LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
RAIMONDA JAZOKAITĖ
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA TIKRŲJŲ IMBIERŲ
(ZINGIBER OFFICINALE R.) ŠAKNIASTIEBIŲ, TYRIMAS TAIKANT
FIZIKO-CHEMINĖS ANALIZĖS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. Augusta Ževžikovienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanė
Prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data:
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA TIKRŲJŲ IMBIERŲ
(ZINGIBER OFFICINALE R.) ŠAKNIASTIEBIŲ, TYRIMAS TAIKANT
FIZIKO-CHEMINĖS ANALIZĖS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. Augusta Ževžikovienė
Data: Recenzentas Doc. D. Burdulis Data: Darbą atliko Magistrantė Raimonda Jazokaitė Data: KAUNAS, 2019
TURINYS
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Tikrieji imbierai (Z.officinale R.), jų paplitimas ir morfologiniai požymiai ... 11
1.2. Tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) šakniastiebių fitocheminė sudėtis ir maistinė vertė ... 12
1.3. Tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) šakniastiebiuose kaupiamų junginių: 6-gingerolio ir 6-šogaolio, apžvalga ... 13
1.4. Tikrųjų imbierų (Z.officinale R.) šakniastiebių farmakologinės savybės ir panaudojimas ... 14
1.5. Tikrųjų imbierų (Z.officinale R.) kaupiamų biologiškai aktyvių junginių absorbcija ir pasiskirstymas ... 15
1.6. Toksiškumas ... 16
1.7. Junginių ekstrakcija ... 17
1.8. Kokybinės bei kiekybinės analizės metodai 6-gingeroliui ir 6-šogaoliui nustatyti ... 18
1.8.1. Plonasluoksnė chromatografija ... 18
1.8.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 19
1.9. Antioksidantinis tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) aktyvumas ... 19
1.9.1. DPPH laisvojo radikalo surišimo metodas ... 20
1.9.2. FRAP redukcinio aktyvumo įvertinimo metodas ... 21
2. TYRIMO OBJEKTAS, METODIKA IR METODAI ... 22
2.1. Tyrimo objektas ... 22
2.2. Medžiagos ir reagentai... 23
2.3. Prietaisai ir priemonės ... 24
2.4. Tyrime naudojami metodai ... 24
2.4.1. Mėginių paruošimas... 24
2.4.2. Etaloninių tirpalų paruošimas ... 25
2.4.3. Plonasluoksnės chromatografijos metodika ... 25
2.4.3.1. Kokybinė analizė ... 26
2.4.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 27
2.4.4.1. Kokybinė analizė ... 28
2.4.5. Spektrofotometrinė analizė ... 29
2.4.5.1. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas DPPH laisvojo radikalo surišimo metodu ... 29
2.4.5.2. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas FRAP redukcinės gebos nustatymo metodu ... 30
2.5. Duomenų statistinis įvertinimas ... 31
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
3.1. Kokybinis 6-gingerolio ir 6-šogaolio nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu... 32
3.2. Kokybinis 6-gingerolio ir 6-šogaolio nustatymas ESC metodu ... 34
3.3. Kiekybinis 6-gingerolio ir 6-šogaolio įvertinimas ESC metodu ... 36
3.3.1. Kiekybinis 6-gingerolio nustatymas tiriamuosiuose mėginiuose ... 37
3.3.2. Kiekybinis 6-šogaolio nustatymas tiriamuosiuose mėginiuose ... 38
3.3.3. 6-gingerolio ir 6-šogaolio kiekybinės analizės apibendrinimas ... 39
3.4. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas ... 40
3.4.1. Tikrojo imbiero (Z. officinale R.) produktų antioksidantinio aktyvumo nustatymas vertinant DPPH laisvojo radikalo surišimą. ... 40
3.4.2. Tikrojo imbiero (Z. officinale R.) produktų antioksidantinio aktyvumo nustatymas vertinant redukcinį aktyvumą. ... 42
4. IŠVADOS ... 44
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 46
SANTRAUKA
R. Jazokaitės magistro baigiamasis darbas „Maisto papildų, kurių sudėtyje yra tikrųjų imbierų (Zingiber officinale R.) šakniastiebių, tyrimas taikant fiziko-cheminės analizės metodus“, darbo rengimo mokslinė vadovė doc. Augusta Ževžikovienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2019.
Raktiniai žodžiai: Zingiber officinale Roscoe, tikrasis imbieras,maisto papildai, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, DPPH, FRAP.
Tyrimo tikslas: šio tyrimo tikslas yra atlikti tikrųjų imbierų (Zingiber officinale R.) šakniastiebių kaupiamų biologiškai aktyvių medžiagų kokybinę, kiekybinę analizę bei antioksidantinio aktyvumo nustatymą Lietuvos Respublikoje notifikuotuose maisto papilduose, pritaikant efektyviąją skysčių chromatografiją, plonasluoksnę chromatografiją bei UV spektrofotometriją. Tyrimo uždaviniai: Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikas tikrųjų imbierų kaupiamų pagrindinių biologiškai aktyvių medžiagų kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui. Palyginti tiriamųjų objektų kiekybinę sudėtį ir įvertinti jų antioksidantinį aktyvumą.
Tyrimo objektas ir metodai: šio tyrimo objektas – keturi Lietuvos Respublikoje notifikuoti maisto papildai ir vienas tradicinis augalinis vaistinis preparatas, kurie savo sudėtyje turi tikrųjų imbierų (Zingiber officinale R.) šakniastiebių. Tiriamųjų objektų kokybinei, kiekybinei bei antioksidantinio aktyvumo analizei atlikti naudota plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija su fotodiodų matricos detektoriumi ir UV spektrofotometrijos metodai: DPPH ir FRAP.
Tyrimo rezultatai, išvados ir praktinės rekomendacijos: atlikus kokybinius maisto papildų ir palyginamojo augalinio vaistinio preparato tyrimus buvo identifikuoti du pagrindiniai imbierų šakniastiebių veiklieji junginiai – 6-gingerolis ir 6-šogaolis. Atlikus kiekybinius tyrimus buvo nustatytas šių veikliųjų junginių kiekis kiekviename tiriamąjame objekte. Didžiausias 6-gingerolio kiekis buvo nustatytas metanoliniame MP_1 maisto papildo mėginyje (0,233±0,001 mg/ml) ir palyginamąjame AVP_1 mėginyje (0,498±0,001 mg/ml), tuo tarpu didžiausias 6-šogaolio kiekis nustatytas maisto papilde MP_2 – (0,254±0,002 mg/ml), o mažiausias – MP_4 tiriamąjame papilde – (0,006±0,001 mg/ml). Remiantis antioksidantinio tyrimo duomenimis, galima teigti, kad veikliųjų junginių kiekis maisto papilduose sąlygoja jų antioksidantinį aktyvumą ir proporcingai didėja kartu su aptinkamu didėjančiu 6-gingerolio, ir 6-šogaolio kiekiu.
SUMMARY
The topic of the final master thesis by R. Jazokaite is „The analysis of food supplements, containing ginger (Zingiber officinale R.) rhizomes, using methods of physico-chemical analysis“ The research supervisor is doc. Augusta Zevzikoviene; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological chemistry. Kaunas, 2019.
Key words: Zingiber officinale Roscoe, ginger, food supplements, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography, spectrophotometry, DPPH, FRAP.
The aim of the research: to investigate the active compounds of ginger (Zingiber officinale R.) rhizomes qualitatively and quantitatively using thin-layer chromatography and high power liquid chromatography, and to measure the antioxidant activity of all the samples using UV spectrophotometry.
The objectives of the research: to apply thin-layer chromatography and high power liquid chromatography methodics for qualitative and quantitative analysis of bioactive substances found in ginger rhizomes. To compare the composition of bioactive substances in research objects and to determine and compare the antioxidant activity of all the samples.
The object and methods of the research: The objects of this investigation is four different food supplements, containing ginger rhizomes and one traditional herbal medicine. The qualitative analysis were proceeded using thin-layer chromatography, also qualitative and quantitative composition of phenolic compounds were determined by high-power liquid chromatography method with photodiode array detector. FRAP and DPPH methods were used to determine the antioxidant activity of prepared samples.
The results, conclusions and recomendations of the research: during qualitative analysis two bioactive substances – 6-gingerol and 6-šogaol were identified. During quantitative analysis the quantity of those active substances was determined. The largest amount of 6-gingerol was detected in MP_1 sample (0,233±0,001 mg/ml) and AVP_1 sample (0,498±0,001 mg/ml), meanwhile the largest amount of 6-shogaol was identified in MP_2 test sample (0,254±0,002 mg/ml) and the lowest amount of 6-shogaol was detected in MP_4 sample – (0,006±0,001 mg/ml). According to the antioxidant activity research, we can clearly see that the amount of active compounds in food supplements determines their antioxidant activity and increases proportionally with the detectable growth rate of 6-gingerol and 6-shogaol.
PADĖKA
Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas dėkoju Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros kolektyvui.
Už pagalbą ir patarimus noriu padėkoti savo magistrinio darbo vadovei doc. Augustai Ževžikovienei, taip pat doc. dr. Andrejui Ževžikovui ir lektoriui Mindaugui Marksai. Jūsų profesionalumas padėjo man įgyvendinti visas šio darbo rengimo metu kilusias idėjas.
SANTRUMPOS
AVP_1 – tiriamasis augalinis vaistinis preparatas nr. 1 DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia MP_1 – tiriamasis maisto papildas nr. 1
MP_2 – tiriamasis maisto papildas nr. 2 MP_3 – tiriamasis maisto papildas nr. 3 MP_4 – tiriamasis maisto papildas nr. 4 Ph. Eur. – Europos farmakopėja
R – Pirsono koreliacijos koeficientas R2 – regresijos koeficientas
Rf - pasiskirstymo faktorius
Rs – tapatybės rodiklis
SN – standartinis nuokrypis
TE – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas
ĮVADAS
Tikrasis imbieras (Zingiber officinale Roscoe) yra daugiametis, žolinis imbierinių (Zingiberaceae) šeimos augalas, plačiai paplites drėgnojo klimato vietovėse. Tikrųjų imbierų (Zingiber officinale R.) šakniastiebiai tradicinėje medicinoje naudojami virškinimui pagerinti, pykinimui slopinti ir peršalimo simptomams palengvinti. Ajurvedos medicinoje tikrieji imbierai vertinami dėl savo uždegimą slopinančio poveikio. [1] Vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių, lemiančių imbiero poveikį, yra fenoliniai junginiai, tokie kaip 6-gingerolis ir 6-šogaolis, kurie taip pat suteikia imbierui ir antioksidantinių savybių. [2]
Dėl savo teigiamo poveikio žmogaus sveikatai pastaruoju metu natūralūs veiklieji junginiai, išgauti iš augalinių žaliavų, tampa vis dažnesniu mokslinių tyrimų objektu. Todėl kiekvienas gamintojas, pateikdamas į rinką produktą, kurio sudėtyje yra tikrųjų imbierų šakniastiebių, turi atlikti reikiamus tyrimus ir įvertinti savo produkto kokybę bei saugumą būsimoms tikslinėms vartotojų grupėms. Kadangi saugumas pacientams yra vienas iš svarbiausių kriterijų, Pasaulio Sveikatos Organizacija pabrėžia, kad kiekvienas produktas privalo būti atidžiai patikrintas su pagarba būsimiems vartotojams prieš išleidžiant jį į rinką. Todėl pastaruoju metu didžiausio susidomėjimo sulaukia tokie fitocheminės analizės metodai kaip plonasluoksnė chromatografija bei efektyvioji skysčių chromatografija, kurie nereikalauja ilgų laiko sąnaudų bei yra ekonomiškai prieinami rutininei laboratorinei analizei tikrinant produktų kokybinę bei kiekybinė sudėtį. [3]
Pagrindinis šio baigiamojo magistro darbo tikslas yra ištirti Lietuvos Respublikos rinkoje esančius notifikuotus maisto papildus, kurių sudėtyje yra tikrųjų imbierų šakniastiebių, atlikti jų kokybinę, kiekybinę ir antioksidantinio aktyvumo analizę bei gautus rezultatus palyginti su Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registre esančiu tradiciniu augaliniu vaistiniu preparatu, kurio sudėtyje taip pat yra tikrųjų imbierų šakniastiebių.
Baigiamąjį magistro darbą sudaro įvadas, turinys, literatūros apžvalga, eksperimentinių tyrimų objektas ir metodai, tyrimų rezultatai bei jų aptarimas, ir išvados bei priedai. Eksperimentiniai tyrimai atlikti 2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros laboratorijoje.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – Atlikti tikrųjų imbierų (Zingiber officinale R.) šakniastiebių kaupiamų biologiškai aktyvių medžiagų kokybinę, kiekybinę analizę bei antioksidantinio aktyvumo nustatymą Lietuvos Respublikoje notifikuotuose maisto papilduose.
Darbo uždaviniai:
1. Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos metodiką tikrųjų imbierų šakniastiebių kaupiamų pagrindinių biologiškai aktyvių junginių kokybiniam nustatymui tiriamuosiuose magistro darbo objektuose.
2. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką tikrųjų imbierų kaupiamų pagrindinių biologiškai aktyvių medžiagų kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui tikriamuosiuose magistro darbo objektuose.
3. Palyginti Lietuvos Respublikos rinkoje esančių maisto papildų, kurių sudėtyje yra tikrųjų imbierų šakniastiebių, kiekybinę sudėtį.
4. Įvertinti tiriamųjų objektų antioksidantinį aktyvumą, analizei pritaikant UV spektrofotometrijos metodikas.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Tikrieji imbierai (Z.officinale R.), jų paplitimas ir morfologiniai požymiai
Tikrasis imbieras (lot. Zingiber officinale Rosc.) – atogražų augalas, į mūsų šalį dažniausiai importuojamas iš Kinijos. Anglų botanikas William Roscoe šį augalą Zingiber officinale pavadino ir pirmasis apibūdino 1807 metais. Genties pavadinimas yra kilęs iš graikiško žodžio „zingiberis“, kuris savo ruožtu yra kildinamas iš Sanskrito kalbos žodžio „shringavera“, reiškiančio „suformuotas, kaip elnio ragai“, o rūšies pavadinimas „officinale“ yra susijęs su šakniastiebių medicininėmis savybėmis. [1,2]
Šis daugiametis žolinis augalas priklauso imbierinių (Zingiberaceae) šeimai. Jau 500 m. pr. Kr. tikrieji imbierai buvo minimi Konfucijaus raštuose. Romėnai ir graikai tikruosius imbierus pažino Arabijos pirklių dėka, o vėliau romėnai šį vaistinį augalą į Didžiąją Britaniją atgabeno karo žygių metu. Šiuo metu imbierai yra labai plačiai kultivuojami visame pasaulyje ir pagal savo sunaudojimo mąstą nusileidžia tik juodiesiems pipirams. Daugiausiai tikrųjų imbierų užaugina ir eksportuoja Kinija, Indija, Nigerija, Indonezija, Jamaika bei Australija. [2]
Tikrųjų imbierų šakniastiebiai yra pailgos, dažnai netaisyklingos formos, iš jų pirmaisiais metais gali išaugti net iki 100 cm ilgio stiebai. Augalas turi siaurus, lygiakraščius ir iki 30 cm išaugančius lapus, kuriuos numeta kiekvienais metais. Stiebų viršūnėse, varpos formos žiedynuose susitelkę geltonos arba rudos spalvos žiedai. (1 pav.) [3,4]
a) b)
Tikriesiems imbierams augti yra būtina šilta ir drėgna dirva, savaime jis neauga, todėl praktiškai šis augalas visada yra specialiai auginamas komerciniais tikslais. Kadangi tikriesiems imbierams yra būdingas deginančiai aštrus, pikantiškas ir kartus skonis bei aromatingas kvapas, pasaulyje atsiranda vis daugiau komerciniu produktų, kurių sudėtyje yra tikrųjų imbierų šakniastiebių miltelių arba šaknų ekstrakto. [4]
Šio vaistinio augalo šakniastiebiai yra vartojami kaip vaistinė augalinė žaliava, kuri Europos farmakopėjoje apibūdinama kaip pilnai išdžiovinti, nesmulkinti arba susmulkinti šakniastiebiai, nuo kurių dalinai arba visiškai pašalinta žievė. Tikrųjų imbierų šakniatiebiai gali būti 5 – 10 cm ilgio, 1,5 – 4 cm pločio ir 1 – 1,5 cm storio. Išorinė imbiero šakniastiebio žievelė visai atvejais būna tamsesnė, nei vidus, išorinė dengiamoji spalva dažniausiai varijuoja nuo šviesiai gelsvos iki tamsiai rudos, priklausomai nuo imbiero kilmės šalies ir tiekėjo laikymo sąlygų. [7]
Kiti du visame pasaulyje paplitę ir plačiai naudojami imbierinių (Zingiberaceae) šeimai priklausantys prieskoniai yra tikrasis kardamonas (Elettaria cardamomum L.) ir daržinė ciberžolė (Curcuma longa L.), kurie taip pat pasižymi savitu skoniu bei kvapu kaip ir tikrieji imbierai. Pasaulinėje rinkoje tikrųjų imbierų šakniastiebiai gali būti tiekiami nesmulkinti šviežia arba džiovinta jų forma, taip pat skystojo arba tirštojo ekstrakto pavidalu, tabletėmis arba kapsulėmis, ir birių miltelių forma arbatos maišeliuose. [1,4]
1.2. Tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) šakniastiebių fitocheminė sudėtis ir
maistinė vertė
Mokslininkams atlikus tikrųjų imbierų šakniastiebių fitocheminės sudėties tyrimus, buvo nustatyta, kad žaliava kaupia įvairias veikliąsias medžiagas. Šakniastiebių sudėtyje yra 60-70% angliavandenių, 3 – 8% neapdorotų skaidulų, 9% baltymų, 8% lipidų, 8% nedegių medžiagų, 5 – 8% dervų, 3 – 6% riebiųjų aliejų ir 1,5 – 3% lakiųjų eterinių aliejų. Pagrindiniai lakiųjų eterinių aliejų, esančių šakniastiebiuose, komponentai yra seskviterpenai su pagrindiniu komponentu alfa-zingiberenu (30 – 70%), beta-seskvifelandrenu (15 – 20%), beta-bisabolenu (10 – 15%) ir monoterpenai, tokie kaip citralis, cineolis, geraniolis, borneolis. Be to tikrųjų imbierų šakniastiebiai kaupia ir arilalkanus, diarilheptanoidus (gingeroną A, gingeroną B ir kt.), vandenyje netirpias medžiagas fenilalkanonus bei fenilalkanonolius. [8,11,13,14]
Žaliavai specifinį imbiero kvapą suteikia žaliavoje esantys zigiberenai, o savo deginamą skonį imbierų šakniastiebiai turi dėl kaupiamų gingerolių, kurių žaliavoje yra apie 8%. Dėl savo biologinio aktyvumo daugiausiai mokslininkų dėmesio sulaukia gingeroliai ir šogaoliai. Yra žinoma serija 4,6,8,10 ir 12 gingerolių ir šogaolių homologų, iš kurių pagrindiniai ir labiausiai tiriami yra 6-gingerolis bei 6-šogaolis. [11,13,15]
Tikrieji imbierai taip pat pasižymi turtinga maistine verte, atliktos analizės duomenys parodė, kad 100 g tikrųjų imbierų šakniastiebių kaupia tik 0,8 g riebalų, 1,8 g baltymų, 18 g angliavandenių iš kurių tik 1,7 g cukrų, 16 mg kalcio, 13 mg natrio, 415 mg kalio, 43 mg magnio, 0,34 mg cinko, 0,6 mg geležies, 5 mg vitamino C, 0,2 mg vitamino B6, o energetinė 100 g tikrųjų imbierų šakniastiebių vertė yra vos 79 kcal. [16]
1.3. Tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) šakniastiebiuose kaupiamų junginių:
6-gingerolio ir 6-šogaolio, apžvalga
Pagrindinių fenolinių junginių, aptinkamų tikrojo imbiero šakniastiebiuose, cheminė struktūra vaizduojama paveiksle:
a) b)
2 pav. 6 – gingerolis (a) ir 6 – šogaolis (b) [8]
Aštrus šviežių tikrųjų imbierų šakniastiebių skonis yra susijęs su grupe lakių fenolinių junginių - gingerolių. [8] 6-gingerolis yra pragrindinis šakniastiebių komponentas, atsakingas už aitrumą, kai tuo tarpu kiti gingeroliai, tokie kaip 4-gingerolis, 8-gingerolis, 10-gingerolis ir 12-gingerolis randami mažesnėmis koncentracijomis. Šie komponentai yra termiškai stabilūs, bet labai aukštoje temperatūroje yra paverčiami į šogaolius, kurie suteikia imbiero šakniastiebiams aštriai – saldų kvapą. [16]
Šviežias imbiero šakniastiebis savo sudėtyje turi sukaupęs labai nedidelį 6-šogaolio, tačiau termiškai apdorojant šviežią šakniastiebį – dehidratacijos proceso metu susikaupia daug didesnis kiekis šogaolio. Remiantis kitų mokslininkų darbais galima teigti, kad būtent 6-šogaolis yra pagrindinis dehidratacijos produktas. Taip pat mokslinių tyrimu metu buvo nustatyta, kad 6-šogaolis pasižymi didesniu biologiniu aktyvumu, nei 6-gingerolis. [1]
Norint kuo ilgiau išsaugoti imbiero šakniastiebiuose esančius veikliuosius junginius, patariama šviežiai surinktus šakniastiebius laikyti tamsioje, vėsioje vietoje. Tačiau nesant galimybių tinkamai laikyti šakniastiebius, tikslinga būtų kuo skubiau ekstrahuoti veikliuosius junginius. Nors yra manoma, kad tikrųjų imbierų biologiškai aktyvūs junginiai veikia per serotonino receptorius juos blokuodami, šių fenolinių junginių konkretus veikimo mechanizmas nėra nustatytas moksliniais tyrimais, tačiau į juos krepiamas didelis mokslininkų dėmesys dėl gan stiprių antioksidantinių savybių, kurios itin svarbios žmogaus sveikatai. [9,12]
1.4. Tikrųjų imbierų (Z.officinale R.) šakniastiebių farmakologinės savybės ir
panaudojimas
Tikrųjų imbierų šakniastiebiai plačiai naudojami ne tik kaip prieskonis, bet ir kaip medicinos priemonė. Kinijoje, kuri yra ir viena iš didžiausių tikrųjų imbierų šakniastiebių žaliavos eksportuotojų, šis augalas jau daugiau nei 2500 metų pasitelkiamas tokių būklių kaip peršalimas, pykinimas ir galvos skausmai lengvinimui. Viduržemio jūros regiono šalyse tikrųjų imbierų šakniastiebiai naudojami kaip alternatyvioji terapija raumenų skausmams, dislipidemijai bei įvairioms reumatologinėms būklėms. [4]
Imbieras plačiai naudojamas tradicinėje medicinoje peršalimo simptomams, virškinimo sutrikimams bei reumatiniams skausmams palengvinti. Tyrimais patvirtintas tikrųjų imbierų virškinamojo trakto veiklą stimuliuojantis poveikis. Tikrieji imbierai skatina seilių gamybą, palengvina ryjimo procesą žmonėms turintiems difagijos simptomų. Virškinimo sistemos stimuliavimo mechanizmas grindžiamas tuo, kad imbiero šakniastiebių veiklieji fenoliniai junginiai stimuliuoja tulžies rūgščių gamybą kepenyse ir jų išskyrimą į tulžį. Kadangi tulžies vaidmuo virškinimo sistemoje yra labai svarbus, vartojant imbiero preparatus tampa intensyviau skatinama žarnų peristaltika, pagreitėja riebalų emulgavimo procesas (tulžies rūgštys suskaido riebalus į mažesnius subvienetus), to pasekoje žmogaus organizme tampa geriau įsisavinami riebaluose tirpūs vitaminai A, D, E ir K. Be to, šarminis tulžies sekretas neutralizuoja rūgštų
skrandžio turinį ir slopina jo veikimą, taip pat tulžies rūgštys aktyvina kasos sulčių fermentą lipazę, amilazę, skatina fermento tripsino aktyvumą. [8,12,15,17]
Mokslininkų dėmesio susilaukia ir vis intensyviau yra analizuojamas tikrųjų imbierų šakniastiebių kaupiamų veikliųjų junginių antimikrobinis, uždegimą slopinantis, antinavikinis bei antidiabetinis poveikiai. [13,17]
Lietuvos Respublikoje esančiose visuomenės vaistinėse tikrųjų imbierų turinčius maisto papildus galime rasti prie kitų prepraratų, skirtų virškinimui pagerinti. Tačiau nenorintiems gerti tablečių, bet turintiems dispepsijos reiškinių rekomenduojama 0,5 – 1 g susmulkintos šakniastiebių žaliavos užplikyti 150 ml verdančio vandens, po 5 min. perkošti ir gerti po vieną puodelį pieš valgį. [10,11]
Ajurvedos, Kinų bei tradicinėje medicinoje taip pat nurodomos šios tikrųjų imbierų naudingosios savybės: pykinimas dėl jūros ligos arba keliavimo antžemine transporto priemone, pykinimas dėl nėštumo, vėmimas, apetito praradimas, skrandžio skausmai, viduriavimas, dujų kaupimasis žarnyne, migreniniai galvos skausmai ir netgi hipertenzija. Ajurvedinės medicinos specialistai labai dažnai gydo migreną pasitelkdami tikruosius imbierus. Moksliškai taip pat įrodyta, kad įdedant šiek tiek nevirtų imbierų į paruoštą maistą, apsisaugoma nuo pasikartojančių migrenos priepuolių. [4,8,13]
Vakarų šalyse imbieras plačiai naudojamas ne tik dėl savo medicininių savybių, bet ir dėl aštraus kvapo ir aitraus skonio. Imbierinė duona, konditerijos gaminiai, sriubos, netgi imbierinis alus ir vynas. Imbierinis alus gaminamas iš fermentuotų imbierų ekstraktų. Nevirtas imbierinis alus gaminamas distiliuojant komerciniu būdu pagamintą imbierinį alų su karbonatų turinčiu vandeniu ir gaunamas produktas, kurio sudėtyje yra tik apie 2% alkoholio. Liaudies medicinoje karštas imbierinis vynas yra populiarus namų vaistas nuo gripo infekcijos esant nedideliam karščiavimui. [1,2]
1.5. Tikrųjų imbierų (Z.officinale R.) kaupiamų biologiškai aktyvių junginių
absorbcija ir pasiskirstymas
Moksliniuose šaltiniuose buvo rasta duomenų apie 6-gingerolio ir 6-šogaolio farmakokinetinius parametrus ir bioprieinamumą. Eksperimentiniame tyrime su laboratorinėmis žiurkėmis buvo nustatyta, kad 6-gingerolis pasiskirsto įvairiuose audiniuose: smegenyse, širdyje, plaučiuose, kepenyse, inkstuose, tačiau didžiausias jo kiekis aptinkamas virškinamojo trakto
organuose. Maksimalios 6-gingerolio koncentracijos buvo pasiektos praėjus 30 minučių po dozės suvartojimo, o eliminacijos pusperiodis siekė 1,77 valandos. [18]
Kitas klinikinis tyrimas buvo atliktas su sveikais savanoriais, kuriems buvo duodama nuo 100 mg iki 2 g imbiero šakniastiebių miltelių. 6-gingerolis ir 6-šogaolis buvo aptinkami gliukuronido ir sulfato konjugatų pavidalu kraujo plazmos mėginiuose praėjus vos 15 minučių nuo dozės suvartojimo, o jų eliminacijos pusperiodis buvo mažiau nei 2 valandos. Dar vienas klinikinis tyrimas buvo atliktas ne tik su savanorių kraujo plazma, bet ir su storosios žarnos audiniais. Kraujo plazmoje veikliųjų junginių eliminacijos pusperiodis buvo 1-3 valandos. Tiriant storosios žarnos audinius, veikliųjų imbiero šakniastiebių kaupiamų junginių buvo aptikti tik pėdsakai. Maksimali 6-šogaolio koncentracija kraujo plazmoje buvo aptikta praėjus vienai valandai nuo dozės suvartojimo, o 6-gingerolio šiuo atveju nebuvo nustatyta. Tačiau pritaikius jautresnę techniką po 1 valandos buvo aptiktas ne tik laisvas 6-šogaolis, bet ir 6-gingerolio gliukuronido metabolitai. [19,20]
Taigi, 6-gingerolis ir 6-šogaolis yra gana greitai absorbuojami gyvūnų bei žmonių audiniuose ir pasiskirsto juose įvairiai, todėl didžioji dalis imbiero veikliųjų junginių ekskretuojami iš organizmo metabolitų pavidalu. [18,19,20]
Faktoriai, nulemiantys klinikinius žmogaus organizmo atsakus į naudojamus tikrųjų imbierų preparatus nėra tiksliai žinomi, tačiau gali būti labai skirtingi priklausomai nuo vartojamo preparato kokybės bei kiekybinės sudėties. Taip pat kiekybinė ir kokybinė produktų sudėtis yra labai svarbi dėl vartotojų saugumo, ypač jei preparatus, kurių sudėtyje yra imbiero šakniastiebių, pykinimo ir vėmimo prevencijai vartoja besilaukiančios moterys. [21]
1.6. Toksiškumas
Farmakokinetinio tyrimo metu buvo nustatyta, kad tikrojo imbiero šakniastiebių metabolitai, tokie 6-gingerolis, 8-gingerolis, 10-gingerolis ir 6-šogaolis yra saugūs žmonėms tol, kol vartojamo preparato dozė neviršija 2000 mg per parą. Šis kiekis yra mažesnis už rekomenduojamą gairėse, sudarytose Jungtinių Valstijų Nacionalinio vėžio instituto (pagrindinių toksiškumo kriterijų). [1,19] Kiti autoriai taip pat įvardija, kad tikrųjų imbierų žaliavos rekomenduojama dienos dozė yra 2 – 4 gramai. [10,11,12] Atliktame tyrime su sveikais savanoriais tiriamieji patyrė nežymius virškinimo sutrikimus, tokius kaip atsirūgimas, rėmens
graužimas ir nevirškinimo požymiai, kai imbiero preparatai buvo vartojami pačiomis didžiausiomis dozėmis. [1,19]
Siekiant apsaugoti vartotojus nuo nepageidaujamų reiškinių, surenkant ir laikant imbiero žaliavą būtina laikytis visų atsargumo priemonių. 2017 metais Nigerijoje mokslininkų atlikto tyrimo metu buvo lyginamas tikrųjų imbierų šakniastiebių mikrobiologinis užterštumas aflatoksinais ir ochratoksinais A surinkus žaliavas atskirai lietingojo ir sausojo sezono metu toje pačioje vietovėje. Analizei atlikti buvo naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos metodika. Rezultatai parodė, kad žaliavų užterštumas aflatoksinais (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) ir
ochratoksinais A (OTA) buvo reikšmingai didesnis lietingojo sezono metu (81% ir 71% atitinkamai) nei žaliavų, kurios buvo surinktos analizei sausojo periodo laiku (46% ir 37% atitinkamai). Taip pat buvo nustatyta, kadseptynuose iš trisdešimt vieno mėginių, surinktų lietingojo sezono metu, aflatoksinų (AFB1) kiekis viršijo Europos Sąjungos (EU) nustatytą
leistiną kiekį (5 μg/kg). Tyrimo autorių teigimu, mikrobiologinio užterštumo riziką padidina drėgmė ir temperatūros pokyčiai žaliavos rinkimo ir saugojimo metu. Todėl labai svarbu stengtis surinktą tikrųjų imbierų žaliavą laikyti sausoje ir nuo temperatūros pokyčių apsaugotoje vietoje, kad toliau gaminami produktai skirti tiekti į rinką pasižymėtų geriausia kokybe. [4]
1.7. Junginių ekstrakcija
Medicininių augalų analizė dažniausiai prasideda nuo ekstrahavimo procedūros, kuri yra labai svarbi tolesnei tyrimų eigai. Išskiriant veikliuosius junginius iš tikrųjų imbierų šakniastiebių svarbiausi parametrai yra ekstrakcijos laikas, temperatūra ir tirpiklis. Dažniausiai tyrėjų pasirenkamas metodas 6-gingeroliui bei kitiems imbiero veikliesiems junginiams išskirti yra ultragarsu skatinamas ekstrahavimas. Ultragarsas padidina tirpiklio skverbimąsi į žaliavą skatindamas membranų destrukciją ir tuo pagerindamas junginių pernašą bei palengvindamas jų išsiskyrimą. Tai žymiai greitesnis ekstrahavimas lyginant su maceracijos ar perkoliacijos metodais, kadangi tirpiklio molekulės įkaista ir pradeda greičiau judėti, suintensyvėja analizuojamų junginių difuzija. [11,17,22,23,24,25]
Remiantis kitų mokslininkų tiriamųjų darbų duomenimis, optimaliausios sąlygos tikrųjų imbierų šakniastiebių veikliųjų junginių ekstrahavimui yra: 60 minučių trukmės ekstrahavimas 70-75 % etanoliu arba metanoliu 40 oC temperatūroje. [11,17,23,24] Analizes atliekantys tyrėjai
naudojant ektrahavimą rutininėje laboratorinėje analizėje. [23,25] Taip pat buvo rasta tyrimų, kuriuose ekstrahavimo tirpikliu veikliesiems tikrųjų imbierų šakniasteibių junginiams išskirti dar gali būti naudojamas acetonas, etilacetatas ir net chloroformas [17,24,26]
1.8. Kokybinės bei kiekybinės analizės metodai 6-gingeroliui ir 6-šogaoliui
nustatyti
Mokslininkai dažnai derina kelis metodus: kokybiškai imbiero sudėtį vertina plonasluoksnės chromatografijos būdu, o kiekybiškai – efektyviąja skysčių chromatografija arba dujų chromatografija. [13,27] Tačiau duju chromatografijos metodika turi trūkumų, todėl yra rečiau naudojama, nes dėl chromatografinės kolonėlės temperatūros gali iškreipti analizės rezultatus, todėl šis metodas naudojamas rečiau. Analizuojant 6-gingerolį dujų chromatografijos metodu jis dažniausiai nespėjamas aptikti kokybiškai dėl to, kad temperatūros poveikis jį greitai paverčia 6-šogaoliu. Todėl efektyvioji skysčių chromatografija turi pranašumų prieš dujų chromatografiją analizuojant 6-gingerolį, nes šio metodo pritaikymo metu jis nekonvertuojamas į 6-šogaolį ir išlieka stabilus visos analizės metu bei neiškraipo tyrimo rezultatų. [11,15,21,24]
1.8.1. Plonasluoksnė chromatografija
Plonasluoksnė chromatografija yra ekonomiškas ir lengvai atliekamas chromatografinis junginių analizės metodas. Identifikavimas atliekamas naudojant UV šviesą arba densitometriniu būdu, esant 350–365 nm arba 250–260 nm bangų ilgiams. Plonasluoksnės chromatografijos privalumai: greitas junginių atskyrimas bei galimybė analizuoti keletą mėginių vienu metu. [14,28] Plonasluoksnė chromatografija gali būti naudojama ne tik preliminariam augalinių ekstraktų tyrimui prieš ESC, bet taip pat kiekybinei fenolinių junginių analizei. Europos farmakopėjos 01/2011:1522 straipsnyje aprašomas plonasluoksnės chromatografijos metodas, kurio metu imbiero veikliųjų junginių nustatymui naudojama silikagelio plokštelė. [7] Šis metodas su keletu pakeitimų pritaikytas maisto papildų ir augalinio vaistinio preparato kokybinei analizei prieš atliekant kokybinę bei kiekybinę analizę efektyviąja skysčių chromatografija. [7,27]
Dauguma mokslinės literatūros šaltinių autorių pritaria, kad pastaruoju metu plonasluoksnė chromatografija tampa vis populiaresniu analizės metodu dėl sąlyginai mažų laiko ir reagentų sąnaudų. [3,28]
1.8.2. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyvioji skysčių chromatografija yra viena iš dažniausiai pasirenkamų biologiškai aktyvių junginių išskirstymo ir kiekybinio nustatymo technikų, nes šis analizės metodas yra gerai žinomas dėl savo didelio efektyvumo. Tinkamai analizei ESC metodu svarbu mėginio išvalymas, judrios fazės, kolonėlės bei detektoriaus parinkimas. Judrios fazės ir gradiento parinkimas yra vienas svarbiausių uždavinių parenkant ESC metodiką augalinių ekstraktų analizei. Dėl konjuguotų dvigubųjų ryšių bei aromatinių struktūrų fenoliniai junginiai absorbuoja UV arba UV/regimąją šviesą. Dėl to fenolinių junginių detekcijai ESC metodas dažniausiai jungiamas su UV/regimosios šviesos, fotodiodų matricos ir UV-fluorescenciniais detektoriais. Labiausiai paplitęs fotodiodų matricos detektorius, kadangi jis geba skenuoti visų pro detektorių praeinančių analičių UV/regimosios šviesos spektrą, suteikdamas daugiau informacijos apie junginius sudėtiniuose mišiniuose, pavyzdžiui, augaliniuose ekstraktuose. [29,30]
1.9. Antioksidantinis tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) aktyvumas
Mokslinės literatūros duomenimis, tikrųjų imbierų (Zingiber officinale Roscoe) augalų šakniastiebiai ir jų komerciniai produktai pasižymi reikšmingu antioksidantiniu poveikiu. Kadangi įvairių aplinkos veiksnių sukeliama laisvųjų radikalų hiperprodukcija gali būti sunkių lėtinių ligų atsiradimo ir vystymosi priežastis, augalų kaip potencialių antioksidantų paieška ir panaudojimas yra ypač svarbi šiuo metu dirbančių mokslininkų užduotis. [16,17]
Susidomėjimas natūraliais antioksidantais žymiai padidėjo dėl galimo sėkmingo jų panaudojimo farmacijos industrijoje kuriant vaistus su mažesniais šalutiniais poveikiais ir pritaikomumu įvairiems negalavimams. [13] Tikrasis imbieras (Zingiber officinale R.) yra priskiriamas egzogeniniams antioksidantams. Tai grupė iš augalų kartu su maistu gaunamų junginių, kurie tiesiogiai sąveikaudami su laisvaisiais radikalais neleidžia įvykti tolimesnėms jų reakcijoms žmogaus organizme. Reguliarus produktų, turinčių antioksidantų, vartojimas, ne tik sulėtina senėjimo procesus, tačiau ir mažina lėtinių ligų atsiradimo riziką, stabdo jų progresavimą, palaiko organizmo ląstelių funkcijas. Augalinės kilmės antioksidantų vartojimo nauda yra pagrįsta moksliniais tyrinėjimais. [16,32] Taip pat tyrimais įrodyta, kad tikrųjų imbierų šakniastiebių kaupiamos medžiagos suteikia šiai augalo daliai statistiškai reikšmingai didesnį antioksidantinį aktyvumą lyginant su kitomis šio augalo dalimis. [31]
Tikrųjų imbierų šakniastiebiuose randama tokių antioksidantų kaip askorbo rūgštis, terpenoidai, alkaloidai, ir polifenoliai (flavonoidai, flavonų glikozidai). Augalų antioksidantinės savybės svarbios ne tik dėl to, kad apsaugo žmogaus organizmą nuo laisvųjų radikalų neigiamo poveikio, bet ir dėl maisto bei farmacinių produktų apsaugos nuo oksidavimosi. Natūralūs augaliniai antioksidantai naudojami komercinių produktų sudėtyje yra saugesni už sintetinius antioksidantus, taip pat apsaugo maistą bei maisto papildus nuo lipidų peroksidacijos, kuri lemia produktų kokybės pablogėjimą gamybos ir laikymo metu. Nors sintetiniai antioksidantai taip pat suteikia produktams apsaugą nuo peroksidacijos, tačiau vis dažniau pabrėžiama natūralių antioksidantų svarba dėl mažesnio jų toksiškumo ir didesnio saugumo žmogui dėl sukeliamų mažesnio mąsto nepageidaujamų reakcijų. [9,32]
Jeigu ląstelėms padaryta didelė oksidacinė pažaida ir jos negali indukuoti apsauginių mechanizmų, nuo oksidacinės pažaidos progresavimo ir jos daromos žalos gali apsaugoti iš išorės gaunamos medžiagos – antioksidantai. Antioksidantai neutralizuoja laisvuosius radikalus sudarydami mažai toksiškus junginius ir taip sumažindami ar visiškai panaikindami organizme laisvųjų radikalų sukeliamą žalą. Imbiero sudėtyje esantys fenoliniai junginiai – gingeroliai ir šogaoliai (bei kitos biologiškai aktyvios medžiagos) suteikia jam antioksidacines savybes. Naudojant 96 proc. etanolį kaip ekstrahentą tiriamiesiems mėginiams – gaunamas didžiausias antioksidantinis aktyvumas. 2015 metais S. H. Nile ir S. W. Parko atliktame moksliniame tyrime buvo nustatyta, kad 6-gingerolis ir 6-šogaolis turi potencialų antioksidantinį ir priešuždegiminį aktyvumą, todėl po klinikinių tyrimų ir in vivo studijų tikrieji imbierai (Z. officinale R.) galėtų būti panaudojami kaip natūralūs oksidacinį stresą ir uždegimines ligas gydantys vaistai. [41]
1.9.1. DPPH laisvojo radikalo surišimo metodas
DPPH (2,2- difenil-1-pikrilhidrazilo) laisvasis radikalas yra vienas iš nedaugelio organinių azoto radikalų, pasižyminčiu dideliu stabilumu. Savo struktūroje DPPH turi delokalizuotą elektroną, dėl šios priežasties jis nesijungia su kitu DPPH laisvuoju radikalu. Paruoštas reagento tirpalas yra tamsiai violetinės spalvos, o antioksidantas, kuris geba atiduoti vandenilio atomą, pakeičia tirpalo spalvą į geltoną ir suformuoja molekulinį DPPH-H (difenil-pikrilhidrazino) junginį. [32] Matuojant tirpalo absorbcijos dydžio pokytį, esant fiksuotam 515 – 528 nm šviesos bangos ilgiui, galima nustatyti antioksidantinį aktyvumą, nes antioksidanto kiekis yra proporcingas absorbcijos dydžio sumažėjimui. [9,13]
1.9.2. FRAP redukcinio aktyvumo įvertinimo metodas
Antioksidantinėmis savybėmis pasižymintys junginiai dažnai analizuojami FRAP metodu, kurio esmė trivalenčio geležies komplekso redukcija rūgštinėje terpėje į dvivalentį geležies kompleksą. Redukcinio aktyvumo nustatymo metodas su FRAP reagentu leidžia įvertinti antioksidanto gebėjimą prisijungti laisvojo radikalo nesuporuotą elektroną. Junginių redukcinė geba vertinama pagal standartinį antioksidantą – troloksą. [18,20]
Tačiau FRAP metodas turi keletą trūkumų. FRAP metodui vykti yra būtina sudaryti rūgštinę terpę, nes esant neutraliai terpei gali susidaryti [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ nuosėdos [19]. Taip pat FRAP
metodu gali būti nustatinėjami ne visi junginiai. Antioksidantai, kurie veikdami atiduoda vandenilio atomą, šiuo metodu negali būti nustatomi [31]. Nepaisant šių trūkumų, FRAP metodo atlikimas yra nesunkus, nereikia specialios aparatūros ir šis metodas plačiai naudojamas tiriant antioksidantinį aktyvumą [7,18,20,38].
2. TYRIMO OBJEKTAS, METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Šio baigiamojo magistro darbo eksperimentinės dalies tiriamasis objektas yra Lietuvos Respublikos rinkoje esantys notifikuoti maisto papildai (MP_1, MP_2, MP_3, MP_4), kurių sudėtyje yra tikrųjų imbierų (Zingiber officinale Rosc.) šakniastiebių. Palyginimui buvo tirtas vienas Lietuvos Respublikos rinkoje esantis registruotas tradicinis augalinis vaistinis preparatas (AVP_1), kurio sudėtyje yra tikrųjų imbierų (Zingiber officinale Rosc.) šakniastiebių. Visų tiriamųjų objektų kokybinė sudėtis pateikta pirmoje lentelėje. [33,34]
1 lentelė. Tiriamųjų objektų sudėtis, pateikiama gamintojų.[33,34]
Tyrimo objektas Farmacinė forma Kilmės šalis
Tyrimo objekto kokybinė sudėtis, nurodyta gamintojų Gamintojo deklaruojamas tikrųjų imbierų kiekis (mg) MP_1 Tabletės Danija
• Tikrųjų imbierų (Z. officianale) džiovintų šaknų milteliai;
• dikalcio fosfatas; • želatina;
• hidroksipropilmetilceliuliozė; • riebalų rūgščių magnio druskos.
300 mg (vienoje tabletėje)
MP_2 Tabletės Danija • Tikrųjų imbierų (Z. officianale)
džiovintų šakniastiebių milteliai. 300 mg (vienoje tabletėje)
MP_3 Tabletės Lenkija
• Tikrųjų imbierų (Z. Officinale) šakniastiebiai;
• piridoksino hidrochloridas (vit. B6); • mikrokristalinė celiuliozė;
• riebalų rūgščių magnio druskos; • silicio dioksidas.
300 mg (vienoje tabletėje)
MP_4 Tabletės Lietuva
• Gvaraninių paulinijų (Paullinia cupana) sėklų ekstraktas (Kofeinas 12%);
• inulinas;
• kambodžinių garcinijų (Garcinia
50 mg (vienoje tabletėje)
Cambogia) vaisių ekstraktas; • cholinas;
• tikrųjų imbierų (Z. officinale) šaknų ekstraktas;
• vienamečių paprikų (Capsicum annum) vaisių ekstraktas;
• chromas.
AVP_1 Kietosios
kapsulės Lenkija
• Tikrųjų imbierų (Z. officinale) šakniastiebių milteliai;
• želatina;
•chinolino geltonasis (E104); • indigotinas (E132);
• titano dioksidas (E171).
250 mg (vienoje kietoje kapsulėje)
2.2. Medžiagos ir reagentai
Visi šiame tyrime naudoti reagentai, tirpikliai bei standartai yra analitinio švarumo ir atitinka šioms medžiagoms keliamus kokybės reikalavimus.
• 2,4,6-tripyridyl-s-triazinas (TPTZ) (Sigma-Aldrich, Vokietija);
• 6- gingerolio ir 6 – šogaolio junginių standartai (Sigma-Aldrich, Vokietija); • Acetonitrilas (≥99,9 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
• Etanolis (96,3 proc. (v/v), Stumbras, Lietuva); • Eteris (≥99,8 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
• Geležies (III) chlorido heksahidratas (FeCl3×6H2O) (Sigma-Aldrich, Vokietija);
• Heksanas (≥95 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);
• Dejonizuotas vanduo, ruoštas išgryninto vandens paruošimo sistema „Millipore“ (JAV); • Koncentruota druskos rūgštis (Buchs, Šveicarija);
• Metanolis (≥99,8 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija); • Natrio acetato trihidratas (Steinheim, Vokietija); • Sieros rūgštis (≥99,8 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija); • Vanilinas (≥99,8 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija).
2.3. Prietaisai ir priemonės
• Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija); • UV spektrofotometras (Shimadzu UV-1800 Spectrophotometer, JAV); • Skysčių chromatografas Waters 2695 (Waters Corporation, Milford, JAV); • Plonasluoksnės chromatografijos vizualizatorius (Camag, Muttenz, Šveicarija); • Centrifuga („SIGMA3-18KS“, Vokietija);
• Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedfordas, MA, JAV); • Ultrаgarso vonelė BioSonic UC100 (JAV);
• Q-Max membraninis filtras (13 mm diametro, 0,22 μm dydžio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija);
• 20 cm aukščio ir 20 cm pločio stiklinės plokštelės TLC Silica gel 60 F254 25 (Merck,
Vokietija);
• Stiklinė, dvivietė, plonasluoksnės chromatografijos kamera su metaliniu dangčiu (Camag, Muttenz, Šveicarija);
• Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);
• Pusiau automatinis mėginių ėmiklis Camag Linomat 5 (Camag, Muttenz, Šveicarija);
2.4. Tyrime naudojami metodai
2.4.1. Mėginių paruošimasKokybinei bei kiekybinei tiriamųjų objektų mėginiai ruošti panaudojant tris skirtingus tirpiklius. Visi mėginių paruošimui naudoti tirpikliai buvo parinkti atsižvelgiant į mokslinės literatūros duomenis. [23,24,25]
Plonasluoksnės chromatografijos pavyzdžiams tirpikliu buvo naudojamas metanolis, o efektyviosios skysčių chromatografijos meginiams paruošti buvo parinkti metanolis ir 70% etanolis. [7,26] 70% etanolis buvo pagamintas skiedimo būdu naudojant 96% etanolį. Antioksidantinio aktyvumo nustatymui mėginiai buvo ruošiami tirpikliu naudojant metanolį. Taip pat remiantis mokslinės literatūros šaltiniais buvo nuspręsta ekstrahavimui naudoti ultragarsinę vonelę. Buvo naudojama 168 W stiprio ir 40 KHz dažnio ultragarsinė vonelė. [23,24,25]
Tiriamųjų maisto papildų tabletės ir palyginamojo augalinio vaistinio preparato kapsulių turinys smulkintas grūstuvėje, atsverta po 2,5 g kiekvieno tiriamojo mėginio ir 25 ml kolbutėje sumaišyta su skirtingais tirpikliais iki žymės. Ekstrahuojama ultragarso poveikyje 60 min. palaikant 45±2˚C temperatūrą. Visi analizei paruošti ekstraktai atvėsinami ir filtruojami pro nailoninius membraninius švirkštų filtrus, kurių porų dydis - 0,22 μm. Paruošti tiriamųjų mėginių ekstraktai tirti plonasluoksnės chromatografijos, efektyviosios skysčių chromatografijos bei UV spektrofotometrijos metodais. [24,25,26]
2.4.2. Etaloninių tirpalų paruošimas
Etaloniniai tirpalai buvo ruošiami iš 6-gingerolio ir 6-šogaolio standartinių tirpalų. Šiuos standartus maišant su 96 proc. etanoliu buvo pagaminti 6-gingerolio ir 6-šogaolio pradiniai tirpalai, kurių koncentracijos atitinkamai buvo gautos 0,11 mg/ml gingerolio) ir 0,2 mg/ml (6-šogaolio). Iš pradinių tirpalų buvo gaminami skirtingos koncentracijos tirpalai siekiant sudaryti kalibracinių kreivių grafikus kiekybiniam tiriamųjų mėginių įvertinimui efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu. 6-gingerolio kalibracinis grafikas buvo sudarytas iš 9 taškų, o 6-šogaolio kalibracinis grafikas buvo sudarytas iš 6 taškų.
2.4.3. Plonasluoksnės chromatografijos metodika
Analizei atlikti naudotas chromatogramos prietaisas CAMAG TLC Visualizer. Duomenims apdoroti bei kokybinei analizei atlikti naudota programinė įranga winCATS. Šio tiriamojo darbo metu analizė buvo atliekama remiantis plonasluoksnės chromatografijos metodu, atitinkančiu Europos farmakopėjos 01/2011:1522 straipsnį. [7]
Eliuento paruošimas. Tirpiklių sistema naudota šio eksperimento metu buvo heksanas:eteris (40:60). Tinkamą tirpiklių sistemą parinkti yra labai svarbu, nes nuo to priklauso chromatografinio atskyrimo veiksmingumas. Šiam tyrimui eliuentas buvo parinktas remiantis Europos farmakopėja. Į chromatografinę kamerą santykiu 40:60 buvo įpiltas 50 ml turio heksano/eterio mišinys. Į kamerą supiltas mobiliosios fazės mišinys iki chromatografavimo proceso pradžios turėjo nusistovėti apie 20 minučių su sandariai uždengtu dangčių, kad chromatografijai skirta kamera prisipildytų garais. [7,14]
Chromatografinės plokštelės paruošimas. Tiriamosios medžiagos ir etanoliniai standartų tirpalai ant chromatografijai skirtos silikagelio plokštelės buvo užnešami pusiau automatiniu užnešėju CAMAG Linomat 5 ir užpurškiami su specialia CAMAG 100 μl švirkšto adata. Užnešamas tiriamosios medžiagos tirpalas lašinamas ant plokštelės maždaug 2,5 cm atstumu nuo apatinio plokštelės krašto, kur yra pažymima starto linija ir ne arčiau kaip 2 cm atstumu nuo plokštelės šono. Mėginiai ant plokštelės užnešami brūkšniniu būdu. Prieš įdedant plokštelę į chromatografavimo kamerą – ji išdžiovinama traukos spintoje.
Chromatografavimo eiga. kelias 15 cm, laikas apie 60 minučių.
Ryškinimo reagentai. Ryškinimui buvo naudojamas vanilino ir sieros rūgšties mišinys, kuris buvo gaminamas 1 g vanilino miltelių ištirpinant 100 ml kolboje iki žymės užpildant sieros rūgštimi. Chromatografavimo plokštelės buvo džiovinamos ore ir patalpinant į džiovinimo spintą (įkaitinta iki 100 °C) kelioms minutėms.
Chromatogramų vertinimas. Tiriamųjų mėginių kokybinis vertinimas atliekamas naudojantis CAMAG TLC Visualizer prietaisu ir winCATS programine įranga, kurių pagalba nufotografuojami chromatografinių plokštelių vaizdai bei apskaičiuojami tiriamųjų medžiagų bei etaloninių tirpalų sulaikymo faktoriai (Rf). Plokštelių vaizdai šio tyrimo metu buvo užfiksuoti prie
366 nm bangos ilgio ir baltoje šviesoje. [14]
2.4.3.1. Kokybinė analizė
Analizuojamos medžiagos sugebėjimą judėti adsorbentu nusako sulaikymo rodiklio reikšmė:
Rf = L1/L2
Rf – sulaikymo rodiklis
L1 – chromatografuojamos medžiagos judėjimo plokštele atstumas
L2 – tirpiklio judėjimo plokštele atstumas
Sulaikymo rodiklio ribinės vertės yra nuo 0 iki 1, kurios paprastai apskaičiuojamos kaip šimtainės trupmenos – iki dviejų skaičių po kablelio. Rf vertė priklauso ne tik nuo tiriamosios medžiagos
kilmės, bet ir nuo eksperimento atlikimo sąlygų. Tiriamoji medžiaga chromatografuojama su etaloniniais tirpalais ir lyginamos jų Rf reikšmės. [14,35,36]
Lyginant gautas Rf reikšmes, apskaičiuojamas tapatybės rodiklis RS:
RS = Rf1/Rf2
RS – tapatybės rodiklis
Rf1 – tiriamosios medžiagos sulaikymo rodiklis
Rf2 –etaloninės medžiagos sulaikymo rodiklis
Jeigu apskaičiavus gauname, kad RS ~ 1, vadinasi tiriamoji medžiaga yra tapati etaloninei
medžiagai. [35,36]
2.4.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Analizei atlikti naudotas skysčių chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 966 PDA. Duomenims apdoroti bei kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti naudota programinė įranga Empower2 (Empower Chromatography Data Software). [37]
Analizės sąlygos:
• Veikliesiems junginiams išskirstyti naudota chromatografinė kolonėlė ACE C18 (250 x 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5 μm).
• Mobilioji fazė sudaryta iš acetonitrilo (tirpiklis B) ir vandens (tirpiklis A). • Injekcijos tūris 10 μl;
• gradientinio eliuavimo tėkmės greitis - 1,0 ml/min; • analizės trukmė 43 min.;
• kolonėlės temperatūra 25oC,
• tiriamųjų junginių detekcija mėginiuose atlikta fotodiodų matricos detektoriumi esant 225 nm šviesos bangos ilgiui. [37]
Eliuento gradiento sudėties kitimas vyko atitinkama seka, kuri pavaizduota 2 lentelėje.
2 lentelė. Eliuento gradiento sudėties kitimas.
Laikas 0 min. 0 - 8 min. 8 - 17 min. 17 - 32 min. 32 - 43 min.
Eliuentas A 55% 50% 35% 0% 55%
Eliuentas B 45% 50% 65% 100% 45%
Naudojamos analitinės metodikos validacija yra labai svarbus aspektas, kuris patvirtina, kad naudojamas analizės metodas yra tinkamas tyrimui atlikti ir atitinka šiuos specifinius parametrus: specifiškumą, tiesiškumą, rezultatų preciziškumą (kurį sudaro pakartojamumas bei atkartojamumas), taip pat aptikimo ir nustatymo ribos. Visi šie specifiniai ESC metodikos parametrai buvo įvertinti remiantis ICH gairėmis ir metodika buvo validuota studentės, kuri 2017 metais kiekybiškai tyrė skystuosius tikrųjų imbierų ekstraktus. [29,37]
2.4.4.1. Kokybinė analizė
Tiriamųjų 6-gingerolio ir 6-šogaolio chromatografinių smailių identifikavimas atliktas lyginant analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laikus kolonėlėje ir junginių UV šviesos spinduliuotės absorbcijos spektrines charakteristikas. [29,30]
2.4.4.2. Kiekybinė analizė
Kiekybiniam veikliųjų junginių įvertinimui sudarytas kalibracinis grafikas. 6-gingerolio kalibracinis grafikas sudarytas iš 9 taškų, jų koncentracijos ribos buvo 0,000883-0,226 mg/ml, o 6-šogaolio - iš 6 taškų, kurių koncentracijos ribos buvo 0,0125-0,4 mg/ml. Įvertinus tiesiškumą nustatyta, kad kalibraciniai grafikai tenkina validacijos parametrus, nes abiejų junginių tiesiškumas buvo ne mažesnis kaip - R2=0,9999. [29,30]
2.4.5. Spektrofotometrinė analizė
Spektrofotometriniai analizės metodai – vieni iš plačiausiai taikomų instrumentinės analizės metodų. Šių metodų esmė – tiriamosios medžiagos yra įvertinamos pagal tai, kaip jų dalelės (atomai, molekulės, branduoliai, elektronai ar jonai) geba absorbuoti arba išsklaidyti elektromagnetinę spinduliuotę. Spektrofotometriniai analizės metodai yra labai svarbūs tada, kai norima įvertinti fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą.
2.4.5.1. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas DPPH laisvojo radikalo surišimo metodu Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas pamatavus, kiek procentų stabilaus 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalo gali neutralizuoti fenoliniai junginiai. Laisvajam radikalui antioksidantas atiduoda vandenilio atomą arba elektroną ir taip stabilizuoja laisvuosius radikalus, paversdamas juos neaktyviais. [9,13,26]
DPPH 0,1mM tirpalo paruošimas: į 250 ml matavimo kolbą įberiama 10 mg DPPH radikalo ir tirpinama etanolyje, juo praskiedžiant iki žymės. Paruoštas tirpalas sumaišomas ir spektrofotometru patikrinama gauto tirpalo absorbcija (~ 1,000). Paruoštas DPPH tirpalas saugomas tamsoje [86]. Ruošiant tiriamąjį tirpalą į kiuvetę įpilama 2,9 ml paruošto DPPH reagento ir 0,1 ml tiriamojo mėginio tirpalo. Kiuvetės laikomos 30 min. tamsoje. Matuojama absorbcija spektrofotometru esant 518 nm bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas - 96,6 % etanolis. Tyrimai kartoti po tris kartus, rezultatai pateikti išvedus vidurkį ir apskaičiavus standartinį nuokrypį. Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas inaktyvuoto DPPH radikalo kiekio procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę: [13,23,31]
𝐃𝐏𝐏𝐇 𝐢𝐧𝐚𝐤𝐭𝐲𝐯.𝐩𝐫𝐨𝐜.=𝑨𝒐−𝑨x/𝑨𝒐 ×𝟏𝟎𝟎
Ao – tuščio bandinio absorbcija, gryno DPPH optinis tankis (t = 0 min.) Ax – tiriamojo bandinio absorbcija (t = 30 min.)
2.4.5.2. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas FRAP redukcinės gebos nustatymo metodu Antioksidantinis aktyvumas šiuo metodu įvertinamas panaudojant geležies gebėjimą redukuotis. Šio metodo esmė: antioksidantas redukuoja geležies (III) joną į geležies (II) joną. Taigi tiriamasis ekstraktas redukuoja [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ kompleksą ir susidaro mėlynos spalvos
[Fe(II)-(TPTZ)2]2+ kompleksas, kurio absorbcija matuojama spektrofotometru, esant 593 nm
bangos ilgiui. [42] Esant antioksidantams, absorbcija padidėja dėl susidariusio [Fe(II)-(TPTZ)2]2+
komplekso. [38]
Darbinis FRAP reagentas ruošiamas sumaišant A, B ir C reagentus santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo). Visi trys reagentai buvo ruošiami laboratorijoje prieš vykdant analizę. Reagentų sudedamosios dalys ir paruošimas pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Darbinio FRAP tirpalo reagentų paruošimas
Reagentas Reagento sudėtis ir paruošimas
A
300 mM acetatiniam buferiui paruošti atsveriama 1,6 g natrio acetato, suberiama į 500 ml matavimo kolbą, įpilama 8 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės;
B
10 mM TPTZ tirpalui paruošti į 50 ml išgryninto vandens įpilama 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties. Gautame 40 mM druskos rūgšties tirpale ištirpinami tiksliai atsverti 0,1562 g TPTZ milteliai.
C
20mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalui paruošti atsveriama 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato miltelių ir ištirpinama 50 ml išgryninto vandens.
Analizei imama 3 ml darbinio FRAP reagento ir sumaišoma su 20 μl tiriamojo mėginio ekstrakto. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 593 nm bangos ilgiui (palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tačiau vietoje ekstrakto dedama tirpiklio). [13]
Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Norint apskaičiuoti rezultatus prieš tai nubrėžiama kalibracinė kreivė
naudojant trolokso etanolinį tirpalą. Trolokso gradavimo grafikas (y = 0,000168x + 0,07223; R2 = 0.9984) paruoštas FRAP metodu nustačius 0 - 3 mg/ml koncentracijos trolokso tirpalų absorbcijos dydžius. Apskaičiuojama pagal formulę:
TEFRAP = c × V/m
c – trolokso koncentracija (μM) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (L);
m – tikslus atvertas žaliavos kiekis (g).
2.5. Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenų statistinis įvertinimas atliktas „MS Excel 2010“ ( Microsoft, JAV ) programa ir „IBM SPSS Statistics 20“ ( IBM, JAV ) stаtistine duomenų programa. Visi bandymai buvo atlikti po tris kartus. Duomenys buvo įvertinti apskaičiuojant gautų tyrimų duomenų aritmetinį vidurkį (AVERAGE) ir standartinį nuokrypį (SN). Rezultatų statistinis reikšmingumas tarp tiriamųjų mėginių įvertintas taikant ANOVA vienfaktorinę dispersinę analizę, taikant Tukey kriterijų. Statistiškai reikšmingas skirtumas buvo nustatytas jeigu p < 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Kokybinis 6-gingerolio ir 6-šogaolio nustatymas plonasluoksnės
chromatografijos metodu
Kokybinis 6-gingerolio ir 6-šogaolio nustatymas tiriamuosiuose objektuose buvo atliktas remiantis Europos farmakopėjos 01/2011:1522 straipsniu, pagal nurodytą metodiką, kuri detaliai apibūdinta 2.4.3. skyriuje. [7] Visų penkių tiriamųjų mėginių metanoliniai ekstraktai buvo tiriami užnešant juos ant tos pačios silikagelio plokštelės kartu su ieškomų junginių standartų tirpalais. 6-gingerolis ir 6-šogaolis buvo identifikuoti visuose tiriamuosiuose mėginiuose, 3 ir 4 paveiksluose pavaizduoti chromatogramų pavyzdžiai. Naudojant aprašytą plonasluoksnės chromatografijos metodiką tikrųjų imbierų veikliųjų junginių nustatymui, tiriamųjų mėginių ekstraktai buvo analizuojami tris kartus.
3 pav. Apšvietimas prie 366 nm ilgio bangos: A - 6-šogaolio standartinis tirpalas, B – MP_1, C – MP_2, D – MP_3, E – MP_4, F – AVP_1, G – 6-gingerolio standartinis tirpalas.
Remiantis moksline literatūra ir kitų tyrėjų analizių duomenimis, buvo pasirinkta užfiksuoti plokštelių vaizdą ne tik prie 366 nm bangos ilgio šviesos, bet ir taikant apšvietimą baltoje šviesoje. (3,4 pav.) [14] Abiejose plokštelių nuotraukose matomos skirtingo ryškumo dėmės, tačiau jų aukštis labai panašus. Visuose tiriamuosiuose mėginiuose buvo nustatytas 6-gingerolis, kurio standartinio tirpalo sulaikymo rodiklis buvo 0,77 bei 6-šogaolis, kurio standartinis tirpalas parodė sulaikymo rodiklį ties 0,89.
4 pav. Apšvietimas baltoje šviesoje: A - 6-šogaolio standartinis tirpalas, B – MP_1, C – MP_2, D – MP_3, E – MP_4, F – AVP_1, G – 6-gingerolio standartinis tirpalas.
Sprendžiant iš dėmės ryškumo ir padėties daroma prielaida, kad E raide pažymėtame mėginyje tikrųjų imbierų šakniastiebių ekstraktas gali būti negrynas. Chromatogramose be 6-gingerolio ir 6-šogaolio išskirtų dėmių taip pat matomos neryškios ir neidentifikuotos dėmės, kurios galimai yra 8 - gingerolis, 10 - gingerolis arba 8 - šogaolis. [14]
Tiriamųjų junginių Rf reikšmės nustatytos vizualizatoriaus ir programinės įrangos
pagalba. Siekiant įvertinti pritaikyto metodo patikimumą, bandymai buvo atlikti tris kartus, apskaičiuotas sulaikymo laiko vidurkis (Rf), standartinis nuokrypis (SN) ir tapatybės rodiklis (Rs).
Gauti duomenys pateikti 4 lentelėje. [35,36]
4 lentelė. Tiriamųjų mėginių statistinės analizės rezultatai Tiriamasis mėginys 6-gingerolio Rf vidurkis 6-gingerolio SN 6-gingerolio Rs 6-šogaolio Rf vidurkis 6-šogaolio SN 6-šogaolio Rs MP_1 0,75 0,002 0,974 0,90 0,001 1,011 MP_2 0,75 0,001 0,974 0,90 0,001 1,011 MP_3 0,74 0,001 0,961 0,90 0,002 1,011 MP_4 0,73 0,002 0,948 0,90 0,002 1,011 AVP_1 0,76 0,001 0,987 0,91 0,001 1,022
Tiriamųjų mėginių sulaikymo laikai statistiškai reikšmingai nesiskiria nuo standartinių tirpalų sulaikymo laikų (p>0,05), tai patvirtina tapatybės rodiklis, kurio reikšmė artima vienetui įrodo, kad tiriamoji medžiaga yra tapati etaloninei medžiagai. Šios analizės metu tirtų mėginių atsikartojamumo paklaidos neviršija leistinos 0,05%, todėl pritaikytą plonasluoksnės
chromatografijos metodiką galime laikyti tinkama ir patikima komercinių imbiero produktų kokybinei analizei. [28]
3.2. Kokybinis 6-gingerolio ir 6-šogaolio nustatymas ESC metodu
Tyrimo Efektyviosios Skysčių chromatografijos metodu buvo siekiama kokybiškai įvertinti keturis maisto papildus ir vieną tradicinį vaistinį augalinį preparatą, kurie savo sudėtyje turi tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) šakniastiebių. Literatūros duomenimis, tikrųjų imbierų šakniastiebiuose didžioji dalis kaupiamų biologiškai aktyvių junginių yra gingeroliai ir 6-šogaoliai. Tikrųjų imbierų kokybė vertinama pagal šių fenolinių junginių sulaikymo laikus. Detekcija tiriamuosiuose mėginiuose buvo atlikta naudojant fotodiodų matricos detektorių esant 225 nm šviesos bangos ilgiui.
Smailių identifikavimas chromatogramose yra pagrįstas tiriamojo objekto smailės sulaikymo laiko ir spektro lyginimu su žinomų standartų sulaikymo laiku bei spektrais. 5 paveiksle pateiktos standartinių tirpalų sulaikymo smailės, kurios identifikuoja, kad 6-gingerolio standartinis tirpalas buvo sulaikytas ties 10,578 minute, o 6-šogaolio standartinio tirpalo sulaikymo laikas buvo 19,922 minutės.
5 pav. Standartinių tirpalų sulaikymo laikai: 1 – [6] - gingerolis, 2 – [6] – šogaolis
Visuose tiriamuosiuose maisto papilduose ir palyginamąjame augaliniame preparate buvo identifikuoti biologiškai aktyvūs tikrųjų imbierų šakniastiebių kaupiami junginiai: 6-gingerolis bei 6-šogaolis. 6-gingerolio sulaikymo laikai tiriamuosiuose metanoliniuose ekstraktuose varijavo nuo 10,866 iki 10,874 min, o 6-šogaolio sulaikymo laikai varijavo nuo 19,921 iki 19,934 minutės. Atitinkamai veiklieji junginiai buvo identifikuoti ir etanoliniuose
tiriamųjų mėginių ekstraktuose, kur 6-gingerolio sulaikymo laikai varijavo nuo 10,848 iki 10,856 minutės, o 6-šogaolio sulaikymo laikai varijavo nuo 19,898 iki 19,909 minutės. 6 paveiksle pateikiama vieno iš tiriamųjų maisto papildų (MP_1) chromatograma, gauta ištyrus paruoštą metanolinį ekstraktą. Ties smailėmis pažymimi veikliųjų junginių, rastų ekstrakte, sulaikymo laikai.
6 pav. MP_1 tiriamojo metanolinio ekstrakto chromatograma
6 paveiksle pateiktoje MP_1 tiriamojo metanolinio ekstrakto mėginio chromatogramoje matome, kad buvo kokybiškai identifikuoti abu veiklieji junginiai, 6- gingerolis buvo sulaikytas ties 10,874 min., o 6-šogaolio sulaikymo laikas buvo 19,934 min.
Kiti autoriai atlikę kokybinę maisto papildų, kurie savo sudėtyje turi tikrųjų imbierų šakniastiebių, analizę užfiksavo 6-gingerolio sulaikymo laiką ties 13,59 min. naudodami 280 nm bangos ilgį. 6-gingerolio standartinio tirpalo sulaikymo laikas šio tyrimo metu buvo 13,48 minutės, todėl lyginant tyrimo rezultatus su mūsų analizės metu gautais duomenimis matome, kad tiriamųjų mėginių ir standartinių tirpalų sulaikymo laikai taip pat buvo labai artimi vienas kitam. [15]
Palyginamąjame augaliniame vaistiniame preparate taip pat buvo identifikuoti abu veiklieji junginiai: 6-gingerolis ir 6-šogaolis. Gauta tiriamojo metanolinio ekstrakto chromatograma pateikiama 7 paveiksle.
7 pav. AVP_1 tiriamojo metanolinio ekstrakto chromatograma
Tradiciniame augaliniame vaistiniame preparate taip pat kaip ir visuose tiriamuosiuose maisto papilduose buvo identifikuoti du biologiškai aktyvūs tikrųjų imbierų šakniastiebių kaupiami junginiai. 6-gingerolis buvo sulaikytas ties 10,867 min., o 6-šogaolio sulaikymo laikas buvo 19,921 min. 6-šogaolio sulaikymo laikas šiuo atveju buvo artimesnis standartinio tirpalo sulaikymo laikui, nei 6-gingerolio paieškos atveju.
3.3. Kiekybinis 6-gingerolio ir 6-šogaolio įvertinimas ESC metodu
Kiekybinė dviejų pagrindinių biologiškai aktyvių tikrųjų imbierų (Z. officinale R.) šakniastiebių kaupiamų junginių (6-gingerolio ir 6-šogaolio) analizė buvo atliekama pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, detaliau aprašytą 2.4.4. skirsnyje. Nustatymui buvo naudojamas skysčių chromatografas su fotodiodų matricos detektoriumi, o duomenims apdoroti bei kiekybinei analizei atlikti pasirinkta programinė įranga Empower2. Analizė buvo atlikta su metanoliniu ir etanoliniu (naudotas 70 proc. etanolis) ekstraktais, kuriuose, remiantis kitų mokslininkų duomenimis, efektyviausiai išlaisvinamos veikliosios tikrųjų imbierų šakniastiebių kaupiamos veikliosios medžiagos ir gaunami geriausi rezultatai. Tyrimai buvo pakartoti po tris kartus, išvestas jų vidurkis ir apskaičiuotas standartinis nuokrypis. Kadangi tyrimų su metanoliniais ekstraktais literatūroje nėra daug, todėl šio eksperimento metu buvo siekiama palyginti koks kiekis 6-gingerolio bei 6-šogaolio gali būti identifikuotas etanoliniuose ir metanoliniuose tiriamųjų objektų ekstraktuose.
3.3.1. Kiekybinis 6-gingerolio nustatymas tiriamuosiuose mėginiuose
Kiekybiniam 6-gingerolio nustatymui naudoti tiriamųjų preparatų mėginiai, kurie buvo paruošti pagal 2.4.1. skirsnyje detaliai aprašytą metodiką. Gauti duomenys pavaizduoti 8 paveiksle.
8 pav. 6-gingerolio kiekis (mg/ml) metanoliniuose ir etanoliniuose tiriamųjų mėginių ekstraktuose
Kaip matome iš 8-ojo paveikslo, didžiausias 6-gingerolio kiekis nustatytas pirmuoju numeriu pažymėtame metanoliniame tiriamojo maisto papildo (MP_1) ekstrakte – (0,233±0,001 mg/ml) ir palyginamojo augalinio vaistinio preparato (AVP_1) metanoliniame ekstrakte – (0,498±0,001 mg/ml), o mažiausias 6-gingerolio kiekis nustatytas ketvirtuoju numeriu pažymėtame metanoliniame maisto papildo (MP_4) ekstrakte – (0,001±0,001 mg/ml). Tiriant šio maisto papildo etanolinį ekstraktą, 6-gingerolio nebuvo aptikta visiškai.
Lyginant gautus duomenis tarp dviejų tirpiklių pastebima tendencija, kad metanoliniuose tiriamųjų mėginių ekstraktuose išskirtas 6-gingerolio kiekis visais atvejais buvo statistiškai reikšmingai didesnis nei etanoliniuose ekstraktuose. Didžiausias skirtumas tarp 6-gingerolio kiekybinės išraiškos lyginant du analizei pasirinktus tirpiklius pastebėtas MP_3 mėginyje – etanolinio ekstrakto MP_3 mėginyje nustatytas 7.11 karto statistiškai reikšmingai mažesnis 6-gingerolio kiekis, nei metanoliniame to pačio tiriamojo objekto mėginyje. Lyginant gautus tyrimų rezultatus su kitų mokslininkų duomenimis buvo pastebėta, kad dažniausiai kaip
0,233 0,215 0,185 0,001 0,498 0,12 0,082 0,026 0 0,196 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 MP_1 MP_2 MP_3 MP_4 AVP_1 6-gi n gero lio k ie ki s, m g/ml Tiriamieji mėginiai Metanoliniai ekstraktai Etanoliniai ekstraktai
