PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Baltymų, išskirtų iš pietinės barškės (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.) vaistinės žaliavos, kiekinis nustatymas ir kapsulių su baltymais gamyba“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir
ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Gustė Vitkutė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) (
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir
ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Gustė Vitkutė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) (
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir
ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-05 Nijolė Savickienė
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir
ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-21 Sonata Trumbeckaitė
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas)
vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir
ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
GUSTĖ VITKUTĖ
Baltymų, išskirtų iš pietinės barškės (Baptisia
australis (L.) R. Br ex Ait f.) vaistinės žaliavos,
kiekinis nustatymas ir kapsulių su baltymais
gamyba
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Prof. dr. Nijolė Savickienė
Konsultantai:
Prof. dr. Ona Ragažinskienė
Prof. habil. dr. Arūnas Savickas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė
Data
Baltymų, išskirtų iš pietinės barškės (Baptisia
australis (L.) R. Br ex Ait f.) vaistinės žaliavos,
kiekinis nustatymas ir kapsulių su baltymais
gamyba
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantai
Prof. dr. Ona Ragažinskienė
Prof. habil. dr. Arūnas Savickas
Data
Recenzentas
Data
Darbo vadovė
Prof. dr. Nijolė Savickienė
Data
Darbą atliko
Magistrantė
Gustė Vitkutė
Data
KAUNAS, 2020
TURINYS
SANTRAUKA ... 7 SUMMARY ... 9 SANTRUMPOS ... 12 SĄVOKOS ... 13 ĮVADAS ... 14DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 15
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 16
1.1. Baptisia Vent. genties augalų mokslinė klasifikacija, paplitimas ir augalinės žaliavos cheminė sudėtis ... 16
1.2. Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. augalinės žaliavos cheminė sudėtis, biologinis aktyvumas ir vartojimas medicinoje ... 17
1.3. Ankštinių šeimos augalų kaupiamų baltymų sudėtis, jų funkcijos ir vartojimas ... 20
1.4. Baltymų išskyrimo iš vaistinės augalinės žaliavos metodai... 21
1.4.1. Kolonėlinė chromatografija ... 22
1.4.1.1. Afininė chromatografija ... 23
1.4.1.2. Jonų mainų chromatografija ... 23
1.4.1.3. Hidrofobinės sąveikos chromatografija ... 24
1.4.1.4. Dydžių išskyrimo chromatografija (gelchromatografija) ... 25
1.5. Baltymų kiekinis nustatymas ... 25
1.5.1. Bradford metodas ... 25
1.5.2. Lowry metodas ... 26
1.6. Baltymų technologinis funkcionalizavimas ... 27
1.7. Kietos vaisto formos – kapsulės – charakteristika ... 27
1.8. Kietųjų kapsulių gamybos ypatumai ... 28
1.9. Kietųjų kapsulių kokybės nustatymas ... 29
2. TYRIMO METODIKA ... 31 2.1. Tyrimo objektas ... 31 2.2. Reagentai... 31 2.3. Įranga ... 32 2.4. Tyrimo schema... 33 2.5. Analitiniai metodai... 33
2.5.1. Baltymų ekstrakcija iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų ... 34
2.5.2. Baltymų, išskirtų iš Baptisia australis (L.) R. Br. ex Ait f. šaknų, kiekinis nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 34
2.5.3. Baltymų, išskirtų iš Baptisia australis (L.) R. Br. ex Ait f. šaknų, mėginių
liofilizavimas... ... 36
2.5.4. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų, gamyba ir kapsulių masės vienodumo nustatymas ... 37
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 44
3.1. Baltymų, išskirtų iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų, kiekinė analizė ... 44
3.2. Baltymų, išskirtų iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų, liofilizuotų miltelių kiekinis nustatymas ... 44
3.3. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų, kokybės įvertinimas ... 45
3.3.1. Liofilizuotų baltymų miltelių kokybės nustatymas ... 45
3.3.2. Kietųjų kapsulių su baltymais gamyba ... 49
3.4. Baltymų atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių įvertinimas ... 49
4. IŠVADOS ... 51
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 52
6. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 53
SANTRAUKA
Gustės Vitkutės magistro baigiamasis darbas: “Baltymų, išskirtų iš pietinės barškės (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.) vaistinės žaliavos, kiekinis nustatymas ir kapsulių su baltymais gamyba”. Mokslinio darbo vadovė: prof. dr. N. Savickienė1. Konsultantai: prof.
habil. dr. Arūnas Savickas2, prof. dr. Ona Ragažinskienė3. Kaunas, 2020.
1 Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos
katedra.
2 Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos
ir socialinės farmacijos katedra.
3 Vytauto Didžiojo universiteto, Kauno botanikos sodo, Vaistinių ir prieskoninių
augalų skyrius.
Darbo tikslas: Nustatyti, pietinės barškės (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.) augalinės žaliavos – šaknų, baltymų kiekinę sudėtį skirtingais augalo vegetacijos laikotarpiais bei pagaminti kietąsias kapsules su išskirtais baltymais.
Darbo uždaviniai: 1. Išskirti iš pietinių barškių šaknų baltymų frakcijas skirtingais augalo vegetacijos periodais ((intensyvaus augimo (BA 1), butonizacijos (BA 2), intensyvaus žydėjimo (BA 3) ir sėklų brandos BA 4)). 2. Nustatyti pietinių barškių baltymų, išskirtų iš šaknų skirtingais augalo vegetacijos periodais, kiekinę sudėtį. 3. Įvertinti technologinių veiksnių (pagalbinių medžiagų, miltelių birumo ir masės vienodumo) įtaką kietųjų kapsulių su baltymais technologijai. 4. Įvertinti baltymų, išskirtų iš pietinių barškių šaknų, atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
Tyrimo objektas ir metodai: žaliava – šviežios Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknys, surinktos skirtingais vegetacijos tarpsniais Vytauto Didžiojo universiteto, Kauno botanikos sodo (VDU KBS) Vaistinių ir prieskoninių augalų skyriaus kolekcijoje. Metodai: baltymų ekstrakcija iš augalinės žaliavos, naudojant PBS vandeninį buferio tirpalą 0,01 M, pH = 7,2, paruoštą iš Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl ir dejonizuoto vandens; baltymų išsodinimo
metodas, naudojant amonio sulfatą (AS); resuspendavimo metodas naudojant 10 kartų skiestą PBS, spektrofotometrinis baltymų kiekinis nustatymas Bradford metodu; šaknų ekstrakto liofilizavimas. Įvertinant kapsuliuojamų liofilizuotų miltelių technologines savybes buvo nustatytas birumas, išbyrėjusių miltelių kūgio kampas ir suberiamasis tankis. Nustatyta pagamintų kietųjų kapsulių vidutinė masė, suirimo laikas, baltymų atsipalaidavimas. Gauti rezultatai apdoroti naudojant duomenų analizės paketą Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, JAV) ir „SPSS 20” (IBM, JAV).
Rezultatai: 1. Kiekiškai įvertinus baltymus, išskirtus iš pietinių barškių šaknų skirtingais augalų vegetacijos laikotarpiais, nustatyta, jog didžiausias baltymų kiekis kaupiamas intensyvaus augimo fazėje (BA 1 frakcija). Baltymų kiekis mažėja su kiekviena vėlesne augalo vegetacijos faze ir mažiausias jų kiekis nustatytas BA4 frakcijoje, t.y. sėklų brandos fazėje. 2. Nustatyta, kad 1 mg liofilizuotų baltymų miltelių mišinio yra 0,0012 ± 0,0002 mg baltymo. 3. Nustatyta, kad kapsuliavimui geriausiomis savybėmis pasižymėjo užpildo miltelių sudėtis, sudaryta iš 65 % pagalbinių medžiagų (Polivinilpirolidono, Prosolv®,
Mg stearato) ir 35 % BA baltymų (I BA receptūra). 4. Skrandžio sulčių terpę atitinkančiame pH = 1,2, baltymų atsipalaidavimas – 81,20 ± 0,03 (%), žarnyno terpę atitinkančiame pH = 6,8, baltymų atsipalaidavimas – 91,45 ± 0,07 (%).
Išvados: 1. Išskirtos baltymų frakcijos iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų skirtingais augalo vegetacijos periodais (intensyvaus augimo (BA 1), butonizacijos (BA 2), intensyvaus žydėjimo (BA 3) ir sėklų brandos (BA 4). 2. Nustatyta baltymų, išskirtų iš pietinių barškių šaknų, kiekinė sudėtis (šviežių šaknų žaliavoje (mg/g)): BA 1 ̶ 1,39 ± 0,01; BA 2 ̶ 0,98 ± 0,02; BA 3 ̶ 0,78 ± 0,06; BA 4 ̶ 0,31 ± 0,06. Intensyvaus augimo metu pietinių barškių šaknys sukaupia didžiausią baltymų koncentraciją, mažiausias baltymo kiekis nustatytas sėklų brandos fazėje. 3. Nustatyta, kad kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš pietinių barškių šaknų, gamybai parinktos pagalbinės medžiagos (polivinilpirolidonas, Prosolv®, Mg stearatas), užtikrino tinkamą kietųjų kapsulių užpildo miltelių birumą ir masės vienodumą. 4. Atlikus baltymų, išskirtų iš pietinių barškių šaknų, atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių testą, nustatyta, kad esant terpės pH 1.2 (skrandžio turinio terpę atitinkančiame pH), atsipalaidavo 81,20 ± 0,03 (%) baltymų, o esant terpės pH 6.8 (žarnyno turinio terpę atitinkančiame pH), atsipalaidavo 91,45 ± 0,07 (%). Baltymų atsipalaidavimas iš kietųjų kapsulių atitinka Ph. Eur. 01/2020:20901 reikalavimus.
Raktiniai žodžiai: Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., augalų baltymai, vegetacijos laikotarpis, Bradford metodas, kietųjų kapsulių gamyba.
SUMMARY
Master thesis of Guste Vitkute: Quantification of proteins isolated from the raw material of Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. roots and production of protein hard capsules. Supervisor of the research paper: prof. dr. N. Savickiene1. Consultants: prof. habil. dr. Arunas
Savickas2, prof. dr. Ona Ragazinskiene3. Kaunas, 2020.
1 Department of Pharmacognosy, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty
of Pharmacy.
2 Department of Pharmaceutical Technology and Social Pharmacy, Lithuanian
University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy.
3 Department of Vytautas Magnus University, Kaunas Botanical Garden, Medicinal
and Spice Plants.
The aim: to determine the protein content of Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. roots in different vegetation periods and to produce hard capsules with those isolated proteins.
Objectives of the work: 1. To extract protein fractions from Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. roots during different vegetation periods of the plant (intensive growth (BA 1), butonization (BA 2), intensive flowering (BA 3) and seed maturity BA 4)). 2. To determine the quantitative composition of Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. proteins isolated from roots during different vegetation periods of the plant. 3. To evaluate the influence of technological factors (excipients, powder flow and mass uniformity) on the technology of hard capsules with proteins. 4. To evaluate the release of proteins extracted from Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. roots from hard capsules.
Research object and methods: material – fresh Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. roots collected in Vytautas Magnus University Botanical Garden Medical Herbs section during different vegetation periods. Methods: extraction of proteins from plant material using PBS, 0.01 M aqueous buffer solution, pH = 7.2, prepared from Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl and
deionized water; protein precipitation using ammonium sulfate (AS); resuspension using PBS diluted 10 times, spectrophotometric protein determination by Bradford method; Extracts with proteins lyophilization. In order to evaluate the technological properties of the encapsulated lyophilized powder, the bulk, cone angle, and bulk density of the expelled powder were determined. The capsules average weight, disintegration time and protein relaxation were also evaluated. The obtained results were processed using data analysis package Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, USA) and SPSS 20 (IBM, USA).
Results: 1. Quantification of protein content in fractions and in the root raw material showed that the highest protein content is accumulated in BA 1 fraction, the phase of intensive growth. The protein content decreases with each subsequent plant vegetation phase and the lowest protein content is found in the BA 4 fraction, the seed maturity phase. 2. It has been found that 1 mg of the powder mixture contains 0.0012 ± 0.0002 mg of pure protein. 3. The first formulation of I BA was found to have the best encapsulation properties. It consists of 65 % excipients (PVP, Prosolv®, Mg stearate) and 35 % BA protein powder. 4. Percentage of the protein release in the gastric juice pH 1.2 was 81.20 % ± 0.03, in the intestine with pH 6.8, protein release was 91.45 % ± 0.07.
Conclusions: 1. Proteins were isolated from different fractions of Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., roots at different periods of plant vegetation (intensive growth (BA 1), butonization (BA 2), intensive flowering (BA 3) and seed maturity (BA 4). 2. Determined the amount of protein extracted from the roots of Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., (fresh root raw material (mg/g)): BA 1 ̶ 1.39 ± 0.01; BA 2 ̶ 0.98 ± 0.02; BA 3 ̶ 0.78 ± 0.06; BA 4 ̶ 0.31 ± 0.06. During intensive growth, the roots of Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., accumulate the highest protein concentration, the lowest protein content was detected during the seed maturity phase. 3. Excipients (polyvinylpyrrolidone, Prosolv®, Mg stearate) have been selected for the production of hard capsules with proteins extracted from Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., roots, which ensure proper bulk and mass uniformity of the hard capsule filler powder. 4. In a release test for the proteins isolated from Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., roots hard capsules, it was found that 81.20 ± 0.03 (%) of the medium was released at pH 1.2 (pH corresponding to the gastric contents) and at pH 6.8 (intestinal contents of the medium). corresponding to pH) was 91.45 ± 0.07 (%). Protein release from hard capsules meets the requirements Ph. Eur. 04/2018: 2.9.1.
Keywords: Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., plant protein, vegetation period, Bradford method, capsule production.
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei už visokeriopą pagalbą, begalinę kantrybę bei laiką skirtą konsultuojant visais su mokslinio darbo rengimu susijusiais klausimais. Už nuolatinį palaikymą ir paskatinimą dalyvaujant mokslinėse konferencijose.
Taip pat dėkoju dr. Gabrielei Balčiūnaitei už pagalbą atliekant tyrimus ir suteiktas konsultacijas analizuojant duomenis. Dėkoju prof. habil. dr. Arūnui Savickui ir prof. dr. Onai Ragažinskienei už bendradarbiavimą, konsultacijas ir idėjas darbo rengimo metu.
Už suteiktą tyrimui žaliavą dėkoju Vytauto Didžiojo universiteto, Kauno botanikos sodo (VDU KBS) Vaistinių ir prieskoninių augalų skyriaus darbuotojams. Taip pat mokslo darbuotojui Modestui Žiliui bei dr. Agnei Mazurkevičiūtei, padėjusiems atlikti reikiamus tyrimus.
SANTRUMPOS
A3, B, Ž2, V2 – augalų vegetacijos tarpsniai: intensyvus augimas, butonizacija, intensyvus
žydėjimas ir sėklų branda
AGP – rūgštinis arabinogalaktano baltymas AS – amonio sulfatas
BA – Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų žaliava
BA 1, BA 2, BA 3, BA 4 –baltymų frakcija iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų žaliavos, surinktos atskirais vegetacijos laikotarpiais, atitinkamai: intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo ir sėklų brandos
BSA – jaučio serumo albuminas CNT – anglies nanovamzdeliai CSD – koloidinis silikono dioksidas DOC – natrio deoksicholatas
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
HEPES – 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonrūgštis HPC – hidroksipropilceliuliozė
MCC – silicifikuota mikrokristalinė celiuliozė
NBG – Ukrainos Nacionalinis Botanikos sodas „Grysh-ko“ PBS – fosfatinio buferio tirpalas
Ph. Eur. – Europos Farmakopėja PVP – polivinilpirolidonas TCA – trichloracto rūgštis UV – ultravioletiniai spinduliai
VDU KBS – Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodas
I BA, II BA, III BA, IV BA – pagalbinių medžiagų miltelių mišinių kompozicijos su pietinių barškių baltymais
SĄVOKOS
Antikancerogenas – tai medžiaga, kuri neutralizuoja kancerogeno poveikį arba slopina vėžio vystymąsi.
Hipocholesterolemija – tai neįprastai mažas cholesterolio kiekis kraujyje.
Kofaktorius – į fermento sudėtį įeinanti nebaltyminės kilmės, nedidelės molekulinės masės organinė medžiaga arba jonas, kurie būtini fermento veikimui.
Prototipas – pirmasis egzempliorius, pavyzdys, pagal kurį gaminami visi kiti analogiški objektai.
ĮVADAS
Ankštinių (pupinių) šeima (Leguminosae (Fabaceae) yra viena gausiausių augalų šeimų, turinti apie 18000 rūšių ir suskirstyta į maždaug 650 genčių [7]. Ankštiniai augalai gausiai kaupia baltymus. Viename mokslininkų tarybos seminare, buvo patvirtinta, kad ankštinių šeimos augalai veiksmingai prisideda prie subalansuotos mitybos ir gali užkirsti kelią ligoms, pvz II tipo diabeto bei širdies ir kraujagyslių ligų vystymuisi [9]. Įrodyta, jog augalinės kilmės baltymai kontroliuoja daugelį sveikatos sutrikimų, tarp kurių ir bereikalingą svorio prieaugį [2; 61].
Šiame rašto darbe aptarta pietinė barškė (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.) yra daugiametis Fabaceae šeimos ankštinis augalas. Šio augalo šaknys kaupia biologiškai aktyvias medžiagas. Pagrindinės jų yra alkaloidai, flavonoidai, saponinai. Pavyzdžiui, alkaloidas sparteinas suteikia antiaritminį, o flavonoidai – priešuždegiminį poveikį [7].
Taip pat nustatyta, kad pietinių barškių šaknys ir sėklos kaupia baltymus [61; 62]. Tai aktualu šių dienų visuomenei, nes vis dažniau raginama gyvūninės kilmės baltymus bent iš dalies pakeisti į augalinės kilmės, stengiantis suvartoti daugiau ankštinių produktų bei sumažinant neigiamą gyvulininkystės poveikį (“šiltnamio efektą“ ir užterštumą) aplinkai [63]. Tačiau nėra pakankamai mokslinės literatūros šaltinių apie Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. augalinės žaliavos cheminės sudėties baltymų tyrimus.
Mūsų tyrimo naujumas – pirmą kartą atliktas Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., užaugintos VDU KBS, šaknyse kaupiamų baltymų išskyrimas ir kiekinė analizė bei vykdytas šių baltymų technologinis funkcionalizavimas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas:
Nustatyti, pietinių barškių (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.) augalinės žaliavos – šaknų, baltymų kiekinę sudėtį skirtingais augalo vegetacijos laikotarpiais bei pagaminti kietąsias kapsules su išskirtais baltymais.
Uždaviniai:
1. Išskirti iš pietinių barškių šaknų baltymų frakcijas skirtingais augalo vegetacijos periodais ((intensyvaus augimo (BA 1), butonizacijos (BA 2), intensyvaus žydėjimo (BA 3) ir sėklų brandos BA 4)).
2. Nustatyti pietinių barškių baltymų, išskirtų iš šaknų skirtingais augalo vegetacijos periodais, kiekinę sudėtį.
3. Įvertinti technologinių veiksnių (pagalbinių medžiagų, miltelių birumo ir masės vienodumo) įtaką kietųjų kapsulių su baltymais technologijai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Baptisia Vent. genties augalų mokslinė klasifikacija, paplitimas ir
augalinės žaliavos cheminė sudėtis
Baptisia Vent. genties augalai priklauso pupinių (ankštinių) (Fabaceae, Leguminosae) šeimos augalams. Yra sutinkama 18 šios genties augalų rūšių, tarp kurių 7 priklauso porūšio taksonui, o 6 – įvardijamos kaip hibridai. Baptisia Vent. genties augalai paplitę ir geriausiai prisitaikę augti rytinėje Jungtinių Amerikos Valstijų (JAV) dalyje bei Kanadoje [1].
Persodinus šios genties augalus, jie sunkiai prigyja. Paprastai Baptisia Vent. rūšys dauginamos sėklomis. Pasitaiko atvejų, kai ankštys, surinktos iš vietinių ekosistemų, yra užkrėstos parazitais, dėl šios priežasties daigumas būna labai mažas. Daigai auga lėtai, o pražysta tik po 2-3 metų [2].
Dažniausiai sutinkamos septynios šios genties augalų rūšys. Iš jų lengviausiai atpažįstami taksonai yra Baptisia perfoliata (L.) R. Br. ir Baptisia australis (L.) R. Br. B. perfoliata turi vienspalvius, perlenktus lapus, o likę taksonai – trispalvius. B. australis žiedai išskirtinai mėlynos spalvos, nes likusiems taksonams būdingi baltos, kreminės ar geltonos spalvos žiedynai. Baptisia bracteata Elliott yra unikali tuo, kad turi didelius ir ištisinius 15-40 mm ilgio žiedkočius. Nors B. megacarpa ir B. alba lapija yra panaši, tačiau šias rūšis tarpusavyje galima atskirti iš besiskiriančių žiedynų. B. megacarpa žiedynai – geltonspalviai, o išdžiovinti vaisiai yra gelsvai rudos spalvos, kai tuo tarpu B. alba sukrauna baltos spalvos žiedynus, o išdžiovinti vaisiai įgauna juodą spalvą. B. albescens rūšies augalai skiriasi tuo, kad turi trumpesnę taurelę (4,5-6,5 mm ilgio) ir mažesnius žiedus (13-18 mm ilgio), atitinkamai palyginus su B. alba, kur šie matmenys – 7-8 mm ir 20-25 mm (ilgis). O Baptisia lanceolata (Walter) Elliott yra unikali, nes augalų žiedyne vyrauja 2-6 žiedai ir 1-2 žiedai – lapo ašyje [1]. Baptisia Vent. genties augalai sandėliuoja išskirtinai daug baltymų ir angliavandenių. Atlikus Baptisia Vent. šaknų cheminės sudėties tyrimus buvo aptiktas rūgštinis arabinogalaktano baltymas (AGP), o vandeniniu β-gliukozilo Yariv reagentu nusodinta L-arabinozė (34,0 %) ir galaktozė (58,7 %). Aptikti nedideli gliukurono rūgšties kiekiai, D-ramnozės ir D-gliukozės pėdsakai. AGP baltymų sudėtyje daugiausia randama asparagino rūgšties (11,3 %), glutamino/glutamo rūgšties (10,8 %), alanino (8,0 %), serino (8,0 %), leucino (7,0 %) ir hidroksiprolino (6,3 %) [3].
S. Srivastava (2007) nustatė, jog Baptisia Vent. genties augalinė žaliava (šaknys, stiebai) kaupia L-3,4-dihidroksifenilalaniną, kuris svarbus antrinio metabolizmo procecui – augalo išgyvenimui stresinėje aplinkoje. Augalo vegetatyviniuose organuose – šaknyse ir
stiebuose – šis tarpinis produktas atpažįstamas kaip alkaloidų: betalaino ir melamino, prototipas [4]. Taip pat tirta antrųjų augimo metų Baptisia Vent. genties augalų lapų cheminė sudėtis. Visų anksčiau minėtų septynių Baptisia Vent. augalų rūšių žiedai ir lapai tirti chromatografiškai. Analizuoti chromatografiniai profiliai (atskirai lyginant lapus ir žiedus) buvo panašūs net ir kiekiškai. Lapai buvo sukaupę liuteolino-7-glikozidą, apigenino-7-β-gliukozidą, apigenino-7-glikozidą ir dihidroksifenilalaniną. Kiekvienas iš junginių, aptiktų žieduose, atsikartojo bent trijose skirtingose augalų rūšyse: liuteolino-7-rutinozidas, biochaninas A (izoflavonas), sferobiozidas (izoflavonas), apigenino-7-rutinozidas, kvercetino-7-rutinozidas, kvercetino-3-β-D-gliukozido-kvercetino-7-rutinozidas, kvercetino 3-β-D-gliukozidas [5].
Akivaizdu, jog Baptisia Vent. genties augalinė žaliava kaupia platų spektrą įvairių cheminių medžiagų. Išskirtinė augalinė žaliava – šaknys, kuriose gausu pupinių šeimai būdingų baltymų. Jų funkcija – net tik statybinė (vegetatyvinių organų vystymuisi), baltymai pasižymi imunomoduliacinėmis savybėmis, pvz, šaknyse kaupiamas AGP baltymas išsiskiria imunostimuliuojančiu poveikiu [6].
1.2. Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.
augalinės žaliavos cheminė
sudėtis, biologinis aktyvumas ir vartojimas medicinoje
Pietinė barškė (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.), žinoma kaip „mėlynasis netikras indigo“ arba „mėlynasis laukinis indigo“, yra daugiametis dekoratyvinis augalas. Ši augalų rūšis yra labiausiai paplitusi Vidurio ir Šiaurės Amerikoje [7]. B. australis yra dažniausiai auginama šios genties rūšis ir yra vertinama dėl labai patrauklių, nuo žydros iki violetinės spalvos, lubinus primenčių žiedynų bei mėlynai žalios lapijos. Daugiamečių augalų asociacija B. australis įvardijo „2010 metų daugiamečiu augalu“ [2].
1 pav. Pietinė barškė (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f) VDU Botanikos sodo
Vaistinių ir prieskoninių augalų kolekcijoje (autorius Gustė Vitkutė)
Pietinė barškė (1 pav.) kaupia įvairias biologiškai aktyvias medžiagas. Vienos iš jų yra alkaloidai. Be dažniausiai ankštiniuose augaluose randamų alkaloidų, tokių kaip sparteinas ir lupininas, kaupiami ir biogenetiškai sudėtingesni – piridino grupės alkaloidai (anagirinas ir citusinas). Tačiau alkaloidų kiekis pietinių barškių šaknyse, stiebuose, lapuose ir žieduose siekė vos 0,1 % visų junginių. Be šių junginių pietinių barškių šaknyse nustatyta flavonoidų: farmonetino, farmonetino 7-O-β-D glikozido, afrormosino (I), afrormosino 7-O-β-D glikozido bei didelės molekulinės masės junginio – teksasino 7-O-β-D glikozido. Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknys kaupia ir triterpeno saponinus, pvz., babtisiasaponiną [3].
Ukrainos Nacionaliniame Botanikos sode „Grysh-ko“ (NBG) eksperimentinės floros kolekcijos skyriuje visiško sėklų sunokimo stadijoje buvo surinktos septynių augalų sėklos, tarp jų ir Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f., pasižyminčios antioksidantiniu aktyvumu [8]. Tyrime buvo analizuotas metanolio, etanolio ir vandeninių ekstraktų antioksidantinis potencialas, naudojant 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) reagentą. Atlikus tyrimą nustatyta, kad visų tirtų sėklų ekstraktų mažiausias antiradikalinis aktyvumas buvo stebėtas etanolio ekstraktuose. Atsižvelgiant į antioksidantinį aktyvumą pateikiama tirtų augalų sėklų seka: Bunias orientalis > Galega orientalis > Galega officinalis > Bunias erucago > Isatis littoralis > Baptisia australis > Isatis tinctoria. Vėliau pagal tirtų augalų sėklų vandeninio ekstrakto antioksidantinio poveikio intensyvumą pateikta kita seka: Bunias orientalis > Galega officinalis > Galega orientalis > Baptisia australis > Bunias erucago > Isatis littoralis > Isatis tinctoria. Remiantis Borchardto ir kt. (2008), 12,99 μM pietinių barškių sėklų metanolio ekstraktas turėjo tokį patį antiradikalinį aktyvumą kaip ir 100 μM etaloninio
antioksidanto trolokso [9]. B. australis (L.) R. Br ex Ait f. sėklų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas, naudojant ekstrakcijai skirtingus tirpiklius, pateiktas 1 lentelėje.
1. Lentelė. B. australis (L.) R. Br ex Ait f sėklų ekstraktų antioksidantinis
aktyvumas, mg TE/g [8; 9] Metanolio ekstraktas Etanolio ekstraktas Vandeninis ekstraktas 1.30 ± 0.13 ̶ 3.27 ± 0.11
Dėl šaknų ir sėklų cheminėje sudėtyje kaupiamų alkaloidų B. australis pasižymi raminančiu arba stimuliuojančiu, skausmą malšinančiu poveikiais. Sparteinas suteikia antiaritminį, o flavonoidai – priešuždegiminį poveikį. B. australis (L.) R. Br ex Ait f. augalinė žaliava (pvz., sėklos, šaknys) vartojama ir tam tikrų ligų profilaktikai bei gydymui. Atlikta tyrimų, įrodančių, kad pietinių barškių sėklų išspaudos yra efektyvi priemonė gydant ūminę viršutinių kvėpavimo takų infekciją. Sėklų išspaudomis taip pat gydytas tonzilitas, faringitas, limfadenitas (limfmazgių uždegimas), furunkulozė, burnoje esančios žaizdelės – aftos, opos, stomatitas. Literatūros šaltiniuose aprašyta, kad iš pietinių barškių šaknų paruoštas nuoviras buvo vartojamas pykinimo ir vėmimo skatinimui, o atvėsintas pietinių barškių šaknų nuoviras veikė priešingai – slopino pykinimo ir vėmimo simptomus. Šaknys dar buvo naudotos kompresų gamybai, pažymėta, kad šaknų nuoviru suvilgytas kompresas laikytas burnoje malšino dantų skausmus [10]. Anksčiau paminėtas šaknyse kaupiamas L-3,4-dihidroksifenilalaninas gyvūnų organizme veikia kaip katecholaminų prekursorius ir yra vartojamas kaip vaistas Parkinsono ligos simptomų slopinimui, taip pat šalinant progresuojančius neįgalumo sutrikimus, kurie susiję su dopamino trūkumu smegenyse [4]. Polisacharidų turinčios frakcijos, išskirtos iš B. australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų, buvo apibūdintos kaip veikiančios imunogeniškai. Tai reiškia, jog gebėjo sužadinti imuninį atsaką [3; 11].
Taip pat žinoma, jog pietinių barškių šaknys bei sėklos gali veikti toksiškai [12]. Baptisia Vent. genties sėklų cheminę sudėtį tyręs Gibbons ir kt., (1990) nustatė, jog visų rūšių Baptisia Vent. augalų sėklos turėjo toksinių savybių, kuriomis pasižymi alkaloidai ir glikozidai [1]. Šios rūšies augalų toksiškumas skyrėsi priklausomai nuo sezoniškumo – šaknys didesnę toksinių medžiagų dalį sukaupė intensyvaus augimo metu (A3), kai tuo tarpu sėklose didesnis
šių medžiagų kiekis pastebėtas sėklų pilnos brandos stadijoje (V3).
Apibendrinus vykdytų tyrimų rezultatus, pastebėta, kad Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknys ir sėklos – perspektyvi augalinė žaliava, išsiskirianti biologiškai aktyvių
junginių gausa, kaupianti alkaloidus, flavonoidus, saponinus, polisacharidus, ir pasižyminti antioksidantiniu bei kt. poveikiais.
1.3. Ankštinių šeimos augalų kaupiamų baltymų sudėtis, jų funkcijos ir
vartojimas
Ankštinių šeimos augalai yra pagrindinis augalinės kilmės baltymų šaltinis. Baltymų kiekis gali būti nuo 20 iki 40 g/100 g sausos žaliavos masės [13]. Ankštinių šeimos augalų žaliavoje nustatyta įvairių aminorūgščių: metionino (Met), cisteino (Cys), treonino (Thr), triptofano (Trp), valino (Val), leucino (Leu), histidino (His) [23; 35]. Pagrindinės amino rūgštys, nustatytos ankštinių augalų sėklose – glutamo rūgštis (Glu) (nuo 16,88 iki 19,39 g/100 g baltymų), asparto rūgštis (Asp) (nuo 11,08 iki 12,94 g/100 g baltymų). Taip pat sėklos kaupia liziną (Lys) – vieną svarbiausių žmogui aminorūgščių, kurios orgnizmas pats negamina [7]. Ankštinių augalų cheminėje struktūroje išskiriami ir peptidai, kuriuose aptikta apie 140 amino rūgščių sekų, tiek su dominuojančiu argininu, tiek su lizinu. Aptikta 14 cistino turinčių sekų ir 3 sekos su dominuojančiu metioninu [14].
Globulinai yra pagrindiniai ankštinių augalų sėklose kaupiami baltymai [15]. Teigiama, kad globulinai sudaro apie 70 % visų sėklose esančių baltymų. Į jų sudėtį įeina tokie junginiai, kaip leguminas 11S ir vicilinas/konvicilinas 7S, kurie sudaro 23 % sausos sėklų masės [16]. Šiuos junginius augalai naudoja kaip maistines medžiagas, pvz., 11S globulinas, gautas iš sojų sėklų.
Jahan-Mihan (2011); Rebello ir kt., (2014) įrodė, kad ankštinių augalų sėklos dėl jų sudėtyje esančių baltymų stiprina kaulus, gerina širdies bei kraujagyslių sistemos veiklą, pasižymi priešuždegiminiu veikimu, taip pat vartojamos vėžio profilaktikai, svorio kontrolei, imuniteto stiprinimui, ląstelių gyvybingumui ir geresnei mineralų absorbcijai. Keletas baltymų ir peptidų, išskirtų iš ankštinių šeimos augalų sėklų, priskirti „produkto-vaisto“ kategorijai. 1989 m. JAV Stepono De Felicio Medicinos inovacijų fondo mokslininkai pasiūlė terminą „produktas-vaistas“. Šis terminas apibūdino maistą ar maisto dalis, turinčias medicininę vertę, tuo pačiu ir poveikį ligų profilaktikai. „Produkto-vaisto“ kategorijai buvo priskirti vitaminai, lipidai, polifenoliai, mineralai, skaidulinės medžiagos, taip pat peptidai ir baltymai [17]. Vienas iš pavyzdžių yra kazeino peptidai, kurie pasižymėjo imunomoduliuojančiu, antihipertenziniu, antitromboziniu ir opioidiniu aktyvumais [18]. Iš ankštinių augalų sėklų buvo išskirta ir keletas kitų biologiniu aktyvumu pasižyminčių baltymų/polipeptidų, kurie pateikti 2 lentelėje:
2. Lentelė. Ankštinių augalų sėklų baltymų biologiniai poveikiai
Peptidas/baltymas Ankštinio augalo rūšis Biologinis poveikis
7S globulino α′grandinė Sojos
Mažina cholesterolio ir trigliceridų kiekį kraujo
plazmoje BB serino proteazės
inhibitorius Sojos, žirniai
Priešvėžinis, priešuždegiminis, mažina autoimuninių ligų ir
nutukimo vystymąsi α-amilazės inhibitorius Lubinai, pupos svorio kontrolė: nutukimo ir II
tipo cukrinio diabeto valdymas
Konglutinas γ Lubinai Hipoglikeminis,
hipocholesteroleminis Lektinai Dauguma ankštinių augalų
rūšių
Priešvėžinis, imunomoduliacinis
AKF inhibitoriaus peptidai Sojos Hipotenzinis
Atliekant in vitro ir in vivo klinikinius ir epidemiologinius tyrimus su ankštinių augalų – žirnių, lęšių ir sojų, sėklose kaupiamais baltymais ir peptidais, buvo nustatytas sumažėjęs sergamumas krūties, storosios žarnos ir prostatos vėžiu. Tyrimuose nustatytas ir hipocholesteroleminis, gliukozės kiekį kraujyje bei kraujospūdį mažinantis poveikiai, taip pat antioksidantinis ir priešmikrobinis veikimas [19].
Įrodyta, kad ankštinių šeimos augalų sėkų kaupiami baltymai yra svarbus energijos šaltinis, sudėtyje turintis didelį kiekį skirtingų aminorūgščių ir biologiškai aktyvių peptidų. Dėl įrodyto teigiamo poveikio žmonių sveikatai šios šeimos augalai turėtų tapti svarbia maisto raciono dalimi.
1.4. Baltymų išskyrimo iš vaistinės augalinės žaliavos metodai
Atliekant augalinėje žaliavoje esančių baltymų kokybinę ir kiekinę analizes pirmieji tyrimo etapai susiję su baltymų išskyrimu ir gryninimu [20].
Chromatografijos metodai leidžia atskirti, išgryninti ir identifikuoti mišinio komponentus, naudojamus tolesnei kokybinei bei kiekinei analizei. Baltymai išgryninami pagal jų dalelių dydį ir formą, bendrą krūvį, paviršiuje esančias hidrofobines grupes ir gebėjimą
prisjungti prie nejudančios fazės. Svarbus veiksnys išskirstant mišinio baltymus, yra molekulių savybės, susijusios su adsorbcija, pasiskirstymu ir afinitetu ar skirtumu tarp jų molekulinių masių [21, 22]. Dėl šių ypatumų kai kurie mišinio komponentai ilgiau išlieka nejudančioje fazėje arba lėtai juda chromatografijos sistemoje, o kiti greičiau pereina į judančiąją fazę [23].
Chromatografijos sistemą sudaro:
1. Stacionari fazė – sorbentas arba nešiklis „kieta“ fazė;
2. Judrioji fazė: šią fazę visada sudaro „skystas“ arba „dujinis komponentas“.
Pagrindiniai privalumai, nulėmę chromatografijos metodų populiarumą: jautrumas, automatizavimo paprastumas, nustatant kokybinę-kiekinę sudėtį, tiriant ir atskiriant nelakius ar termolabilius darinius. Chromatografijos metodai taikomi aminorūgščių, baltymų, angliavandenių, nukleorūgščių, terpenoidų, steroidų, antibiotikų, pesticidų, metalų organinių bei įvairių neorganinių junginių tyrimui. Nepaisant privalumų, chromatografijos metodai turi kelis trūkumus: naudojama įranga yra brangi, o su ja gali dirbti tik kvalifikuotas personalas [24].
1.4.1. Kolonėlinė chromatografija
Kolonėlinė chromatografija yra vienas iš labiausiai paplitusių baltymų gryninimo būdų [25]. Šis metodas remiasi baltymų išskirstymu į atskiras frakcijas pagal molekulinę masę – nuo didesnės iki mažesnės molekulinės masės baltymų. Kolonėlinės chromatografijos metu naudojama įranga ir medžiagos:
• Stacionari fazė – užpildas: inertiška matrica, naudojama baltymų atskyrimui. • Kolonėlė: cilindrinis stiklinis rezervuaras.
• Tirpikliai – buferiai, naudojami baltymams iš stacionarios fazės išplauti. Baltymų jungimosi aktyvinimui pasirenkamas buferis, kurio koncentracija yra nedidelė, dažniausiai (apie 10 %) 0,01 M, ir buferio pK bei pH reikšmės yra artimos, pvz., fosfato buferis tinka chromatografijai, kadangi jo pK reikšmė – 7,2, o pH reikšmė ~ 7.
• Surinkimo mėgintuvėliai: indai, skirti išplautiems mėginiams surinkti. Surinkus baltymų frakcijas yra atliekamas grynumo testas. Šiuo metodu (testu) nustatomas santykinis konkretaus baltymo kiekis bendrame baltymų mišinyje [20].
Šiame rašto darbe išskiriamos keturios kolonėlinės chromatografijos rūšys – afininė, jonų mainų, hidrofobinės sąveikos, dydžio išskyrimo chromatografija (gelchromatografija) [25].
1.4.1.1.
Afininė chromatografija
Afininė chromatografija naudojama fermentų, hormonų, antikūnų, nukleorūgščių ir specifinių baltymų valymui [26]. Ligandas, galintis sudaryti kompleksą su specifiniais baltymais (dekstranu, poliakrilamidu, celiulioze ir kt.), apjungia kolonėlės užpildo medžiagas. Specifinis baltymas, sudarantis kompleksą su ligandu, yra pritvirtintas prie matricos ir lieka kolonėlėje, o kiti baltymai išplaunami. Tuomet keičiant pH arba priededant druskos tirpalo, su ligandu surištas baltymas taip pat palieka kolonėlę [27]. Taigi, afininės chromatografijos metu baltymai išskirstomi pagal jų giminingumą ligandui. Afininė chromatografija yra patvariausia ir efektyviausia baltymų gryninimo procedūra, naudojama baltymų išskyrimo pradžioje [28]. Dažnai pakanka vien tik šio metodo baltymų išskyrimui ir išgryninimui.
Afininės chromatografijos metodas – vienas iš selektyviausių ir universaliausių. Metodas pasižymi specifiškumu. Tačiau metodui būdingi ir keli trūkumai: ligandas gali nesusijungti su konkrečiu baltymu, tuomet baltymas nebus išplautas. Kita kliūtis – netinkamas tiriamojo baltymų tirpalo tekėjimo greitis kolonėlėje: greitis gali būti per didelis arba per mažas. Neretai kylanti grėsmė – baltymų aktyvumo praradimas išskyrimo metu [20].
1.4.1.2.
Jonų mainų chromatografija
Jonų mainų chromatografijos metodo esmė – baltymai išskirstomi pagal jų dalelių elektros krūvį.Atliekant baltymų tirpalų analizę šiuo metodu gali vykti dviejų tipų jonų mainai – anijonų mainai (teigiamai įkrauta stacionari fazė, kuri jungiasi prie neigiamai įkrautų baltymų) ir katijonų mainai (neigiamai įkrauta stacionari fazė, kuri jungiasi prie teigiamai įkrautų baltymų). Tyrimui dažniausiai naudojami celiuliozės dariniai: katijonitas – karboksimetilceliuliozė, anijonitas – dietilaminoetilceliuliozė [20]. Jonų mainų chromatografija dažniausiai naudojama kaip tarpinis etapas baltymų išskyrimo procese.
Ši chromatografija pagrįsta sąveika tarp elektrostatiškai įkrautų baltymų grupių ir matricos, kurios jonų krūvis yra priešingas atskirto baltymo krūviui [29].
Kolonėlė yra užpildoma jonitu, ant kurio užpilamas baltymų mišinys. Sąveikaujantys su judriąja faze baltymai nuo kolonėlės atskiriami keičiant druskų tirpalų pH, koncentraciją arba buferinio tirpalo jonų krūvį [30]. Tuo tarpu nesąveikaujantys su judriąja faze baltymai nedelsiant pasišalina iš kolonėlės. Išskirtų baltymų tirpalai surenkami atskiromis frakcijomis, ir jų koncentracija nustatoma kiekvienoje frakcijoje spektofotometriškai [31].
Mažo tūrio kolonėlių naudojimas jonų mainų chromatografijoje yra privalumas, nes užtikrinamas didelis slėgis, tuo pačiu ir greitesnis baltymų atskyrimas [32].
Vis dėlto šis metodas nėra pakankamai selektyvus, todėl baltymo išgryninimui dažnai naudojami keli metodai [20].
1.4.1.3.
Hidrofobinės sąveikos chromatografija
Hidrofobinės sąveikos chromatografijos (HIC) metu baltymai išskirstomi pagal jų hidrofobiškumą. Šis metodas dažnai naudojamas kaip tarpinis analizės žingsnis, išskiriant baltymus [20].
HIC naudojami adsorbentai, skirti ligandui surišti, yra identiški jonų mainų chromatografijos adsorbentams. Todėl hidrofobinės sąveikos chromatografija paprastai gali būti atliekama iš karto po jonų mainų chromatografijos be buferio keitimo ar praskiedimo.
HIC procesą sudaro baltymo mėginio įšvirkštimas į hidrofobinę kolonėlę, užtikrinant didelę druskos koncentraciją. Pastebėta, kad hidrofobinė adsorbcija gali būti sustiprinta į buferinį tirpalą pridedant natrio chlorido arba natrio fosfato [29].
Vienas iš metodo privalumų yra tai, jog jis gali būti naudojamas tiek pradiniame baltymų gryninimo etape, tiek kaip galutinis žingsnis [33], pašalinant iš baltymo nereikalingas priemaišas, susidedančias iš neteisingai susivyniojusių monomerų, kurie trukdytų proceso
efektyvumui. Buferiniam tirpalui nėra keliami dideli reikalavimai.
Nustatyti ir šio metodo trūkumai, neleidžiantys kokybiškai išskirti baltymus: buferio tirpalo jonų krūvis gali būti per didelis arba druskos tirpalo koncentracija – per maža. Neužtikrinus optimalaus jonų krūvio ir pakankamos druskos tirpalo koncentracijos, nebus pasiektas optimalus baltymų išplovimas iš kolonėlės [20].
1.4.1.4.
Dydžių išskyrimo chromatografija (gelchromatografija)
Šio metodo principas – baltymai išskirstomi pagal dalelių dydį (molekulinę masę). Skirtingai nuo kitų anksčiau apibūdintų chromatografinių procedūrų, atliekant baltymų skirstymą šiuo metodu, baltymai nesusijungia su stacionaria faze. Šis metodas dažniausiai naudojamas paskutiniuose baltymo gryninimo etapuose [20].
Siekiant atskirti makromolekules pagal dalelių dydį (molekulinę masę), yra naudojamos medžiagos, kurių sudėtyje yra dekstrano [34].
Gelchromatografijos metu naudojama kolonėlė su užpildu – porėtu geliu. Šis gelis turi būti stabilus ir nereaguoti su atskiriamomis medžiagomis. Į geliu užpildytą kolonėlę įpilama buferio, kuris naudojamas kaip judrioji fazė, pavyzdžiui, baltymų pernešai. Buferis užpildo gelio poras bei pašalina galimai esančius oro tarpus. Gelchromatografijos metu medžiagos iš kolonėlės išplaunamos dalelių dydžių mažėjimo tvarka – pradžioje plaunamos didžiausios molekulinės masės junginiai, kadangi jie neprasiskverbia į gelio poras. Vėliau – iš kolonėlės išsiskiria mažesnės molekulinės masės junginiai. Procesas trunka tol, kol buferis prateka pro kolonėlę [35].
Išskiriamas gelchromatografijos metodo privalumas: galimybė atskirti panašios kilmės baltymus. Metodo trūkumas – gelis gali sureaguoti su medžiagomis, kurias norima atskirti [20].
1.5. Baltymų kiekinis nustatymas
Vienas iš metodų, naudojamų baltymų kiekinei analizei, yra ultravioletinių (UV) spindulių absorbcijos spektroskopija [36]. Jos metu tiriamųjų baltymų koncentracija lyginama su baltymų standartų tirpalų nustatytomis koncentracijomis. Tradiciniai spektroskopiniai metodai, tokie kaip Bradford ir Lowry, yra nesudėtingi, ekonomiškai patrauklūs, dėl to yra vieni dažniausiai naudojamų būdų baltymų koncentracijos nustatymui [37].
1.5.1. Bradford metodas
Baltymų kiekinis nustatymas Bradford metodu remiasi Coomassie G-250 dažo jungimosi su baltymais reakcija. Išsamūs tyrimai parodė, kad “Coomassie Blue G250“ baltymų dažiklis gali egzistuoti keliose skirtingose joninėse formose, kurių pK reikšmės yra 1,15, 1,82
ir 12,4 [38]. Rūgštiniame tirpale vyrauja katijoniniai dažikliai: raudonos ir žalios spalvos dažiklio tirpalai turi absorbcijos maksimumą, atitinkamai esant 470 nm ir 650 nm bangos ilgiui. Su baltymais jungiasi anijoniniai, mėlynos spalvos dažiklio tirpalai, kai absorbcijos maksimumas yra 590 nm. Dažniausiai mėlynas dažas jungiasi prie histidino, arginino, triptofano, fenilalanino ir tirozino [39]. Baltymo koncentracija nustatoma pagal sudarytą kalibracinę kreivę.
Bradford metodo privalumai, lyginant jį su kitais baltymų kiekių nustatymo metodais, yra tai, jog galima identifikuoti mažesnes baltymų koncentracijas (1–2000 µg/ml) per trumpą laiką (~ 2 min.) [40]. Paskaičiuota, kad baltymų kiekinė analizė, naudojant Bradford metodą, yra apie keturis kartus jautresnė ir 15 kartų greitesnė nei baltymų kiekiniam tyrimui naudojamas Lowry metodas [41, 42]. Pagrindinis Bradford tyrimo trūkumas yra metodo nesuderinamumas su dauguma detergentų (paviršiui aktyviomis medžiagomis (PAM)), įprastai naudojamais membranų baltymų tirpinimui. PAM gali būti pašalintos panaudojant filtravimui gelį, dializę ar nusodinant baltymą kalcio fosfatu arba acetonu, tačiau tokiu atveju mėginys yra praskiedžiamas, tuo pačiu gali būti prarandama iki 70 % pradinio baltymo kiekio [38].
1.5.2. Lowry metodas
Lowry metodas daugelį dešimtmečių buvo plačiai naudojamas baltymų kiekio nustatymui, nes pasižymi paprasta atlikimo technika [43].
Šis metodas vykdomas šarminėse sąlygose. Išskirti du Lowry metodo etapai: 1) Biureto reakcija, pagrįsta Cu2+ redukcija, kuomet su dvivalenčiais vario jonais jungiasi baltymų
peptidinėse jungtyse esantys azoto atomai ir aromatinių aminorūgščių – triprofano bei tirozino, liekanos, sudarydamos vienvalenčio (Cu+) peptido kompleksą ir 2) vėlesnė šio komplekso
redukcija Folino-Ciocalteu reagentu [44; 45]. Reakcijos metu susidaro stabilus, tamsiai mėlynos spalvos kompleksas, kurio absorbcija išmatuojama spektrofotometriškai, esant 750 nm bangos ilgui [43].
Šio metodo privalumai: jautrumas, o svarbiausia – tikslumas. Baltymų kiekio nustatymo intervalas – 1-1000 µg/ml [46]. Tačiau Lowry metodas turi ir trūkumų – ne visada įmanomas tikslus baltymo kiekinis nustatymas, kai naudojamuose buferio tirpaluose esančios medžiagos (kai kurie angliavandeniai, lipidai, glicerolis, tricinas, EDTA, tiomersalis) sudaro nuosėdas [47].
Įrodyta, kad Lowry testo rezultatų tikslumui trukdo ir cviterjoninės sulfonrūgšties (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonrūgšties) buferinis tirpalas (HEPES) [48]. Atliktame tyrime HEPES buferio tirpalo reakcija su Lowry reagentu suteikė standartų ir ekstraktų tirpalams intensyvią fono spalvą. Tai buvo trikdis baltymų kiekinės analizės tikslumui. Priešingai, Bradford metodas nepasižymi šiuo trūkumu [45].
Keletas modifikuotų Lowry metodų: natrio deoksicholato (DOC)-trichloracto rūgšties (TCA) nusodinimo metodas, TCA nusodinimo metodas kaitinant ir nusodinimas natrio dodecilsulfatu, sumažina sąveikaujančių medžiagų (detergentų) poveikį. [49].
1.6. Baltymų technologinis funkcionalizavimas
Dėl prasto baltymų biologinio prieinamumo viena populiariausių baltymų ir peptidų technologinių formų – injekcijos, užtikrinančios baltymų tiesioginį patekimą į kraujotaką, išvengiant žarnų epitelio barjero bei fermentų proteazių ardančio poveikio. Polipeptidinių vaistų bioprieinamumas virškinamajame trakte dėl individualių organizmo savybių (pvz., amžius, virškinimo funkcijos, ligos ir kt.) išlieka nuolatiniu iššūkiu dėl skirtingo fermentų metabolizmo, pakeičiančio pusinės eliminacijos laiką kraujo plazmoje, jonų pralaidumą, sukeliančio imunogeniškumą, baltymų agregaciją ar denatūraciją. Baltymų vaisto forma turi būti apsaugota nuo skrandžio rūgščios terpės. Žarnyne baltymų preparatų metabolitai absorbuojami esant beveik neutraliam pH, sąlygojančiam greitesnį aminorūgščių patekimą į kraujotaką [50]. Pagrindinis reikalavimas per os vartojamoms vaistų formoms – bioprieinamumo užtikrinimas nuo 1 % iki 30–50 %. Geriamieji preparatai yra priimtinesni pacientams, nes jų vartojimo būdas ir laikymo sąlygos yra paprastesnės [51, 52].
Augalinių baltymų geriamieji preparatai turi didelę mitybinę vertę, ypač vegetarams ir veganams, papildant jų mitybą reikalingais baltymais bei aminorūgštimis [53, 54]. Tačiau svarbus ir augalinių baltymų geriamųjų preparatų technologinis funkcionalizavimas, pvz., kapsulių apvalkalas taip pat turėtų būti augalinės kilmės, tinkantis vegetarų ir veganų mitybai.
1.7. Kietos vaisto formos – kapsulės – charakteristika
Kapsulės priskiriamos kietoms preparatų formoms, turinčioms kietą arba minkštą apvalkalą. Įvairių formų kapsulės talpina vieną arba kelias veikliąsias medžiagas. Kapsulės yra
dažniausiai vartojamos per burną. Kapsulių apvalkalai yra pagaminti iš želatinos ar kitų medžiagų, kurių konsistenciją galima pakoreguoti (pvz., sluoksniuojant vidinį kapsulės paviršių – naudojant ne tik želatiną, bet ir kitas medžiagas: tamarindų polisacharidą, karageniną, pektiną, kurdaną ir kt.), pridedant medžiagų, tokių kaip glicerolis ar sorbitolis. Lyginant želatinines, polietilenoksido ir hidroksipropilceliuliozės (HPC) kapsules, nustatyta, kad veikliosios medžiagos greičiausiai atsipalaiduoja iš želatininių, sudėtingiau – iš HPC kapsulių [55].
Kapsulių gamintojai parenka užpildo pagalbines medžiagas (pvz., paviršiui aktyvias medžiagas, konservantus, saldiklius, dažiklius, kvapiąsias medžiagas) [56].
Išskiriamos kelios kapsulių rūšys: - kietosios kapsulės;
- minkštosios kapsulės; - skrandyje neirios kapsulės;
- modifikuoto atpalaidavimo kapsulės; - oblatės (krakmolo kapsulės).
Pagal 10.0 Europos farmakopėją (Ph.Eur.) kapsulių kokybės nustatymui taikomi testai:
• Dozių vienodumo nustatymas (2.9.40); • Turinio vienodumo nustatymas (2.9.6); • Masės vienodumo nustatymas (2.9.5); • Tirpimo testas (2.9.3).
Kietąsias kapsules sudaro dvi viena į kitą įlendančios cilindrinės dalys, kurių vienas galas yra suapvalintas ir uždaras, o kitas – atviras. Veiklioji (-osios) medžiaga (-os) su pagalbinėmis medžiagomis, dažniausiai kieto pavidalo (milteliai arba granulės), suberiamos į mažesnį cilindrą, tuomet abi kapsulės apvalkalo dalys suglaudžiamos, ir kapsulė uždaroma [56].
1.8. Kietųjų kapsulių gamybos ypatumai
Kietųjų želatinos kapsulių pildymui naudojami tam tikri aparatai ir prietaisai. Tai užtikrina kapsuliavimo proceso efektyvumą, tikslumą, kapsulių sandarumą.
Kapsulių pildymo mašinėlės turi nustatytą lizdų skaičių, dažniausiai – 30 arba 60, rečiau 120. Į tai reikia atsižvelgti ruošiant miltelių masę. Kapsulės turi būti ne tik pripildytos, bet kiekvienoje jų turi būti tiksli vaistinės medžiagos dozė.
Želatinos kapsulių apvalkalas sudarytas iš baltymų, o jie nedera su medžiagomis, nusodinančiomis (sujungiančiomis) baltymus. Baltymus denatūruoja taninai ir rauginių medžiagų turintys ekstraktai, todėl šio turinio su minėtais junginiais negalima naudoti kaip užpildo želatinos kapsulėse. Tam tikros medžiagos, pavyzdžiui, askorbo rūgštis, laikymo metu dažnai pakeičia želatinos kapsulės apvalkalo spalvą.
Yra išskiriamos 8 kietųjų kapsulių rūšys, priklausomai nuo kapsulės talpos (ml/mg) – nuo didžiausio 000 numerio iki mažiausio 5 numerio [55]. Vaistinės praktikoje dažniausiai naudojamos 1, 2 ir 0 numerio kapsulės [57]. 3 lentelėje pateikti kapsulių numeriai su juos atitinkančia talpa.
3 Lentelė. Kietųjų kapsulių numeriai ir jų vidutinė talpa [10] Kapsulės
numeris
000 00 0 1 2 3 4 5
Talpa (ml) 1,31 0,95 0,67 0,48 0,37 0,27 0,2 0,13
Talpa (mg) 950 650 450 300 250 200 150 100
1.9. Kietųjų kapsulių kokybės nustatymas
Europos farmakopėjos 01/2016:20903 monografija pateikia kietųjų kapsulių, skirtų vartoti per os reikalavimus. Kapsulių turinio vienodumo tyrimas Ph. Eur. 01/2017:20906 atliekamas tik toms kapsulėms, kurių vaistinės medžiagos masė nesiekia 2 mg arba yra mažesnė nei 2 proc. nuo visos mišinio masės. Tuo tarpu masės vienodumo nustatymas (Ph. Eur. 01/2008:20905) atliekamas visoms kapsulėms, nebent atliekamas turinio vienodumo testas, tuomet šis tyrimas nėra vykdomas.
Kapsulės turi atitikti Ph. Eur. 01/2020:20901 reglamentuojamą kietųjų kapsulių suirimo testą. Šiam tyrimui naudojama terpė – vanduo. Taip pat leidžiama naudoti 0,1 M druskos rūgšties (HCl) arba dirbtinių skrandžio sulčių tirpalą. Yra ir daugiau tirpumo testui
naudojamų terpių, kurios parenkamos atsižvelgiant į kietos preparato formos sudėtį ir savybes. Terpės ir jų pH pateiktos 4 lentelėje.
4 Lentelė. Kapsulių tirpinimo terpių pavyzdžiai (pagal Ph. Eur. 07/2010:51701)
Pagal Europos farmakopėjos reikalavimus kietųjų kapsulių suirimo laikas – 30 min. (jei nėra kito nurodymo).
Nuo kapsulės turinio pagalbinių medžiagų ir apvalkalo sudėties priklauso kietųjų kapsulių veikliųjų medžiagų atsipalaidavimas. Kapsulių gamybos metodas taip pat turi įtakos veikliųjų medžiagų atsipalaidavimui. Veikliosios medžiagos iš kapsulės pradeda atsipalaiduoti, kai apvalkalo sluoksnis tampa pralaidus.
Kietų vaisto formų tirpimo testas gali būti atliekamas naudojant krepšelinį, mentinį ar pratakios kameros aparatus. Krepšelinį prietaisą (Ph. Eur. 01/2016:20903) sudaro cilindrinis indas iš borosilikatinio stiklo ar kitos skaidrios medžiagos su pusrutuliniu dugnu ir 1000 ml nominalia talpykla; maišiklis, sudarytas iš vertikalaus veleno, prie kurio apatinės dalies pritvirtintas cilindrinis krepšelis; vandens vonia, kuri palaiko tirpimo terpės temperatūrą 37 ± 0,5 °C. Krepšelio sukimosi greitis – V = 50-200 apsisukimų per minutę. Terpės temperatūra – 37 ± 1°C. Sukimosi metu neturi būti vibracijos. Terpė – vanduo (nebent protokole nurodyta HCl, NaOH, buferiai ar kt.). Krepšelio nuotolis nuo vandens vonios dugno – 20 ± 2 mm. Išsiskyrusių iš kapsulių veikliųjų medžiagų koncentracijos nustatomos 3 kartus (n = 3). Atsižvelgiant į tirpimo greitį, skiriasi mėginių ėmimo laikas. Dažniausiai imami 5 pavyzdžiai: po 5, 10, 30, 45 ir 60 min. nuo kapsulių įdėjimo į krepšelį.
Atliekant kietųjų kapsulių tirpinimo testą mentiniame aparate, tyrimas vyksta analogiškai naudojant krepšelinį aparatą, tačiau kapsulė dedama ant indo dugno. Jei kapsulės plūduriuoja terpės paviršiuje, naudojamas papildomas įtaisas – diskas, prilaikantis kapsules. Atsižvelgiant į Ph. Eur. 07/2010:51701, per 45 minutes iš kapsulių turi atsipalaiduoti ne mažiau kaip 80 % medžiagos.
pH Tirpinimo terpė
pH 1.0 HCl
pH 1.2 NaCl, HCl
pH 1.5 NaCl, HCl
pH 4.5 Fosfatinis arba acetatinis buferis pH 5.5 ir pH 5.8 Fosfatinis arba acetatinis buferis
pH 6.8 Fosfatinis buferis
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – skirtingais augalo vegetacijos tarpsniais surinktos pietinių barškių (Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.) šaknys. Pietinės barškės augintos ir augalinė žaliava rinkta Vytauto Didžiojo universiteto, Kauno botanikos sodo (VDU KBS) Vaistinių ir prieskoninių augalų skyriaus kolekcijoje 2018 metais. Išsamesni augalinės žaliavos surinkimo duomenys pateikti 5 lentelėje.
5 lentelė. Pietinių barškių šaknų rinkimo laikotarpiai
Augalinė žaliava Vegetacijos laikotarpis
Augalinės žaliavos surinkimo data Vegetacijos laikotarpio žymėjimas Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknys
Intensyvus augimas 2018-05-02 BAA3
Butonizacija 2018-05-15 BAB
Intensyvus žydėjimas 2018-05-29 BAŽ2
Sėklų brendimas 2018-06-11 BAV2
Kiekvienoje augalo vegetacijos fazėje (intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo ir sėklų brandos (A3, B, Ž2 ir V2)) surinktos šaknys nuplautos,
nusausintos ir sudėtos į plastikinius užspaudžiamus maišelius. Ant kiekvieno maišelio užrašytas augalinės žaliavos pavadinimas, vegetacijos laikotarpis, surinkimo data ir įdėta į šaldymo kamerą (-18 oC) laikymui iki šaknų tyrimų pradžios.
2.2. Reagentai
Fosfatinis (PBS) buferis: 7,6 mM Na2HPO4, 2,3 mM NaH2PO4, 0,15 mM NaCl
(Sigma-Aldrich, JAV);
Išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΩ/cm), ruoštas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema;
Amonio sulfatas (≥ 99,0 proc.) Sigma-Aldrich Chemie GmBh (Merck, Darmstandt, Vokietija); Natrio fosfatas (≥ 99,0 proc.) Sigma-Aldrich Chemie GmBh (Merck, Darmstadt, Vokietija); Natrio chloridas (99,0-100,5 proc.) Sigma-Aldrich Chemie GmBh (Merck, Darmstadt, Vokietija);
Dinatrio fosfatas (≥ 99,0 proc.) Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich®, JAV)
Jaučio serumo albuminas (BSA), naudojamas kaip baltymų standartas (Sigma-Aldrich®, JAV);
Coomasie briliantinis mėlynasis dažiklis Roti®-Quant (CarlRoth, Vokietija); Skystasis azotas (Gaschema, Lietuva)
Vandenilio chlorido rūgštis (≥ 37,0 proc.) Sigma-Aldrich Chemie GmBh (Merck, Darmstadt, Vokietija);
Natrio šarmo granulės (POCh, Lenkija)
Polivinilpirolidonas Sigma Aldrich Gmbh (Vokietija);
Mikrokristalinė celiuliozė Prosolv® SMCC HD90 (JRS Pharma, Vokietija); Magnio stearatas AppliChem (Vokietija);
Kietosios „1“ dydžio želatininės kapsulės (Capsuline, JAV).
2.3. Įranga
Automatiniai dozatoriai Ependorf (JAV);
Analitinės svarstyklės CP64-0CE Sartorius (Goettingen, Vokietija); Buitinis smulkintuvas Biotecha (Lietuva);
Šaldoma preparatyvinė centrifuga Eppendorf® (JAV); Magnetinė maišyklė MS-3000 Biosan® (Latvija);
Orbitalinė purtyklė Mini Shaker VWR J&M Scientific (JAV); Spektrofotometras Infinite M200 Tecan (Šveicarija);
Chromatografinėje analizėje naudotos stiklinės kiuvetės Merck (Vokietija); Liofilizatorius Telstar Lyo Quest (Ispanija);
Prietaisas miltelių birumui įvertinti Erweka AG GmbH (Vokietija); Tankinimo prietaisas SOTAX TD1 (Šveicarija);
Kapsuliavimo mašinėlė Capsuline-15 (JAV);
2.4. Tyrimo schema
2.5. Analitiniai metodai
Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f.,
augalinės žaliavos – šaknų, surinkimas ir apdorojimas
Šaknų ekstraktų paruošimas
Baltymų išsodinimas amonio sulfatu (AS)
Išsodintų baltymų resuspendavimas Ekstrahentas -
Fosfatinis buferis (PBS)
Spektrofotometrinė analizė
Ekstraktų liofilizavimas
Liofilizuotų baltymų miltelių spektrofotometrinė analizė
Kietųjų kapsulių su liofilizuotų baltymų milteliais gamyba
Baltymų atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių įvertinimas
Baltymų kiekio nustatymas Baltymų kiekio nustatymas
Kietųjų kapsulių su liofilizuotų baltymų milteliais kokybės nustatymas
2.5.1. Baltymų ekstrakcija iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų
Buvo paruošti šaldytos žaliavos (šaknų) trys mėginiai po 10 g. Kiekvieno mėginio šaknys supjaustytos, sudėtos į smulkintuvą, šaldymo tikslu užpiltos skystu azotu ir susmulkintos. Kiekviena susmulkintos žaliavos porcija užpilta praskiestu PBS tirpalu (5 ml PBS praskiesta dejonizuotu vandeniu iki 50 ml). Tuomet vykdyta 2 val. ekstrakcija 4 oC
temperatūroje, užtikrinant nuolatinį maišymą magnetinėmis maišyklėmis.
Vėliau kiekvienos porcijos turinys supiltas į mėgintuvėlius, kurie sandariai uždaryti ir įdėti į 4 oC atšaldytą centrifugą ir centrifuguoti 20 min, panaudojant 8500 × g santykinę
išcentrinę jėgą. Gauti baltymų ekstraktai perfiltruoti ir pakartotinai centrifuguoti 4 oC
temperatūroje 20 min.
Centrifugatas toliau naudotas baltymų išsūdymui (nusodinimui), jį prisotinant amonio sulfatu (AS) nuo 0 iki 80 proc. (m/v): pridėta po 6,97 g AS kiekvienam mėginiui. Tirpalai palikti išsodinimui pastoviai maišant magnetine maišykle 16 val. 4 °C temperatūroje.
Vėliau tirpalai supilti į mėgintuvėlius, ir šie centrifuguoti 20 min., panaudojant 8500 × g santykinę išcentrinę jėgą 4 oC temperatūroje. Supernatantai atskirti nuo nuosėdų ir vykdytas
mėginių resuspendavimas: į supernatantą įpilant po 10 ml praskiesto PBS tirpalo. Kiekvienas mėginys suplaktas sūkuriniu maišytuvu (vorteksu). Tokiu būdu paruoštą baltymų tirpalą naudojome kiekinei analizei Bradford metodu.
Kiekvienos augalo vegetacijos fazės baltymų ekstrakcija iš Baptisia australis (L.) R. Br ex Ait f. šaknų vykdyta atskirai. Visi keturi ekstraktai laikyti šalčio sąlygomis (-18 o C
temperatūroje).
2.5.2. Baltymų, išskirtų iš Baptisia australis (L.) R. Br. ex Ait f. šaknų,
kiekinis nustatymas spektrofotometriniu metodu
Paruoštų mėginių baltymų kiekio nustatymas vykdytas spektrofotometriniu Bradford metodu. Kalibracinės kreivės sudarymui paruošti standarto tirpalai Ependorf mėgintuvėliuose: 0,125; 0,25; 0,5 ir 1,0 mg/ml BSA (jaučio serumo albumino) tirpalai PBS buferyje. Standartų tirpalai išpilstyti po 0,5 ml į mėgintuvėlius ir laikyti -18 oC temperatūroje. Paruoštas
“Coomassie Blue G250“ baltymų dažiklio Quant (Carl Roth) tirpalas. Viena dalis Roti-Quant reagento praskiesta 4 dalimis dejonizuoto vandens. Tokiu būdu paruoštas reagentas laikytas 4 oC temperatūroje iki 2 savaičių. Stikliniuose mėgintuvėliuose paruošti neigiamos
kontrolės mėginiai: po 40 μl praskiesto PBS tirpalo. Į atskirus stiklinius mėgintuvėlius įpilta po 40 μl baltymų mėginių tirpalų, o į kitus mėgintuvėlius – po 40 μl skirtingų koncentracijų standarto tirpalų. Į neigiamos kontrolės pavyzdžius, standarto tirpalus ir baltymų mėginius įpilta po 2 ml praskiesto Roti-Quant tirpalo, išmaišant vortekso pagalba. Paruošti tirpalai inkubuoti 5-10 min 20 ± 2 oC temperatūroje. Fotometru išmatuota standarto skirtingų koncentracijų tirpalų šviesos absorbcija esant 595 nm bangos ilgiui. Gauta kalibracinė kreivė pavaizduota 2 paveiksle. Bradford metodas taikytas baltymų, išskirtų iš pietinių barškių šaknų, kiekio nustatymui prieš ir po baltymų tirpalų liofilizacijos (ištirpinant po 150 mg liofilizuotų baltymų miltelių 1 ml praskiesto PBS tirpalo). Atlikti trys kiekvieno mėginio baltymų kiekio nustatymo pakartojimai.
2 pav. Kalibracinė kreivė, naudota baltymų, išskirtų iš pietinių barškių šaknų,
koncentracijų nustatymui
Baltymų koncentracija apskaičiuota, naudojant 1 formulę: 𝑋 = 𝑌−0,0085
0,603 (1 formulė)
Čia: X – koncentracija, mg/ml; Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
Baltymų kiekis paskaičiuotas, naudojant 2 formulę: 𝑚𝑏 = 𝐶 × 𝑉 (2 formulė)
Čia: mb – baltymų kiekis mėginyje (mg)
y = 0,4518x + 0,0177 R² = 0,9963 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Abso rb cija
Standarto tirpalo koncentracija (mg/ml)
C – baltymų tankis mėginyje (mg/ml) V – mėginio tūris (ml).
Baltymų išeiga mg/g žaliavos paskaičiuota pagal 3 formulę:
ŋ =
𝑚𝑏𝑚𝑧
(3 formulė)
Čia: ɳ - baltymų kiekis žaliavoje (mg/g); mb – baltymų kiekis mėginyje (mg);
mz – žaliavos kiekis (g).
2.5.3. Baltymų, išskirtų iš Baptisia australis (L.) R. Br. ex Ait f. šaknų,
mėginių liofilizavimas
Liofilizavimas – džiovinimas šalčiu. Procese atlikti trys eksperimentų etapai: 1. Užšaldymas; 2. Pirminis džiovinimas; 3. Antrinis džiovinimas. Viso proceso metu stebėta produktų temperatūra, lentynų temperatūra bei slėgis kameroje. Pirmojo etapo – užšaldymo – proceso metu užšaldyti mėginiai sudėti ant metalinių lėkštelių ir patalpinti liofilizatoriaus viduje bei pasirinkus programą „freezing“ laikyti apie 1 val. laiko, kol atvės iki -50 oC temperatūros. Svarbu, kad prieš sudedant baltymų mėginius į liofilizatorių, jie būtų užšaldyti, išvengiant liofilizavimo metu didelių temperatūrinių pokyčių, galinčių turėti įtakos baltymų nuostoliams. Po valandos mėginiai išimti ir patalpinti į stiklinę kamerą, uždėtą ant liofilizatoriaus viršaus. Kameroje sukurtos vakuumo sąlygos: sumažintas slėgis nuo 0 mbar iki 10.000 mbar, lentynų temperatūra kito nuo 18.9 oC iki -32.9 oC, vanduo pašalintas sublimacijos
mechanizmu. Antrinio džiovinimo (garinimo) metu produkto temperatūra kito nuo -7.2 oC iki
-42.3 oC. Mėginiai vakuume laikyti 24 valandas. Po džiovinimo šalčiu nustatytas baltymų
3 pav. Kalibracinė kreivė, naudota baltymų koncentracijos nustatymui
liofilizuotuose milteliuose
Sudarius kalibracinę kreivę (3 paveikslas) atlikta baltymų kiekinė analizė pagal Bradford metodą.
2.5.4. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Baptisia australis (L.) R.
Br ex Ait f. šaknų, gamyba ir kapsulių masės vienodumo nustatymas
Norint pagaminti kapsuliavimui tinkamą miltelių masę, reikia parinkti pagalbines medžiagas, kurios pagerina mišinio birumą ir suteikia kapsuliuojamam mišiniui reikiamas technologines savybes bei užtikrina kokybišką kapsulių užpildą.
Tyrimų metu buvo sudarytos keturios skirtingos kapsuliuojamos masės pagalbinių medžiagų sudėtys. Jos pateiktos 6 lentelėje.
