MAISTO PAPILDŲ TURINČIŲ VITAMINO D TYRIMAS TAIKANT PLONASLUOKSNĖS IR EFEKTYVIOSIOS PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS ANALIZĖS METODUS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

ŽILVINAS KASPARAVIČIUS

MAISTO PAPILDŲ TURINČIŲ VITAMINO D TYRIMAS TAIKANT

PLONASLUOKSNĖS IR EFEKTYVIOSIOS PLONASLUOKSNĖS

CHROMATOGRAFIJOS ANALIZĖS METODUS

Darbo vadovas Prof. Liudas Ivanauskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė

MAISTO PAPILDŲ TURINČIŲ VITAMINO D TYRIMAS TAIKANT

PLONASLUOKSNĖS IR EFEKTYVIOSIOS PLONASLUOKSNĖS

CHROMATOGRAFIJOS ANALIZĖS METODUS

Darbo vadovas: Prof. Liudas Ivanauskas

Recenzentas Darbą atliko:

Magistrantas

Žilvinas Kasparavičius

Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

TIRIAMOJO DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Vitamino D (kalciferolio) charakteristika ... 12

1.2. Vitamino D veiklos mechanizmas ... 12

1.3. Cheminė Vitamino D klasifikacija ... 12

1.4. Vitamino D sintezė žmogaus organizme ... 13

1.5. Vitamino D šaltiniai ... 15

1.6. Vitamino D poveikis griaučių sistemai ... 16

1.7. Vitamino D poveikis imuninei / uždegiminei sistemai ... 18

1.8 Vitamino D poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 22

1.9 Neuroprotekcinis vitamino D poveikis ... 23

2. TIRIAMOJO DARBO METODIKA ... 24

2.1. Tiriamojo darbo objektas ... 24

2.2. Tiriamojo darbo metu naudoti reagentai ... 25

2.3. Tiriamojo darbo metu naudota aparatūra ... 25

2.4. Vitamino D mėginių ruošimas ... 26

2.5. Ryškinamojo reagento ruošimas ... 27

2.6. Vitamino D standartinio tirpalo ruošimas ... 28

2.7. Vitamino D kokybinis identifikavimas paruoštuose mėginiuose plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodais ... 28

2.8. Plonasluoksnės chromatografijos kiekybinio analizės metodo validacija ... 29

2.9. Kalibracinės kreivės ruošimas kiekybiniam vitamino D nustatymui ... 29

2.10. Vitamino D kiekybinis nustatymas paruoštuose mėginiuose plonasluoksnės chromatografijos analizės metodu ... 30

2.11. Statistinės duomenų analizės ruošimas ... 31

3. TIRIAMOJO DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1. Maisto papildų, turinčių vitamino D, pateikiamų įvairiomis farmacinėmis formomis, kokybės įvertinimas ... 31

3.2. Vitamino D kokybinis identifikavimas mėginiuose taikant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą ... 32

3.3. Vitamino D kokybinis identifikavimas mėginiuose taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą ... 34

3.4. Kiekybinio vitamino D nustatymo PC analizės metodo validacija ... 35

3.5. Kalibracinė kreivė ... 36

3.6. Vitamino D kiekybinis nustatymas mėginiuose ... 37

3.7. Kiekybinio vitamino D nustatymo tirtuose maisto papildų mėginiuose rezultatų įvertinimas... 38

3.8. Apibendrinimas ... 39

4. IŠVADOS ... 41

Praktinės rekomendacijos ... 42

Literatūros sąrašas ... 43

SANTRAUKA

Žilvino Kasparavičiaus magistro baigiamasis darbas, pavadinimas: Maisto papildų turinčių vitamino D tyrimas taikant plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodus / mokslinis vadovas: Prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas – kokybiškai nustatyti maisto papilduose esantį vitaminą D, pateikiamuose įvairiomis farmacinėmis formomis, plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodais ir įvertinti vitamino D kiekį skirtinguose maisto papilduose plonasluoksnės chromatografijos analizės metodu. Tiriamieji objektai – maisto papildai, pateikiami įvairiomis farmacinėmis formomis (želatininės kapsulės, aliejinio pagrindo lašiukai, kieta danga dengtos tabletės), sudėtyje turintys vitamino D. Tyrime naudoti metodai – plonasluoksnė ir efektyvioji plonasluoksnė chromatografija. PC metodika pritaikyta ir validuota kiekybiniam vitamino D įvertinimui maisto papilduose.

Tyrimo rezultatai: atlikus kokybinį vitamino D įvertinimą PC analizės metodu remiantis pasirinktomis trijomis metodikomis buvo nustatyta, kad maisto papilduose esančio vitamino D kokybiniam nustatymui parinkta tinkamiausia ir geriausius rezultatus davusi metodika (tirpiklis – eteris; sistema – heksano / eterio / benzeno mišinys (8:4:1); ryškinamasis reagentas – koncentruotos sieros rūgšties, ledinės acto rūgšties ir 10 proc. etanolio mišinys (1:1:8)). Vitaminas D buvo kokybiškai nustatytas maisto papilduose plonasluoknės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodais. Pritaikius ir validavus PC analizės metodą kiekybiškai nustatyti vitamino D kiekiai tirtų maisto papildų pavyzdžiuose. Atlikus analizę nustatyta, kad didžiausias kiekis (mg/g) rastas geriamuose lašuose 1200 TV (0,2539 mg/g), mažiausias kiekis nustatytas tabletėse vaikams 400 TV (0,0198 mg/g). Želatininėse kapsulėse II 2000 TV nustatyta 0,1563 mg/g vitamino D, želatininėse kapsulėse I 1000 TV nustatyta 0,0774 mg/g vitamino D, želatininėse kapsulėse III 800 TV nustatyta 0,0621 mg/g vitamino D, tabletėse 1600 TV nustatyta 0,0792 mg/g vitamino D. Ant pakuotės nurodytus kiekybinius vitamino D rezultatus atitinka visi tirti maisto papildai: geriamieji lašai 1200 TV (103,93 proc.), želatininės kapsulės I 1000 TV (100,65 proc.), želatininės kapsulės II 2000 TV (101,62 proc.), želatininės kapsulės III 800 TV (100,97 proc.), tabletės vaikams 400 TV (103,12 proc.), tabletės 1600 TV (102,99 proc.).

SUMMARY

Master thesis of Žilvinas Kasparavičius, title: Research of food supplements with vitamin D using Thin-layer and High-performance thin-layer chromatographic analysis methods / scientific supervisor: Prof. Liudas Ivanauskas; Lithuanian university of health sciences, Faculty of Pharmacy, Department of analytical and toxicological chemistry. – Kaunas.

The aim of the study is to qualitatively determine vitamin D in food supplements presented in various pharmaceutical forms, using Thin-layer and High-performance Thin-layer chromatographic analysis methods and to quantitatively evaluate the amount of vitamin D in supplements by Thin-layer chromatographic analysis. Subjects of interest are food supplements presented in various pharmaceutical forms (gelatin capsules, oil-based oral drops, hard-coated tablets) containing vitamin D. The methods used in the study are Thin-layer and High-performance thin-layer chromatography. The TLC methodology has been adapted and validated for the quantitative assessment of vitamin D in food supplements.

Results of the research: after qualitative evaluation of vitamin D by TLC analysis method based on the chosen three methods, it was determined that the most suitable and best performing method was chosen for the qualitative determination of vitamin D in food supplements (solvent - ether; system - hexane / ether / benzene mixture (8:4:1); the refining reagent is a mixture of concentrated sulfuric acid, glacial acetic acid and 10 percent ethanol (1:1:8)). Vitamin D was qualitatively determined in food supplements by TLC and HPTLC analysis methods. By applying and validating the TLC analysis method, amounts of vitamin D in samples of supplements were quantitatively examined. The analysis showed that the largest amount (mg/g) was determined in oral drops 1200 IU (0.2539 mg/g), smallest amount was determined in tablets for children 400 IU (0.0198 mg/g). In gelatin capsules I 1000 IU – 0.0774 mg/g of vitamin D, n gelatin capsules II 2000 IU – 0.1563 mg/g of vitamin D, in gelatin capsules III 800 IU – 0.0621 mg/g of vitamin D, in tablets 1600 IU – 0,0792 mg/g of vitamin D. All of analyzed supplements met quantitative results of vitamin D indicated on the packaging: oral drops 1200 IU (103.93 percent), gelatin capsules I 1000 IU (100.65 percent), gelatin capsules II 2000 TV (101.62 percent), gelatin capsules III 800 IU (100.97 percent), tablets for children 400 IU (103.12 percent), tablets 1600 IU (102.99 percent).

PADĖKA

Norėčiau padėkoti visiems, padėjusiems rengiant magistro baigiamąjį darbą. Dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui profesoriui Liudui Ivanauskui ir lektoriui Mindaugui Marksai už patarimus, konsultaciją, pamokymus ir pagalbą dirbant analitinėje laboratorijoje ir ruošiant magistro baigiamąjį darbą.

SANTRUMPOS

VDDR – vitamino D trūkumo rachitas (angl.k. vitamin D deficiency rickets)

HVDRR – paveldimas vitaminui D atsparus rachitas (angl.k. hereditary vitamin D resistant rickets)

FGF23 – fibroblastų augimo faktorius 23 (angl.k. fibroblast growth factor 23) TV – Tarptautiniai Vienetai (angl.k. IU – International Units)

DC – dendritų ląstelės (angl.k. dendric cells) Th – T gelbėtojas (angl.k. T helpers)

SMC – lygiųjų raumenų ląstelės (angl.k. smooth muscle cells)

RAS – renino ir angiotenzino sistema (angl.k. renin-angiotensin system) T1D – I tipo diabetas (angl.k. Type 1 diabetes)

MS – išsėtinė sklerozė (angl.k. multiple sclerosis)

MARRS – su membrana susiję greito reagavimo steroidai (angl.k. membrane-related rapid response steroid)

25(OH)D – 25-hidroksivitaminas D / kalcifediolis (angl.k. 25-hydroxyvitamin D / Calcifediol) 1,25 (OH) D – 1,25-dihydroxyvitamin D / kalcitriolis (angl.k. 1,25-dihydroxyvitamin D / Calcitriol)

PC – plonasluoksnė chromatografija

EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija R2 _{– koreliacijos koeficientas}

ĮVADAS

Teiginys, jog vitamino D funkcijos žmogaus organizme apsiroboja reguliuojant kalcio pasisavinimą žarnyne iš vartojamo maisto, skatinant reabsorbciją inkstuose ir palaikant kalcio koncentraciją serume, yra klaidingas. Atlikta ir kiekvieną dieną atliekama vis daugiau tiriamųjų mokslinių darbų, siejančių vitamino D kiekio kitimą organizme su įvairių kondicijų bei ligų profilaktika ir efektyviu jų gydymu [1].

Vitamino D maisto papildų ir vaistinių preparatų įvairiomis farmacinėmis formomis rinka pasaulyje yra itin plati, ir prognozuojama, kad iki 2020 metų perkamų ir vartojamų preparatų vertė sieks 2,5 milijardų JAV dolerių [34]. Susidomėjimas teigiamomis vitamino D savybėmis ir stebėtinai augantis jo populiarumas ir vartojimas byloja apie vitamino D teikiamos naudos aktualumą žmogaus sveikatai, žmonių bei farmacinių įmonių domėjimąsi potencialiu rinkos plėtimu. Atsižvelgiant į dabartinį rinkos plėtimąsi ir didėjantį esamų maisto papildų ir vaistinų preparatų kiekį įvairiomis farmacinėmis formomis tampa vis svarbesni ir šių preparatų tyrimai. Todėl tampa aktualu ne tik plėsti tyrimų metodikų pasirinkimą moderniomis technologijomis, bet ir tobulinti jau esamų metodikų pritaikomumą modernėjančių tyrimų laboratorijų aplinkoje.

Vitaminas D yra vienas plačiausiai organizmo sveikos būklės palaikymui turinčių įtakos medžiagų, kurias gauname tiek su vartojamu maistu, tiek vykstant jo natūraliai sintezei odoje, esant saulės spinduliuotės apšvitinimui. Nuo 1913 metų, kai buvo atrastas vitaminas D, jo gamybos odoje procesas ir aprašytas jo veikimo mechanizmas fiziologiniu lygmeniu, domėjimasis vitamino D teikiama nauda tik auga [35]. Atliekami tyrimai, grindžiantys vitamino D funkcijas pradedant nuo elementaraus poveikio kalcio, fosforo, magnio, geležies ir kitų mineralų absorbcijai žarnyne, reabsorbcijai inkstuose, koncentracijų palaikyme serume, priešuždegiminiu veikimu esant tiek ūmiom, tiek lėtinėm infekcijoms, adaptyviosios imuninės sistemos veiklos skatinime, poveikiu širdies ir kraujagyslių sistemai skatinant cholesterolio apykaitą ir efektyvesnį širdies darbą ir baigiant teigiamu poveikiu centrinei nervinei sistemai, skatinant nervinių ląstelių proliferaciją, adaptyvumą, gerinant nervinių signalų sklidimą, todėl stabdomas Alzhaimerio ligos, šizofrenijos ir kitų ligų, susijusių su nervinių ląstelių normalių funkcijų sutrikimu, vystymasis. Taip pat atliekami klinikiniai tyrimai ir galimam vitamino D priešvėžiniam poveikiui, stebint ir atliekant tyrimus su pacientais, kuriems yra diagnozuotos tiesiosios žarnos, krūtų, kiaušidžių ir prostatos piktybinių navikų formos [36].

Atsižvelgiant į galimų vitamino D funkcijų platų panaudojimo diapozoną ir į įvairių galimų laboratorinių tyrimų metodikų moderninimo ir pritaikomumo naudą, skatinant ne tik modernių tyrimų naudojimą, bet ir senųjų pritaikymą, siekiant vitamino D laboratorinių tyrimų prieinamumo ir supaprastinimo, tampa aktualu atlikti tyrimus naudojant įvairias prieinamas analizės metodikas ir lyginti gaunamus rezultatus. Remiantis atlikta literatūros apžvalga, buvo pastebėta, jog vis dažniau

analizei naudojamos sudėtingos modernios metodikos (pvz.: DC, ESC UESC), užmirštant paprastesnių (PC, EPC, SC) pritaikomumą kasdienei vitamino D analizei. Siekiant vitamino D laboratorinius tyrimus padaryti kuo labiau prieinamus ir skatinti jų mastą būtina modernizuoti, vystyti, validuoti ir pritaikyti kuo įvairesnius analizės metodus.

Šio tiriamojo darbo objektas yra maisto papildai, turintys vitamino D, pateikiami įvairiomis farmacinėmis formomis ir parduodami Lietuvos Respublikos rinkoje.

Tiriamojo darbo tikslas – kokybiškai nustatyti maisto papilduose esantį vitaminą D, pateikiamuose įvairiomis farmacinėmis formomis, plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodais ir įvertinti vitamino D kiekį taikant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą.

TIRIAMOJO DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Kokybiškai nustatyti maisto papilduose esantį vitaminą D plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodais ir įvertinti vitamino D kiekį skirtinguose maisto papilduose plonasluoksnės chromatografijos analizės metodu.

Darbo uždaviniai:

1. Kokybiškai identifikuoti vitaminą D maisto papilduose, pateikiamuose įvairiomis formacinėmis formomis, taikant plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodus.

2. Pritaikyti ir validuoti plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą kiekybiniam vitamino D kiekio įvertinimui maisto papilduose, pateikiamuose įvairiomis farmacinėmis formomis.

3. Kiekybiškai įvertinti vitamino D kiekį maisto papilduose, pateikiamuose įvairiomis farmacinėmis formomis taikant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą.

4. Palyginti tyrimo metu nustatytus ir gamintojo nurodytus kiekius vitamino D kiekius tirtuose maisto papilduose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Vitamino D (kalciferolio) charakteristika

Vitaminas D – tai riebaluose tirpių sekvesteroidų grupė, atsakinga už kalcio, geležies, magnio, fosfato ir cinko reabsorbciją žarnyne (pagrindinių vitamino D atstovų cheminės struktūros ir pavadinimai nurodyti 1 priede). Dvi pagrindinės formos yra vitaminas D2 (ergokalciferolis) ir vitaminas D3 (cholecalciferolis). Literatūroje vitaminas D be indikatoriaus nurodo tiek vitaminą D2, tiek vitaminą D3 ir yra traktuojamas kaip kalciferolis [1, 2].

1.2. Vitamino D veiklos mechanizmas

Vitamino D aktyvumas yra siejamas su branduolio transkripcijos faktoriu – vitamino D receptoriumi (VDR). Patekęs į ląstelės branduolį 1α,25-dihidroksivitaminas D prisijungia prie VDR ir aktyvuoja branduolinį receptorių – retinoidų X receptorių (RXR). 1α,25-dihidroksivitamino D aktyvacijos metu VDR / RXR kompleksas susieja mažas DNR sekas (vitamino D atsako elementai – ang.k. VDRE) ir inicijuoja molekulinės sąveikos kaskadą, moduliuojančią specifinių genų transkripciją. Visame genome nustatyta tūkstančiai VDRR ir manoma, kad 1α,25-dihidroksivitaminas D aktyvintas VDR tiesiogiai ir netiesiogiai reguliuoja nuo 100 iki 1250 genų [29].

1.3. Cheminė Vitamino D klasifikacija

Vitaminas D pagal cheminę struktūrą skirstomas į penkias formas: 1. Vitaminas D1 (ergokalciferolio ir lumisterolio junginys);

2. Vitaminas D2 (ergokalciferolis – sintezuojamas iš ergosterolio);

3. Vitaminas D3 (cholekalciferolis – sintezuojamas iš 7-dehidrocholesterolio); 4. Vitaminas D4 (22-dihidroergokalciferolis);

5. Vitaminas D5 (sitokalciferolis – sintezuojamas iš 7-dehidrositosterolio).

Dvi pagrindinės išskiriamos formos yra Vitamino D2 ir Vitamino D3, kurios kartu nenurodant indekso yra nuoroda Vitaminui D (kalciferolis) [1, 2].

1.4. Vitamino D sintezė žmogaus organizme

Vienas iš vitamino D3 (cholecalciferolio) šaltinių yra suvartojamas maistas (žuvų taukai ir pieno produktai). Antras galimas vitamino D3 šaltinis – sintezė odoje iš 7-dehidrocholesterolio esant ultravioletinės spinduliuotės apšvitinimui. Vitaminas D, gaunamas procese naudojant 7-dehidrocholesterolį, priklauso nuo UV spinduliuotės intensyvumo, kuri priklauso nuo esamo sezono ir geografinės lokacijos. Esant apsaugai nuo saulės ir drabužių suteiktai priedangai, buvo ribojamas 7-dehidrocholesterolio virtimas į vitaminą D3. Kad vitaminas D būtų biologiškai aktyvus ir turėtų įtakos mineralų apykaitai ir daugeliui kitų fiziologinių funkcijų, įskaitant vėžio ląstelių augimo slopinimą ir apsaugą nuo tam tikrų imuninės sistemos sutrikimų, jis turi būti paverčiamas į aktyviąją formą. Kraujyje vitaminas D rišamas su vitaminą D rišančiu baltymu (ang.k. - DBP, specifinis vitamino D baltymas nešiklis ir jo metabolitai kraujo serume)ir transportuojamas į kepenis [3, 4].

Kepenyse vitaminas D hidroksilinamas C-25 jungtyje vienu ar daugiau citochromų P450 vitamino D 25 hidroksilazių (įskaitant CYP2R1, CYP2D11 ir CYP2D25), dėl šių priežasčių susidaro 25-hidroksivitaminas D3 (25 (OH) D3). Pagrindinis fermentas, dalyvaujantis vitamino D hidroksilinime, yra CYP2R1. Tokia išvada prieinama analizuojant rezultatus, gautus atlikus tyrimą su pacientais, kuriems nustatyta homozigotinio CYP2R1 geno mutacija ir žemas cirkuliuojančio 25 (OH) D3 lygis. 25 (OH) D3 DBP perneša į inkstus [3, 4].

Inkstuose magalinas, kuris priklauso MTL receptorių grupei (mažo tankumo lipoproteinai), pradeda 25 (OH) D3 endotikinę internalizaciją. Proksimaliniuose inkstų kanaluose 25 (OH) D3 hidroksilinamas A žiedo anglies 1 padėtyje, ko pasekoje susidaro aktyvi iš vitamino D, 1,25-dihidroksivitamino D3 (1,25 (OH) 2D3) hormono forma, kuri dalyvauja daugelyje biologinių vitamino D funkcijų (1 pav.). Daugiausia citochromo P450 monoksigenazės 25 (OH) D1α hidroksilazės (CYP27B1; 1α (OH) ase), dalyvaujančios 25 (OH) D3 metabolizavime iki 1,25 (OH) 2D3, yra inkstuose. Šis fermentas taip pat randamas ekstrarenalinėse vietose, įskaitant placentą, monocitus ir makrofagus. Kaip ir su visais mitochondrijų P450 turinčiais fermentais, 1α (OH) azės reakcijos metu elektronai per ferodoksiną perkeliami iš NADPH į NADPH-ferrodoksin-reduktazę. Inaktyvuojančios 1α (OH) azės geno mutacijos sukelia I tipo nuo vitaminų stokos priklausančio rachito (VDDR) vystymąsi [3, 4].

1 pav. Vitamino D metabolizmas žmogaus organizme. Schema modifikuota iš Christakos S. ir kt.(2010) [3]

24-hidroksilazės (24 (OH) azės) poveikis vitamino D sintezei žmogaus organizme

Be 1,25 (OH) 2D3 gamybos, inkstuose taip pat gaminamas 24,25dihidroksivitaminas D3 (24, 25 (OH) 2D3). Šis metabolitas yra santykinai neaktyvus lyginant su 1,25(OH)2D3. 25-hidroksivitamino D3 24hidroksilazė (CYP24), taip pat mitochondrijų P450 fermentas, gali hidroksiluoti tiek 25(OH)D3, tiek 1,25(OH)2D3. Įvairiuose tyrimuos teigiama, kad 24(OH)azės substratas yra 1,25(OH)2D3. Pagreitinant 1,25(OH)2D3 katabolizmą iki 1,24,25(OH)3D3, dėl kurio susidaro kalcitrino rūgštis arba gaminant 24,25(OH)2D3, ribojamas 1,25(OH)2D3 kiekis tiksliniuose audiniuose, taip sumažinamas galimas 25(OH)D3 kiekis, reikalingas I hidroksilacijai [3,4].

Sumažėjusi kalcio ir fosfato koncentracija sustiprina 1α (OH) azės aktyvumą (1 pav.). Padidėjęs PTH, atsiradęs dėl hipokalcemijos, yra pagrindinis signalas, paskatinantis 1,25 (OH) 2D3 sintezę inkstuose. PTH stimuliuoja 1α (OH) azės transkripciją. 1,25 (OH) 2D3 slopina PTH gamybą transkripcijos lygmenyje. 1α (OH) azės genas neigiamai reguliuojamas 1,25 (OH) 2D3 įtakos. Lyginant su 1α (OH) azės reguliavimu, 24 (OH) azė yra reguliuojamas dvilypai (stimuliuojamas 1,25 (OH) 2D3 ir slopinamas maža kalcio ir PTH koncentracija). 1,25 (OH) 2D3 sulelta 24 (OH) azės indukcija pradeda 1,25 (OH) 2D3 savireguliacinį slopinimą, kai 1,25 (OH) 2D3 genų transkripcijos efektai turi būti susilpninti, siekiant apsaugoti nuo hiperkalemijos [3, 4].

Padidėjusi FGF23 koncentracija slopina 1α (OH) azės veikimą ir skatina 24 (OH) azės veikimą inkstuose (1 pav.). Slopinant sintezę ir skatinant 1,25 (OH) 2D3 katabolizmą, FGF23 sumažina 1,25 (OH) 2D3 koncentraciją, ko pasekoje slopinama FGF23 ekspresija kauluose – prasideda neigiamas grįžtamasis ryšys tarp FGF23 ir vitamino D endokrininės sistemos [3, 4].

Remiantis tyrimų, atliktų su paukščių rūšimis, duomenimis, estrogenas vartojamas vienas arba kartu su androgenais arba progesteronu stimuliuojama 1,25 (OH) 2D3 sintezę. Taip pat nustatyta, kad estrogenai slopina 24,25 (OH) 2D3 sintezę [3, 4].

Kalcitonino koncentracijos padidėjimas sukelia 1α (OH) azės transkripcijos padidėjimą, ko pasekoje stimuliuojama 1,25 (OH) 2D3 sintezė [3, 4].

1.5. Vitamino D šaltiniai

Svarbiausias vitamino D šaltinis yra natūrali jo sintezė odoje esant saulės šviesos apšvitinimui. Tam tinkamiausias paros metas yra nuo 10 iki 15 valandos pavasario, vasaros, rudens sezonais. Žiemos sezono metu, esant nutolus 40 ° nuo vidurio platumos, saulės šviesos apšvita yra nepakankama kokybiškai ir kiekybiškai vitamino D sintezei odoje. Lyginant su dietiškai gaunamu vitaminu D, vitaminas D, sintezuotas odoje apšvitos saulės šviesa metu, gali išlikti mažiausiai du kartus ilgesnį laiką kraujyje. Esant viso kūno odos apšvitinimui saulės šviesa iki lengvo raudonumo praėjus vienai valandai po apšvitinimo, odoje susintezuoto vitamino D kiekis apytiksliai atitinka nuo 10.000 iki 25.000 IU vitamino D, gaunamo su maistu. Veiksniai galimai mažinantys vitamino D sintezę odoje:

• Dienos metas – vitamino D sintezė yra aktyvesnė esant intensyvesnei saulės šviesos apšvitai;

• Lokalizacija – saulės šviesa yra intesnyvesnė ir trunkanti ilgiau zonose, esančiose arčiau ekvatoriaus;

• Odos pigmentacija – vitamino D sintezė blyškioje odoje vyksta sparčiau, lyginant su tamsia oda;

• Apšvitintos odos kiekis – esant didesniam apšvitintos odos kiekiui vitamino D sintezė vyksta sparčiau;

• Amžius – vitamino D sintezės efektyvumas mažėja organizmui senstant;

• Vietinių apsaugos priemonių vartojimas – apsauginės priemonės nuo saulės stabdo vitamino D sintezę odoje [7, 8].

Kitas galimas vitamino D šaltinis, siekiant palaikyti būtiną jo kiekį organizme (1 lentelė), yra vartojamas maistas ir maisto papildai. Daugiausia vitamino D randama riebioje žuvyje (pvz.: menkių kepenų aliejus, lašiša, sardinės, tuna, šitake grybai), jaučių kepenyse, sūryje, grybuose ir kiaušinio trynyje. Taip pat galimi dirbtinai vitaminu D praturtinti maisto produktai ar papildai (pvz.: pieno produktai, dribsniai, kruopos, vaisių sultys). Vitamino D kiekiai, randami maisto produktuose, pateikti 2 lentelėje [6, 8].

1 lentelė. Vitamino D vartojimo normos pagal amžių ir lyčių grupes [5, 8]

Amžius Vyrai Moterys Nėštumas Laktacija

0-12 mėnesių 400 IU (10 µg) 400 IU (10 µg) 1-13 metų 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) 14-18 metų 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) 19-50 metų 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) 51-70 metų 600 IU (15 µg) 600 IU (15 µg) >70 metų 800 IU (20 µg) 800 IU (20 µg)

2 lentelė. Vitamino D kiekiai randami maisto produktuose [6, 8]

Produktas IU RMV

Menkių kepenų aliejus, 1 šaukštas 1360 340 proc.

Lašiša laukinė, 100g 530 130 proc.

Lašiša veista, 100g 260 65 proc.

Tuna, 100g 200 50 proc.

Skumbrė, 100g 200 50 proc.

Sardinės, 100g 190 45 proc.

Šitake grybai, 100g 100 25 proc.

Jaučių kepenys, 100g 40 10 proc.

Kiaušinio trinys, 1 vienetas 20 5 proc.

RMV – referencinė maistinė vertė proc.

1.6. Vitamino D poveikis griaučių sistemai

Pagrindinė ir labiausiai ištirta vitamino D funkcija žmogaus organizme yra skeleto kalcio balanso išlaikymas skatinant kalcio absorbciją žarnyne, rezorbciją kauluose didinant osteoklastų kiekį, kalcio ir fosfato balanso palaikymas produktyviam kaulų susidarymui, parathormonų reguliavimas siekiant išlaikyti kalcio kiekį serume. Vitamino D trūkumas organizme gali privesti prie kauluose esančių mineralų tankio mažėjimo ir skatinti kaulų tankio (osteoporozės) ar kaulų lūžių riziką. Vitaminas D atlieka svarbia funkciją kaulų remodeliavimo procese stimuliuodamas kalcio ir kitų mineralų rezorbciją kauluose [30, 34].

Kalcio koncentracijos išlaikymas yra gyvybiškai svarbus normaliam nervų sistemos funkcionavimui, kaulų augimui ir kaulų tankio palaikymui. Vitaminas D yra būtinas siekiant veiksmingai panaudoti organizme cirkuliuojantį kalcį. Skydliaukės liaukos, esant mažėjančiai serumo

kalcio koncentracijai serume, sintezuoja ir išskiria parathormoną (PTH). PTH padidėjimas stimuliuoja 25-hidroksivitamino D3-1α-hidroksilazės fermento aktyvumą inkstuose, todėl padidėja 1α,25-dihidroksivitamino D sintezė. Aktyvi vitamino D forma (1α,25-dihidroksivitaminas D) išskiriama į kraujotaką ir transportuojama į tikslinius audinius. 1α, 25-dihidroksivitaminas skatina VDR aktyvavimą, dėl kurio vyksta genų ekspresijos pokyčiai, ko pasekoje aktyvuojami kalcio koncentraciją normalizuojantys procesai – skatinant kalcio absorbciją žarnyne, skatinant filtruoto kalcio reabzorbciją inkstuose ir kalcio mobilizavimą iš kaulų, kai kalcio kiekis nepakankamas norint palaikyti normalią kalcio koncentraciją serume [30, 34].

Kalcio ir fosforo homeostazės reguliacija glaudžiai susijusios, kalciotropiniai hormonai, PTH ir dihidroksivitaminas D taip pat kontroliuoja ir fosforo koncentraciją serume. 1α,25-dihidroksivitaminas D didina žarnyno fosforo absorbciją stimuliuodamas natrio fosfato kotransporterio išraišką plonojoje žarnoje. Nors PTH padidina fosforo išsiskyrimą šlapimu, mažindamas reabsorbciją inkstuose, dar nėra aišku, ar 1α, 25-hidroksivitaminas D gali tiesiogiai reguliuoti inkstų fosforo transportavimą [30].

Nuo vitamino D priklausomas I tipo rachitas

I tipo VDDR (VDDR-I), taip pat žinomas kaip pseudovitamino D trūkumo. VDDR-I yra autosominis recesinis sutrikimas. Pacientams, turintiems VDDR-I, yra inaktyvuojančių mutacijų CYP27B1 gene, esančių 12q13.3 sekoje, koduojančio fermentą [25- (OH) Dhidroksilazę arba 1-α-hidroksilazę], todėl vystosi 1-α-hidroksilazė trūkumas. Dėl to kalcidijolis nėra hidroksilinamas iki kalcitriolio, lėtėja normali kalcio absorbcija. VDDR-I būdinga ankstyva skeleto ligos pradžia (pirmaisiais gyvenimo metais), sunki hipokalcemija (kartais su tetanija) ir vidutinė hipofosfatemija. Pacientams būdinga emalio hipoplazija, raumenų silpnumas, hipotonija, motorinių funkcijų sutrikimas ir sutrikęs augimas. Progresuojant pacientams atsiranda klinikiniai radiologiniai požymiai nurodantys apie vitamino D trūkumo sukeltą rachitą, kaulų biopsija rodo osteomalacijos požymius. Biocheminis vertinimas rodo hipokalcemiją, padidėjusį PTH kiekį ir padidėjusį amino rūgščių ir fosfatų išsiskyrimą su šlapimu. Normalus kalcidiolio ir nukritęs kalcitriolio lygis serume yra būdingi biocheminiai VDR-I rodmenys. Ligos klinikiniai ir biocheminiai duomenys gali būti pataisyti gydymu 1,25 (OH) 2D preparatais. Dozė priklauso nuo ligos sunkumo ir kūno svorio. Pradinė vaistų rachito gydymui dozė yra 1 µg per parą. Ši dozė tęsiama tol, kol kaulai išgydomi. Po to, priklausomai nuo biocheminių tyrimų rezultatų, palaikomoji dozė svyruoja nuo 0,25 iki 1 µg per parą. Gydymo tikslas yra pasiekti normokalcemiją, palaikyti PTH lygį ir išvengti hiperkalciurijos [9, 10, 32].

II tipo VDDR taip pat žinomas kaip paveldimasis vitaminui D atsparus rachitas (HVDRR). HVDRR yra labai reta autosominė recesinė rachito forma, kuriai priklauso mažiau nei 50 žinomų pacientų. Jis susijęs su organų pasipriešinimu kalcitriolio pasisavinimui, paprastai sukelta genų, koduojančių vitamino D receptorius, mutacijomis. Receptoriaus defektas trukdo hormono-receptorių komplekso funkcijai, tokiu būdu užkertant kelią kalcitriolio veikimui. Nustatytos mutacijos ar vitaminų D receptoriaus defektai apima: a) 1,25 (OH) 2D nepavykusio prisijungimo prie esamų receptorių sutrikimą; b) sumažėjimą 1,25 (OH) 2D receptorių surišimo vietose; c) nenormalų susirišimą 1,25 (OH) 2D su receptoriais, d) nepakankamą 1,25 (OH) 2D receptoriaus komplekso perkėlimą į branduolį; e) sumažėjęs 1,25 (OH) 2D receptorių komplekso giminingumas dNA rišančiam domenui ir receptorių su cinko surišimo pirštais struktūros pokyčiai [9, 10, 32].

Klinikinis HVDRR spektras skiriasi priklausomai nuo vitamino D receptoriaus mutacijos tipo ir likusio vitamino D receptoriaus aktyvumo. Paveikti vaikai paprastai pasirodo įprasti gimdymo metu, tačiau rachitas išsivysto per pirmuosius du gyvenimo metus. Sindromo unikali ypatybė yra alopecija, kuri pastebima maždaug dviem trečdaliais atvejų ir yra ligos sunkumo žymuo. Alopecija atsiranda dėl nepakankamo vitamino D receptorių veikimo keratinocituose. Taip pat gali būti stebimos papildomos ektoderminės anomalijos, įskaitant daugybines epidermio cistas ir oligodontijas. HDVRR gydymas apima terapinį kalcitriolio ir kalcio papildų skyrimą. Atsakas priklauso nuo receptoriaus defekto sunkumo. Gydymas pradedamas kasdien skiriant 2 mikrogramus kalcitriolio ir 1000 mg kalcio. Gali prireikti labai didelių kalcitriolio dozių (iki 30-60 mikrogramų per parą) ir kalcio (iki 3 g per parą). Ilgalaikė kalcio infuzija į centrinę veną yra alternatyva atspariems pacientams ir turi būti tęsiama daugelį mėnesių. Gydyti kalciu per os gali pakakti, esant stebimam rentgenologiniam gijimui. Gydymo metu pacientai iš pradžių turėtų būti vertinami bent kartą per savaitę. Matuojamas kalcio, fosforo, ALP, kreatinino, 1,25 (OH) 2D, PTH koncentracijų ir šlapimo kalcio / kreatinino santykis serume. Jei nepavyksta sukelti biocheminių parametrų atsako, kalcitriolio dozę reikia palaipsniui didinti, kad koncentracija serume būtų 100 kartų didesnė už įprastą vidurkį. Jei po 3-5 gydymo mėnesių neišgaunamas biocheminis atsakas, reikia apsvarstyti gydymo nesėkmę [9, 10, 32].

1.7. Vitamino D poveikis imuninei / uždegiminei sistemai

Dendrito ląstelės (ang.k. dendric cells – DC) pasižymi stipriausiu antigeno pateikimu. 1,25 (OH) 2D3 slopina žmogaus dendrito ląstelių tolerogenines savybes – diferenciaciją, brendimą ir imunostimuliuojančias savybes. Molekuliniai mechanizmai, sąlygojantys tolerogenes dendrito ląstelių savybes, sumažina pagrindinio histologinio suderinamumo komplekso II ir kostimuliuojančių

molekulių (CD40, CD80, CD86) paviršiaus ekspresiją, reguliuoja inhibitorinių imunoglobulinui panašių transkripto 3 molekulių veiklą ir stiprina chemokino ligando 22 ir IL-10 sekeciją. Padidėjęs dendritų ląstelių tolerogeniškumas 1,25 (OH) 2D3 sukelia T-reguliuojančių ląstelių indukavimą, ko pasekoje slopinamas T-efektoriaus ląstelių uždegiminis atsakas. 1,25 (OH) 2D3 taip pat veikia tiesiogiai į VDR, esančius T limfocite, slopina jo proliferaciją. 1,25 (OH) 2D3 slopina prouždegiminių citokinų (IFNγ, IL-17 ir IL-21) gamybą CD4+CD25-T limfocituose ir skatino T-reguliacinių ląstelių, ekspresuojančios citotoksinį T limfocitų antigeną 4 ir FOXP334, gamybą. T-ląstelių citokinai kontroliuoja vitamino D metabolizmą makrofaguose. Th1 citokinas IFNγ reguliuoja makrofago CYP27B1, ko pasekoje 25 (OH) D3 skatinama biokonversija į aktyvųjį metabolitą 1,25 (OH) 2D3. Th2 citokinas IL-4 sukelia 25 (OH) D3 katabolizmą į neaktyvų 24,25 (OH) 2D3,35 metabolitą. Ši metabolizmo jungia ląstelių imuninius atsakus su įgimta imunine sistema [11, 12].

Kalcitriolis veikia per vitamino D receptorių, kuris moduliuoja genų, susijusių su imunine funkcija ir citokinų gamyba, ekspresiją. VDR ir CYP27B1 imuninėse, bronchų bei plaučių epitelio ląstelėse reguliuojami ekstraląstelinių patogenų. Prisijungęs prie VDR kalcitriolis monocituose, neutrofiluose ir epitelio ląstelėse aktyvuoja endogeninius antimikrobinius peptidus (katelicidinas LL-37, α-defensinas, β-defensinas, lipokalinas) ir azoto oksido sintazę. AMP slopina bakterijų, virusų ir grybelių infekciją, o NO sintazė reguliuoja aktyvuotų makrofagų oksidacinį aktyvumą. Vitaminas D sukelia Th2 atsaką kovojant su parazitų, protozonų ir grybelių ekstraląstelinėmis infekcijomis [11, 12].

Vitaminas D skatina apsauginį poveikį – stimuliuoja azoto oksido gamybą ko pasekoje mažėja oksidacinis stresas. Slopindamas ciklooksigenazės-1 išraišką ir reaktyviosios deguonies gamybą, vitaminas D slopina širdies susitraukimus, priklausančius nuo endotelio. Taip pat kalcitriolis slopina ciklooksigenazės 2 ekspresiją ir skatina prostaglandino katabolizmą, ko pasekoje sumažinamas prostaglandinų kiekis ir slopinama uždegiminių citokinų ekspresija endoteliocituose. 1,25 (OH) 2D3 slopina buferinių ląstelių susidarymą ir makrofagų cholesterolio įsisavinimą mažindamas receptorių-γ CD36 ekspresiją. Sukeldamas reguliuojamojo endoplazminio retikulumo stresą vitaminas D aktyvuoja antiaterogeninius monocitus / makrofagus .Vitamino D trūkumas sukelia padidėjusią uždegiminių citokinų ekspresiją epikardiniame riebaliniame audinyje. 1,25 (OH) 2D3 slopina kraujagyslių SMC proliferaciją ir apsaugo nuo VSMC morfologinių pokyčių, ko pasekoje dar labiau slopinama uždegiminių molekulių sekreciją [11, 13].

Vitaminas D skatina IL-10 sintezę, kartu sumažindamas prouždegiminių citokinų ekspresiją kvėpavimo takų lygiųjų raumenų ląstelėse (ang.k. SMC). Padidėjus TNFα ekspresija sumažina VDR išraišką ir mažina vitamino D aktyvumą. Skirtas vitamino D kiekis mažina TNFα lygį, taip padidindamas VDR ir prohibitino išraišką – sumažėja alerginis kvėpavimo takų uždegimas [11, 14].

Ankstyvieji vitamino D poveikio žmogaus adaptyviosioms imuninėms ląstelėms tyrimai parodė egzistuojančią branduolio VDR ir vitamino D aktyvuojančių fermentų išraišką tiek T, tiek B ląstelėse. Pažymėtina, kad šių ląstelių VDR ekspresija yra labai maža esant mažo aktyvumo metu, tačiau aktyvinant ir proliferuojant T ir B ląsteles VDR išraišką padidėja, ko pasekoje galima reguliuoti iki 500 į vitaminą D reaguojančių genų, kurie veikia šių ląstelių diferenciaciją ir proliferaciją. B ląstelėse antiproliferacinis kalcitriolio poveikis, pvz.: diferencijavimo, proliferacijos slopinimas, apoptozės iniciavimas ir sumažėjęs imunoglobulinų gamyba, iš pradžių buvo laikomi išskirtinai netiesiogiai tarpininkaujami T gelbėtojo (Th) ląstelių (ang.k. T helper cells). Naujausi tyrimai patvirtino papildomą tiesioginį kalcitriolio poveikį B ląstelių homoeostazei, įskaitant atminties slopinimą ir plazminių ląstelių gamybą, taip pat imunoglobuliną gaminančių B ląstelių apoptozės propagavimą. Ši B-ląstelių aktyvavimo ir proliferacijos kontrolė gali būti kliniškai svarbi autoimuninėms ligoms, nes B-ląstelės, gaminančios autoreaktyvius antikūnus, atlieka svarbų vaidmenį autoimunijos patofiziologijoje. Kitas svarbus prisitaikančių imuninių ląstelių tipas, T ląstelės, taip pat laikomas svarbiu įvairių vitaminų D formų imunoduliuojančio poveikio padariniu. Atliktoje apžvalgoje nustatyti keturi galimi mechanizmai, kuriais vitaminas D gali įtakoti T ląstelių funkciją:

1) tiesioginis endokrininis poveikis T ląstelėms, kontroliuojamas sistemiškai pernešant kalcitriolį;

2) tiesioginis 25 (OH) D perorientavimas į kalcitriolį T ląstelių pagalba;

3) tiesioginis parakrininis kalcitriolio poveikis T ląstelėms po 25 (OH) D konversijos į kalcitriolį monocitų arba dendritinių ląstelių pagalba;

4) netiesioginis poveikis antigeno pateikimui T ląstelėms, kontroliuojamas per lokalizuotą APC, paveiktą kalcitriolio.[20, 22, 23]

Iš esmės, vitamino D poveikis imuninės sistemos statusą pakeičia iš prouždegiminio į daugiau imuninę toleranciją, įskaitant ir labai įvairius poveikius T ląstelių potipiams: kalcitriolis slopina T pagalbininkų (TH) ląstelių proliferaciją, diferenciaciją ir moduliuoja savo citokinų gamybą. Visų pirma, gydymas T ląstelių su kalcitriolio arba analogų slopina uždegiminių Th1 (IL2, interferono-gama, auglio nekrozės faktoriaus alfa), Th9 (IL9) ir Th22 (IL22) citokinų sekreciją, bet skatina didesnę gamybą uždegiminių Th2 citokinų (IL3, IL4, IL5, IL10) [84]. Vitaminas D taip pat turi įtakos IL17 gaminant Th17 ląsteles. Buvo nustatyta, kad kalcitrioliu tiesiogiai slopinant IL17 gamybą transkripcijos lygyje ir aktyvuojant žmogaus T-ląsteles sumažėjo pagamintų IL17, interferono-gama ir IL21 lygiai [20, 22, 23].

Tas pats tyrimas taip pat atskleidė tolerogeninio fenotipo pokyčius, įskaitant padidėjusį reguliuojančių T ląstelių (Tregs) būdingų genų ekspresiją, papildant žmogaus pirminių T ląstelių kultūras kalcitriolio ir IL2 deriniu [20, 22, 23].

Vitamino D poveikis autoimuninėms ligoms

Autoimuninės ligos pasižymi imuninės homeostazės praradimu, ko pasekoje sutrinka savaiminio antigeno atpažinimas ir kūno audinys sunaikinamas autoreaktyvių imuninių ląstelių. Genetinių polinkių derinys, epidemiologiniai rizikos veiksniai ir aplinkos veiksniai prisideda prie autoimuninių ligų vystymosi. Vienas svarbus veiksnys gali būti pakankamas vitamino D kiekis – įvairūs epidemiologiniai tyrimai rodo ryšį tarp vitamino D trūkumo ir didesnio autoimuninių ligų, tokių kaip T1D, MS, sisteminės raudonosios vilkligės (SLE), reumatoidinio artrito (RA) ir uždegiminės žarnų ligos (IBD) dažnio. Gyvūnų modeliuose tiriant T1D, MS, SLE, IBD ir autoimuninį uveitą kalcitriolio vartojimas užkerta kelią arba sumažina autoimuninį poveikį. Tyrimai atlikti su gyvūnais, turinčiais vitamino D deficitą arba VDR nejautrą rodo padidėjusį uždegimų ir jautrumų T1D ir Krono ligai dažnį, sutrikdyta T ląstelių gyvavimą ir šeimininko apsaugą nuo bakterijų invazijos ir infekcijos. Dviejų šimtų devyniolikos paskelbtų tyrimų rezultatai ir padarytos išvados rodo, kad vitaminas D vaidina svarbų vaidmenį siekiant išvengti autoimuninio sutrikimo [21, 22, 23].

Vitamino D poveikis I tipo cukriniam diabetui

Viena iš cukrinio diabeto priežasčių (I tipo diabetas (T1D), II tipo diabetas (T2D)) yra insulino sekrecijos sumažėjimas β-ląstelėse. T1D atveju autoimuninė sistema yra pagrindinis faktorius, lemiantis β-ląstelių funkcionalumo mažėjimą. Vitaminas D mažina uždegiminius procesus, atsakingus už T1D, todėl vitamino D lygio sumažėjimas skatina šio imuninio atsako atsiradimą [20, 24].

Vitamino D trūkumo metu padidėja kanalų, kurie skatina kalcio jonų judėjimą į β-ląsteles, išraiška. Vitaminas D skatina buferinių komponentų, palaikančių žemą kalcio jonų lygį (pvz.: kalbindinas D-9k, kalbindinas D-28k, parvalbuminas, plazminės membranos ATPazė 1b (PMCA1b). Esant vitamino D trūkumui vyksta perteklinis kalcio jonų judėjimas į lasteles, sukeliama apoptozė ir β-ląstelių mirtis [23, 24].

Vitaminas D, kartu su Klotho ir Nrf2, reguliuoja daugelio antioksidacinių sistemų išraišką, mažinančią oksidacinį stresą, mažinant pernelyg didelį ROS signalizacijos kiekį. Sumažinant NADPH oksidazės (NOX) išraišką, mažnamas generuojamas ROS kiekis, tuo pačiu skatinama superoksido dismutazės sintezė, kuri konvertuoja superoksidą į vandenilio peroksidą. Vitaminas D taip pat padidina gliukozės 6-fosfato dehidrogenazės (G6PD), glutamato cisteino ligazės ir glutationo reduktazės ekspresiją, padidinama pagrindinio redokso buferio GSH sintezė. Didesnė glutationo peroksidazės ekspresija reguliuoja H2O2 konversiją į vandenį. Šis vitamino D gebėjimas palaikyti normalų kalcio jonų ir ROS lygį paaiškina, vitamino D trūkumo santykį su diabeto atsiradimu: sumažėjus vitaamino D

kiekiui, padidėja tiek kalcio jonų, tiek ROS kiekis, atsiranda pokyčiai β-ląstelėse, dėl kurių sumažėja ląstelių masė ir gebėjimas sintezuoti insuliną [23, 24].

Vitamino D poveikis išsėtinei sklerozei

Hipovitaminozė D yra siejama su padidėjusia išsėtinės sklerozės išsivystymo rizika: autoimuninė liga, pasireiškianti T ląstelių kontroliuojamu uždegiminiu procesu smegenų nervinėje sistemoje. Kalcitrioliui veikiant į T ląsteles užkertamas kelias ligos atsiradimui, moduliuojama T ląstelių kompoziciją labiau priešuždegiminiu būdu – sumažinamas Th17 ląstelių skaičius centrinėje nervų sistemoje. Vitamino D endogeninis vaidmuo – aktyviųjų antikūnių slopinimas, paremtas didėjančia VDR ekspresija įprastoje baltojoje MS pacientų dalyje, taip pat padidėjusia VDR ir CYP27B1 ekspresija [20, 21].

1.8 Vitamino D poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai

Vitamino D asociacija tarp kraujospūdžio ir hipertenzijos yra pastebima ir aprašoma įvairiuose tyrimuose jau daugiau kaip ketvirtį amžiaus. Daugiausiai ištirtas vitamino D su hipertenzija siejamas mechanizmas yra neigiamas RAS (renino-angiotenzino-aldosterono sistema) reguliavimas – padidėjęs RAS aktyvumas prisideda prie žmogaus hipertenzijos ir širdies ir kraujagyslių ligų rizikos [16, 18, 19].

Daugelis ląstelių rūšių, įskaitant kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles, endotelio ląsteles ir kardiomiocitus, gamina 1α-hidroksilazę, kuri 25-OH D paverčia kalcitrioliu. Vitamino D trūkumas sukelia renino-angiotenzino-aldosterono sistemos reguliavimo sutrikimus, pastebimus ir aprašomus atliekant tyrimus su pelėmis, kurioms buvo geetiškai pakeisti kalcitriolio metabolizmo, VDR funkcijos arba FGF23 ir klotų išraiška [16, 18, 19].

Atlikus preliminarius tyrimus su ląstelių modeliais, buvo rasta, kad lyginant su kardiomiuko ląstelėmis, kurios buvo kultivuotos nesant aktyvinto vitamino D, 1,25 (OH) D įdėjimas slopina ląstelių proliferaciją, sustiprina kardiomiukitų susidarymą, saugo nuo apoptozės ir paskatino genų, susijusių su ląstelių ciklo reguliavimu (ciklinų A1, C ir E bei ciklinų priklausomų kinazių Cdk2 ir Cdk4) sumažėjimą. Tai rodo, kad vitamino D skyrimas gydomosiomis dozėmis esant jo trūkumui gali padėti pagerinti širdies audinio struktūrą ir funkciją, taip sumažinant širdies ir kraujagyslių sistemos keliamą riziką [15, 17].

Vitaminas D taip pat yra susijęs kraujagyslių kalcifikacija. Aktyvuoto vitamino D vaidmuo kraujagyslių kalcifikacijoje vis dar išlieka paradoksu, tačiau pastaruoju metu atlikamų studijų su pelių

modeliais metu aiškėja, kad kalcitriolio ir parikalcitolio vartojimas dozėmis skirtomis antrinio hiperparatiroidizmo gydymui, apsaugo nuo aortos kalcifikacijos. Kita vertus, didesnės dozės skatina atvirkštinį procesą – aortos kalcifikaciją. Apsauginės 1,25 (OH) D dozės slopina aortos osteoblastino geno ekspresiją, kuri paprastai pastebima esant padidėjusiai CKD rizikai. Taip pat kraujagyslių kalcifikacija galima moduliuojant osteoblastinę kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių diferenciaciją, sustiprinant osteoblastų reguliavimo vaidmenį kraujagyslių kalcifikacijoje. Pastebėtas ryšys tarp vitamino D ir kraujagyslių sveikatos būklės klinikiniu požiūriu: pakitusios periferinės arterijos ligos dažnėjimas yra 80 proc. tarp NHANES dalyvių, turinčių mažiausią 25 (OH) D koncentraciją (17,8 ng/ml), palyginti su aukščiausia koncentracija (29,2 ng/ml) [15, 16, 18, 19].

1.9 Neuroprotekcinis vitamino D poveikis

Vitamino D įtaka centrinėje nervų sistemoje yra pagrįsta fermento 25 (OH) D3-1α-hidroksilazės, atsakingo už aktyvios vitamino D formos susidarymą, aktyvumu. Taip pat vitamino D įtaka grindžiama vitamino D receptorių lokalizacija smegenyse, daugiausia hipotalame ir dopaminerginiuose neuronuose esančiuose juodojoje medžiagoje (lot.k. substantia nigra). Sąveikaudamas su MARRS receptoriais, vitamino D hormoninė forma veikia įvairius viduląstelinius metabolizmo kelius. Be to, fermentas 1α-hidroksilazė ir branduoliniai VDR taip pat randami mikroglijoje (centrinės nervų sistemos neneuroninėse ląstelėse), kas rodo, kad kalcitriolis pasižymi ne tik autokrininiu, bet ir parakrininiu poveikiu nervinėms ląstelėms [25, 26, 28].

Neuroprotekcinis vitamino D poveikis pasireiškia palaikant ląstelinę kalcio jonų homeostazę, reguliuojant kalcio jonų antplūdžius į neuronus. Padidėjęs kalcio jonų kiekis nervų ląstelėse didina glutamo ir asparagino rūgščių išsiskyrimą, stimuliuojamas N-metil-D-aspartato (NMDA) receptorius ir atidaromas kalcio kanalas, sukeliama nervinių ląstelių depolarizacija ir padidėjęs kalcio jonų įtekėjimas per nuo įtampos priklausomus kalcio kanalus. Padidėjęs kalcio jonų kiekis citozolyje sukelia sinaptinių pūslelių surišimą su presinaptine membrana ir mediatorių išsiskyrimą. Kalcio perteklius nervinėse ląstelėse pasireiškia eksitotoksiškumu, skatinant stimuliuojančių neurotransmiterių (amino rūgščių ir kitų neuromediatorių) išsiskyrimą, azoto oksido sintezės (NOS) įjungimą ir reaktyvios deguonies formavimąsi, taip pat proteazių ir lipazių aktyvavimą, dėl kurių atsiranda plazminių ir mitochondrinių pažeidimų membranose. Šių fermentų aktyvumo sistemos prisideda apsaugant nervinius audinius nuo tokių neurodegeneracinių būklių kaip Parkinsono, Alzheimerio ar Huntingtono ligos [25, 26, 27].

2. TIRIAMOJO DARBO METODIKA

2.1. Tiriamojo darbo objektas

Tiriamieji objektai – maisto papildai, pateikiami įvairiomis farmacinėmis formomis (želatininės kapsulės, aliejinio pagrindo lašiukai, kieta danga dengtos tabletės), sudėtyje turintys vitamino D. Tiriamieji objektai pirkti tiriamojo darbo pradžioje ir buvo išlaikyti atsižvelgiant į gamintojų rekomenduojamas laikymo sąlygas. Atlikus vaizdinę analizę galima teigti, kad tiriamieji objektai išliko kokybiški bei nepakitę – laikymo sąlygos ir farmacinių formų kokybė įtakos tiriamajam darbui neturėjo.

Tiriamajam darbui buvo parinkti trijų farmacinių formų maisto papildai – aliejinio pagrindo lašiukai vartojimui per os, želatininės kapsulės, kieta danga dengtos tabletės. Analizei buvo naudoti: vienas aliejinių pagrindo lašiukų pavyzdys (Oilesen 10 µg), du dengtų tablečių pavyzdžiai (Ambio vaikams 10 µg ir Ambio 40 µg), trys želatinių kapsulių pavyzdžiai (Oilesen 25 µg, Vitamin D3 50 µg, Ambio 20 µg).

Tiriamųjų objektų kokybės vertinimas

Tiriamųjų objektų kokybė tiriamojo darbo metu buvo vertinama vizualiniu analizės metodu:  Aliejinio pagrindo lašiukai vartojimui per os, kurių pagrindas yra pirmo spaudimo

alyvuogių aliejus (angl.k. Virgin olive oil) – tiriamojo darbo metu išliko skaidrūs, permatomi, geltonos spalvos, nesusidarė mechaninių priemaišų, nesusidarė nuosėdų, tirpalas neišsisluoksniavo;

 Želatininės kapsulės vartojimui per os, kurių pagrindas yra pirmo spaudimo alyvuogių aliejus (angl.k. Virgin olive oil) ir transportuojamas želatininėse kapsulėse – tiriamojo darbo metu išliko nepakitusios, nesuminkštėjo, apvalkalas nesuiro ir nepakeitė splavos, netapo grubus.

 Kieta danga dengtos tabletės – tiriamojo darbo metu išliko nepakitusios, nesutrūkinėjo, netrupėjo, išlaikė savo formą, spalva nepakito.

Tiriamieji objektai buvo laikomi originaliose pakuotėse gerai vėdinamoje patalpoje, nekintančioje kambario temperatūroje (21 °C ± 1 °C), saugant nuo tiesioginių saulės spindulių ir ore esančio deguonies oksidacinio poveikio. Išpakavus ir pradėjus naudoti tiriamuosius objektus analizei skirtų ekstraktų gamybai, procesas buvo atliekamas sklandžiai ir skubiai, siekiant kuo trumpesnio ir mažesnio galimo ore esančio deguonies ir saulės šviesos poveikio.

2.2. Tiriamojo darbo metu naudoti reagentai

Tiriamojo darbo metu buvo naudojami šie reagentai:  Distiliuotas vanduo;

 Acetonitrilas (≥99,9 proc., Sigma-Aldrich, Izraelis);  Metanolis (≥99,8 proc., Sigma-Aldrich, Izraelis);

 Chloroformas (≥99 proc., Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);  Tetrahidro furanas (≥99 proc., Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);  Etanolis (≥ 95 proc., Sigma-Aldrich, Missouri,JAV);

 Koncentruota sieros rūgštis (≥ 95 proc., Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija);  Benzenas (≥37 proc., Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);

 Hexanas (≥ 95 proc., Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija);  Ledinė acto rūgštis (≥99 proc., Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);  Dietileteris (≥99 proc., Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);

2.3. Tiriamojo darbo metu naudota aparatūra

Distiliuoto vandens gamybai buvo naudojama MILIPORE (Darmstadt, Vokietija) vandens gryninimo sistema.

Gaminant analizei skirtus ekstraktus ir standartus medžiagų pasvėrimui buvo naudojamos Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) svarstyklės.

Gaminant analizei skirtus ektraktus iš kieta danga dengtų tablečių žaliavos smulkinimui buvo naudota trintuvė su piestele.

Gaminant analizei skirtus ekstraktus siekiant kokybiško tiriamosios medžiagos pasiskirstymo ir ištirpimo tirpiklyje buvo naudojama ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Ohio, JAV).

Gaminant mėginius, siekiant kokybiško fazių atskyrimo buvo naudota centrifugos apratas Centurion Scientific C2 Series.

Gaminant mėginius, siekiant kokybiško fazių atskyrimo buvo naudotas horinzontalus purtytuvas ELPAN laboratory shaker type 358 S (Lenkija).

Tiriamojo darbo metu siekiant palaikyti reikiamą temperatūrą ryškinamojo reagento aktyvavimo metu buvo naudota kaitlentė CAMAG TLC PLATE HEATER III.

Tiriamojo darbo metu siekiant kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti vitamino D koncentracijas plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodais buvo naudojamos plonasluoksnės chromatografavimo kameros CAMAG Twin Trough Chamber 20x20cm ir CAMAG Twin Trough Chamber 10x10cm (Muttenz, Šveicarija); chromatografinės aliuminio plokštelės, padengtos silikagelio sluoksniu (TLC Silica Gel 60 F254 20x20 cm) ir chromatografinės stiklinės plokštelės padengtos silikagelio sluoksniu (HPTLC Glass Plates Silica Gel 60, Polymeric Fluorescent Indicator) (Sigma-Aldrich) – sorbentas prisotintas fluorescencuojančiu indikatoriumi, kuris fluorescuoja jį paveikus 254nm ultravioletinių spindulių šviesa.

Tiriamojo darbo metu analizei skirti ekstraktai ant plokštelės buvo užnešami naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją CAMAG Linomat 5 (Muttenz, Šveicarija).

Tiriamojo darbo metu gauti chromatografinės plokštelės duomenys buvo analizuojami naudojant vizualizavimo prietaisą CAMAG TLC Visualizer (Muttenz, Šveicarija) ir programinę įrangą VisionCATS v2.0.

2.4. Vitamino D mėginių ruošimas

Atsižvelgiant į duomenis, gautus atlikus literatūros apžvalgą, buvo pasirinktos trys mėginių ruošimo metodikos norint įvertinti mėginių ruošimo tinkamumą atliekant tiriamųjų objektų analizę naudojant metodiką geriausiai atkūrusią esamo vitamino D kiekį tirtuose maisto papilduose.

Tiriamajam darbui, siekiant patikrinti galimybę tirti įvairių formų mėginius, buvo naudojami maisto papildai, pateikti trijomis skirtingomis farmacinėmis formomis:

1. Aliejinio pagrindo lašiukai, kurių pagrindą sudaro pirmo spaudimo alyvuogių aliejus: a. Oilesen, 1 lašas – 10 µg / 400 TV vitamino D;

2. Želatininės kapsulės, kurių pagrindą sudaro pirmo spaudimo alyvuogių aliejus: a. Oilesen, 1 želatininė kapsulė – 25 µg / 1000 TV vitmaino D;

b. Ambio, 1 želatininė kapsulė – 20 µg / 800 TV vitamino D; c. Vitamin D3, 1 želatininė kapsulė – 50 µg / 2000 TV vitamino D; 3. Kieta danga dengtos tabletės:

a. Ambio vaikams, 1 kieta danga dengta tabletė – 10 µg / 400 TV vitamino D; b. Ambio, 1 kieta danga dengta tabletė – 40 µg / 1600 TV vitamino D.

Ruošiant mėginius skirtingomis metodikomis mėginiai buvo ruošiami atitinkamai vienodai, naudoti kiekiai taipogi vienodi siekiant galimybės palyginti skirtingomis metodikomis paruoštų mėginių gautus rezultatus.

Aliejinio pagrindo lašiukai: 3 lašai (1 lašas – 10 µg vitamino D) 10 ml tikslaus matavimo kolboje skiedžiami 10 ml tirpiklio. Gautas tirpalas talpinamas į ultragarsinę vonelę BioSonic UC100 (Ohio, JAV) ir laikomas 10 minučių. Tuomet tirpalas filtruojamas per 0,45 µm PVDF filtrą į tamsaus stiklo buteliuką ir pateikiamas analizei.

Želatininės kapsulės: želatininės kapsulės turinys (1 želatininė kapsulė – 20, 25, 50 µg vitamino D) kokybiškai pernešamas į 10 ml tikslaus matavimo kolbą, skiedžiami 10ml tirpiklio. Gautas tirpalas talpinamas į ultragarsinę vonelę BioSonic UC100 (Ohio, JAV) ir laikomas 10 minučių. Tuomet tirpalas filtruojamas per 0,45 µm PVDF filtrą į tamsaus stiklo buteliuką ir pateikiamas analizei.

Kieta danga dengtos tabletės: kieta danga dengta tabletė (1 kieta danga dengta tabletė – 10, 40 µg vitamino D) grūstuvėje sutrinama iki homogeniškų miltelių pavidalo, milteliai kokybiškai pernešami į 10 ml tikslaus matavimo kolbą, skiedžiami 10 ml tirpiklio. Gautas tirpalas talpinamas į horinzontalųjį purtytuvą ELPAN laboratory shaker type 358 S (Lenkija) ir laikomas 5 minutes. Vėliau tirpalas talpinamas į ultragarsinę vonelę BioSonic UC100 (Ohio, JAV) ir laikomas 10 minučių. Išėmus iš vonelės tirpalas talpinamas į centrifugą ir laikomas 6 minutes esant 2500 rpm. Tuomet atskiriamos fazės, tirpalas filtruojamas per 0,45 µm PVDF filtrą į tamsaus stiklo buteliuką ir pateikiamas analizei.

Atliekant tiriamųjų objektų mėginių ruošimą remiantis G. Ponchon ir kt. 1968 rekomendacijomis kaip tirpiklis buvo naudotas chloroformas [37].

Atliekant tiriamųjų objektų mėginių ruošimą remiantis M. Trass ir kt. 2016 rekomendacijomis kaip tirpiklis buvo naudotas vandens ir acetonitrilo mišinys (1:1) [41].

Atliekant tiriamųjų objektų mėginių ruošimą remiantis K. Sarioglu ir kt. 2001 rekomendacijomis kaip tirpiklis buvo naudotas eteris [39].

2.5. Ryškinamojo reagento ruošimas

Prieš mėginių analizę buvo paruoštas ryškinamasis reagentas, susidedantis iš koncentruotos sieros rūgšties, ledinės acto rūgšties ir 10 proc. etanolio (1:1:8) remiantis A. M. Hossu ir kt. 2009 rekomendacijomis[40]: 18 ml distiliuoto vandens sumaišoma su 2 ml 96 proc. etanoliu. Tuomet į 16 ml gauto tirpalo laikantis saugaus darbo su rūgštimis taisyklių įpilama 2 ml koncentruotos sieros rūgšties ir 2 ml ledinės acto rūgšties. Gautas tirpalas sumaišomas ir naudojamas mėginių ryškinimui.

2.6. Vitamino D standartinio tirpalo ruošimas

Standartinis 1 mg / ml vitamino D tirpalas buvo ruošiamas naudojant vitamino D standartą: Naudojant analizines svarstykles Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) atsverta 10 mg vitamino D standarto, kokybiškai suberta į 10 ml tikslaus matavimo kolbą ir skiedžiami metodikoje naudojamu tirpikliu (chloroformas / vandens ir acetonitrilo mišinys (1:1) / eteris). Gautas tirpalas talpinamas į horinzontalųjį purtytuvą ELPAN laboratory shaker type 358 S (Lenkija) ir laikomas 5 minutes. Vėliau tirpalas talpinamas į ultragarsinę vonelę BioSonic UC100 (Ohio, JAV) ir laikomas 10 minučių. Išėmus iš vonelės tirpalas talpinamas į centrifugą ir laikomas 6 minutes esant 2500 rpm. Tuomet atskiriamos fazės, tirpalas filtruojamas per 0,45 µm PVDF filtrą į tamsaus stiklo buteliuką ir pateikiamas analizei.

2.7. Vitamino D kokybinis identifikavimas paruoštuose mėginiuose plonasluoksnės

ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodais

Vitamino D kokybinis identifikavimas mėginiuose atliktas taikant plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodus remiantis A. M. Hossu ir kt. 2009 rekomendacijomis [40]. Tyrimo procedūros buvo atliktos atitinkamai vienodai visiems skirtingomis metodikomis paruoštiems mėginiams. Prieš tyrimo pradžią paruošiama mobili fazė – heksano / eterio / benzeno mišinys (8:4:1).

Vitamino D kokybinio identifikavimo PC ir EPC metodais buvo naudojami paruošti skirtingų tirpiklių mėginiai ir standartinis vitamino D 1 mg/ml tirpalas.

Analizės PC metodu atlikimas: užnešama po 40 µl mėginių ir vitamino D standartinio 1 mg/ml tirpalo ant chromatografinės aliumininės silikagelio plokštelės pusiau automatiniu mėginių užnešėju.

Analizės EPC metodu atlikimas: užnešama po 10 µl mėginių ir vitamino D standartinio 1 mg/ml tirpalo ant chromatografinės stiklinės silikagelio plokštelės pusiau automatiniu mėginių užnešėju.

Tiek PC, tiek EPC analizėje naudotos mobiliosios fazės sudėtis buvo heksanas / eteris / benzenas (8:4:1). Ruošiantis analizei paruošta tirpiklių sistema supilama į chromatografavimo kamerą. Prieš dedant chromatografinę plokštelę, kamera uždengiama ir laikoma 10 minučių, kad pasklistų tirpiklių sistemos garai. Tuomet į chromatografavimo kamerą dedama chromatografinė plokštelė su užneštais standartinio 1 mg/ml vitamino D tirpalo ir mėginiais, laukiama kol tirpiklių sistema užkils iki pabaigos linijos. Išimta chromatografinė plokštelė džiovinama kambario temperatūroje traukos spintoje, kol visi tirpiklių pėdsakai and chromatografinės plokštelės išnyksta.

Chromatografinė plokštelė apipurškiama ryškinimuoju reagentu, dedama ant iki 110 °C temperatūros įkaitintos kaitlentės ir šildoma 10 minučių. Kaitinimo metu į temperatūrą reaguojant su mėginais susijungusiam ryškinamajm reagentui gaunama žalsvai mėlyna spalva šviesiai raudoname fone, kurios intensyvumas priklauso nuo esamos mėginių koncentracijos [40].

Vitamino D kokybinis identifikavimas patvirtinamas esant žalsvai mėlynom dėmėm, kurių Rf reikšmės sutampa su standartinio 1 mg/ml vitamino D tirpalo Rf reikšme.

2.8. Plonasluoksnės chromatografijos kiekybinio analizės metodo validacija

Plonasluoksnės chromatografijos analizės metodo validacija buvo atliekama pagal šiuos parametrus: metodo glaudumas (preciziškumas), specifiškumas, aptikimo riba, nustatymo riba, tiesiškumas.

Atlikus pakartojamumo ir atkuriamumo tyrimus buvo įvertintas analizės metodo preciziškumas. Glaudumas vertinamas atsižvelgiant į santykinį standartinį nuokrypį (SSN): SSN išreiškiamas procentais apskaičiuojant standartinio nuokrypio ir vidutinio smailės ploto santykį. Pakartojamumas: atliktos trys mėginio analizės tą pačią dieną (angl.k. intra-day); atkuriamumas: atliktos trys mėginio analizės trijų skirtingų dienų laikotarpiu (angl.k. inter-day).

Specifiškumas buvo vertinamas lyginant standartinio vitamino D tirpalo ir mėginiuose esančio vitamino D Rf reikšmių sutampamumą.

Atsižvelgiant į S/N santykį apsikaičiuojamos aptikimo (angl.k. limit of detection – LOD) ir nustatymo ribos (angl.k. limit of quantitation – LOQ). S/N santykis apskaičiuojamas lyginant vitamino D smailės aukštį su bazinės chromatogramos linijos triukšmu. Identifikavimo galimybės vertinamos lyginant standartinio vitamino D tirpalo ir mėginių Rf reikšmes; kiekybinio nustatymo galimybės vertinamos lyginant standartinių Vitamino D ir mėginių dėmių ryškumo analizės duomenis.

Tiesiškumas vertinamas atsižvelgiant į kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientą r2_.

2.9. Kalibracinės kreivės ruošimas kiekybiniam vitamino D nustatymui

Kalibracinės kreivės ruošimas buvo atliktas naudojant paruoštą standartinį vitamino D 1 mg/ml tirpalą pritaikant PC analizės metodą: užnešami 6 skirtingo kiekio standartinio tirpalo taškai (30, 35, 40, 50, 55, 60 µl) ant chromatografinės silikagelio plokštelės pusiau automatiniu mėginiu užnešėju.

Ruošiant kalibracinę vitamino D standarto kreivę mobiliosios fazės sudėtis buvo heksanas / eteris / benzenas (8:4:1). Paruošta tirpiklių sistema supilama į chromatografavimo kamerą. Prieš

dedant chromatografinę plokštelę, kamera uždengiama ir laikoma 10 minučių, kad pasklistų tirpiklių sistemos garai. Tuomet į chromatografavimo kamerą dedama chromatografinė plokštelė su užneštais standartinio 1 mg/ml vitamino D tirpalo ir mėginiais, laukiama, kol tirpiklių sistema užkils iki pabaigos linijos. Išimta chromatografinė plokštelė džiovinama kambario temperatūroje traukos spintoje, kol visi tirpiklių pėdsakai and chromatografinės plokštelės išnyksta.

Ryškinimo metu chromatografinė plokštelė apipurškiama ryškinimuoju reagentu, dedama ant iki 110 °C temperatūros įkaitintos kaitlentės ir šildoma 10 minučių. Kaitinimo metu į temperatūrą reaguojant su mėginais susijungusiam ryškinamajm reagentui gaunama žalsvai mėlyna spalva šviesiai raudoname fone, kurios intensyvumas priklauso nuo esamos mėginių koncentracijos [40].

Vitamino D kiekybinis nustatymas atliekamas gautus chromatografinės plokštelės duomenis analizuojant vizualizavimo prietaisu ir programine įranga.

2.10. Vitamino D kiekybinis nustatymas paruoštuose mėginiuose plonasluoksnės

chromatografijos analizės metodu

Vitamino D kiekybinio nustatymo PC metodu buvo naudojami pagal K. Sarioglu ir kt. 2001 rekomendacijas paruošti mėginiai ir standartinis vitamino D 1 mg/ml tirpalas [39].

Analizės PC metodu atlikimas: užnešama po 40 µl mėginių ir vitamino D standartinio 1 mg/ml tirpalo ant chromatografinės silikagelio plokštelės pusiau automatiniu mėginių užnešėju.

Analizėje naudotos mobiliosios fazės sudėtis buvo heksanas / eteris / benzenas (8:4:1). Ruošiantis analizei paruošta tirpiklių sistema supilama į chromatografavimo kamerą. Prieš dedant chromatografinę plokštelę, kamera uždengiama ir laikoma 10 minučių, kad pasklistų tirpiklių sistemos garai. Tuomet į chromatografavimo kamerą dedama chromatografinė plokštelė su užneštais standartinio 1 mg/ml vitamino D tirpalo ir mėginiais, laukiama kol tirpiklių sistema užkils iki pabaigos linijos. Išimta chromatografinė plokštelė džiovinama kambario temperatūroje traukos spintoje, kol visi tirpiklių pėdsakai ant chromatografinės plokštelės išnyksta.

Ryškinimo metu chromatografinė plokštelė apipurškiama ryškinimuoju reagentu, dedama ant iki 110 °C temperatūros įkaitintos kaitlentės ir šildoma 10 minučių. Kaitinimo metu į temperatūrą reaguojant su mėginais susijungusiam ryškinamajm reagentui gaunama žalsvai mėlyna spalva šviesiai raudoname fone, kurios intensyvumas priklauso nuo esamos mėginių koncentracijos [40].

Vitamino D kiekybinis nustatymas atliekamas gautus chromatografinės plokštelės duomenis analizuojant vizualizavimo prietaisu ir programine įranga. Vitamino D koncentracijos buvo apskaičiuojamos pagal anksčiau gautą kalibracinę kreivę.

2.11. Statistinės duomenų analizės ruošimas

Eksperimentinių duomenų apdorojimas buvo atliktas naudojant statistinį duomenų analizės paketą Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV). Kiekybinio nustatymo bandymai kartoti po tris kartus, jų gauti rezultatai išreikšti vidurkiais ± standartine išraiška.

3. TIRIAMOJO DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Maisto papildų, turinčių vitamino D, pateikiamų įvairiomis farmacinėmis

formomis, kokybės įvertinimas

Vizualiniu analizės metodu atlikus tiriamųjų objektų kokybės analizę tiriamojo darbo pradžioje ir atitinkamai kiekvieną kartą prieš ruošiant mėginius buvo nustatyta, jog visų tiriamųjų objektų išvaizda buvo nepakitus, tiek lašiukuose, tiek želatininių kapsulių užpilduose nesusidarė mechaninių priemaišų ir nuosėdų, lašiukai netapo drumsti ir nepakito jų spalva.

Aliejinio pagrindo lašiukai vartojimui per os, kurių pagrindas yra pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus (angl.k. Virgin olive oil) išliko skaidrūs, permatomi, geltonos spalvos, nesusidarė mechaninių priemaišų, nesusidarė nuosėdų, tirpalas neišsisluoksniavo.

Želatininių kapsulių vartojimui per os, kurių pagrindas yra pirmo spaudimo alyvuogių aliejus (angl.k. Virgin oilive oil) išliko nepakitusios, nesuminkštėjo, apvalkalas nesuiro ir nepakeitė splavos, netapo grubus, aliejus išliko skaidrus, permatomas, geltonos spalvos, nesusidarė mechaninių priemaišų, nesusidarė nuosėdų, neišsisluoksniavo.

Kieta danga dengtos tabletės išliko nepakitusios, nesutrūkinėjo, netrupėjo, išlaikė savo formą, spalva nepakito.

Atsižvelgiant į tai, jog tiriamieji objektai buvo laikomi originaliose pakuotėse gerai vėdinamoje patalpoje, nekintančioje kambario temperatūroje (21 °C ± 1 °C), saugant nuo tiesioginių saulės spindulių ir ore esančio deguonies oksidacinio poveikio ir tai, jog kokybinių pakitimų nebuvo nustatyta tiriamojo darbo metu, buvo prieita prie išvados, kad tiriamieji objektai buvo tinkami naudoti tiriamojo darbo metu.

3.2. Vitamino D kokybinis identifikavimas mėginiuose taikant plonasluoksnės

chromatografijos analizės metodą

Vitamino D esančio maisto papilduose, pateikiamuose įvairiomis faramcinėmis formomis, kokybinis nustatymas buvo atliekamas plonasluoksnės chromatografijos metodu, remiantis trimis skirtingomis monografijomis siekiant kiek įmanoma labiau kokybiško rezultato ir metodikų palyginimo. Kokybinio nustatymo rezultatai buvo vertinami lyginant gautus mėginių sulaikymo faktorius su standartinio vitamino D tirpalo duomenimis.

Atliekant vitamino D kokybinį nustatymą tiriamuose objektuose PC metodu buvo remtasi trijų skirtingų monografijų rekomendacijomis tirpiklių sistemomis, kurios buvo parinktos pagal atliktą literatūros apžvalgą.

Remiantis G. Ponchon ir kt. 1968 rekomendacijomis kokybiniam vitamino D identifikavimui kaip tirpiklis buvo naudotas chloroformas [37]. Atlikus bandymą buvo pastebėtas chromatografinių juostų išplitimas visoje chromatografinėje plokštelėje (2 pav.). Dėl šios priežasties kokybinis identifikavimas lyginant su standartinio tirpalo sulaikymo faktoriumi buvo neįmanomas. Toks chromatografinių juostų išplitimas gali būti paaiškinamas dideliu tirpiklio inertiškumu ir gebėjimu laisvai plisti ant chromatografinės juostelės išplečiant ir suliejant gretimų juostų ribas.

Remiantis M. Trass ir kt. 2016 rekomendacijomis kokybiniam vitamino D identifikavimui kaip tirpiklis buvo naudotas vandens ir acetonitrilo mišinys (1:1) [38]. Atlikus bandymą buvo pastebėta, kad tiek mėginai, tiek standartinis tirpalas liko ant užnešimo linijos (3 pav.), ko pasekoje nesusidarė chromatografinių juostelių ir kokybinis identifikavimas buvo neįmanomas. Toks reiškinys gali būti paaiškinamas tirpiklių sistemos savybių nederėjimu su nešančiosios fazės sistema ir vitaminas D nėra nešančiosios fazės pernešamas iš užnešimo taškų ir nesusidaro chromatografinės juostos.

3 pav. Chromatograma atlikta kaip tirpiklį naudojant vandens ir acetonitrilo mišinį (1:1)

Remiantis K. Sarioglu ir kt. 2001 rekomendacijomis kokybiniam vitamino D identifikavimui kaip tirpiklis buvo naudotas eteris [39]. Atlikus bandymą buvo gauta vitamino D tapatybę patvirtinanti chromatograma (4 pav.). Gautos mėginių Rf reikšmės buvo Rf1=0,670, Rf2=0,668, Rf3=0,665, Rf4=0,668, Rf5=0,667, Rf6=0,670, ±0,03, o standarto RfS reikšmė – 0,670. Atsižvelgiant į gautus rezultatus galima teigti, jog vitaminas D buvo nustatytas tiriamuosiuose mėginiuose.