DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

(1)

DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS

CHEMIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Aminorūgščių įvertinimas bičių produktuose dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS

TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL

DARBO GYNIMO

(2)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS

KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės ) vardas, pavardė) (parašas)

BAIGIAMOJO DARBO RECENZENTAS

(vardas, pavardė) (parašas)

BAIGIAMŲJŲ DARBŲ GYNIMO KOMISIJOS ĮVERTINIMAS:

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

RIMANTĖ JASKELEVIČIŪTĖ

AMINORŪGŠČIŲ ĮVERTINIMAS BIČIŲ PRODUKTUOSE DUJŲ

CHROMATOGRAFIJOS – MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. dr. Konradas Vitkevičius

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė

Prof. dr. Ramunė Morkūnienė_______

Data:

AMINORŪGŠČIŲ ĮVERTINIMAS BIČIŲ PRODUKTUOSE DUJŲ

CHROMATOGRAFIJOS – MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. dr. Konradas Vitkevičius______

Data:

Recenzentas:

Parašas: _________

Data:

Darbą atliko:

Magistrantė

Rimantė Jaskelevičiūtė _________

Kaunas, 2020

(5)

Turinys:

SANTRAUKA ...5

SUMMARY ...6

SANTRUMPOS...8

ĮVADAS ...9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...10

1. LITERATŪROS ANALIZĖ ...11

1.1 Aminorūgščių literatūros apžvalga ...11

1.1.1 Aminorūgščių klasifikacija ...12

1.1.2 Aminorūgščių funkcijos ...12

1.2 Bičių produktų literatūros apžvalga ...14

1.2.1 Žiedadulkių savybės ir cheminė sudėtis ...15

1.2.2 Bičių duonelės savybės ir cheminė sudėtis ...16

1.2.3 Skirtumai tarp bičių duonelės ir žiedadulkių...18

1.3 Aminorūgščių nustatymas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu .18 2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA ...20

2.1 Tyrimo objektas ...20

2.2 Naudota įranga ir medžiagos ...20

2.3 Dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodika ...20

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...22

3.1 Aminorūgščių kokybinis ir kiekybinis nustatymas ...22

3.1.1. Kokybinis aminorūgščių nustatymas ...23

3.1.2 Aminorūgščių kiekybinis nustatymas ...25

3.1.3 Rezultatų pakartojamumas ...28

3.1.4 Aminorūgščių kiekio palyginimas skirtinguose Lietuvos regionuose ...29

(6)

3.1.6 Aminorūgščių kiekio palyginimas duonelėje ...36

3.1.7 Aminorūgščių kiekio palyginimas žiedadulkėse ir duonelėje ...38

4. IŠVADOS ...39

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...40

(7)

SANTRAUKA

Aminorūgščių įvertinimas bičių produktuose dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

Rimantės Jaskelevičiūtės magistro baigiamojo darbo vadovas Doc. dr. Konradas Vitkevičius; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas; Farmacijos fakultetas, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra, Kaunas.

Darbo tikslas: Atlikti aminorūgščių analizę bičių produktuose: identifikuoti aminorūgštis skirtingų Lietuvos regionų žiedadulkėse ir duonelėje, įvertinti aminorūgščių kiekybinę sudėtį skirtinguose produktuose ir palyginti juos tarpusavyje.

Darbo uždaviniai: 1. Parinkti tinkamas aminorūgščių ekstrakcijos iš bičių produktų sąlygas. 2. Pritaikyti dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su junginių derivatizacija ir identifikuoti aminorūgštis bičių produktuose. Palyginti aminorūgščių varijavimą bičių produktuose surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose. 3. Atlikti kiekybinį aminorūgščių įvertinimą taikant dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su aminorūgščių derivatizacija ir palyginti, kaip varijuoja aminorūgščių kiekiai skirtingų Lietuvos regionų bitynų bičių produktuose. 4. Apžvelgus visų regionų bičių produktus įvertinti žiedadulkių ir bičių duonelės aminorūgščių sudėtį.

Metodas: dujų chromatografija – masių spektrometrija su junginių derivatizacija. Tyrimo objektas: bičių produktai – žiedadulkės ir bičių duonelė.

Rezultatai ir išvados: 1. Parenkant aminorūgščių ekstrakcijos sąlygas buvo nustatyta, kad bičių produktuose – duonelėje ir žiedadulkėse, nėra randama laisvųjų aminorūgščių, dėl to prieš atliekant tyrimą buvo vykdoma baltymų hidrolizė druskos rūgštimi. Tinkamiausiu derivatizatoriumi parinktas N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamido (MTBSTFA) reagentas. 2. Pritaikius dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su junginių derivatizacija ir remiantis masių spektrų duomenų baze buvo nustatyta 15 aminorūgščių. Ištirta 10 mėginių – penkių skirtingų Lietuvos regionų žiedadulkės ir bičių duonelės. 3. Palyginus aminorūgščių kiekius buvo nustatyta, kad daugiausia aminorūgščių žiedadulkėse buvo Kretingos rajono bityno pateiktame mėginyje, o mažiausiai – Kaišiadorių rajono. Didžiausia aminorūgščių koncentracija bičių duonelėje susidarė Biržų rajono tirtame mėginyje ir mažiausia – Kaišiadorių rajone surinktoje bičių duonelėje. 4. Vertinant aminorūgščių sudėtį žiedadulkėse ir bičių duonelėje nustatyta, kad žiedadulkėse susidaro didesnė aminorūgščių koncentracija nei duonelėje.

(8)

SUMMARY

Evaluation of amino acids in bee products using gas chromatography – mass spectrometry method

Final thesis for master’s degree by Rimantė Jaskelevičiūtė, supervisor Doc. dr. Konradas Vitkevičius; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas.

Aim of the work: do analysis of amino acids in bee products: evaluate variation of amino acids quantity in bee products gathered in different locations of Lithuania, also evaluate quantitative and qualitative composition of amino acids and compare it together.

Tasks of work: 1. Choose proper conditions for extraction of amino acids in bee products. 2. Apply qualitative gas chromatography– mass spectrometry method to evaluate amino acids and compare them in products of different Lithuanian regions’ apiaries. 3. Do quantitative gas chromatography research and compare, how varies quantity of amino acids in products of different Lithuanian regions’ apiaries. 4. Evaluate composition of pollen and bee bread by taking into consideration and comparing average quantity of amino acids in it.

Method: gas chromatography – mass spectrometry with derivatization of compouds. Research object: bee products – pollen and bee bread.

Results and conclusions: 1. After performing the experiments, it was determined that in bee products – bread and pollen, no free amino acids are found, therefore, before the research, hydrolysis was executed. As the most appropriate derivative, the MTBSTFA (N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamid) regent was chosen. 2. By applying gas chromatography method– mass spectrometry method and relying on data base, there were found 15 amino acids, relying to its different retention time. 10 samples were examined – pollen and bee bread from five different Lithuanian regions. 3. After comparing quantity of amino acids, it was determined that the most amino acids in pollen were found in the sample submitted by Kretinga region’s apiary, and least – by Kaišiadorys region, the biggest concentration of amino acids in bee bread formed in researched sample of Biržai region’s apiary and smallest – in Kaišiadorys region gathered bee bread. 4. By valuating average composition of amino acids in pollen and bee bread, it can be stated that the bigger concentration of amino acids is formed in pollen.

(9)

PADĖKA

Noriu padėkoti analizinės ir toksikologinės katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui už suteiktas darbo sąlygas atliekant magistro tiriamąjį darbą „Aminorūgščių įvertinimas bičių produktuose dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu“. Už konsultacijas ir pagalbą vykdant eksperimentinę magistro dalį dėkoju lekt. Mindaugui Marksai.

Taip pat esu labai dėkinga visiems atsiliepusiems Lietuvos bitininkams, kurie prisidėjo savo bitynų bičių produktais prie mano atliekamo tyrimo.

(10)

SANTRUMPOS

AR BCAA BSTFA DC – MS HAD HMDS HCl MTBSTFA mTOR aminorūgštys

šakotosios grandinės nepakeičiamos aminorūgštys. bis(trimetilsilil)trifluoracetamidas

dujų chromatografija – masių spektrometrija 10-hidroksi-2-dekeno rūgštis

Heksametildisilzanas druskos rūgštis

N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamidas) žinduolių rapamicino taikinys.

(11)

ĮVADAS

Bičių produktai jau nuo seno vertinami liaudies medicinoje. Šie produktai pasižymi priešuždegiminėmis, antitoksinėmis, antibakterinėmis bei imunitetą stiprinančiomis savybėmis. Bičių produktuose randama nemažai mikroelementų, vitaminų (vitaminai A, visa B grupė bei vitaminas C) [1]. Skirtingi bičių produktai yra sudaryti iš skirtingų medžiagų, kurios lemia jų savybes. Medaus pagrindas yra angliavandeniai, vašką sudaro esteriai, sočiosios riebalų rūgštys, o štai aminorūgščių šaltinis yra bičių surinktos žiedadulkės bei iš jų fermentuojama bičių duonelė [2].

Aminorūgštys yra labai reikalingos žmogaus organizmui, kadangi jos atlieka daug skirtingų funkcijų. Pirmiausia aminorūgštys yra struktūrinis vienetas, kuris sudaro polipeptidus ir proteinus. Taip pat šios rūgštys dalyvauja įvairių medžiagų sintezėje bei stiprina imunitetą. Gavus nepakankamą šių medžiagų kiekį, gali sutrikti medžiagų apykaita, pablogėti atmintis taip pat gali būti sunku susikaupti ir išlaikyti dėmesį [3,4].

Šio mokslinio darbo tikslas yra įvertinti kiekybinį ir kokybinį aminorūgščių įvairavimą skirtinguose bičių produktuose, turinčiuose savo sudėtyje šį komponentą. Aminorūgštys bus nustatinėjamos dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu su junginių derivatizacija. Vertinant rezultatus bus atsižvelgiama į tai, kokias aminorūgštis kaupia bičių duonelė ir žiedadulkės. Šie produktai buvo pasirinkti remiantis tuo, jog būtent juose yra randama daugiausia aminorūgščių [5]. Kadangi bičių duonelė yra fermentuojama iš žiedadulkių, taip pat bus atliktas šių produktų palyginimas tarpusavyje.

(12)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Atlikti aminorūgščių analizę bičių produktuose: identifikuoti aminorūgštis skirtingų Lietuvos regionų žiedadulkėse ir duonelėje, įvertinti aminorūgščių kiekybinę sudėtį skirtinguose produktuose ir palyginti juos tarpusavyje.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti tinkamiausią analizės metodą aminorūgščių kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui. 2. Pritaikyti dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su junginių derivatizacija ir identifikuoti aminorūgštis bičių produktuose. Palyginti aminorūgščių varijavimą bičių produktuose surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose.

3. Atlikti kiekybinį aminorūgščių įvertinimą taikant dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su aminorūgščių derivatizacija ir palyginti, kaip varijuoja aminorūgščių kiekiai skirtingų Lietuvos regionų bitynų bičių produktuose.

4. Apžvelgus visų regionų bičių produktus įvertinti žiedadulkių ir bičių duonelės aminorūgščių sudėtį.

(13)

1. LITERATŪROS ANALIZĖ

1.1 Aminorūgščių literatūros apžvalga

Aminorūgštys tai – organinės kilmės rūgštys, kurios sudaro baltymus. Šių rūgščių vienas vandenilio atomas struktūroje yra pakeistas amino grupe (1 paveikslas) . Priklausomai nuo amino grupės padėties grandinėje, karboksi grupės atžvilgiu, aminorūgštys skirstomos į α-, β-, γ-amino rūgštis [6].

1 paveikslas. Bendra aminorūgščių struktūrinė formulė [7].

Visos aminorūgštys sudarančios baltymus yra α-aminorūgštys, tai reiškia kad amino grupė yra prie karboksirūgšties α anglies atomo. Išskiriamos pagrindinės aminorūgštys, kurių yra 20, tarpusavyje jos skiriasi šoninių grandinių variaciją (1 lentelė). Būtent dėl skirtingų šoninių grandinių – R struktūros šios aminorūgštys gali turėti visiškai skirtingas biochemines savybes bei funkcijas [8].

1 lentelė. Pagrindinės amino rūgštys

Pavadinimas Akronimas Pavadinimas Akronimas

Nepolinės AR, R grupė alifatinė Polinės AR, neturinčios krūvio

1. Alaninas Ala (A) 11. Serinas Ser (S)

2. Glicinas Gly (G) 12. Treoninas* Thr (T)

3. Prolinas Pro (P) 13. Cisteinas Cys (C)

4. Izoleucinas* Ile (I) 14. Asparaginas Asn (N)

5. Leucinas* Leu (L) 15. Glutaminas Gln (Q)

6. Valinas* Val (V) Polinės AR, turinčios neigiamą krūvį 7. Metioninas* Met (M) 16. Glutamo rūgštis Glu (E)

Nepolinės AR, R grupė aromatinė 17. Asparto rūgštis Asp (D) 8. Fenilalaninas* Phe (F) Polinės AR, turinčios teigiamą krūvį

9. Triptofanas* Trp (W) 18. Lizinas* Lys (K)

10. Tirozinas Tyr (Y) 19. Histidinas His (H)

* – pažymėtos nepakeičiamos

(14)

1.1.1 Aminorūgščių klasifikacija

Aminorūgštis klasifikuoti galima pagal kelis pagrindinius kriterijus, vienas iš jų – tirpumas vandenyje. Kaip jau buvo minėta, pagrindines savybes šiems junginiams suteikia jų šoninė grandinė, būtent ji ir lemia hidrofilines bei hidrofobines savybes. Hidrofobiškiauskios aminorūgštys yra leucinas, izoleucinas bei valinas. Priešingai glutamo rūgštis, asparto rūgštis, li zinas, argininas bei serinas yra hidrofiliškiausios [7].

Atsižvelgiant į šoninės grandinės poliškumą, aminorūgštys gali būti polinės arba nepolinės. Poliškumas yra susijęs su hidrofiliškumu. Visos nepolinės aminorūgštys yra hidrofobinės. Polinės dar skirstomos į – neigiamą krūvį turinčias, teigiamą krūvį turinčias ir krūvio neturinčias. Nepolinių aminorūgščių šoninė grandinė gali būti alifatinė arba aromatinė (1 lentelė).

Visos pagrindinės aminorūgštys yra reikalingos žmogaus organizmui. Vienas iš jų organizmas gali pasigaminti pats, o kitas gauna tik su maistu. Dėl šios savybės atsiranda dar viena klasifikavimo rūšis – pakeičiamos ir nepakeičiamos aminorūgštys. Nepakeičiamųjų aminorūgščių yra aštuonios ir jas žmogus gali gauti tik su maistu ar maisto papildais, kadangi jo organizmas šių aminorūgščių pats nesintezuoja (1 lentelė). Iš nepakeičiamųjų AR yra išskiriamos dar trys rūgštys, tai leucinas, izoleucinas ir valinas, kurios yra šakotos grandinės nepakeičiamos aminorūgštys (BCAA).

1.1.2 Aminorūgščių funkcijos

Aminorūgštys turi didžiulę fiziologinę reikšmę žmogaus organizmui, kadangi jos tarnauja kaip pradinė medžiaga polipeptidams ir proteinams susidaryti ir kaip substratai mažos molekulinės masės medžiagų sintezei. Kai kurios aminorūgštys yra svarbios įvairiems medžiagų apykaitos procesams, kurie yra būtini palaikyti organizmų augimą, dauginimąsi bei stiprų imunitetą [9].

Genų ekspresija

Reguliacinė aminorūgščių funkcija pasireiškia genų ekspresijos metu kai genuose užkoduota informacija perduodama į jo produktą: RNR ar/arba baltymą. Šie biocheminiai procesai yra transkripcija, vertimas ir posttransliacinės modifikacijos. Ląstelių kultūros tyrimų rezultatai rodo, kad dėl aminorūgščių trūkumo padidėja nepakrautos tRNR, kuri suriša ir suaktyvina bendrąją kontrolinę nedepresyvinio baltymo 2 (GCN2) kinazę, prieinamumas [9,10].

Su reguliacine funkcija labiausiai siejamos aminorūgštys yra glutaminas ir argininas. Moksliniais tyrimais buvo įrodyta, kad vartojant maisto produktus ar papildus, kuriuose yra arginino yra padidinama genų ekspresija, kuri yra atsakinga ir už oksidantų šalinimą iš organizmo.

(15)

Aminorūgštys reguliacinę funkciją atlieka keliais mechanizmais: tai pakeisdamos specifinių RNR polimerazių aktyvintojų specifiškumą; prisijungdamos prie DNR sekoje esančių slopiklių, kurie yra netoli ar persidengia su aktyvatorių regionu; pakeisdamos transkripcijos kofaktorių [10].

Hormonų sintezė ir sekrecija

Dauguma mažos molekulinės masės hormonų yra sintezuojami iš tam tikrų AR. Geras pavyzdys yra fenilalaninas, kuris yra epinefrino, norepinefrino, dopamino bei skydliaukės hormonų sintezės prekursorius. Didelė aminorūgščių koncentracija, kuri dažnai pasiekiama išgėrus ar suleidus į veną 10-20 kartų didesnes farmakologines AR dozes nei jų yra gaunama iš maisto, taip pat gali skatinti hormonų sekreciją endokrininėse ląstelėse [11].

Iš visų AR argininas, glutaminas ir leucinas yra geriausi sekretoriai. Farmakologinės L-arginino dozės stimuliuoja insulino, augimo hormono, prolaktino, glukagono, progesterono sekrecijas, o glutaminas ir leucinas didina insulino pasišalinimą iš kasos β-ląstelių. Reikėtų paminėti, kad AR poveikis hormonams priklauso nuo aminorūgščių suvartojamos dozės, mitybos įpročių bei žmogaus amžiaus [4].

Maistinių medžiagų apykaita ir oksidacija

Dar viena aminorūgščių funkcija yra susijusi su maistinių medžiagų apykaita ir oksidacija. AR dalyvauja ląstelių signalo perdavime, medžiagų apykaitos procesuose, įvairiuose oksidacijos procesuose ir reguliuoja baltymų panaudojimo efektyvumą. Argininas yra alosterinis N-acetilglutamato sintezės aktyvatorius. Jis veikia mitochondijose acetyl-CoA ir glutamatą paversdamas N-acetilglutamatu [4,12]. Taigi argininas ir glutamatas palaiko kepenų karbamido ciklą, kad būtų detoksikuotas amoniakas.

Gliukozės gamybą užtikrina alaninas, kuris slopina piruvato kinazę, taip reguliuodamas gliukogenezę ir glikolizę. Aminorūgštys iš dalies yra susijusios ir su antioksidantinėmis savybėmis. Pagrindinis organizmo antioksidantas ląstelėse yra glutationas, kuris reguliuoja laisvųjų radikalų homeostazę, o pats jis yra sudarytas iš cisteino, glutamato ir glicino aminorūgščių [13].

Intraląstelinių baltymų apykaita

Baltymų apykaita ląstelėse reikalauja didelio kiekio ATP energijos, tačiau šis medžiagų apykaitos ciklas yra būtinas baltymų homeostazei, senų ar pažeistų baltymų pašalinimui, gliukogenezei, žaizdų, audinių gijimui, imuniteto atsakui [14].

Leucinas stipriai aktyvuoja ląstelinį metabolizmą, ląstelių augimą ir baltymų sintezę per žinduolių rapamicino taikinį (mTOR). Leucinas kartu su kitomis nepakeičiamomis aminorūgštimis stimuliuoja raumenų baltymų sintezę tiek in vitro, tiek in vivo eksperimentinėmis sąlygomis.

(16)

Pagrindiniai mechanizmai gali apimti mTOR signalizacijos suaktyvinimą, siekiant sustiprinti transliacijos inicijavimą ir slopinti autofagiją (svarbiausią lizosomų proteolizės etapą) kepenyse ir raumenyse. Leucinas, kartu su izoleucinu ir valinu, yra nepakeičiamos aminorūgštys žmogaus organizme. Buvo pastebėta, kad izoleucinas ir valinas atskirai nuo leucino neturi jokios įtakos mTOR fosforilinimui ar raumenų baltymų apykaitai, tai įrodo leucino specifiškumą [3,15].

Imuniteto stiprinimas

Cisteino prieinamumas yra pagrindinis veiksnys, ribojantis glutationo sintezę, taigi mitybos praturtinimas N-acetil-cisteinu (stabiliu cisteino pirmtaku) yra labai veiksmingas stiprinant imunitetą įvairiose ligos stadijose [16]. Didelis azoto monoksido (NO) kiekis, sintetinamas iš arginino, yra citotoksiškas patogeniniams mikroorganizmams ir virusams [17]. Atitinkamai, maisto papildai su argininu stiprina žmonių imunitetą ir didina atsparumą ligoms.

Didelis prolino oksidazės aktyvumas placentoje ir plonojoje žarnoje gali atlikti lemiamą vaidmenį apsaugant šiuos organus nuo infekcijų kritiniais vaisiaus ir naujagimio vystymosi laikotarpiais [18]. Be to, prolino oksidazė yra piene ir atlieka svarbų vaidmenį apsaugant naujagimio žarnyną nuo infekcijos sukėlėjų. Iš dalies tai gali paaiškinti, kodėl naujagimiams, maitinamiems ne motinos pienu, yra didelė žarnyno disfunkcijos rizika, palyginus su tais, kuriuos maitina jų motinos [18,19].

1.2 Bičių produktų literatūros apžvalga

Bitės ir jų nauda gamtai yra geriausiai žinomos ir gerbiama už augalų apdulkinimą, kadangi be bičių pagalbos dauguma augalų negalėtų daugintis ir plisti. Bitės padeda išlaikyti biologinę pusiausvyrą gamtoje ir suteikia galimybę klestėti įvairioms augalų rūšims bei suteikia nuostabius bičių produktus praturtintus įvairiausiomis sveikatai naudingomis savybėmis žmogui.

Bitininkystė bei apiterapija1_{yra praktikuojamos visame pasaulyje, o bičių teikiamas medus}

žinomas nuo receptų virtuvėje, grožio procedūrų iki ypatingų gydomųjų veiklų. Be medaus, kuris yra neabejotinai labiausiai paplitęs bičių produktas, bitės taip pat teikia žiedadulkes, pikį, duonelę, pienelį, vašką, net bičių nuodai gali būti naudojami sveikatos gerinimui.

Skirtingi bičių produktai pasižymi skirtingomis savybėmis ir skirtinga sudėtimi. Medaus pagrindas yra angliavandeniai. Koryje fermentuojamo medaus sudėtis kinta, jame esantys sudėtingi angliavandeniai yra verčiami paprastais ir daug lengviau įsisavinamais. Apie 95% medaus yra vandenyje ištirpę angliavandeniai, pagrindiniai iš jų yra monosacharidai – gliukozė bei fruktozė.

1_{Apiterapija – tai mokslo sritis, nagrinėjanti bičių produktų panaudojimo galimybes įvairių ligų profilaktikai}

(17)

Angliavandenius skaido tokie fermentai kaip α-, β-gliukozidazė, α-, β-amilazė ir β-fruktozidazė [20]. Medus pasižymi priešuždegiminėmis, antiseptinėmis, antibakterinėmis savybėmis, gydant odos uždegiminius procesus (aknę), nudegimus, žaizdas, opas [1].

Bičių vaškas yra kompleksinis, polimerinis produktas, kurį sekretuoja liaukos esančios jaunų (12-18 dienų amžiaus) bičių apatinėje pilvelių dalyje. Bičių vaškas yra sudėtingas mišinys, kuris yra sudarytas iš angliavandenilių, laisvųjų riebalų rūgščių, alkoholių esterių, diesterių ir egzogeninių medžiagų. Kosmetikos gamyboje bičių vaškas naudojamas kaip natūralus tirštiklis, emulsiklis. Medaus, bičių vaško ir alyvuogių aliejaus mišinio naudojimas yra efektyvus atopinio dermatito, psoriazės ir vystyklų dermatito gydymui [21].

Bičių pienelis – tai bičių darbininkių viršutinių žandų ir ryklės liaukų sekretas, kurį išskiria 4-15 dienų amžiaus bitės darbininkės. Jame randami žmogaus organizmui reikalingi baltymai, sudaryti iš aminorūgščių, taip pat didelė B grupės vitaminų įvairovė bei daugelis reikalingų mikroelementų. Bičių pienelis yra stimuliuojanti priemonė, gerinanti savijautą, darbingumą, žvalumą, didinanti hemoglobino kiekį kraujyje. Jis yra sudarytas iš daugybės bioaktyvių junginių, įskaitant 10-hidroksi-2-dekeno rūgštį (HAD), pasižyminčia kai kuriomis imunomoduliacinėmis savybėmis. Kiti bičių pienelyje randami aktyvūs komponentai yra riebalų rūgštys, baltymai, adenozinas, acetilcholinas, polifenoliai ir hormonai, tokie kaip testosteronas, progesteronas, prolaktinas ir estradiolis [22,23].

Didžiausias aminorūgščių šaltinis yra iš žydinčių augalų bičių surinktos žiedadulkės bei iš jų fermentuojama bičių duonelė.

1.2.1 Žiedadulkių savybės ir cheminė sudėtis

Žiedadulkės – tai žydinčių augalų vyriškosios lytinės ląstelės. Žiedadulkės gali būti dviejų rūšių, tai platinamos vėjo arba vabzdžių. Žiedadulkės, kaip bičių produktas, susidaro būtent iš vabzdžių išnešiojamų augalų žiedadulkių, kadangi jos yra lipnios ir prilimpa prie bitės plaukuoto kūnelio. Bitės skraidydamos nuo vieno augalo prie kito išnešioja dalį žiedadulkių, taip apdulkindamos augalus, o kitą dalį parneša į avilį. Žiedadulkės yra apdorojamos pačių bičių seilėmis bei sulipdomos nektaru [24].

Žiedadulkės yra pagrindinis produktas iš kurio bitės gauna mineralų, riebalų bei proteinų. Jų cheminė sudėtis gali kisti priklausomai nuo paties augalo iš kurio jos buvo surinktos bei nuo regiono, kuriame augalas žydėjo [25]. Pagrindiniai komponentai sudarantys bičių suneštas žiedadulkes yra proteinai (5-60%), kuriuos sudaro aminorūgštys, cukrai (13-55%), lipidai (4-7%)

(18)

bei ląsteliena (0,3-20%). Žiedadulkių sudėtyje galima rasti ir mikroelementų, tokių kaip kalcis, magnis, varis, geležis, cinkas, kalis bei natris bei kelis skirtingus B grupės vitaminus [26].

Dėl savo plačios sudėties žiedadulkės yra laikomos visaverčiu maistu bei sveikatos šaltiniu. Jos pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antikancerogeniniu, antibakteriniu, priešgrybeliniu, hepatoprotekciniu ir antiateroskleroziniu poveikiu [26,27]. Žmogaus organizme padidėjus oksidaciniams procesams sukeliamas stresas ląstelėms ir vystosi įvairios širdies ir kraujagyslių, medžiagų apykaitos ligos bei degeneraciniai procesai (artritas, Parkinsono liga, Alzheimerio liga). Žiedadulkės pasižymėdamos antioksidaciniu poveikiu inaktyvuoja laisvuosius radikalus ląstelėse. Šis poveikis yra susijęs su antioksidantinių fermentų aktyvumu bei su antrinių augalų metabolitais, tokiais kaip fenolinės medžiagos, karotenoidai, vitaminas C, vitaminas E ir glutationas [28,29].

Flavanoidai, polifenoliai, riebiosios rūgštys mažina uždegiminį procesą, fenolinės rūgštys ir gliukozės oksidazė pasižymi priešgrybeliniu, antibakteriniu poveikiu, alfa-lioinė bei omega-3 rūgštys mažina lipidų, cholesterolio kiekį ir taip apsaugo ląsteles nuo aterosklerozės [26].

Žiedadulkės, kaip visavertis produktas, yra naudingas žmogaus organizmui, dėl to pravartu jomis praturtinti savo mitybą. Bičių žiedadulkės yra ypatingai naudingos vyresnio amžiaus žmonėms, kuriems gali būti sunku atsigauti po netinkamos, skurdžios mitybos ir tiems, kuriems keliami dideli reikalavimai būtinosioms aminorūgštims, nepakeičiamoms riebalų rūgštims ir mikroelementams gauti. Įrodyta, kad dieta, praturtinta baltymų turinčiomis žiedadulkėmis, tinka vaikams, turintiems apetito stoką. Žiedadulkės taip pat naudingos pacientams atsigaunantiems po įvairių operacijų. Maistines medžiagas turinčios žiedadulkės gali sumažinti chemoterapijos ar radioterapijos šalutinį poveikį ir pagerinti pacientų būklę. Reguliarus šviežių bičių žiedadulkių vartojimas naudingas ir žmonėms, dirbantiems sunkų fizinį ir protinį darbą. Dietos papildymas bičių žiedadulkėmis sustiprina raumenų funkcijas ir padidina kūno masę. Buvo nustatyta, kad bičių žiedadulkių, kurių dozė yra 500 mg/kg, pridėjimas yra perspektyvus šaltinis gyvūnų ir žmonių antioksidantų būklei pagerinti. Jį rekomenduojama vartoti kaip kasdienį maistą ar natūralų maisto papildą, nes jis yra gausus nepakeičiamųjų amino ir riebalų rūgščių, reikalingų sveikam ir normaliam organizmo vystymuisi, šaltinis [30].

1.2.2 Bičių duonelės savybės ir cheminė sudėtis

Bičių surinktos žiedadulkės yra dar negalutinis jų produktas. Žiedadulkės yra suskirstomos į korio akutes, užpilamos medumi ir uždengiamos vašku. Taip vyksta duonelės anaerobinis fermentavimo procesas, kurį sukelia Lactobacillus bakterija [5], o duonelė bitėms tarnauja, kaip

(19)

maisto atsargų rezervuaras. Subrandinta duonelė yra saldžiai rūgštaus skonio ir turi ruginės duonos poskonį.

Žiedadulkių fermentacija į bičių duonelę ne tik apsaugo žiedadulkes nuo jų savybių praradimo, bet ir praturtina naujomis savybėmis bei cheminiais komponentais. Tiriant bičių duonelės sudėtį daugiausia yra randama riebiųjų rūgščių, tai alifatinės rūgštys (55-69%), iš kurių daugiausia randama palmitino ir arichidono rūgščių, bei nesočiųjų – alfa-linolio, linolio bei oleino rūgščių (35-45%). Duonelėje taip pat randama įvairių angliavandenių (15-25%) bei baltymų (10-20%) likusią dalį sudaro mineralai, vitaminai, flavanoidai [31,32].

Pagrindinė savybė, kuria pasižymi bičių duonelė yra antioksidantinis veikimas. Antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo gebėjimas atiduoti vandenilį, kuris oksidacijos metu nutraukia laisvųjų radikalų grandinę. Junginiai atiduoda vandenilį iš fenolio hidroksilo grupių ir sudaro stabilius galutinius produktus, kurie sustabdo tolesnę lipidų oksidaciją. Bičių duonelėje yra nemažai bioaktyvių junginių, tokių kaip fermentai, kartotenoidai, laisvosios aminorūgštys, nepakeičiamos riebalų rūgštys, lipidai, mineralai, visas vitaminų kompleksas ir mikroelementai, taip pat fenoliai ir polifenoliai. Bičių žiedadulkės turi sveikatą stiprinantį poveikį ir dėl gabėjimo mažinti laisvųjų radikalų kiekį bei dėl polifenolinių medžiagų yra laikomos natūraliu maisto papildu, tačiau bičių duona turi stipresnių antioksidantinių ir laisvųjų radikalų šalinimo savybių [33,34].

Duonelė yra žiedadulkių mišinys surinktas tiek iš laukinių, tiek iš kultyvuojamų augalų, dėl to jos sudėtyje yra įvairių sočiųjų ir nesočiųjų rūgščių, įskaitant maistiniu požiūriu svarbią omega-3 linolo rūgštį (ALA). Taip pat yra daug sočiųjų riebalų rūgščių (palmitino) (20,50–26,21%). Bičių duonelė gali būti naudojama kaip tinkamas maisto papildas dėl didelio omega-3 linoleno rūgšties kiekio ir naudingųjų ω-3/ω-6 riebalų rūgščių bei nesočiųjų ir sočiųjų riebiųjų rūgščių santykio. Riebalų rūgščių ypatingai trūksta veganų, vegetarų, žaliavalgių mitybų racionuose, kadangi jie su jokiu kitu augaliniu maistu negauna tiek šių medžiagų, kiek gali gauti visavalgiai, dėl to laikantis tokios mitybos dietos būtų pravartu papildyti savo mitybą ir bičių duonele.

Bičių duonoje yra žymiai didesnis peptidų ir laisvųjų aminorūgščių kiekis. Dėl tam tikrų komponentų proporcijų bičių duona yra puikus maisto produktas, galintis papildyti vitaminų ir maistinių medžiagų trūkumą žmogaus organizme. Organizmas geriau pasisavina aminorūgštis iš duonelės nei žiedadulkių, nes bičių duonos komponentai jau yra iš dalies fermentuoti, dėl to lengviau įsisavinami organizmo. Dėl visų būtinųjų aminorūgščių bičių duona pasižymi geresne sudėtimi nei daugelis vertingų produktų, gaunamų gyvulinių baltymų pagrindu. Bičių duona taip pat pasižymi geromis savybėmis, kurios padeda pašalinti iš organizmo įvairius toksinus.

(20)

1.2.3 Skirtumai tarp bičių duonelės ir žiedadulkių

Nuo žiedadulkių bičių duonelė skiriasi tuo, kad joje yra monosacharidų, pieno rūgšties ir daugiau vitamino K. Pieno rūgštis bičių duonelę konservuoja ir neleidžia jai fermentuotis bei gesti. Todėl bičių duonelės aktyvusis rūgštingumas (pH 4,3) yra didesnis negu žiedadulkių (pH 6,3). Savo biologine sudėtimi ir fiziologiniu poveikiu bičių duonelė beveik nesiskiria nuo žiedadulkių, tačiau šie produktai turi ir skirtumų.

Bene svarbiausias skirtumas tarp bičių duonelės ir žiedadulkių yra susijęs su baltymų kiekiu. Nors duonelėje yra daugiau angliavandenių ir mažiau baltymų nei žiedadulkėse, jų kokybė ir biologinis prieinamumas bičių duonoje žymiai pagerėja. Mokslininkai atrado, kad bičių duonoje maistinių medžiagų biologinis prieinamumas yra beveik 20 kartų didesnis nei žydinčių augalų žiedadulkėse [5].

Bičių duonelėje taip pat yra daugiau vitaminų, o kai kurie, pavyzdžiui, vitaminas K susidaro tik fermentacijos proceso metu [31]. Šio proceso metu taip pat padidėja tiek antioksidantų, tiek fermentų koncentracijos. Žiedadulkėse randama daug vertingų maistinių bei mineralų tokių kaip cinkas, magnis ir silicio dioksidas, kurie dažnai yra kaupiami celiulioziniame žiedadulkių sluoksnyje.

1.3 Aminorūgščių nustatymas dujų chromatografijos – masių

spektrometrijos metodu

Lakiesiems junginiams analizuoti, dažniausiai yra parenkamas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC – MS) metodas. Dujų chromatografija – analitinis metodas, naudojamas dujų ir lakių organinių junginių nustatymui. Organiniai junginiai atskiriami dėl jų dalijimosi tarp dujų judriosios ir stacionarios fazės kolonėlėje skirtumų [35]. Šiuo metodu galima tirti mėginius kiekybiškai bei kokybiškai, o jų nustatymas yra paremtas dalelių pasiskirstymu tarp judrios ir nejudrios fazių.

Dujų chromatografijos privalumai:

1) Tai yra universalus metodas, vienos analizės metu gali nustatyti tiek kokybinę, tiek kiekybinę mišinio sudėtį;

2) Greitas analizės būdas;

3) Didelis jautrumas, galintis aptikti įvairias priemaišas;

(21)

Taigi DC metodas yra puikiai tinkamas ir aminorūgščių atskyrimui mišiniuose. DC judri fazė yra inertiškos dujos, tai gali būti helio, azoto ar vandenilio dujos. Judri fazė perneša mėginį į chromatografinę kolonėlę. Kolonėlėje yra atskiriami skirtingi mėginio komponentai.

Norint atlikti tyrimą DC metodu svarbu žinoti tiriamų medžiagų fizikochemines savybes, tokias kaip atsparumas aukštai temperatūrai bei lakumas. Dujų chromatografijos metodu atliekant analizę svarbus žingsnis yra junginių derivatizacija. Derivatizacija – molekulių modifikacija, kurios metu vykstant tam tikroms cheminėms reakcijoms vieni junginiai keičiami kitais. Ši modifikacija padeda padidinti junginių lakumą, sumažindama polinių grupių skaičių molekulėje (pavyzdžiui, -OH, -NH grupių), padidina junginių stabilumą [36]. Derivatizacija yra skirstoma į tokias kategorijas: sililinimas, alkilinimas ir acilinimas.

Aminorūgštys yra derivatizuojamos silinimo būdu, mažinant AR poliškumą. Poliškumą suteikia grupės turinčios laisvą vandenilio atomą, tai –COOH, –NH, –SH, –OH. Silinimo metu laisvuosius vandenilio atomus pakeičia sililo grupės, kurios sumažina molekulės poliškumą. Aminorūgštims derivatizuoti yra naudojami reagentai: heksametildisilzanas (HMDS), bis(trimetilsilil)trifluoracetamidas (BSTFA) bei N-metil-N-(t-butildimetilsilil)trifluoracetamidas (MTBSTFA) ir kt. Šie reagentai padeda susidaryti patvariems ir atspariems aukštai temperatūrai junginiams [37,38].

(22)

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Tyrimui buvo naudojamos žiedadulkės bei duonelė surinktos iš penkių skirtingų Lietuvos rajonų: Kretingos, Biržų, Ignalinos, Lazdijų bei Kaišiadorių. Šie rajonai buvo pasirinkti norint įvertinti aminorūgščių kintamumą bičių produktuose lyginant tolimiausiai nutolusius regionus bei Kauno apskritį. Žaliavos surinktos 2019 metais, žiedadulkės rinktos vasaros pradžioje po pienių ir sodų žydėjimo, duonelė surinkta vasaros pabaigoje.

Ką tik surinktos žiedadulkės turi iki 15-20% drėgmės, todėl jos yra džiovinamos. Surinkta šviežia duonelė taip pat buvo džiovinama specialiai tam skirtoje džiovykloje palaikant temperatūrą apie 35°C.

2.2 Naudota įranga ir medžiagos

Medžiagos

Distiliuotas vanduo, acetonitrilas (99.99%) (Sigma – Aldrich, Vokietija), MTBSTFA derivatizatorius (>97%) (Sigma – Aldrich, Vokietija), septyniolikos aminorūgščių standartų mišinys (2,5 μmol/ml kiekvienos AR) (Sigma-Aldrich, Vokietija).

Įranga

Analizei naudojama dujų chromatografinė sistema Shimazdu GC-2010 plius (Shimandzu Corporation, Japonija), su masių spektrometrijos detektoriumi. Atskyrimui naudojama spausto silikagelio kolonėlė (Rxi®-5ms), 30m ilgio ir 0,25 mm vidinio skersmens, 0,25μm nejudančios fazės sluoksnio storio nešančios dujos - helis. Analitinės svarstyklės Shimadzu Auw 120 D (Duisburgas, Vokietija), ultragarso vonelė „WiseClean“. Medžiagų tapatybei nustatyti pasitelkta masių spektrų duomenų bazė (WR10 ir NIST14), statistinei analizei naudota „Microsoft excel“.

2.3 Dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodika

Tirpalo ruošimas

Žiedadulkės susmulkinamos laboratorijos smlukintuvu. Analitinėmis svarstyklėmis atsveriamas 1g (tikslus svoris) žaliavos ir užpilamas 10ml 6N druskos rūgšties (HCl) tirpalu. Bičių duonelė sutrinama, susmulkinama grūstuvėje, analitinėmis svarstyklėmis taip pat atsveriamas 1g žaliavos ir užpilama 10ml 6N HCl tirpalu. Pagaminti tirpalai užkimštuose buteliukuose kaitinami 110 ̊C temperatūroje glicerolio vonioje 6 valandas [39].

(23)

Gautas tirpalas nucentrifuguojamas, atskiriama skysta fazė ir iš jos paimama 100μl mėginio. Mėginys visiškai išgarinamas po azoto dujų srove iki sauso likučio. Gautos nuosėdos užpilamos 100μl acetonitrilo ir 100μl MTBSTFA derivatizatoriaus reagento tirpalu. Buteliukas sandariai uždaromas kamščiu ir kaitinamas 100 ̊C temperatūroje 2,5 valandos glicerolio vonioje. Tirpalas atvėsinamas ir perkeliamas į chromatografinį mėgintuvėlį, po to 1μl tiriamojo mėginio injekuojama į dujų chromatografą.

Etaloninio tirpalo ruošimas:

Amino rūgščių standartų mišinio paimama 100μl ir išdžiovinama po azoto srove iki sauso likučio. Tuomet sausos nuosėdos užpilamos 100μl acetonitrilo ir 100μl MTBSTFA derivatizatoriaus reagento tirpalu. Gautas tirpalas kaitinamas 100 laipsnių temperatūroje glicerolio vonioje 2,5 valandos.

Tyrimo metodika

Kolonėlė (Rxi®-5ms), 30m ilgio ir 0,25μm skersmens, su 0,25μm nejudančios fazės sluoksnio storiu. Kolonėlės temperatūra 75°C. Tekėjimo kolonėle greitis: 1,5ml/min, slėgis 100,0 kPa, bendras tekėjimo greitis: 34,4 ml/min. Metodas atliekamas per 41 min. Temperatūra kolonėlėje buvo užprogramuota: pradinė kolonėlės temperatūra 75°C išlaikant pastovią 5 min, po to didinant 10°C/min ir keliama iki 290°C, laikoma pastovi 5 min, toliau temperatūra keliama kas 20°C/min iki 320°C ir laikoma pastovi 5 min. Mėginiai injekuoti, taikant srauto dalinimą santykiu 1:10. Injekcijos tūris 1 μl. Injekavimo temperatūra 260°C. Tyrimai kartoti po 3 kartus tarp jų paleidžiant tik tirpiklį acetonitrilą, siekiant išvalyti kolonėlę.

(24)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Aminorūgščių kokybinis ir kiekybinis nustatymas

Tyrimas pradėtas nuo tinkamo derivatizatoriaus parinkimo. Atlikus literatūros apžvalgą ir įvertinus anksčiau atliktų tyrimų rezultatus derivatizatoriumi buvo parinktas MTBSTFA reagentas. Pirmiausia atlikome bandomąjį tyrimą nustatinėjant laisvąsias aminorūgštis žiedadulkėse bei duonelėje. Po 1g smulkintos medžiagos užpilama skirtingais tirpikliais: metanoliu, etanoliu, vandeniu ir 15 min. laikoma ultragarso vonelėje, atliekama derivatizacija ir analizė dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu. AR buvo identifikuojamos remiantis masių spektrų duomenų baze (WR10 ir NIST14). Atlikus tyrimą buvo negauta norimų rezultatų, kadangi buvo rasta tik viena laisva aminorūgštis – prolinas.

Norint identifikuoti daugiau aminorūgščių buvo nuspręsta atlikti baltymų hidrolizę, kadangi iš atliktos literatūros apžvalgos yra žinoma, kad žiedadulkės yra baltyminis produktas, o duonelė yra žiedadulkių fermentacijos produktas. Hidrolizė buvo vykdoma 6N HCl tirpalu ir kaitinant 2, 6 ir 24val norint įvertinti tinkamiausias sąlygas (2 paveikslas). Nustatytas nežymus skirtumas tarp mėginių kaitinamų 6 ir 24val, atlikus statistinę analizę nenustatyta reikšmingo skirtumo taro 6 ir 24 valandų kaitintų mėginių, dėl to siekiant optimizuoti sąlygas buvo pasirinkta kaitinti 6 valandas.

Po hidrolizės mėginys visiškai išgarinamas po azoto dujų srove iki sauso likučio. Gautos nuosėdos užpilamos 100μl acetonitrilo ir 100μl MTBSTFA derivatizatoriaus reagento tirpalo. Buteliukas sandariai uždaromas kamščiu ir kaitinamas 100 ̊C temperatūroje 2,5 valandos glicerolio vonioje. Tirpalas atvėsinamas ir perkeliamas į chromatografinį mėgintuvėlį, po to 1μl tiriamojo mėginio injekuojama į dujų chromatografą.

Aminorūgščių nustatymo tyrimas bičių produktuose dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu su derivatizacija pasitvirtino. Prieš atliekant analizę hidrolizavus baltymus bičių duonelėse ir žiedadulkėse buvo nustatyta penkiolika aminorūgščių: alaninas, glicinas, valinas, leucinas, izoleucinas, prolinas, metioninas, serinas, treoninas, fenilalaninas, asparto rūgštis, glutamo rūgštis, lizinas, histidinas, tirozinas (3 paveikslas).

(25)

3.1.1. Kokybinis aminorūgščių nustatymas

2 Paveiklas. Aminorūgščių kiekis priklausomai nuo baltymų hidrolizės trukmės.

Prieš nustatinėjant aminorūgštis bičių produktuose buvo vykdoma baltymų hidrolizė. Hidrolizės metu baltymai buvo skaidomi iki aminorūgščių 6N HCl tirpalu ir kaitinant 2, 6 ir 24val (2 paveikslas). Atlikus bandymą nustatytas nežymus skirtumas tarp mėginių kaitinamų 6 ir 24val, tačiau atlikus statistinę analizę nenustatyta reikšmingo skirtumo tarp 6 ir 24 valandų kaitinimo, dėl to siekiant optimizuoti sąlygas buvo pasirinkta mėginius kaitinti 6 valandas.

2 lentelė. Rastos aminorūgštys rastos tirtuose mėginiuose. Biržų r. žiedadulkėse/ duonelėje Kretingos r. žiedadulkėse/ duonelėje Lazdijų r. žiedadulkėse/ duonelėje Molėtų r. žiedadulkėse/ duonelėje Kaišiadorių r. žiedadulkėse/ duonelėje Alaninas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Argininas -/- -/- -/- -/- -/- Glicinas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Metioninas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Serinas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Treoninas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Fenilalaninas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Asparto rūg. +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Glutamo rūg. +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Lizinas -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Histidinas -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Tirozinas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Valinas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Leucinas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Izoleucinas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Cisteinas -/- -/- -/- -/- -/- Prolinas +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 0,000 200,000 400,000 600,000 800,000 1000,000 1200,000 1400,000 1600,000 2val 6val 24val

(26)

3 Paveikslas. Aminorūgščių chromatograma. 1 – alaninas, 2 – glicinas, 3 – valinas, 4 – leucinas, 5 – izoleucinas, 6 – prolinas, 7 – metioninas, 8 – serinas, 9 – treoninas, 10 – fenilalaninas, 11 – asparto rūgštis, 12 – glutamo rūgštis, 13 – lizinas, 14 – histidinas, 15 – tirozinas.

Aptiktų aminorūščių sulaikymo laikai yra tokie: alanino – 14,694 minutės, glicino – 14,990min., valino – 16,188min., leucino – 16,697min., izoleuzino – 17,058min., prolino – 17,509min., metionino – 19,671min., serino – 19,923min., treonino – 20,235min., fenilalanino – 20,913min., apsarto rūgšties – 21,561min., glutamo rūgšties – 22,636min., lizino – 23,569min., histidino – 25,340min., tirozino – 25,715min.

Aminorūgšrys indentifikuotos palyginant nustatytus AR sulaikymo laikus su standartinio mišinio sulaikymo laikais. Visuose 10 mėginių, iš kurių buvo 5 žiedadulkių mėginiai ir 5 duonelių, buvo aptikta 15 aminorūgščių, išsiskyė tik Biržų rajone bičių surinktos žiedadulkes, jose nebuvo rasta lizino bei histidino, taip pat nei viename mėginyje nebuvo arginino bei cisteinas. Rezultatai pateikti 2 lentelėje žymint pliusu („+“), jei tame produkte buvo rasta AR arba minusu („-“), jei AR nustyta nebuvo (rezultatai atskiriami pasvirusiu brūkšneliu „/“)

(27)

3.1.2 Aminorūgščių kiekybinis nustatymas

Radus aminorūgštis ir jas įvertinus kokybiškai, toliau turime atlikti jų kiekybinį nustatymą. Atlikus chromatografinę analizę, gauname aminorūgščių sulaikymo laikus, kuriuos naudojame kokybiniam įvertinimui, o norint apskaičiuotu AR koncentracijas mėginiuose mums reikalingi AR smailių plotai. Pagal visų rastų aminorūgščių etaloninius tirpalus, žinomomis koncentracijomis, buvo sudarytos kalibracinės kreivės. Kelios gautos kreivės pateiktos 4-7 paveiksluose.

4 paveikslas. Alanino kalbiracinė kreivė 5 paveikslas. Glutamo rūg. kalbiracinė kreivė

(28)

Kalibraciniuose grafikuose su aminorūgštimis abscisių ašyje yra nurodoma medžiagos koncentracija, o ordinačių ašyje žymima dujų chromatografo atsako intensyvumas arba kitaip – smailės plotas. Šalia kalibracinių kreivių yra nurodomi du duomenys, tai r – Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientas ir r2_{– determinacijos koeficientas. Determinacijos koeficientas visais}

atvejais yra netoli vieneto (3 lentelė), dėl to galima teigti, jog pagal šias kalibracines kreives galima pakankamai tiksliai nustatyti nežinomų mėginių koncentracijas.

3 lentelė. Aminorūgščių funkcijų lygtys ir determinacijos koeficientai

Aminorūgštis Funkcijos lygtis Determinacijos koeficientas

Alaninas f(x)=281766.732385*x-151475.614966 r2_=0.930 Glicinas f(x)=307888.469976*x-386511.363171 r2_=0.925 Valinas f(x)=249141.957926*x+363365.493606 r2_=0.886 Leucinas f(x)=287041.492244*x-201473.326389 r2_=0.928 Izoleucinas f(x)=233454.537256*x+544450.385570 r2_=0.896 Prolinas f(x)=288232.903171*x+1720910.693438 r2_=0.865 Metioninas f(x)=191580.533564*x-317706.645069 r2_=0.924 Serinas f(x)=324303.113917*x+1971749.329881 r2_=0.887 Treoninas f(x)=254206.553589*x+2531324.218197 r2_=0.903 Fenilalaninas f(x)=211654.925651*x+421367.953259 r2_=0.889 Asparto rūgštis f(x)=273314.973170*x+2701137.416486 r2_=0.882 Glutamo rūgštis f(x)=218542.759110*x-352240.735532 r2_=0.934 Lizinas f(x)=236839.828705*x-3007313.281102 r2_=0.939 Histidinas f(x)=290134.615620*x-2836462.193286 r2_=0.917 Tirozinas f(x)=218746.004720*x+4267862.926887 r2_=0.814 Cisteinas f(x)=191862.297143*x-2574073.400000 r2_=0.933

(29)

Kalibracinės kreivės parodo tiesinę koncentracijos priklausomybę nuo smailės ploto – kuo didesnis smailės plotas, tuo didesnė tiriamosios medžiagos koncentracija. Turint kalibracines kreives kartu yra gaunamos ir jų funkcijų lygtys, pagal kurias galima apskaičiuoti AR koncentracijas mėginiuose. Gauti rezultatai yra nurodomi μg/ml, dėl to perskaičiuojame, kokia koncentracija bus atsvertoje žaliavoje μg/g:

∁=

𝑐 ∙ 𝑉

𝑎

C – AR koncentracija μg/g c – AR koncentracija μg/ml V – tirpalo tūris, ml

(30)

3.1.3 Rezultatų pakartojamumas

Norint įsitikinti ar atliekamas metodas yra tinkamas aminorūgštims nustatinėti yra atliekamas analizės pakartojimas. Jis įvertinamas standartiniu nuokrypiu ir skaičiuojamas iš tą pačią dieną atliktų analizės rezultatų. Pakartojimai buvo atliekami tris kartus. Rezultatai pateikiami standartiniu nuokrypiu procentais (4 lentelė).

4 lentelė. Aminorūgščių standartiniai nuokrypiai (proc.)

Amino rūgštis Standartiniai nuokrypiai (proc.)

Alaninas 0,95 Glicinas 0,80 Metioninas 0,62 Serinas 0,91 Treoninas 0,89 Fenilalaninas 0,75 Asparto rūg. 1,10 Glutamo rūg. 1,33 Lizinas 0,60 Histidinas 0,55 Tirozinas 0,92 Valinas 0,89 Leucinas 0,76 Izoleucinas 0,81 Prolinas 0,87

Apžvelgiant gautus rezultatus, apskaičiavus visų aminorūgščių nustatymo standartines paklaidas, įrodyta, jog jos neviršija rekomenduojamos 15 proc. ribos, todėl galima teigti, jog metodo pakartojamumas yra tinkamas ir remiantis šiuo aspektu metodas yra tinkamas aminorūgščių kiekybiniam nustatymui.

(31)

3.1.4 Aminorūgščių kiekio palyginimas skirtinguose Lietuvos regionuose

8 paveikslas. Aminorūgščių koncentracija (μg/g) žiedadulkėse ir duonelėje surinktose Biržų rajone 8-tame paveiksle matome pateiktas visas nustatytas aminorūgštis ir jų koncentracijas žiedadulkėse bei duonelėje surinktose Biržų rajone. Didžiausia koncentracija žiedadulkėse susidarė šių aminorūgščių: prolino, glutamo bei asparto rūgščių. Prolino koncentracija nustatyta 1036,44 ± 134,44 μg/g, asparto rūgšties koncentracija – 1091,65 ± 130,99 μg/g, glutamo rūgšties koncentracija – 961,13 ± 105,73 μg/g. Analogiškai didžiausi aminorūgščių kiekiai duonelėje yra prolino ir asparto bei glutamo rūgščių. Čia jų kiekiai nustatyti tokie: asparto rūgšties koncentracija – 1227,10 ± 157,65 μg/g, glutamo rūgšties – 1137,63 ± 149,43 μg/g ir prolino – 1077,02 ± 109,62 μg/g. Mažiausios AR koncentracijos bičių duonelėje buvo histidino, kurio nustatyta 260,03 ± 31,79 μg/g, metionino 378,65 ± 50,32 μg/g ir izoleucino 424,20 ± 56,74 μg/g. Tyrimo metu iš visų tiriamųjų išsiskyrė Biržų rajono žiedadulkės, kuriose histidino ir lizino aminorūgščių buvo visiškai nerasta (koncentracijos lygios 0 μg/g) kita aminorūgštis, kurios koncentracija nustatyta mažiausia buvo metioninas 272,45 ± 27,25 μg/g. Taip pat išsiskyrė ir tirozino AR, kurio duonelėje buvo nustatyta beveik dvigubai daugiau nei žiedadulkėse.

0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 Alaninas Glicinas Metioninas Serinas Treoninas Fenilalaninas Asparto rūg. Glutamo rūg. Lizinas Histidinas Tirozinas Valinas Leucinas Izoleucinas Prolinas 723,01 580,88 272,45 767,25 758,27 559,24 1091,65 961,13 0,00 0,00 343,82 410,62 623,62 334,53 1036,44 807,16 670,29 378,65 825,43 816,75 706,72 1227,10 1137,63 626,20 260,03 675,50 511,24 701,25 424,20 1077,02 Duonelė Žiedadulkės

(32)

9 paveikslas. Aminorūgščių koncentracija (μg/g) žiedadulkėse ir duonelėje surinktose Kretingos rajone

Kaip galime matyti 9-tame paveiksle Kretingos rajono bitininko surinktose žiedadulkėse bei bičių duonelėje buvo rasta 15 aminorūgščių. Žiedadulkėse daugiausia buvo rasta asparto bei glutamo rūgščių ir prolino. Jų koncentracijos nustatytos tokios: asparto rūgštis – 1351,92 ± 105,41 μg/g, glutamo rūgštis – 1287,73 ± 104,42 μg/g ir prolinas – 1179,99 ± 99,71 μg/g. Tose pačiose žiedadulkėse mažiausi AR kiekiai buvo nustatyti histidino (267,63 ± 22,27 μg/g), metionino (465,09 ± 98,18 μg/g) ir izoleucino (521,20 ± 59,59 μg/g). Tame pačiame bityne surinktoje bičių duonelėje taip pat didžiausi kiekiai susidarė asparto bei glutamo rūgščių ir prolino AR. Jų koncentracijos nustatytos tokios: asparto rūgštis – 1202,86 ± 155,84 μg/g, prolinas – 1125,55 ± 135,08 μg/g ir glutamo rūgštis – 1088,57 ± 126,84 μg/g. Mažiausi AR kiekiai duonelėje susidarė histidino (252,31 ± 26,67 μg/g), metionino (354,58 ± 37,84 μg/g) ir izoleucino (434,20 ± 46,86 μg/g) 0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 Alaninas Glicinas Metioninas Serinas Treoninas Fenilalaninas Asparto rūg. Glutamo rūg. Lizinas Histidinas Tirozinas Valinas Leucinas Izoleucinas Prolinas 901,09 735,69 465,09 866,44 884,95 787,82 1351,92 1287,73 793,84 267,63 745,58 586,88 777,56 521,20 1179,99 779,89 660,82 384,58 803,19 791,65 665,44 1202,86 1088,57 631,44 252,31 663,68 506,06 701,82 434,20 1125,55 Duonelė Žiedadulkės

(33)

10 paveikslas. Aminorūgščių koncentracija (μg/g) žiedadulkėse ir duonelėje surinktose Lazdijų rajone

Toliau matome grafiką su Lazdijų rajono bityno duonele bei žiedadulkėmis. Šio rajono produktai išsiskyrė tuo, kad žiedadulkėse bei duonelėje nustatyti aminorūgščių kiekiai tarpusavyje skyrėsi mažiausiai, pavyzdžiui, metionino duonelėje rasta 365,38 ± 37,20 μg/g, o žiedadulkėse 366,91 ± 38,08 μg/g, AR koncentracijos abejuose produktuose yra labai panašios. Didžiausi AR kiekiai tiek žiedadulkėse, tiek duonelėje nustatyti asparto bei glutamo rūgščių ir prolino. Asparto rūgšties koncentracija žiedadulkėse – 1236,51 ± 160,75 μg/g, o duonelėje – 1180,02 ± 151,06 μg/g. Glutamo rūgšties kiekis žiedadulkėse 1163,31 ± 147,74 μg/g, duonelėje – 1104,38 ± 139,15 μg/g. Prolino rasta žiedadulkėse – 987,28 ± 108,62 μg/g, o duonelėje – 975,77 ± 104,41 μg/g.

(34)

11 paveikslas. Aminorūgščių koncentracija (μg/g) žiedadulkėse ir duonelėje surinktose Molėtų rajone

11-tame paveiksle yra pateiktos žiedadulkės ir duonelė vieno iš Molėtų rajono bitynų. Čia taip pat buvo nustatytos visos 15 aminorūgščių tiek duonelėje, tiek žiedadulkėse. Didžiausi AR kiekiai nustatyti žiedadulkėse ir tai yra asparto bei glutamo rūgštys ir alaninas. Asparto rūgšties žiedadulkėse rasta 1258,10 ± 161,04 μg/g, glutamo rūgšties – 1215,01 ± 144,71 μg/g ir alanino – 836,37 ± 91,96 μg/g. Mažiausios koncentracijos žiedadulkėse susidarė histidino (292,36 ± 26,87 μg/g), izoleucino (423,99 ± 46,72 μg/g) ir prolino (478,62 ± 54,12 μg/g). tame pačiame bityne surinktoje duonelėje daugiausia buvo nustatyta prolino ir asparto bei glutamo rūgščių, o mažiausiai – histidino, metionino ir izoleucino. Asparto rūgšties koncentracija duonelėje buvo 1195,05 ± 157,73 μg/g, glutamo rūgšties koncentracija – 1062,62 ± 136,02 μg/g, o prolino – 876,65 ± 96,43 μg/g. Molėtų rajono mėginiuose išsiskyrė duonelė ir joje rastas prolino kiekis, kadangi visų kitų aminorūgščių buvo nustatyta didesnė koncentracija žiedadulkėse nei duonelėje, o šiuo atveju prolino kiekis duonelėje buvo ~1,83 karto didesnis nei ten pat surinktose žiedadulkėse.

(35)

12 paveikslas. Aminorūgščių koncentracija (μg/g) žiedadulkėse ir duonelėje surinktose Kaišiadorių rajone

Kaišiadorių rajono žiedadulkės ir duonelė išsiskyrė iš kitų tiriamųjų nustatytomis mažiausiomis aminorūgščių koncentracijomis. Žiedadulkėse buvo daugiausia rasta asparto ir glutamo rūgščių bei prolino. Įvertinus aminorūgščių koncentracijas šio rajono žiedadulkėse buvo apskaičiuoti didžiausi AR kiekiai, tai glutamo rūgštis – 1174,77 ± 110,75 μg/g, asparto rūgštis – 1076,22 ± 108,91 μg/g ir prolinas – 778,54 ± 102,14 μg/g. Mažiausia buvo rasta histidino, metionino ir izoleucino aminorūgščių žiedadulkėse. Jų koncentracijos nustatytos tokios: histidino – 183,21 ± 23,79 μg/g, metionino – 256,65 ± 26,87 μg/g ir izoleucino – 280,00 ± 35,41 μg/g. Analogiškai bičių duonelėje didžiausios koncentracijos susidarė asparto ir glutamo rūgščių bei prolino. Asparto rūgšties duonelėje rasta 1041,46 ± 107,24 μg/g, glutamo rūgšties – 1010,52 ± 102,46 μg/g ir prolino – 860,04 ± 98,94 μg/g. Mažiausios AR koncentracijos duonelėje buvo histidino, metionino ir izoleucino. Histidino koncentracija nustatyta 178,34 ± 22,75 μg/g, metionino – 265,67 ± 35,83 μg/g ir izoleucino – 265,99 ± 33,87 μg/g. 0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 Alaninas Glicinas Metioninas Serinas Treoninas Fenilalaninas Asparto rūg. Glutamo rūg. Lizinas Histidinas Tirozinas Valinas Leucinas Izoleucinas Prolinas 689,75 522,09 256,65 650,94 610,95 482,70 1076,22 1174,77 357,34 183,21 492,60 338,81 563,86 280,00 778,54 701,10 574,93 265,67 737,48 670,99 514,84 1041,46 1010,52 350,48 178,34 507,98 325,43 572,81 265,99 860,04 Duonelė Žiedadulkės

(36)

3.1.5 Aminorūgščių kiekio palyginimas žiedadulkėse

13 paveikslas. Aminorūgščių koncentracijos (μg/g) žiedadulkėse palyginimas skirtinguose Lietuvos rajonuose

13-tame paveiksle matome visas rastas aminorūgštis bičių suneštose žiedadulkėse skirtinguose Lietuvos regionuose. Buvo aptikta 15 aminorūgščių. Visuose mėginiuose nebuvo rasta cisteino bei arginino. Lyginant bendrai visus regionus yra aiškiai matoma, kad visuose mėginiuose AR sudėtis vyrauja panaši – daugiausia yra randama asparto bei glutamo rūgščių ir prolino, o mažiausiai histidino, izoleucino ir metionino. Aminorūgščių koncentracijos svyruoja proporcingai lyginant visus rajonus. Labiausiai išsiskyrė tik Biržų rajono žiedadulkės, kuriose nebuvo nustatyta nei histidino, nei lizino. Bendrai didžiausia aminorūgščių koncentracija buvo nustatyta Kretingos rajone surinktose žiedadulkėse 12153,41 ± 1241,01 μg/g (visų aminorūgščių kiekis), o mažiausiai – Kaišiadorių rajono 8458,43 ± 992,77 μg/g (5 lentelė).

0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 1600,00 Biržų raj. Kretingos raj. Lazdijų raj. Molėtų raj. Kaišiadorių raj.

(37)

5 lentelė. Didžiausių ir mažiausių aminorūgščių koncentracijų žiedadulkėse palyginimas. Kretingos r. žiedadulkės (μg/g) Kaišiadorių r. žiedadulkės (μg/g) Alaninas 901,09 ± 106,86 689,75 ± 82,67 Glicinas 735,69 ± 58,42 522,09 ± 63,87 Metioninas 465,09 ± 98,18 256,65 ± 26,87 Serinas 866,44 ± 63,48 650,94 ± 84,62 Treoninas 884,95 ± 86,55 610,95 ± 72,42 Fenilalaninas 787,82 ± 97,70 482,70 ± 62,75 Asparto rūg. 1351,92 ± 105,41 1076,22 ± 103,91 Glutamo rūg. 1287,73 ± 104,42 1174,77 ± 110,75 Lizinas 793,84 ± 79,85 357,34 ± 43,51 Histidinas 267,63 ± 22,27 183,21 ± 23,79 Tirozinas 745,58 ± 90,47 492,60 ± 63,04 Valinas 586,88 ± 81,72 338,81 ± 44,04 Leucinas 777,56 ± 86,38 563,86 ± 72,98 Izoleucinas 521,20 ± 59,59 280,00 ± 35,41 Prolinas 1179,99 ± 99,71 778,54 ± 102,14

(38)

3.1.6 Aminorūgščių kiekio palyginimas duonelėje

14 paveikslas. Aminorūgščių koncentracijos (μg/g) duonelėje palyginimas skirtinguose Lietuvos regionuose.

14-tame paveiksle yra pateikta aminorūgščių kiekybinis įvertinimas bičių duonelėje. Buvo identifikuota 15 aminorūgščių. Visuose mėginiuose nebuvo tik cisteino ir arginino. Kiekiai tarp skirtingų Lietuvos rajonų keičiasi analogiškai. Visose bitininkų surinktose ir tyrimui pateiktose bičių duonelėse buvo daugiausia rasta asparto bei glutamo rūgščių ir prolino. Mažiausios koncentracijos susidarė metionino, histidino ir izoleucino. Išsiskyrė tik Kretingos rajono pateikta bičių duonelė, kurioje buvo rasta daugiau prolino nei kituose mėginiuose. Didžiausia aminorūgščių koncentracija susidarė Biržų rajono pateiktoje bičių duonelėje 10845,18 ± 1370,53 μg/g (bendras aminorūgščių kiekis), o mažiausia Kaišiadorių rajone surinktoje bičių duonelėje 8578,04 ± 1018,82 μg/g (6 lentelė). 0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 Biržų raj. Kretingos raj. Lazdijų raj. Molėtų raj. Kaišiadorių raj.

(39)

6 lentelė. Didžiausių ir mažiausių aminorūgščių koncentracijų duonelėse palyginimas. Biržų r. AR duonelėje (μg/g) Kaišiadorių r. AR duonelėje (μg/g) Alaninas 807,16 ± 104,93 701,10 ± 90,87 Glicinas 670,29 ± 86,98 574,93 ± 75,61 Metioninas 378,65 ± 50,32 265,67 ± 35,83 Serinas 825,43 ± 98,93 737,48 ± 94,67 Treoninas 816,75 ± 106,98 670,99 ± 88,17 Fenilalaninas 706,72 ± 90,86 514,84 ± 65,92 Asparto rūg. 1227,10 ± 157,65 1041,46 ± 107,24 Glutamo rūg. 1137,63 ± 149,43 1010,52 ± 102,46 Lizinas 626,20 ± 79,56 350,48 ± 44,62 Histidinas 260,03 ± 31,79 178,34 ± 22,75 Tirozinas 675,50 ± 88,57 507,98 ± 65,41 Valinas 511,24 ± 67,41 325,43 ± 41,78 Leucinas 701,25 ± 90,76 572,81 ± 75,68 Izoleucinas 424,20 ± 56,74 265,99 ± 33,87 Prolinas 1077,02 ± 109,62 860,04 ± 98,94

(40)

3.1.7 Aminorūgščių kiekio palyginimas žiedadulkėse ir duonelėje

15 paveikslas. Aminorūgščių koncentracijų (μg/g) palyginimas tarp žiedadulkių ir bičių duonelių. 15-tame paveiksle matome žiedadulkių ir bičių duonelių kiekybinę aminorūgščių sudėtį, kuri buvo sudaryta išvedant aminorūgščių koncentracijų vidurkius. Aiškiai matome, jog labiausiai išsiskiria asparto ir glutamo rūgštys bei prolinas, kurių koncentracijos yra didžiausios visų regionų pateiktuose produktuose. Taip pat išsiskyrė prolinas bičių duonelėse, jose šios AR yra randama neįprastai daugiau nei bičių surinktose žiedadulkėse. Tiek žiedadulkėse, tiek bičių duonelėse daugiausia randama asparto (po 12% visos sudėties) ir glutamo (po 11%) rūgščių bei prolino (duonelėse 10%, žiedadulkėse 9%), o mažiausia koncentracija nustatyta – histidino (2%), metionino (3%) bei izoleucino (4%) abejuose tirtuose produktuose.

0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 žiedadulkės bičių duonelės

(41)

4. IŠVADOS

1. Parenkant tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas buvo nustatyta, kad bičių produktuose – duonelėje ir žiedadulkėse, nėra randama pakankamai laisvųjų aminorūgščių išsamiam tyrimui atlikti, dėl to prieš atliekant tolimesnius tyrimus buvo vykdoma baltymų hidrolizė. Tinkamiausiu derivatizatoriumi parinktas MTBSTFA (N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamidas) reagentas.

2. Pritaikius dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su junginių derivatizacija ir remiantis masių spektrų duomenų baze (WR10 ir NIST14) nustatyta 15 aminorūgščių. Buvo tirta 10 mėginių – penkių skirtingų Lietuvos regionų žiedadulkės ir bičių duonelės. Iš visų mėginių išsiskyrė tik Biržų rajono žiedadulkės, kuriose nebuvo rasta lizino bei histidino. 3. Palyginus aminorūgščių kiekius buvo nustatyta, kad didžiausias bendras aminorūgščių kiekis

žiedadulkėse buvo Kretingos rajono bityno pateiktame mėginyje 12153,41 ± 1241,01 μg/g, o mažiausias – Kaišiadorių rajono 8458,43 ± 992,77 μg/g. Didžiausia aminorūgščių koncentracija bičių duonelėje susidarė Biržų rajono tirtame mėginyje 10845,18 ± 1370,53 μg/g ir mažiausia – Kaišiadorių rajone surinktoje bičių duonelėje 8578,04 ± 1018,82 μg/g. Nors aminorūgščių kiekiai lyginant skirtingus regionus skyrėsi, tačiau visuose mėginiuose dominavo asparto ir glutamo rūgštys bei prolinas, o mažiausios koncentracijos susidarė metionino, histidino ir izoleucino tiek žiedadulkėse, tiek ir bičių duonelėse.

4. Vertinant aminorūgščių sudėtį žiedadulkėse ir bičių duonelėje nustatyta, kad žiedadulkėse nustatyta ~1,5% didesnė aminorūgščių koncentracija. Taip yra dėl to, kad bičių duonelė yra fermentacijos produktas ir jos sudėtyje daugėja kitų maistinių medžiagų, lyginant su bičių surinktomis žydinčių augalų žiedadulkėmis.

(42)

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Tyrimas buvo atliekamas norint palyginti skirtingų Lietuvos regionų bičių produktus ir juose randamas aminorūgštis. Norint gauti išsamesnius duomenis reikėtų atlikti tyrimą remiantis vieno regiono kelių skirtingų bitynų pateiktais žiedadulkių ir duonelių mėginiais.

(43)

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Mandal MD, Mandal S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop Biomed. 2011;1(2):154–60.

2. Nakajima Y, Tsuruma K, Shimazawa M, Mishima S, Hara H. Comparison of bee products based on assays of antioxidant capacities. BMC Complement Altern Med. 2009;9:1–9. 3. Wu G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 2013;45(3):407–11. 4. Wu G, Bazer FW, Davis TA, Kim SW, Li P, Marc Rhoads J, et al. Arginine metabolism and

nutrition in growth, health and disease. Vol. 37, Amino Acids. 2009. p. 153–68.

5. Kieliszek M, Piwowarek K, Kot AM, Błażejak S, Chlebowska-Śmigiel A, Wolska I. Pollen and bee bread as new health-oriented products: A review. Trends Food Sci Technol. 2018;71(October 2017):170–80.

6. Bhagavan N V., Ha C-E. Essentials of medical biochemistry : with clinical cases. Elsevier/Academic Press; 2011. 581 p.

7. Rodwell DA, Bender KM, Botham PJ, Kennelly P, Anthony W, Rodwell VW, et al. Harper’s illustrated biochemistry / Victor W Spis treści. 2015.

8. Michael Lieberman ADM. Marks’ Basic Medical Biochemistry– A Clinical Approach

[Internet]. 2017 [cited 2020 Feb 1]. Available from:

https://books.google.lt/books?hl=lt&lr=&id=HHK7S7t47BEC&oi=fnd&pg=PA1&ots=e9zk PP-1ZI&sig=W-9P7KVp5O2SpgygIWJje23j61A&redir_esc=y#v=onepage&q&f=false 9. Wu G. Amino acids: Metabolism, functions, and nutrition. Amino Acids. 2009;37(1):1–17. 10. Oommen AM, Griffin JB, Sarath G, Zempleni J. Roles for nutrients in epigenetic events. J

Nutr Biochem [Internet]. 2005 Feb [cited 2020 Mar 16];16(2):74–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15681164

11. Newsholme P, Brennan L, Rubi B, Maechler P. New insights into amino acid metabolism, β-cell function and diabetes [Internet]. Vol. 108, Clinical Science. 2005 [cited 2020 Mar 19]. p. 185–94. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15544573

12. Rhoads JM, Wu ÆG. Glutamine , arginine , and leucine signaling in the intestine. 2009;111– 22.