) įvairavimas skirtinguose paprastųjų erškėčių ir miškinių erškėčių vaisių mėginiuose
0 2 4 6 8 10 12 P1 P2 P3 P4 F lavon oid ų k ieki s, m g RE/ R VP
Maisto papildo mėginio numeris
0 20 40 60 80 100 120 140 160 Antir ad ik ali n is ak tyvum as , µm ol TE /g
Miškinių erškėčių vaisiuose antiradikalinis aktyvumas varijuoja nuo 100,1 µmol TE/g iki 132,44 µmol TE/g. Liudvinave (Marijampolės raj.) ir Marijampolėje surinkti Rosa majalis Herrm. vaisiai pasižymi didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu (132,44±0,98 µmol TE/g ir 127,77±0,4 µmol TE/g, atitinkamai). Jurbarko ir Šilalės augimviečių miškinių erškėčių vaisiai pasižymi tokiu pačiu antiradikaliniu aktyvumu (127,44±3,54 µmol TE/g ir 127,44±0,99 µmol TE/g, atitinkamai). Kiek mažesnis antiradikalinis aktyvumas nustatytas Lukšių (Šakių raj.) ir Raudonės (Jurbarko raj.) augimviečių Rosa majalis Herrm. mėginiuose (126,44±0,70 µmol TE/g ir 124,77±1,60 µmol TE/g, atitinkamai), o mažiausias – Tauragės augimvietės miškinių erškėčių vaisiuose (100,1±1,75 µmol TE/g). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, p < 0,05.
Taip pat antiradikalinis aktyvumas nustatytas ir tirtuose maisto papildų mėginiuose (8 pav.) Didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi maisto papildo mėginys P4 (773,6±30,73 µmol TE/RVP). Kiek mažesnis antiradikalis aktyvumas nustatytas mėginyje P2 – 531,8±22,01 µmol TE/RVP. Mažiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi mėginiai P1 (264,8±6,09 µmol TE/RVP) ir P3 (91,2±4,39 µmol TE/RVP). Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, p < 0,05.
Turkijos mokslininkų atliktame tyrime nustatyta, jog Turkijoje augančių erškėčių vaisiuose antiradikalinis aktyvumas varijuoja nuo 56,80 µmol TE/g iki 113,60 µmol TE/g [10]. Kitame tyrime, kurio metu ištirtos 5 skirtingos erškėčių vaisių rūšys, nustatyta, jog Rosa canina L. vaisių antiradikalinis aktyvumas yra 35,51 µmol TE/g [6]. Lietuvoje augančių erškėčių vaisių antiradikalinio aktyvumo įvairavimas (nuo 101,1 µmol TE/g iki 132,44 µmol TE/g) yra didesnis už augančių Turkijoje. Taip pat nustatyta, kad Lietuvoje surinktų paprastųjų erškėčių vaisių antiradikalinis aktyvumas yra didesnis (126,48 µmol TE/g). Tokiam rezultatų skirtumui galėjo turėti įtakos vaisių augimo sąlygos, jų surinkimas, laikymas bei naudotas tyrimo metodas.
8 pav. Antiradikalinio aktyvumo (µmol TE/RVP) įvairavimas maisto papildų mėginiuose
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 P1 P2 P3 P4 Antir ad ik ali n is ak tyvum as, µ m ol T E /R VP
3.4 Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė tiriamuosiuose mėginiuose
UESC-MS/MS metodu
Atlikus fenolinių junginių analizę UESC-MS/MS metodu, tirtuose mėginiuose išskirti šie junginiai: chlorogeno rūgštis, kemferol-3-O-gliukozidas, hiperozidas, izokvercitrinas, rutinas, neochlorogeno rūgštis, kvercitrinas, tilirozidas, kvercetinas. Hiperozido kiekio rodiklio pasiskirstymas įvertintas tarp tiriamųjų mėginių (9 pav.). Didžiausias hiperozido kiekio rodiklis nustatytas Rosa canina L. vaisiuose, rinktuose Šakių augimvietėje. Šiame mėginyje identifikuotas hiperozido kiekio rodiklis didesnis iki 3 kartų lyginant su kitais šios rūšies erškėčių vaisių mėginiais. Rosa majalis Herrm. vaisiuose identifikuotas ženkliai mažesnis (nuo 2 iki 26 kartų) hiperozido kiekio rodiklis lyginant su Rosa canina L. vaisiais. Maisto papildų mėginiuose lyginant su kitais tirtais preparatais ženkliai didesniu hiperozido kiekio rodikliu išsiskiria mėginys P2 (iki 35 kartų).
9 pav. Hiperozido kiekybinės sudėties pasiskirstymas tiriamuosiuose mėginiuose
Pietų Korėjos mokslininkai atliko tyrimą su hiperozidu, kurio metu analizuotas hiperozido vaidmuo gydant kraujagyslines uždegimines ligas. Šio tyrimo metu nustatyta, kad hiperozidas yra tinkama medžiaga sunkių uždegiminių būklių, tokių kaip septinis šokas, gydyme [60]. Atsižvelgiant į gautus tyrimo rezultatus, norint gauti didžiausią kiekį hiperozido reikėtų rinktis paprastųjų erškėčių vaisius surinktus Šakiuose.
Šakiai Valakbūdis, Šakių raj. Griškabūdis, Šakių raj. Klaipėda Marijampolė Liudvinavas, Marijampolės raj. Jurbarkas Tauragė Lukšiai, Šakių raj. Šilalė Raudonė, Jurbarko raj. P1 P2 P3 P4 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 M ėgin io p avad in im as Kiekio rodiklis, % Hiperozidas
