LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
LAURA STANKEVIČIŪTĖ
NESTEROIDINIŲ VAISTŲ NUO UŽDEGIMO MIŠINIO TYRIMAS
TAIKANT CHROMATOGRAFINIUS ANALIZĖS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Lekt. dr. D. Kazlauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data
NESTEROIDINIŲ VAISTŲ NUO UŽDEGIMO MIŠINIO TYRIMAS
TAIKANT CHROMATOGRAFINIUS ANALIZĖS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. D. Kazlauskienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Laura Stankevičiūtė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SANTRUMPOS ... 8
SĄVOKOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Nesteroidinių vaistų nuo uždegimo (NVNU) suvartojimas Baltijos šalyse ir Australijoje ... 12
1.1.2. Lietuvoje ... 12
1.1.3. Latvijoje ... 13
1.1.4. Estijoje ... 14
1.1.5. Australijoje ... 15
2.1. NVNU apibūdinimas ir klasifikacija ... 16
2.2. NVNU veikimo mechanizmas ... 17
2.3. Nesteroidinių vaistų nuo uždegimo atstovai ... 18
2.3.1. Diklofenakas (Diclofenacum) ... 18
2.3.2. Ibuprofenas (Ibuprofenum) ... 18
2.3.3. Ketoprofenas (Ketoprofenum) ... 19
2.3.4. Naproksenas (Naproxenum) ... 19
2.4. Nesteroidinių vaistų nuo uždegimo poveikis ir indikacijos ... 20
2.5. Kontraindikacijos ir dozavimas ... 21
3. Plonasluoksnė chromatografija ... 21
4. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 23
5. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 24
5.1. Tyrimo objektas ir metodika ... 24
5.1.1. Tyrimo objektas ... 24
5.1.1.1. Kraujas ... 24
5.1.1.2. Plazmos mėginio paruošimas ... 24
5.1.2. Mišinio komponentų skirstymas ir identifikavimas, taikant plonasluoksnę chromatografiją (PC)...25
5.1.2.1. Įranga, tirpikliai ir ryškiklis ... 25
5.1.2.2. Etaloniniai tirpalai ... 26
5.1.2.3. Tiriamieji tirpalai ... 26
5.1.3. NVNU mišinio komponentų atskyrimas ir identifikavimas efektyviosios skysčių chromatografija (ESC) metodu ... 28 5.1.3.1. Įranga ir tirpikliai ... 28 5.1.3.2. Etaloniniai tirpalai ... 28 5.1.3.3. Tiriamieji tirpalai ... 28 5.1.3.4. Analizės eiga ... 29 5.2. Rezultatai ir jų aptarimas ... 30
5.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodo optimizavimas ... 30
5.2.1.1. Ryškiklio parinkimas ... 30
5.2.1.2. Eliuento parinkimas ... 31
5.2.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 32
5.2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo optimizavimas ... 35
5.2.3.1. Spektrinių duomenų įvertinimas ... 35
5.2.3.2. Kolonėlės parinkimas ... 37
5.2.3.3. Gradientinės sistemos ... 38
5.2.4. Vaistinių preparatų analizė taikant efektyviąją skysčių chromatografiją ... 40
5.2.5. Kiekybinis vaistinių preparatų nustatymas naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją ... 46
6. IŠVADOS ... 48
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 50
SANTRAUKA
NESTEROIDINIŲ VAISTŲ NUO UŽDEGIMO MIŠINIO TYRIMAS TAIKANT
CHROMATOGRAFINIUS ANALIZĖS METODUS
L. Stankevičiūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas lekt. dr. D. Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2015.
Darbo tikslas: Optimizuoti chromatografinius analizės metodus – plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos – diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno skirstymui iš biologinių terpių, bei vaistinių preparatų mišinių, jų identifikavimui ir kiekybiniam vertinimui.
Tyrimo objektas ir metodai: Optimizuojant plonasluoksnės chromatografijos metodiką, buvo analizuoti 0,2 mg/ml koncentracijos diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno metanoliniai tirpalai bei jų mišinys. Tirpiklių sistemos sudarytos iš: dichlormetano, etilo acetato, heksano, ledinės acto rūgšties ir acetono. Vaistinių veikliųjų medžiagų ryškinamas UV šviesa (254 nm). Optimizuotos metodikos buvo pritaikytos tiriant metanolinius vaistinių preparatų tirpalus, kurie pagaminti iš „Naklofen“, „Ibuprofen Lannacher“, „Ketonal forte“ ir „Nalgesin forte“ vaistinių preparatų, taip pat ši metodika pritaikyta vaistinių medžiagų išskyrimui iš kraujo plazmos.
Optimizuojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką tiriamųjų junginių analizei buvo tiriami 0,1 mg/ml koncentracijos metanoliniai diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno tirpalai ir jų mišiniai. Medžiagų atskyrimui ir identifikavimui buvo naudotas Waters 2695 chromatografas su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996. Chromatografinė eliucija sudaryta iš 0,5% acto rūgšties ir acetonitrilo. Optimizuota ESC metodika buvo pritaikyta tiriant metanolinius vaistinių preparatų tirpalus, pagamintus iš tokių pačių vaistinių preparatų, kaip ir plonasluoksnėje chromatografijoje.
Rezultatai: Sukurtos dvi optimaliausios tirpiklių sistemos diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio kokybiniam įvertinimui PC metodu – TS – 1 (dichlormetanas: etilo acetatas: heksanas: ledinė acto rūgštis (35:35:25:5)). TS – 2 (acetonas: dichlormetanas: etilo acetatas: heksanas: ledinė acto rūgštis (18:20:34:24:4)). Sukurta plazmos mėginio paruošimo metodika, kuri leidžia atskirti ir identifikuoti diklofenaką, ibuprofeną, ketoprofeną ir naprokseną.
Atliekant diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno, naprokseno ir jų mišinių kokybinį įvertinimą ESC metodu buvo naudotos dvi chromatografinės kolonėlės: ACE 3C –18 – PFP (150×3,0 mm), sorbento dalelių dydis 3µm ir ACE 5C18 (250×4,6 mm), sorbento dalelių dydis 5µm. Tėkmės greitis
naudojant ACE 3C –18 – PFP kolonėlę – 0,5 ml/min, naudojant ACE 5C18 tėkmės greitis – 1 ml/min. Tiriamojo tirpalo injekcijos tūris 10 µl. Vertinant spektrų duomenis pateiktus mokslinėje literatūroje su mūsų tirtomis standartinėmis medžiagomis, bei vaistiniais preparatais nustatytas medžiagų UV spektrų sutapimas [27].
Išvados: Abi tirpiklių sistemos, taikant plonasluoksnės chromatografijos metodiką, yra tinkamos tiriamųjų medžiagų mišinio kokybiniam įvertinimui ir jų nustatymui vaistiniuose preparatuose, kurią taip pat galima taikyti kraujo plazmos mėginių analizei. ESC metodika yra tinkama diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio kokybiniam ir kiekybiniam vertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose.
SUMARRY
CHROMATOGRAPHICAL ANALYSIS OF NON
–STEROIDAL ANTI
–INFLAMMATORY DRUGS MIXTURE
Laura Stankevičiūtė. Master's thesis/ Scientific supervisor lekt. dr. Daiva Kazlauskienė. Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and Toxicological Chemistry Departament. Kaunas, 2015.
Aim: To optimize chromatography analysis methods – thin – layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) methods for diclofenac, ibuprofen, ketoprofen and naproxen seperation from biological substances, their drugs mixtures, identification and quantitative evaluation.
Object and methods: For TLC method optimization: The NSAIDs mixture and their mixture stock solution 0,2 mg/ml in methanol were analysed. For the mobile phase, the following were used: dichlormethan, ethyl acetate, hexane, acetic acid and acetone. The UV light lamp (254 nm) was used for spot development. The optimized methods were tested with medicinal products: „Naklofen“, „Ibuprofen Lannacher“, „Ketonal forte“ and „Nalgesin forte“ to adapt and develop a methodology design for plasma sample analysis.
For HPLC method optimization: the NSAIDs and their mixture stock solutions 0,1 mg/ml in methanol were analysed. Chromatograph Waters 2695 with photo diode array detector Waters 996 were used for qualitative analysis. Analysis was made by using 0,5% acetic acid and acetonitrile solution. The optimized methods were applied using the same medicinal products used in TLC.
Results: The best mobile phases for the NSAIDs mixture for qualitative analysis using TLC is TS – 1 (dichlormethan: ethyl acetate: hexane: acetic acid (35:35:25:5)) and TS – 2 (acetone: dichlormethan: ethyl acetate: hexane: acetic acid (18:20:34:24:4)). Also plasma sample preparation methodology was developed, which lets to separate and idetify NSAIDs. The HPLC methodology for the NSAIDs mixtures was developed using two columns: ACE 3C–18–PFP (150×3,0 mm), were the particle size of the sorbent is 3µm and ACE 5C18 (250×4,6 mm), were the particle size of the sorbent is 5µm. The flow rate used was ACE 3C–18–PFP column – 1 ml/min, using ACE 5C18 column flow rate – 0,5 ml/min. Injection volume 10µl. The absorption of the NSAIDs in UV light were similar to the ones found in scientific literature [27].
Conclusion: Both mobile phases are suitable for examining substances using TLC qualitative analysis in the mixture and determining these substances in medicinal products and human plasma. Therefore, the HPLC methodology is more suitable for examining substances with qualitative and quantitative analysis in mixtures and determining them in medicinal products.
SANTRUMPOS
ESC (ang. HPLC) – efektyvioji skysčių chromatografija HPTLC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija
NVNU (ang. NSAIDs) – nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo PC (ang. TLC) – plonasluoksnė chromatografija
Rf – sulaikymo rodiklis
TAD – tirpiklių sistema, sudaryta iš chloroformo ir metanolio (90:10) TAE – tirpiklio sistema, sudaryta iš metanolio.
TAJ – tirpiklių sistema, sudaryta iš chloroformo ir etanolio (90:10)
TAK – tirpiklių sistema, sudaryta iš chloroformo, cikloheksano ir acto rūgšties (40:40:20) TAL – tirpiklių sistema, sudaryta iš chloroformo, metanolio ir propiono rūgšties (72:18:10) TD – tirpiklių sistema, sudaryta iš chloroformo ir acetono (80:20)
TE – tirpiklių sistema, sudaryta iš etilo acetato, metanolio ir stipraus amoniako tirpalo (85:10:5) TF – tirpiklio sistema, sudaryta iš etilo acetato.
TG – tirpiklių sistema, sudaryta iš etilo acetato, mentolio ir stipraus amoniako tirpalo (80:10:10) TS – tirpiklių sistema
SĄVOKOS
Ciklooksigenazė – fermentas, kuris yra žinomas kaip prostaglandinų – endoperoksidų sintetazė. Šis fermentas dalyvauja biologinių mediatorių prostanoidų (prostaglandinų, prostaciklinų, tromboksano) sintezėje. Fermento blokavimas mažina uždegimą ir skausmą.
Gradientinis eliuavimas – eliuavimo rėžimas, kai chromatografavimo eigoje kinta eliuento, tekančio per kolonėlę, sudėtis.
ĮVADAS
Klinikinėje praktikoje apsinuodijimas nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo (NVNU) yra labai dažnas reiškinys. Tai lemia visuomenėje vyraujanti nuomonė, jog šios grupės preparatų perdozuoti neįmanoma. Dėl šios priežasties jie vartojami ilgą laiką bei neracionaliomis dozėmis (NVNU suvartojimas nuo 2010 m. iki 2013 m. išaugo 5%) [8]. Dauguma nesteroidinių vaistų nuo uždegimo yra nereceptiniai, todėl šių vaistų suvartojimas Lietuvoje (2013 metais parduotų nereceptinių preparatų pakuočių kiekis siekė 40%) ir visame pasaulyje didėja kiekvienais metais [8]. Remiantis Lietuvos Respublikos Toksikologijos centro duomenimis apsinuodijimai šios vaistų grupės preparatais sudaro 3 % visų apsinuodijimų [6].
2010 metais Valstybinės Visuomenės Sveikatos Priežiūros Tarnybos prie Sveikatos apsaugos ministerijos (VVSPT) atliktais apsinuodijimų tyrimais nustatyta, kad apsinuodijimas medikamentais yra antroje vietoje po alkoholio. Moterys medikamentais apsinuodijo 1,8 karto dažniau nei vyrai, o nesaugus medikamentų laikymas lemia dažniausius vaikų apsinuodijimus [7].
Remiantis 2009 metų Amerikos apsinuodijimų kontrolės centro pateikta metine ataskaita, paaiškėjo, jog analgetikai yra dažniausia vaistų grupė, kuria perdozuoja suaugusieji (10%). Ši vaistų grupė yra viena iš pirmųjų, kuria perdozuoja ir vaikai (9%). Ibuprofenas yra vienas iš dažniausių NVNU, kuriuo žmonės apsinuodija – net 81%, tuo tarpu naproksenu – 11% žmonių. Ūminių apsinuodijimų NVNU protokoluose išvardinti dažniausi nepageidaujami reiškiniai: pykinimas, vėmimas ir epigastriumo diskomfortas yra dažniausi bei ryškiausi simptomai [14], [33], [30].
Iš 126 apsinuodijimų atvejų ibuprofenu, 19% asmenų pasireiškė lengvi virškinamojo trakto sutrikimai, įskaitant pykinimą, vėmimą, diarėją ir pilvo skausmus [20]. Vėlesni tyrimo rezultatai atskleidė, jog sutrikus rijimui dėl naprokseno [16], [22], [36] ar diklofenako [29], [33] vartojimo, atsiranda nedideli virškinamojo trakto sutrikimai [14].
Darbo tikslas: optimizuoti chromatografinės analizės metodus – plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos – diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno skirstymui iš biologinių terpių, bei vaistinių preparatų mišinių, jų identifikavimui ir kiekybiniam vertinimui.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: optimizuoti chromatografinius analizės metodus – plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos – diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno skirstymui iš biologinių terpių, bei vaistinių preparatų mišinių, jų identifikavimui ir kiekybiniam vertinimui.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti mokslinės literatūros, nagrinėjančios nesteroidinių vaistų nuo uždegimo farmakologines savybes ir chromatografinę šių vaistų analizę, apžvalgą.
2. Optimizuoti diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio komponentų atskyrimą ir identifikavimą plonasluoksnės chromatografijos metodu, sukurtą metodiką pritaikyti kraujo plazmos mėginio tyrimui.
3. Optimizuoti diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio komponentų atskyrimą ir identifikavimą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
4. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno kiekybiniam nustatymui.
1. LITERATŪROS
APŽVALGA
1.1. Nesteroidinių vaistų nuo uždegimo (NVNU) suvartojimas Baltijos
šalyse ir Australijoje
Dažniausia pasirinkimo priemonė skausmo malšinimui yra nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo, kurių suvartojimas Lietuvoje, bei kitose Baltijos šalyse yra didelis. Norint įvertinti kartu ir palyginti vaistų suvartojimą skirtingose šalyse, dažniausiai renkamasi ATC – DDD metodologiją. Ši metodologija leidžia įvertinti vaistų skyrimo bei suvartojimo tendencijas. Vaistų suvartojimas yra pateikiamas DDD (ang. Defined Daily Dose) – apibrėžta vidutinė terapinė paros dozė, kuri nusakoma skaičiumi, tenkančiu 1000-čiui gyventojų per dieną [1], [8], [37].
Remiantis VVKT (Valstybinė Vaistų Kontrolės Tarnyba) pateiktais duomenimis apie nesteroidinių priešuždegiminių ir prieš reumatinių vaistų (M01A) (remiantis ATC klasifikacija) suvartojimą Lietuvoje 2009 siekė 52,645 DDD/1000gyv./per dieną, o 2013 metais – 65,504 DDD/1000gyv./per dieną. Šios vaistų grupės suvartojimas 2009 – 2013 metais išaugo 19,63% [8].
1.1.2. Lietuvoje
Nesteroidinių priešuždegiminių ir prieš reumatinių vaistų (M01A – ATC klasifikacijos kodas) grupei priskiriami dar du pogrupiai: M01AB – acto rūgšties dariniai ir jiems artimos medžiagos (šios grupės atstovai: diklofenakas, diklofenako dariniai ir kt.), bei M01AE – propiono rūgšties darinių (šią grupę sudaro: ibuprofenas, naproksenas, ketoprofenas ir kt.) suvartojimas 2013 metais buvo 50,646 DDD/1000gyv./per dieną. Vertinant atskirai, konkrečių vaistų suvartojimą Lietuvoje 2013 metais, iš šių dviejų pogrupių populiariausi buvo diklofenakas – 21,132 DDD/1000gyv./per dieną ir ibuprofenas – 19,619 DDD/1000gyv./per dieną (1 lentelė) [8].
1 lentelė. Nesteroidinių priešuždegiminių ir prieš reumatinių vaistų suvartojimas Lietuvoje 2009 – 2013 metais (remiantis VVKT vaistų suvartojimo 2009 – 2013 m. ataskaita) [24].
ATC kodas
Pavadinimas
DDD /1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną 2009 metai 2010 metai 2011 Metai 2012 metai 2013 metai M01AB Acto rūgšties dariniai ir jiems artimos 24,985 23,610 23,944 25,883 26,921
medžiagos
M01AB01 Indometacinas (DDD 0,1 g)1 1,971 1,699 1,756 1,903 1,898 M01AB05 Diklofenakas (DDD 0,1 g)1 17,913 18,836 19,027 20,494 21,132 M01AB15 Ketorolakas (DDD 30 mg)1 2,496 2,347 2,427 2,604 2,588
M01AB16 Aceklofenakas (DDD 0,2 g)1 – – – 0,113 0,524
M01AB55 Diklofenakas, deriniai (DDD 0,1 g)1 2,605 0,728 0,734 0,769 0,779 M01AE Propiono rūgšties dariniai 17,336 18,793 23,096 22,363 23,725 M01AE01 Ibuprofenas (DDD 1,2 g)1 16,329 17,677 20,339 18,299 19,619 M01AE02 Naproksenas (DDD 0,5 g)1 0,000 – 1,234 1,951 1,789 M01AE03 Ketoprofenas (DDD 0,15 g)1 0,577 0,677 0,687 0,746 0,769 M01AE12 Oksaprozinas (DDD 0,9 g)1 0,077 0,011 – – – M01AE17 Deksketoprofenas (DDD 75 mg) 0,353 0,423 0,581 0,803 0,951 M01AE51 Ibuprofenas+Pseudoefedrinas – 0,005 0,003 – – M01AE52 Naproksenas+Ezomeprazolas (DDD 0,5 g)1 – – 0,252 0,564 0,597
Lietuvoje diklofenako vartojimas išaugo 8,05%. Vertinant ibuprofeno suvartojimą Lietuvos Respublikoje, jis sumažėjo 2012 metais, 10,03% lyginant su 2011 metais, kai šio NVNU suvartojimas buvo didžiausias – 20,339 DDD/1000gyv./per dieną [1].
Lietuvos Respublikoje ketoprofeno suvartojimas padidėjo mažiausiai – tik 9,33%. Tuo tarpu naprokseno suvartojimas Lietuvoje, pradėtas fiksuoti tik 2011 metais. Nuo 2011 m. iki 2012 metų šio vaisto vartojimas išaugo 36,92%. [1].
1.1.3. Latvijoje
Norint įvertinti NVNU suvartojimą kitose šalyse, t.y. Latvijoje ir Estijoje 2010 – 2012 metais, jų populiarumas bei suvartojimo tendencijos aprašytos Baltijos šalių vaistų suvartojimo ataskaitoje.
Diklofenako suvartojimas Baltijos šalyse per trejus metus skiriasi. Daugiausiai diklofenako preparatų suvartoja Latvija. Šio NVNU suvartojimas, lyginant 2010 – 2012 metus, išaugo nuo 21,48 DDD/1000gyv./per dieną iki 23,85DDD/1000gyv./per dieną, t.y. 9,93% [1]. Ibuprofenas, antras pagal populiarumą ir pasirinkimą vaistas, skausmo malšinimui. Didžiausias šio NVNU suvartojimas pastebėtas Latvijoje. Latvijoje 2012 metais, ibuprofeno preparatų suvartojimas siekė 19,30 DDD/1000gyv./per dieną, t.y. 19,69% daugiau nei buvo suvartojama 2010 metais (15,50 DDD/1000gyv./per dieną) [1].
2010 – 2012 metais Latvijoje ketoprofeno suvartojimas išaugo nuo 0,20 DDD/1000gyv./per dieną iki 0,29 DDD/1000gyv./per dieną, tai sudaro 31,03%, o naproksenas visai nevartojamas [1].
1.1.4. Estijoje
Estijoje diklofenako suvartojimas per trejus metus visiškai nesikeitė. 2010 metais ibuprofeno suvartojimas šioje šalyje siekė 20,55 DDD/1000gyv./per dieną, tuo tarpu 2012 metais siekė 23,38 DDD/1000gyv./per dieną (12,10%) [1].
Vertinant naprokseną Estijoje, šio vaisto suvartojimas išaugo nuo 0,01 DDD/1000gyv./per dieną (2010 metais) iki 0,43 DDD/1000gyv./per dieną (2012 metais), t.y. 97,67%. Nuo 2010 m. iki 2012 m. ketoprofeno vartojimas padidėjo 20%, todėl Estija užima antrąją vietą tarp Baltijos šalių vartojančių šį NVNU [1].
Remiantis tuo pačiu VVKT pateiktu dokumentu, kuriame pateikta statistika apie vaistų suvartojimą Baltijos šalyse 2010 – 2012 metais, buvo sudaryta TOP 15 daugiausiai išrašomų receptinių vaistų (1 diagrama). Diklofenako išrašymas Estijoje, Latvijoje ir Lietuvoje labai skiriasi. Estijoje – tarp TOP 15 labiausiai išrašomų receptinių vaistų, diklofenakas yra dvyliktoje vietoje, Latvijoje– jis siekia net trečiąją vietą, o Lietuvoje – penktą [1].
1 diagrama. TOP 15 daugiausiai išrašomų receptinių vaistų- diklofenako suvartojimas Baltijos šalyse (Šaltinis: Baltijos šalių (Estija, Latvija, Lietuva) vaistų suvartojimo statistika 2010 -
2012 metais) [1].
Tarp TOP 15 parduodamų nereceptinių vaistų (2 diagrama) ibuprofenas, užima panašias pozicijas tarp visų Baltijos šalių (pasaulio rinkoje pagal suvartojimą ibuprofenas užima trečiąją vietą
Estija 34% (13,12 DDD/1000/ per dieną) Latvija 62% (23,85 DDD/1000/ per dieną) Lietuva 4% (20,49 DDD/1000/ per dieną)
Diklofenakas
[31]). Estijoje kaip ir Lietuvoje jis yra trečioje vietoje, Latvijoje šio vaisto parduodama žymiai daugiau, todėl jis užima antrąją vietą [1].
2 diagrama. TOP 15 daugiausiai parduodamų nereceptinių vaistų – ibuprofeno suvartojimas Baltijos šalyse. (Šaltinis: Baltijos šalių (Estija, Latvija, Lietuva) vaistų suvartojimo
statistika 2010– 2012 metais) [1].
Įvertinus visų trijų Baltijos šalių NVNU suvartojimą, matome, kad dažniausiai šių šalių vartotojai renkasi ibuprofeną, diklofenaką. Galime teigti, jog Estijoje populiariausias vaistas nuo skausmo yra ibuprofenas, diklofenako ir naproksenas, kombinacijos su kitais šios grupės vaistais yra labai mažai pasirenkami. Latvijoje plačiausiai vartojamas vaistas – diklofenakas, mažiau populiarus yra ketoprofenas, o naproksenas – nevartojamas. Lietuvoje dažniausiai pirmo pasirinkimo vaistas skausmui malšinti yra diklofenakas ir diklofenako kombinacijos, mažiausiai vartojamas ketoprofenas [1].
1.1.5. Australijoje
2005 – 2006 metais Australijoje buvo užfiksuoti 6358 netyčiniai apsinuodijimo vaistais atvejai. Visi pacientai, kurie netyčia apsinuodijo vaistais buvo hospitalizuoti. Iš visų apsinuodijusiųjų didesnė dalis buvo moterys – 3441, vyrų buvo mažiau – 2917 [25].
43% (19,71 DDD/1000/per dieną) 41% (18,45 DDD/1000/per dieną) 16% (7,42 DDD/1000/ per dieną)
Ibuprofenas
Iš visų netyčinių apsinuodijimo atvejų net 1/5 sudaro 0 – 4 metų vaikai, dar 3% sudaro vaikai 5 – 14 metų amžiaus. Berniukai sudaro didesnę dalį iš visų vaikų apsinuodijimo atvejų, nei mergaitės. Kiekvienais metais yra hospitalizuojama daugiau nei 63% iš 4770 vaikų apsinuodijimo vaistais atvejų. Rizika vaikui apsinuodyti vaistais yra mažesnė, kai vaikas yra 5 – 12 metų amžiaus, vėliau galimybė apsinuodyti didėja [25].
Dažniausi netyčiniai apsinuodijimai įvyksta vartojant raminamuosius preparatus (17% iš 1053 atvejų). Antroje vietoje yra skausmą mažinantys vaistai (16%, 1048 atvejai) iš jų apsinuodijimas paracetamoliu sudaro 12%, 760 atvejų, o nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo, pvz.: ibuprofenas, diklofenakas, sudaro 3%, 204 atvejus [25].
Tyčinių apsinuodijimų atveju dažniausios vaistų grupės, kurias renkasi žmonės yra vaistai parkinsono ligai, epilepsijai gydyti, raminamieji ir psichotropiniai vaistai, jei sudaro 46% visų apsinuodijimo atvejų. Antroje vietoje, kaip ir netyčinių apsinuodijimų atveju yra skausmą mažinantys vaistai, jie sudaro 19% [25].
Išanalizavus Lietuvos ir Australijos NVNU suvartojimą ir apsinuodijimų galimybę, abiejose šalyse netyčiniai apsinuodijimai šios grupės vaistais sudaro 3% [6], [25].
2.1. NVNU apibūdinimas ir klasifikacija
Dauguma nesteroidinių vaistų nuo uždegimo yra silpnai rūgštinės organinės medžiagos (išskyrus selektyvius ciklooksigenazės (COX-2) inhibitorius tokius kaip celekoksibas, kuris yra nerūgštinis heterociklinis darinys). NVNU dėl savo analgetinio ir antipiretinio poveikio gali būti priskiriami nenarkotinių analgetikų grupei. Vienos ir bendros klasifikacijos, kaip galėtumėme suskirstyti visus nesteroidinius vaistus nuo uždegimo – nėra. Tačiau labiausiai paplitusi klasifikacija yra kai NVNU sugrupuojame pagal cheminę sudėtį arba selektyvumą ciklooksigenazėms.
Klasifikacija pagal cheminę sudėtį remiasi tuo, jog kiekvieną konkretų NVNU vaistą priskiriame prie konkretaus organinio junginio darinio. Salicilo rūgšties darinių atstovas yra acetilsalicilo rūgštis. Antroji cheminė grupė yra 5–pirazolo dariniai, šios grupės atstovas fenilbutazonas. Arilacto rūgšties dariniai skirstomi į tris pogrupius: fenilacto rūgšties darinius (atstovas – diklofenakas [9], [35]), fenilmetilacto rūgšties darinius (atstovai yra trys: ibuprofenas, ketoprofenas, naproksenas) ir heteroarilacto rūgšties dariniai (šio pogrupio atstovai yra indometacinas, oksaprozinas, ketorolakas). Dar viena išskiriama cheminė grupė yra fenamatai ir šios grupės atstovai tolfenamo rūgštis ir niflumo rūgštis. Oksikamų cheminę grupę sudaro keletas atstovų: meloksikamas, piroksikamas bei lornoksikamas. Paskutinės cheminės grupės, kurias galima išskirti yra kiti rūgštiniai dariniai (nimesulidas) ir nerūgštiniai heterociklai (celekoksibas, etorikoksibas ir nabumetonas) [2].
Tačiau aktualesnė klasifikacija remiasi selektyvumu ciklooksigenazėms. Šios klasifikacijos esmė, jog NVNU suskirstomi pagal tai, kuri ciklooksigenazė yra slopinama (tai lemia dažniausią nepageidaujamų poveikių pasireiškimą) [2].
Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo gali būti selektyvūs COX– 1 (COX– 2 neslopinama arba slopinama labai mažai), šiai grupei priskiriamos mažos acetilsalicilo dozės (50 – 100 mg). Iš dalies selektyvių COX– 2 inhibitorių (stipriau slopina COX– 2 nei COX– 1) grupei priklauso meloksikamas, piroksikamas, nimesulidas. Selektyvių COX– 2 inhibitorių grupei (COX– 1 neslopinamas arba slopinamas labai silpnai) priklauso refekoksibas, valdekoksibas, celekoksibas. Dar viena grupė, kuri yra išskiriama pagal selektyvumą COX inhibitoriams yra neselektyvūs COX inhibitoriai, jie panašiai slopina tiek COX– 1, tiek COX– 2. Šios grupės atstovai yra ibuprofenas ir diklofenakas [2].
2.2. NVNU veikimo mechanizmas
Veikimo mechanizmas aiškinamas ir remiasi ciklooksigenazės slopinimu. Yra žinomos trys ciklooksigenazės tipai: COX– 1 ir COX– 2 (kurie yra periferinių audinių fermentai) ir COX– 3 (tai nervų sistemos fermentas). COX– 1 fermentas yra labai svarbus organizmo funkcionavimui, kadangi palaiko optimalią inkstų perfuziją, skatina virškinamojo trakto gleivinę apsaugančių gleivių gamybą, adekvačią trombocitų agregaciją (t.y. prilipimą vienam prie kito). O COX– 2 fermentas aktyvuojamas tik audinių pažaidos metu. Pirmiausia yra išaktyvuojamas COX fermentas tuomet pasireiškia arachidono rūgšties slopinimas ir virtimas cikliniais endoperoksidais, PGG2, PGH2, iš ciklinių
endoperoksidų vėliau susidaro prostaglandinai: PGE1, PGE2, PGF2 ir PGD2, dviejų tipų tromboksanai
(TxA2 ir TxB2) bei prostaciklinas PGI2 [23].
Dviejų potipių prostaglandinai (E ir F) gali sukelti tiek vietinius ir sisteminius uždegimo požymius, tokius kaip temperatūros pakilimas, kraujagyslių išsiplėtimas, padidėjęs kraujagyslių sienelių pralaidumas, skausmas ir patinimas bei suintensyvėjusi leukocitų migracija [23].
2.3. Nesteroidinių vaistų nuo uždegimo atstovai
2.3.1. Diklofenakas (Diclofenacum)
1 pav. [5]
IUPAC pavadinimas – 2–[(2,6–dichlorfenil)amino]fenilacto rūgštis (fenilacto rūgšties darinys).
ATC kodas – M01AB05, diklofenako kombinacijos- M01AB55 [37].
Savybės – tai balti arba gelsvi kristaliniai milteliai, vidutiniškai tirpstantys vandenyje, lengvai tirpūs metanolyje, etanolyje, tačiau netirpsta eteryje, mažai tirpūs acetone. Kalio druska gerai tirpsta vandenyje.
Farmacinė forma – gali būti kapsulės, prailginto veikimo kapsulės, dengtos, prailginto veikimo, prailginto veikimo dengtos tabletės arba žvakutės, injekciniai tirpalai [15].
Firminiai pavadinimai – Cataflam; Diclac; Dicloberl; Diclofenac– ratiopharm; Diclomax; Diclomelan; Feloran; Feloran; Inflamac; Naclofen; Olfen; Voltaren; Diclovit [4]. Yra ir generinių diklofenako kombinacijų (jų žinoma daugiau nei 1047) su kitais vaistais, pvz.: paracetamoliu – Panoxen, Diclotop, Dicimol ir kiti, tačiau jie Lietuvoje neregistruoti [26].
2.3.2.
Ibuprofenas (Ibuprofenum)
2 pav. [5]
IUPAC pavadinimas – α–metil–4–(2–metilpropil)fenilacto rūgštis (fenilmetilacto rūgšties dariniai).
Savybės – bespalviai kristalai ar balti kristaliniai milteliai, kristalai ar milteliai yra netirpūs vandenyje, tačiau lengvai tirpūs metanolyje, acetone, eteryje, metileno chloride. Preparatai tirpūs karbonatų tirpaluose bei praskiestuose šarminių metalų hidroksidų tirpaluose. Milteliams ir kristalams būdingas silpnai kartokas skonis.
Farmacinė forma – geriamoji suspensija, tabletės, dengtos tabletės [15].
Firminiai pavadinimai – Brufen; Finalflex; Ibufen; Ibumax; Ibumetin; Ibuprofen; Ibuprofen– Grindeks; Ibuprofen – Lannacher; Ibuprofen VVB; Ibuprom; Irfen; Nurofen; Pfeil [4].
2.3.3. Ketoprofenas (Ketoprofenum)
3 pav. [5]
IUPAC pavadinimas – 3–benzoil–α–metilbenzilacto rūgštis (fenilmetilacto rūgšties darinys). ATC kodas – M01AE03 [37].
Savybės – balti arba beveik balti kristaliniai milteliai, kurie yra netirpūs vandenyje, tačiau gerai tirpsta metileno chloride, acetone, etanolyje.
Farmacinė forma – injekciniai tirpalai, žvakutės, kapsulės, prolanguoto veikimo kapsulės, tabletės, prolanguoto veikimo tabletės, dengtos tabletės, aerozoliai arba gelis [15].
Firminiai pavadinimai – Begsan; Fastum; Keto; Ketonal; Ketoprofen Sopharma; Ketorpray; Spinax [4].
2.3.4. Naproksenas (Naproxenum)
4 pav. [5]
IUPAC pavadinimas – (S)–6–metoksi–α–metil–2–naftilacto rūgštis (fenilmetilacto rūgšties darinys).
Savybės – naproksenas yra balti kristaliniai milteliai gerai tirpūs etanolyje ir metanolyje, tačiau netirpūs vandenyje ir vidutiniškai tirpūs eteryje.
Farmacinė forma – tabletės, dengtos tabletės, žvakutės, gelis [15].
Firminiai pavadinimai – Emox; Momendol; Nalgesin; Naprosyn; Vimovo [4].
2.4. Nesteroidinių vaistų nuo uždegimo poveikis ir indikacijos
Visi nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo pasižymi trimis pagrindiniais farmakologiniais poveikiais: mažina uždegimą, skausmą ir karščiavimą. Tačiau ne visų NVNU farmakologinis poveikis yra vienodai stiprus [23].
Diklofenakas – vartojamas uždegimo ir skausmo slopinimui, tačiau pasižymi ir tuo, jog kaupiasi sąnariniame skystyje. Taip pat vartojamas šlapimtakių dieglių, podagros priepuolių sukeltam skausmui bei pooperaciniam skausmui mažinti. Gali sukelti opas, pasižymi neigiamu poveikiu skrandžio ir dvylikapirštės žarnos gleivinei [3], [23].
Ibuprofeno pagrindinis poveikis, kaip ir daugelio NVNU, yra skausmo malšinimas, uždegimo ir karščiavimo mažinimas. Ibuprofenas pasižymi tuo, kad sukelia mažiau nepageidaujamų reakcijų ir silpniau slopina uždegimą nei kiti NVNU. Šis NVNU vartojamas skausmui malšinti bei uždegimui, sukeltam reumatinės ligos (įskaitant ir jaunatvinį reumatoidinį artritą) ar kitokiam kaulų ir raumenų sistemos uždegimui, gydymui. Taip pat silpnam ar vidutiniam skausmui, dismenorėjai, pooperaciniam, migrenos sukeltam skausmui, dantų skausmui malšinti. Ibuprofenas gali būti skiriamas slopinti karščiavimui po imunizacijos ar vaikų karščiavimo sukeltam skausmui mažinti [3], [12], [13], [23], [32].
Ketoprofeno pagrindinis poveikis yra skausmo malšinimas, karščiavimo ir uždegimo slopinimas. Ketoprofeną skiria pacientams, kurie skundžiasi skausmu ir uždegimu dėl reumatinės ligos ar kitokio raumenų ir kaulų pažeidimo, taip pat po ortopedinių operacijų, dismenorėjos ar podagros priepuolių [3], [23].
Naproksenas – nesteroidinis vaistas nuo uždegimo, vartojamas osteoartrito, reumatoidinio artrito, psoriazinio artrito2, menstruacinių skausmų mažinimui [28]. Naproksenas išsiskiria tuo, jog sukelia nedaug nepageidaujamų reakcijų (tačiau daugiau nei ibuprofenas) [3], [23].
2Psoriazinis artritas – lėtinė, uždegiminė liga, kuri apibūdinama, kaip artritas ir psoriazė kartu, ši liga
gali sukelti sunkius paciento fizinių funkcijų sutrikimus bei sutrikdo normalią gyvenimo kokybę [18], [19], [24].
2.5. Kontraindikacijos ir dozavimas
Diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno vartoti negalima, esant padidėjusiam jautrumui veikliajai ar bet kuriai kitai pagalbinei medžiagai. Jei pacientas serga astma, ūminiu rinitu, nosyje yra polipų ar esant angioneurozinei edemai, dilgėlinei ar kitokiai alerginei reakcijai, sukeltai NVNU ar acetilsalicilo rūgšties. Šių vaistų vartoti negalima, jei pacientui buvo pasireiškusi pepsinė opa. Taip pat esant ar buvus kraujavimui iš virškinamojo trakto, kai kraujavimas susijęs su NVNU vartojimu. Sunkaus inkstų ar kepenų nepakankamumo atveju šių preparatų vartojimas yra draudžiamas. Diklofenako negalima skirti pacientams, sergantiems bronchine astma, kartu su antikoaguliantais ar jei įtariamas hemoraginis smegenų insultas.
Diklofenako optimali paros dozė suaugusiems yra 100 mg. Po valgio vartojama per os po 50 – 150 mg per parą, išgeriant šitą dozę per 2 – 3 kartus. Jei diklofenakas vartojamas paūmėjusiam ar po operaciniam skausmui malšinti vartojama po 75 mg, 1 kartą per parą (jei reikia – 2 kartus) ne ilgiau kaip 2 dienas. Gydant jaunatvinį reumatoidinį artritą (6 – 12 metų asmenims) – 1 – 2 mg/kg, tačiau negalima viršyti 150 mg per parą, vartoti galima ne ilgiau kaip 4 dienas [3].
Ibuprofenas, kaip ir diklofenakas, vartojamas po valgio per os. Iš pradžių vartojamas po 300 – 400 mg 3 – 4 kartus per parą, esant reikalui, reikia didinti dozę iki 2,4 g per parą, o vėliau palaikomajam gydymui gali pakakti 0,6 – 1,2 g per parą. Gydant reumatines ligas, įskaitant jaunatvinį reumatoidinį artritą, vaikams nuo 3 mėn. iki 18 metų (kūno svoris >5 kg) skiriama 30 – 40 mg/kg, bet ne daugiau kaip 2,4 g per parą, vartojant per 3 – 4 kartus [3].
Ketoprofenas taip pat skiriamas suaugusiems per os, po valgio. Reumatinėms ligoms gydyti skiriama po 100–200 mg per parą per 2–4 kartus. Didžiausia paros dozė yra 200 mg [3].
Naproksenas, kaip ir kiti NVNU, suaugusiems skiriami per os, po valgio. Skausmo, reumatinių ligų sukelto uždegimo gydymui skiriama po 0,5 – 1 g per parą, vartojant 1 – 2 kartus. Gydant jaunatvinį reumatoidinį artritą, 2 – 18 metų jaunuoliams skiriama po 5 – 7,5 mg/ kg 2 kartus per parą; didžiausia paros dozė – 1 g. Naproksenas nerekomenduojamas gydant podagros priepuolius [3].
3. Plonasluoksnė chromatografija
Terminą „plonasluoksnė chromatografija“ 1950 m. sukūrė Egon‘as Stahl‘is Vokietijoje. Plonasluoksnė chromatografija (PC) (ang. Thin layer chromatography (TLC)) tradiciškai yra laikoma paprasčiausiu, greičiausiu ir pigiausiu tyrimo metodu medžiagų atskyrimui ir identifikavimui. Nepaisant to, kad PC plačiai naudojama visame pasaulyje daugiau nei 40 metų, metodas dažnai
nebuvo laikomas labai efektyviu. Plonasluoksnės chromatografijos metodą galima naudoti vaistinių medžiagų identifikavimui biologiniuose skysčiuose, junginių valymui ar priemaišų nustatymui. Judančioji fazė plonasluoksnėje chromatografijoje yra skystis, o nejudančioji fazė (sorbento sluoksnis) yra užnešta ant plokštelės. Dažniausiai naudojamos plokštelės yra pagamintos iš plastiko, aliuminio ar stiklo, jos yra padengtos plonu (0,15 – 0,25 mm) sorbento sluoksniu [17].
Atliekant analizę plonasluoksnės chromatografijos metodu, pirmiausia yra paruošiamas mėginys. Medžiaga yra ištirpinama atitinkamame tirpiklyje, po to mikrokapiliaro ar automatinio užpurškimo pagalba yra užnešama ant chromatografinės plokštelės. Paruošta chromatografinė plokštelė yra išdžiovinama ir patalpinama į chromatografinę kamerą, kuri prieš tai yra užpildoma pasirinkta tirpiklių sistema (užpildoma apie 1,5 – 2 cm storio sluoksniu ir paliekama, kad kamera prisisotintų tirpiklių garais). Eliuentas, kuris iškelia tiriamąsias medžiagas, kyla chromatografine plokštele, veikiamas adsorbcijos. Medžiagų identifikavimas galimas dėl skirtingo tiriamųjų medžiagų afiniteto sorbentui. Tiriamųjų medžiagų dėmių ryškinimui galima taikyti skirtingus metodus, t.y. naudoti cheminius ryškinimo reagentus arba ultravioletinę (UV) spinduliuotę [17].
Vaistų išskyrimui yra taikomos įvairios tirpiklių sistemos, kurių dėka iš mišinio galime išskirti atskirus komponentus. Yra žinomos įvairios sistemos, kai kurios sistemos pateikiamos Clarke‘s „Analysis of drugs and poisons“ žinyne. Visų sistemų atveju, tiriamosios medžiagos yra užneštos ant 250 µm storio silikagelio plokštelės. Tam pačiam vaistui yra sukurtos kelios tirpiklių sistemos (2 lentelė):
2 lentelė. „Clarke‘s Analysis of drugs and poisons“ naudotos tirpiklių sistemos. [27]
Vaistas SISTEMA
TD TE TF TG TAD TAE TAJ TAK TAL
Diklofenakas 25 12 27 29 47 90 40 64 84
Ibuprofenas 46 6 57 18 54 75 59 76 93
Naproksenas 33 6 38 14 44 82 60 75 93
Ketoprofenas 27 6 25 14 41 85 54 82 98
Europos Farmakopėjoje (7–tasis leidimas) pateiktos tirpiklių sistemos yra individualios kiekvienam junginiui. Diklofenako nustatymui plonasluoksnės chromatografijos metodikoje, judančioji fazė susideda iš: amoniako, metanolio ir etilo acetato (10:10:80). Ibuprofeno judančioji fazė susidaro iš bevandenės acto rūgšties sumaišytos su metilo acetatu ir heksanu (5:24:71). Tiriant ketoprofeną, judančiosios fazės sudėtis yra: ledinė acto rūgštis, metileno chloridas ir acetonas (1:49:50) [15].
Iš pateiktų duomenų matome, kad dauguma judančiosios fazės sistemų, nėra tinkamos diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio išskyrimui. Dažniausios šios medžiagos negali būti atskirtos dėl Rf reikšmių, kurios yra artimos viena kitai. Taip pat nėra sukurtos tirpiklių
sistemos, kuri būtų tinkama nesteroidinių vaistų nuo uždegimo atskyrimui [15].
Analizuojant literatūros šaltiniuose pateiktus duomenis, nepavyko surasti vienos sistemos, kuri būtų tinkama pasirinkto NVNU mišinio (diklofenakas, ibuprofenas, ketoprofenas, naproksenas) kokybinei analizei atlikti, dėl to judančiosios fazės sistemos sudėtis ieškoma eksperimentiniu būdu.
4. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) (angl. High- performance liquid chromatography (HPLC)) – tai kolonėlinė skysčių chromatografija, kuri išsiskiria labai dideliu efektyvumu bei analizės greičiu. ESC yra vienas iš dažniausiai ir plačiausiai taikomų chromatografijos metodų norint kiekybiškai ir kokybiškai įvertinti medžiagas. Šis metodas dažnai taikomas toksikologijos, farmacijos, biotechnologijos bei kitose srityse [35].
Nuo įprastinės kolonėlinės skysčių chromatografijos, efektyvioji skysčių chromatografija skiriasi tuo, jog naudojamos trumpos (~5 – 25 cm) bei siauro (~ 2 – 6 mm) skersmens kolonėlės. Plieno kolonėlės yra pripildytos (~ 3 – 5 µm) nejudančiosios fazės granulių. Dėl sorbento dalelių mažo skersmens susidaro hidrodinaminis slėgis, kuriam įveikti naudojami aukšto slėgio siurbliai (0,5 – 40 MPa). Šie siurbliai leidžia įvykdyti greitą tiriamųjų medžiagų analizę. Lyginant įprastinę stiklo kolonėlę su ESC kolonėle, ši pasižymi didesniu linijiniu judančiosios fazės greičiu (didesnis apie 100 kartų), dėl to sutrumpėja medžiagų analizės trukmė ir greitėja skirstymas [35].
Chromatografinis skirstymas yra pagrįstas analičių plovimu per nejudančiosios fazės poras. Rezervuaras yra pripildytas judančiosios fazės, kuri slėgio siurblio pagalba, eliuentas yra varoma į kolonėlę. Kaip sorbentas dažniausiai naudojamas silikagelis. Kartu su eliuentu yra tiekiamas ir analizuojamasis mišinys. Mišinio komponentai iš kolonėlės yra išplaunami skirtingu laiku, tai priklauso nuo jų afiniteto sorbentui. Medžiagų atskyrimui gali būti taikomi įvairūs mechanizmai, tokie kaip: ekskliuzija, jonų mainai, pasiskirstymas ar kiti. Kuo silpniau sorbentas adsorbuoja analitę, tuo greičiau ji yra išplaunama iš kolonėlės. Detektoriaus pagalba išplauta medžiaga yra užfiksuojama kaip signalas, o šis kompiuterinės sistemos pagalba yra paverčiamas į signalo stiprumo priklausomybę nuo laiko grafiką, t.y. chromatogramą [35].
5. EKSPERIMENTINĖ DALIS
5.1. Tyrimo objektas ir metodika
5.1.1. Tyrimo objektas
5.1.1.1. Kraujas
Atlikti eksperimentai su kraujo plazma. Naudoti kraujo mėginiai be donoro identifikavimo ženklų. Jie gauti iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Kraujo centro (Bioetikos centro pritarimas Nr. BEC – FF – 342, 1 priedas). Kraujo plazma buvo išskirta iš kraujo mėginių centrifugavimo būdu.
5.1.1.2. Plazmos mėginio paruošimas
Kraujo mėginiai buvo centrifuguojami 6000 apsisukimų per minutę greičiu 10 minučių (naudojant Centurion Scientifie C 2 series centrifugatorių). Centrifuguojant kraujo mėginius, kraujo forminiai elementai nusodinami mėgintuvėlio apačioje, o kraujo plazma – mėgintuvėlio viršuje. Nuo mėgintuvėlio viršaus, į atskirą, švarų indą surenkama kraujo plazma (tyrimui naudojama ir surenkama tik skaidri, nuo švelniai gelsvos spalvos iki švelnaus gintarinio atspalvio, plazma). Skirtingų mėginių kraujo plazma buvo sumaišyta viename inde ir saugota šaldytuve +4o
C temperatūroje.
Išnagrinėtuose literatūros šaltiniuose buvo nurodyta, jog maksimalios laisvų, t.y. prie plazmos baltymų neprisijungusių, vaistinių preparatų koncentracijos kraujo plazmoje po vienkartinės arba paros dozės suvartojimo yra tokios: ketoprofeno 10,4 µg/ml (praėjus 4 valandoms), naprokseno 23 – 49 μg/ml (praėjus 1 – 2 valandoms), ibuprofeno 25 – 35 µg/ml (praėjus 2 valandoms), o diklofenako – 1,5 µg/ml (praėjus 2 valandoms). Literatūroje nurodyta, kad net 99,5 % naprokseno [3], 99 % diklofenako [11] bei ketoprofeno [3] ir 90 % ibuprofeno [32] rišasi su kraujo plazmos baltymais.
Atsižvelgus į literatūroje pateiktus laisvų ir susijungusių su plazmos baltymais medžiagų kiekius, buvo paruošti metanoliniai vaistinių medžiagų tirpalai: diklofenako 150 µg/ml (D), ibuprofeno 150 µg/ml (I), ketoprofeno 150 µg/ml (K), naprokseno 150 µg/ml (N).
Visų pirma, ruošiant plazmos mėginį 1,5 ml talpos mėgintuvėlyje iki sauso likučio buvo išdžiovinta 20 µl D, 20 µl I, 20 µl K ir 20 µl N tirpalų (naudojant azoto srovę). Gautas sausasis likutis ištirpinamas 250 µl kraujo plazmoje, tuo pat metu maišant vibracine maišykle. Pagamintas
vaistinių preparatų tirpalas kraujo plazmoje buvo laikomas kambario temperatūroje 30 minučių. Praėjus 30 minučių, kraujo plazmos mėginiai buvo užšaldyti esant –8 °C temperatūrai (30 minučių). Po to atšildyti mėginiai išmaišyti naudojant vibracinę maišyklę. Šis metodas, kai plazma yra užšaldoma ir atšildoma padeda nusodinti dalį plazmos baltymų.
Ekstrakcija iš plazmos vykdoma naudojant organinį tirpiklį – dietileterį. Ant jau paruoštų plazmos mėginių (250 µl) užpilta po 1,25 ml dietileterio (plazmos ir ekstrahento santykis 1:5). Ekstrahavimas trunka 1 minutę maišymui naudojant vibracinę maišyklę. Po ekstrakcijos mėgintuvėliai buvo centrifuguojami 10 minučių, 4000 apsisukimų per minutę greičiu. Centrifugavimo metu plazma bei kitos dalelės nusėda mėgintuvėlių apačioje, o dietileterio sluoksnis lieka viršuje. Atlikus centrifugavimą, organinio tirpiklio sluoksnis buvo atsargiai atskiriamas į švarius indus ir išgarinamas iki sauso likučio, naudojant azoto srovę. Tuomet sausas likutis maišant ištirpinamas 1,5 ml metanolio ir laikomas kambario temperatūroje 30 minučių. Baltos nuosėdos, kurios iškrenta tirpinimo metu atsiranda dėl metanolio gebėjimo nusodinti baltymus. Šių – baltyminių nuosėdų atsiradimas yra naudingas procesas, nes mėginiai yra išvalomi nuo balastinių medžiagų, tokių kaip plazmos baltymai. Iškritusios nuosėdos buvo atskiriamos filtravimo būdu, naudojant membraninį filtrą Rotilabo® – siringe filter (skersmuo 25 mm, o porų dydis 0,45 µm). Taip paruošti ir išvalyti plazmos mėginiai yra naudojami atliekant analizę plonasluoksnės chromatografijos metodu [21].
Buvo siekiama sukurti optimalias plonasluoksnės bei efektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, kuriomis būtų galima atskirti ir identifikuoti nesteroidinių vaistų nuo uždegimo (diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno, naprokseno) mišinio komponentus.
5.1.2. Mišinio komponentų skirstymas ir identifikavimas, taikant plonasluoksnę
chromatografiją (PC)
5.1.2.1. Įranga, tirpikliai ir ryškiklis
Analizuojant nesteroidinių vaistų nuo uždegimo mišinį, naudotos chromatografinės plokštelės, kurios buvo padengtos silikagelio sorbcine mase, matmenys 20 x 20 cm (silikageliu G UV254, Vokietija), taip pat naudotos ir stiklo plokštelės 20 x 20 cm. Chromatografinis tyrimas buvo atliktas, naudojant CAMAG Twin Chamber 20 x 20 cm kameras. Tirpiklių mišinio tūris kameroje – 50 ml. Mėginiai ant plokštelės buvo užnešti naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją CAMAG Linomat 5, kuris suformuoja brūkšnelio pavidalo dėmę. „Starto linija“ yra atidedama 1,5 cm nuo plokštelės apačios ir kildinama 10 cm (tirpiklių sistemos poslinkis „starto linijos“ atžvilgiu). Po to plokštelė išdžiovinama ir apšviečiama 254 nm bangos ilgio ultravioletine (UV) šviesa. Tiriamuosiuose
mišiniuose esančių vaistinių medžiagų dėmių Rf reikšmės yra nustatomos naudojantis vizualizavimo
prietaisu CAMAG TLC Visualizer, bei programine įranga VideoScan.
Tirpikliai, kurie buvo naudojami, kuriant eliuentų sistemas: dichlormetanas, etilo acetatas, heksanas, ledinė acto rūgštis, acetonas. Tiriamieji tirpalai buvo ruošiami naudojant metanolį. Kaip ryškiklis buvo naudojama UV šviesa (254 nm).
5.1.2.2. Etaloniniai tirpalai
Etaloniniai tiriamųjų medžiagų tirpalai ruošti, naudojant jų standartus (diklofenakas – Sigma – Aldrich, ibuprofenas – Sigma – Aldrich, ketoprofenas – Sigma – Aldrich, naproksenas – Sigma – Aldrich), kurie buvo tirpinami metanolyje. Tokiu būdu gauti etanoliniai diklofenako (DE1), ibuprofeno (IE1), ketoprofeno (KE1), naprokseno (NE1) 0,2 mg/ml koncentracijos tirpalai. Šių tiriamųjų medžiagų mišinys buvo paruoštas sumaišant po 1 ml etaloninių tirpalų, tokiu būdu gautas etaloninis medžiagų mišinio tirpalas (DIKNE1).
5.1.2.3. Tiriamieji tirpalai
Tiriamieji tirpalai buvo ruošiami iš Lietuvoje registruotų vaistinių preparatų. Diklofenako darbiniam tirpalui (D1) paruošti buvo naudojamos „Naklofen“ (diklofenako natrio druska) 50 mg tabletės (Slovėnija). Nuo trijų diklofenako tablečių buvo pašalintas apvalkalas, tabletės susmulkintos grūstuvėje. Gauti milteliai buvo ištirpinti 20 ml metanolio, gauta suspensija filtruota ir gautas skaidrus, metanolinis tirpalas naudotas tolimesniuose tyrimuose.
Ibuprofeno darbinis tirpalas (I1) buvo gaminamas iš „IBUPROFEN Lannacher“ 600 mg dengtų tablečių (Austrija). Pirmiausia nuo tabletės buvo pašalintas apvalkalas, dvi tabletės buvo sutrintos grūstuvėje ir gauti milteliai ištirpinti 20 ml metanolio. Gauta suspensija buvo perfiltruota naudojant Albet 400 filtrą (porų dydis 12,5 µm). Gautas metanolinis tirpalas buvo naudojamas tolimesniuose tyrimuose.
Ketoprofeno darbiniam tirpalui (K1) paruošti buvo naudojamos „Ketonal forte“ 100 mg tabletės (Slovėnija). Nuo trijų tablečių buvo pašalintas apvalkalas ir jos buvo sutrintos grūstuve. Kaip ir visų kitų tablečių tirpalų gamybai, gauti milteliai buvo ištirpinti 20 ml metanolio ir perfiltruoti. Gautas tirpalas buvo naudojamas tolimesniuose tyrimuose.
Gaminant naprokseno darbinį tirpalą (N1) buvo naudojamos iš vaistinės įsigytos „Nalgesin forte“ (naprokseno natrio druska) 550 mg tabletės (Slovėnija). Tirpalo gamybai buvo naudojamos
grūstuvėje susmulkintos dvi tabletės, kurių apvalkalas kaip ibuprofeno ir diklofenako atveju buvo pašalintas. Susmulkinti milteliai buvo ištirpinti 20 ml metanolio, tirpalas perfiltruotas ir naudojamas tolimesniuose tyrimuose.
5.1.2.4. Analizės eiga
Optimalios PC chromatografavimo sąlygos buvo nustatomos naudojant standartinius tirpalus: DE1, IE1, KE1, NE1. Kiekvienas iš jų pusiau automatiniu būdu buvo užnešamas ant chromatografinės plokštelės, kuri padengta silikageliu. Nugaravus metanoliui, plokštelė perkeliama į prisotintą tirpiklių sistemos garais chromatografavimo kamerą. Kameroje plokštelė laikoma, kol tirpiklių sistemos poslinkis sudaro 10 cm virš starto linijos. Tuomet plokštelė išimama iš kameros ir išdžiovinama. Ryškinimui naudota UV šviesa (254 nm). Identifikavus gautas dėmes, apskaičiuojamas jų sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės. Sulaikymo rodiklis Rf, yra pagrindinis kokybinis vertinimo kriterijus
plonasluoksnėje chromatografijoje. Rf reikšmė yra apskaičiuojama naudojantis formule:
𝑅𝑓 =
L1
L2
Tai yra tiriamosios medžiagos poslinkio atstumo (L1) santykis su tirpiklių sistemos poslinkio atstumu (L2). Kiekvienos medžiagos Rf reikšmė gali priklausyti nuo daugelio faktorių: medžiagos
savybių, nuo tirpiklių sistemos (tūrio, sudėties), taip pat nuo pasirinkto sorbento ir kameros įsotinimo tirpiklių sistemos garais. Atliekant įvairių medžiagų mišinių analizę, svarbu pasirinkti optimalius chromatografinės sistemos parametrus, kurie užtikrintų, kad skirtingi mišinio komponentai neturės identiškų arba labai artimų Rf reikšmių.
Atlikus eilę tyrimų, buvo nustatytos tinkamiausios tirpiklių sistemos nesteroidinių vaistų nuo uždegimo – diklofenako, ibuprofeno, ketorofeno ir naprokseno – atskyrimui mišinyje. Pakartotinai buvo atliekami tyrimai su tiriamaisiais tirpalais, kurie gauti iš vaistinių preparatų. Tokiu būdu buvo siekiama įvertinti metodikos tinkamumą medžiagų, gautų iš vaistinių preparatų, analizei. Ant chromatografinės plokštelės pusiau automatiniu būdu buvo užnešami standartinių tirpalų DE1, IE1, KE1, NE1, jų mišinio – DIKNE1, darbinių tirpalų D1, I1, K1, N1 ir jų mišinio – DIKN1 linijos. Chromatografavimas atliekamas identiškomis sąlygomis (tirpiklių koncentracija, kiekybinė sudėtis, kameros prisipildymas garais nebuvo keičiami). Plokštelės džiovintos ir ryškintos UV šviesa. Identifikavus gautas medžiagų dėmes, buvo apskaičiuotos jų Rf reikšmės, kurios palygintos su
5.1.3. NVNU mišinio komponentų atskyrimas ir identifikavimas efektyviosios
skysčių chromatografija (ESC) metodu
5.1.3.1. Įranga ir tirpikliai
Kokybiniam įvertinimui, naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC), optimalios sąlygos buvo nustatytos naudojant chromatografą (Waters 2695) su fotodiodų matricos detektoriumi (Waters 996). Medžiagų atskyrimui buvo naudotos dvi chromatografinės kolonėlės ACE 3C –18 – PFP (150×3,0 mm), sorbento dalelių dydis 3µm ir ACE 5C18 (250×4,6mm), sorbento dalelių dydis 5µm. Tiriamojo tirpalo injekcijos tūris 10 µl. Eliuavimas – gradientinis, gradiento tėkmės greitis, naudojant ACE 3C – 18 – PFP kolonėlę – 0,5 ml per minutę, naudojant ACE 5C18 tėkmės greitis – 1 ml per minutę. Eliuavimui buvo naudoti 0,5 % acto rūgšties vandeninis tirpalas (eliuentas A) ir acetonitrilas (eliuentas B). Darbinių tirpalų gamybai buvo naudojamas metanolis.
5.1.3.2. Etaloniniai tirpalai
Etaloninius tiriamųjų medžiagų tirpalus ruošta naudojant jų standartus (diklofenakas – Sigma – Aldrich, ibuprofenas – Sigma – Aldrich, ketoprofenas – Sigma – Aldrich, naproksenas – Sigma – Aldrich ), kurie buvo tirpinami metanolyje. Tokiu būdu gauti etanoliniai: diklofenako (DE2), ibuprofeno (IE2), ketoprofeno (KE2), naprokseno (NE2) 0,1 mg/ml koncentracijos tirpalai. Šių tiriamųjų medžiagų mišinys buvo paruoštas sumaišant po 1 ml etaloninių tirpalų, tokiu būdu gautas etaloninis medžiagų mišinio tirpalas (DIKNE2).
5.1.3.3. Tiriamieji tirpalai
Tiriamieji tirpalai buvo paruošti iš Lietuvos vaistinėse įsigytų vaistinių preparatų. Ruošiant darbinį diklofenako tirpalą (D2), naudotos 3 „Naklofen“ (diklofenako natrio druska) 50 mg stiprumo tabletės (Slovėnija). Nuo jų taip pat buvo pašalintas apvalkalas, trijų tablečių svoris sudarė 0,6195 g. Tabletės buvo sutrintos grūstuvėje, gauti milteliai ištirpinti 20 ml metanolio. Gautas neskaidrus tirpalas perfiltruotas ir 1 ml skaidraus tirpalo praskiestas metanoliu iki 10 ml tūrio. Gautas praskiestas metanolinis tirpalas toliau buvo naudojamas chromatografiniuose tyrimuose.
Ibuprofeno darbinis tirpalas (I2) buvo paruoštas iš dviejų „IBUPROFEN LANNACHER“, 600 mg stiprumo tablečių (Austrija). Atsvertų tablečių svoris sudarė 1,8485 g, nuo jų buvo pašalintas apvalkalas ir susmulkintos grūstuvėje. Milteliai buvo ištirpinti 20 ml metanolio, gautas tirpalas
perfiltruotas. 1 ml gauto tirpalo buvo skiestas metanoliu iki 10 ml tūrio. Gautas metanolinis tirpalas buvo naudojamas tolimesniuose tyrimuose.
Ketoprofeno darbinis tirpalas (K2) paruoštas iš vaistinėje įsigyto „Ketonal forte“ 100 mg stiprumo tablečių (Slovėnija). Nuo tablečių pašalinus apvalkalą, jos buvo susmulkintos grūstuvėje. Gauti milteliai ištirpinti 20 ml metanolio, gautas tirpalas perfiltruotas. Iš skaidraus tirpalo paimtas 1 ml, kuris praskiestas metanoliu iki 10 ml tūrio. Gautas tirpalas naudotas tolimesniuose tyrimuose.
Darbinis naprokseno tirpalas (N2) paruoštas naudojant 2,550 mg stiprumo „Nalgesin forte“ (naprokseno natrio druska) tabletes (Slovėnija). Tabletės buvo susmulkintos grūstuvėje, prieš tai pašalinus apvalkalą nuo paviršiaus. Susmulkinti milteliai buvo ištirpinti 20 ml metanolio, gautas tirpalas perfiltruotas. Iš paruošto skaidraus tirpalo, paimtas 1 ml, kuris buvo praskiestas metanoliu iki 10 ml tūrio. Praskiestas metanolinis tirpalas vėliau buvo naudotas chromatografiniuose tyrimuose.
5.1.3.4. Analizės eiga
Optimalios sąlygos diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio analizei, naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją, nustatytos ištyrus etaloninius jų tirpalus: DE2, IE2, KE2, NE2, bei jų mišinį – DIKNE2. Norint nustatyti optimaliausią ir tinkamiausią metodiką, naudotos skirtingos kolonėlės, keista eliuento gradientinis rėžimas. Įvertinus gautus duomenis, nustatytos optimaliausios sąlygos kokybiniam ir kiekybiniam medžiagų įvertinimui bei atlikta metodo validacija. Tiriamosios medžiagos: ibuprofenas, diklofenakas, naproksenas, ketoprofenas mišinyje identifikuotos, remiantis UV absorbcijos spektru, esant maksimaliai šviesos sugerčiai 210 – 400 nm ilgio šviesos bangų diapazone.
Nustačius tinkamas sąlygas, mišinį sudarančių medžiagų atskyrimui ir identifikavimui, vėliau jos buvo pritaikytos, analizuojant iš vaistinių preparatų pagamintus darbinius tirpalus, siekiant patikrinti metodikos tinkamumą keturių nesteroidinių vaistų nuo uždegimo (diklofenakas, ibuprofenas, ketoprofenas ir naproksenas) kokybiniam įvertinimui vaistiniuose preparatuose.
5.2. Rezultatai ir jų aptarimas
5.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodo optimizavimas
5.2.1.1. Ryškiklio parinkimas
Optimizuojant plonasluoksnės chromatografijos metodiką, tinkamą keturių nesteroidinių vaistų nuo uždegimo, t.y., diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno atskyrimui bei identifikavimui mišinyje, buvo pasirinktas ryškinimo reagentas. Atlikus eksperimentinius bandymus, kuriais buvo siekiama surasti tinkamiausią ryškinimo reagentą visoms medžiagoms identifikuoti buvo pasirinktas apšvietimas UV šviesa (254 nm). Išbandžius Dragendorfo reagentą arba Dragendorfo reagentą, modifikuotą pagal Munier, nustatyta, kad jie NVNU mišiniui ryškinti netinkami. Naudojant UV šviesą, kaip ryškinimo reagentą, visos chromatogramoje esančios dėmės buvo gerai matomos.
Apšvietus UV šviesa (254 nm), išryškėjusios dėmės buvo skirtingų atspalvių nuo tamsiai pilkos iki šviesiai pilkos. (5 ir 6 pav.) Lyginant apšvietimą UV šviesa ir dėmių ryškinimą ryškinimo reagentais, šis metodas yra patogesnis ir dažniausiai taikomas.
5 pav. Diklofenako (DE1), ibuprofeno (IE1), 6 pav. Diklofenako (DE1), ibuprofeno (IE1),
ketoprofeno (KE1), naprokseno (NE1) dėmės ketoprofeno (KE1), naprokseno (NE1) dėmės
(naudojant TS – 1 sistemą) ant (naudojant TS – 2 sistemą) ant
chromatografavimo plokštelės, apšvietus ją chromatografavimo plokštelės, apšvietus ją
5.2.1.2. Eliuento parinkimas
Atlikus nemažai eksperimentinių tyrimų, buvo siekiama nustatyti optimaliausią tirpiklių sistemą, kuri galėtų atskirti diklofenaką, ibuprofeną, ketoprofeną ir naprokseną iš jų mišinio. Ieškant tinkamiausio eliuento medžiagų atskyrimui, buvo keičiami tirpikliai bei jų santykis kuriamoje sistemoje. Tirpiklių sistemos tinkamumas buvo įvertintas, atsižvelgiant į diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno etaloninių tirpalų dėmių poslinkį chromatogramoje. Palyginus gautas reikšmes, buvo atrinktos dvi tirpiklių sistemos, kurios buvo tinkamos junginių identifikavimui mišinyje (3 lentelė).
3 lentelė. Diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno vidutinės Rf reikšmės naudojant
skirtingas tirpiklių sistemas.
Tirpiklių sistema Diklofenako vid. Rf Ibuprofeno vid. Rf Ketoprofeno vid. Rf Naprokseno vid. Rf Dichlormetanas – etilo acetatas –
heksanas – ledinė acto rūgštis (35:35:25:5) (TS – 1)
0,89 0,93 0,79 0,85
Acetonas – dichlormetanas – etilo acetatas – heksanas – ledinė acto rūgštis
(18:20:34:24:4) (TS – 2)
0,87 0,90 0,74 0,83
Naudojant skirtingas tirpiklių sistemas diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno tirpalo analizei, bandymai buvo kartojami tris kartus. Gauti duomenys buvo įvertinti statistiškai, apskaičiuojant aritmetinį gautų Rf reikšmių vidurkį, standartinį nuokrypį SD, santykinę paklaidą SE, esant 0,95 pasikliautinajam lygmeniui, pasikliautinąjį intervalą, kai klaidos tikimybė p=0,05 (4 lentelė).
4 lentelė. Statistinis tiriamųjų junginių (diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno, naprokseno) Rf
reikšmių vertinimas, kai naudojamos TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemos.
Tirpiklių sistema Tiriamoji medžiaga Rf vidurkis Standartinis nuokrypis Paklaida Pasikliautinasis intervalas Dichlormetanas – etilo acetatas – heksanas – ledinė acto rūgštis
Diklofenakas 0,89 0,004 0,002 0,88 – 0,90
Ibuprofenas 0,93 0,008 0,004 0,92 – 0,94
(35:35:25:5) (TS – 1) Naproksenas 0,85 0,009 0,004 0,84 – 0,86 Acetonas –
dichlormetanas – etilo acetatas – heksanas –
ledinė acto rūgštis (18:20:34:24:4) (TS – 2)
Diklofenakas 0,87 0,005 0,002 0,86 – 0,88
Ibuprofenas 0,90 0,006 0,003 0,89 – 0,91
Ketoprofenas 0,74 0,008 0,004 0,73 – 0,75
Naproksenas 0,83 0,006 0,003 0,82 – 0,84
Visų pakartotiniams bandymams naudotų tirpiklių sistemų atsikartojimo paklaidos neviršijo leistinos 0,05 ribos. Šios dvi tirpiklių sistemos yra tinkamos diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno kokybiniam įvertinimui, jiems esant mišinyje.
5.2.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu
Nustačius optimalias tirpiklių sistemas ir medžiagų dėmių ryškinimo būdą, buvo išanalizuoti darbiniai tirpalai D1, I1, K1, N1, kurie gauti iš vaistinių preparatų, įsigytų Lietuvos vaistinėse. Analizė buvo atlikta naudojant TS – 1 ir TS – 2 sistemas, kaip ryškiklį naudojant UV šviesą (254 nm) (5 lentelė, 7 pav. ir 8 pav.).
5 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, kurios išskirtos iš vaistinių preparatų, Rf reikšmės naudojant TS–1 ir TS–2. Tiriamasis mėginys TS – 1 TS – 2 Diklofenako (D1) Rf 0,89 0,87 Ibuprofeno (I1) Rf 0,93 0,90 Ketoprofeno (K1) Rf 0,79 0,74 Naprokseno (N1) Rf 0,85 0,83
7 pav. Sistema TS – 1 atskirtos ir UV šviesa 8 pav. Sistema TS – 2 atskirtos ir UV šviesa
(254 nm) išryškintos diklofenako (D1), (254 nm) išryškintos diklofenako (D1),
ibuprofeno (I1), ketoprofeno (K1), ibuprofeno (I1), ketoprofeno (K1),
naprokseno (N1) ir tiriamųjų tirpalų naprokseno (N1) ir tiriamųjų tirpalų
D1, I1, K1, N1 dėmės. D1, I1, K1, N1 dėmės.
Analizės metu nustatytos tiriamųjų medžiagų (kurie išskirti iš vaistinių preparatų) vidutinės Rf
reikšmės atitiko pasikliautinuosius intervalus, nustatytus TS – 1 ir TS – 2 sistemose (6 lentelė). Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, jog TS – 1 ir TS – 2 sistemos yra tinkamos diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio analizei bei jų kokybiniam įvertinimui vaistiniuose preparatuose.
6 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, kurios išskirtos iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės
naudojant TS – 1 ir TS – 2 eliuentus. Tiriamasis mėginys TS – 1 vidutinė Rf reikšmė TS – 1 pasikliautinasis intervalas TS – 2 vidutinė Rf reikšmė TS – 2 pasikliautinasis intervalas Diklofenakas (D1) 0,885 0,88 – 0,90 0,865 0,86 – 0,88 Ibuprofenas (I1) 0,93 0,92 – 0,94 0,90 0,89 – 0,91 Ketoprofenas (K1) 0,785 0,78 – 0,80 0,735 0,73 – 0,75 Naproksenas (N1) 0,845 0,84 – 0,86 0,825 0,82 – 0,84
Optimizavus sąlygas, kurios tinkamos standartinių medžiagų mišiniui (mišinys gautas sumaišant 20 µl diklofenako, 20 µl ibuprofeno, 20 µl ketoprofeno, 20 µl naprokseno ir juos praskiedus metanoliu iki 1,5 ml), buvo nuspręsta šį metodą pritaikyti mėginių analizei (mėginiai gauti iš kraujo plazmos). Atlikus ekstrakciją su kraujo plazma, joje buvo ištirpinti anksčiau metodikoje nurodyti tiriamųjų medžiagų kiekiai ir paruošti kraujo plazmos mėginiai pagal aprašytą metodiką.
Ant chromatografinės plokštelės buvo užnešti kraujo plazmos mėginiai su skirtingomis medžiagomis (K, N, D, I) ir šių vaistų mišinys (IDNK). Analizė buvo atlikta naudojant TS – 1 ir TS – 2 sistemas, kaip ryškiklį naudojant UV šviesą (254 nm) (7 lentelė, 9 pav. ir 10 pav.).
9 pav. Ketoprofenas (K), naproksenas (N), 10 pav. Ketoprofenas (K), naproksenas (N),
diklofenakas (D) ir ibuprofenas (I), išskirti diklofenakas (D) ir ibuprofenas (I), išskirti
iš kraujo plazmos ir nustatyti sistema TS – 1 iš kraujo plazmos ir nustatyti sistema TS – 2
7 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, esančių kraujo plazmoje, Rf reikšmės naudojant TS–1 ir TS–2.
sistemas.
8 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, esančių kraujo plazmoje, vidutinės Rf reikšmės naudojant
TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemas. Tiriamasis mėginys TS – 1 vidutinė Rf reikšmė TS – 1 pasikliautinasis intervalas TS – 2 vidutinė Rf reikšmė TS – 2 pasikliautinasis intervalas Diklofenakas (D) 0,88 0,88 – 0,89 0,87 0,86 – 0,88 Ibuprofenas (I) 0,94 0,93 – 0,95 0,90 0,89 – 0,91 Ketoprofenas (K) 0,77 0,76 – 0,78 0,74 0,73 – 0,75 Naproksenas (N) 0,85 0,84 – 0,86 0,81 0,82 – 0,84
Analizės metu nustatytos tiriamųjų medžiagų (kraujo plazmoje) vidutinės Rf reikšmės atitiko
pasikliautinuosius intervalus, nustatytus TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemose (8 lentelė). Remiantis Tiriamasis mėginys TS – 1 TS – 2 Diklofenako (D) Rf 0,88 0,87 Ibuprofeno (I) Rf 0,94 0,90 Ketoprofeno (K) Rf 0,77 0,74 Naprokseno (N) Rf 0,85 0,81
gautais rezultatais, galima teigti, jog TS – 1 ir TS – 2 sistemos yra tinkamos diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinio analizei kraujo plazmoje.
5.2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo optimizavimas
5.2.3.1. Spektrinių duomenų įvertinimas
Diklofenako, ibuprofeno, ketoprofeno ir naprokseno mišinių analizei, naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, buvo pasirinktas fotodiodų matricos detektorius. Šis detektorius pasirinktas kokybiniam medžiagų įvertinimui, nes geba nustatyti tiriamųjų medžiagų UV šviesos absorbcijos maksimumus visame UV spektre. Todėl analizuojamą mišinį galima įvertinti kokybiškai, remiantis dviem kriterijais:
1. Lyginant tiriamųjų medžiagų UV absorbcijos spektrus su literatūroje pateiktais ir nustatytais medžiagų UV šviesos absorbcijos spektrais bei standartinių medžiagų spektrais;
2. Lyginant sulaikymo laikus (tiriamųjų medžiagų su etaloninėmis medžiagomis).
Taikant abu vertinimo kriterijus, yra pasiekiamas didelis kokybinio vertinimo tikslumas. Pirmiausia, buvo įvertinti etaloninių tirpalų UV absorbcijos spektrai, kurie yra svarbūs norint optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką ir identifikuoti diklofenaką, ibuprofeną, naprokseną ir ketoprofeną. Spektrai, gauti naudojant ESC, buvo palyginti su literatūroje pateiktais UV absorbcijos spektrais.
Bangos ilgis (nm) Bangos ilgis (nm)
11 pav. Diklofenako UV absorbcijos spektrai: A – pateiktas „Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons“ [27]; B – gautas išmatavus fotodiodų matricos detektoriumi.
A
b
so
rb
ci
ja
A
B
B
B
A
b
so
rb
ci
ja
Palyginus literatūroje pateiktus [27] ir praktiškai fotodiodų matricos detektoriumi gautus diklofenako UV sugėrimo spektrus, matome, jog absorbcijos maksimumas abiejuose spektruose nustatomas esant 275 nm bangos ilgiui (11 pav.).
Išmatavus ibuprofeno etaloninio tirpalo UV šviesos sugėrimo spektrą ir literatūros šaltiniuose pateiktą spektrą, jų absorbcijos maksimumas yra nustatomas, kai šviesos bangos ilgis yra 262 nm (12 pav.). Absorbcijos maksimumas, esant 228 nm bangos ilgiui, netaikomas ibuprofeno identifikavimui dėl plataus šviesos bangų ilgio intervalo [10].
Bangos ilgis (nm) Bangos ilgis (nm)
12 pav. Ibuprofeno UV absorbcijos spektras: A – pateiktas „Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons“ [27]; B – gautas išmatavus fotodiodų matricos detektoriumi.
Bangos ilgis (nm) Bangos ilgis (nm)
13 pav. Ketoprofeno UV absorbcijos spektras: A – pateiktas „Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons“ [27]; B – gautas išmatavus fotodiodų matricos detektoriumi.
Palyginus teoriškai nurodytus [27] ir praktiškai gautus ketoprofeno UV šviesos absorbcijos spektrus, buvo nustatyta, jog maksimali UV šviesos absorbcija, pagal kurią galima identifikuoti ketoprofeną, yra esant 252 nm šviesos bangos ilgiui (13 pav.).
