FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
AGNĖ KONTRIMAITĖ
KODEINO IR DIFENHIDRAMINO MIŠINIO ANALIZĖ TAIKANT
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS (PC) IR EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC) ANALIZĖS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas _________ _______ (Parašas) (Data)
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
KODEINO IR DIFENHIDRAMINO MIŠINIO ANALIZĖ TAIKANT
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS (PC) IR EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC) ANALIZĖS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas _________ _______ (Parašas) (Data) Kaunas, 2018 Darbą atliko Magistrantė Agnė Kontrimaitė Data Recenzentas
Vardas Pavardė Parašas Data
Turinys
SANTRUMPOS ... 8
1. ĮVADAS ... 9
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
3.1. Tiriamųjų medžiagų apžvalga ... 11
3.1.1. Kodeinas ... 11
3.1.2. Difenhidraminas ... 12
3.2. Kodeino ir difenhidramino vartojimo paplitimas ... 14
3.2.1. Kodeino ir difenhidramino vartojimo paplitimas Lietuvoje ... 14
3.2.2. Kodeino ir difenhidramino vartojimo paplitimas kitose šalyse ... 15
3.3. Apsinuodijimo kodeinu ir difenhidraminu statistika ... 17
3.4. Kodeino ir difenhidramino toksiškumas... 18
3.4.1. Kodeino toksiškumas ... 18
3.4.2. Difenhidramino toksiškumas ... 19
3.5. Kodeino ir difenhidramino kokybinė analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 19
3.5.1. Plonasluoksnė chromatografija (PC) ... 19
3.5.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti kodeiną ir difenhidraminą. ... 20
3.6. Kodeino ir difenhidramino kokybinis vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu 21 3.6.1. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) ... 21
3.6.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti kodeiną ir difenhidraminą ... 21
4. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 23
4.1. Tyrimo objektas ir metodika ... 23
4.1.1. Tyrimo objektas ... 23
4.1.2. Kokybinis ir kiekybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 23
4.1.3. Kokybinis ir kiekybinis vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 26
4.1.4. Duomenų apdorojimas ... 27
4.2. Rezultatai ir jų aptarimas ... 27
4.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodo pritaikymas ... 27
4.2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo pritaikymas ... 31
4.2.4. Pritaikytos efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 32
4.2.5. Vaistinių preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 37
5. IŠVADOS ... 40
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41
SANTRAUKA
KODEINO IR DIFENHIDRAMINO MIŠINIO ANALIZĖ TAIKANT PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS (PC) IR EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC)
ANALIZĖS METODUS
Agnės Kontrimaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. A. Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: kodeinas, difenhidraminas, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių
chromatografija, kokybinis vertinimas, kiekybinis vertinimas.
Darbo tikslas: taikant kodeino ir difenhidramino mišinio tyrimui plonasluoksnės chromatografijos
ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus, sukurti ir pritaikyti mišinio atskyrimo, identifikavimo bei kiekybinio nustatymo metodikas.
Tyrimo objektas ir metodai: taikant plonasluoksnės chromatografijos (PC) ir efektyviosios
skysčių chromatografijos (ESC) metodikas, analizuoti etaloniniai 1 mg/ml koncentracijos kodeino ir difenhidramino etanoliniai tirpalai ir jų mišinys. PC analizei tirpiklių sistemoms naudoti etilo acetatas, metanolis ir 25 % amoniako tirpalas. Dėmių ryškinimui naudota UV šviesa (254 nm). ESC medžiagų atskyrimui ir identifikavimui naudotas chromatografas Waters 2695, detekcijai - fotodiodų matricos detektorius Waters 996. Judriajai fazei naudoti tirpikliai– sieros rūgšties tirpalas vandenyje ir acetonitrilas.
Parinktos PC ir ESC metodikos pritaikytos tiriant trichlormetaninius darbinius tirpalus, pagamintus iš „Ultracod“ vaistinio preparato bei difenhidramino ekstemporalaus vaistinio preparato.
Rezultatai ir išvados: įvertinimui PC metodu, tirpiklių sistema, tinkama kodeino ir
difenhidramino mišinio kokybiniam vertinimui – TE (etilo acetatas: metanolis: 25 % amoniako tirpalas (85:10:5). Ši tirpiklių sistema yra tinkama tiriamųjų medžiagų mišinio kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose.
Tiriamų medžiagų kokybiniam ir kiekybiniam vertinimui ESC metodu naudota Waters Acquity C18 250 x 4.6 mm, 5 µm chromatografinė kolonėlė. Taikomas gradientinis eliuavimo režimas. Tėkmės greitis - 1 ml/min. Injekcijos tūris - 10 μl. Detekcijai naudotas fotodiodų matricos detektorius. Medžiagų UV absorbcijos spektrai, išmatuoti fotodiodų matricos detektoriumi, atitinka pateiktus mokslinėje literatūroje. Metodika yra tinkama kodeino ir difenhidramino mišinio kokybiniam bei kiekybiniam vertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose.
SUMMARY
CODEINE AND DIPHENHYDRAMINE MIXTURE ANALYSIS USING THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) AND HIGH-PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHODS
Key words: codeine, diphenhydramine, thin-layer chromatography, high-performance liquid
chromatography, qualitative analysis, quantitative analysis.
Aim: to create and adapt thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography
methodics for codeine, diphenhydramine and their mixture separation, qualitative and quantitative analysis.
Analysis object and methods: for analysis assessment using TLC and HPLC, the analysis was
conducted using 1 mg/ml codeine and diphenhydramine reference solutions and their mixture. Ethyl acetate, methanol and 25 % ammonia solution were used as mobile phase solvents for TLC. UV light (254 nm) was used for spot visualization. For medical substances separation and indetification by HPLC method chromatograph Waters 2695 and photo diode array detector Waters 996 were used. Sulfuric acid solution in water and acetonitrile were used as eluents.
The mentioned TLC and HPLC methodics were adapted to trichlormethane test solutions of codeine (extracted from a paharmaceutical product „Ultracod“) and diphenhydramine (extracted from an extemporal medicine).
Results and conclusion: the suitable solvent system for codeine and diphenhydramine TLC analysis
is TE (ethyl acetate: methanol: 25 % ammonia solution (85:10:5)). This system is suitable for tested compounds detection and qualitative determination as well as for analysis in pharmaceutical products.
Tested compounds were assessed by HPLC qualitative and quantitative analysis using Waters Acquity C18 250 x 4.6 mm, 5 µm chromatographic column. Gradient elution mode was used, flow rate - 1 ml/min, injection volume - 10 μl. Photodiode array detector was used. Examined compounds UV absorbtion spectra were analogical to the ones found in scientific literature. This system is suitable for tested compounds detection and qualitative determination as well as for analysis in pharmaceutical products.
PADĖKA
Noriu nuoširdžiai padėkoti visiems, padėjusiems rengiant magistro baigiamąjį darbą. Dėkoju savo magistro baigiamojo darbo vadovui doc. dr. Andrejui Ževžikovui už visapusę pagalbą, patarimus ir konsultacijas atliekant tyrimus ir rašant baigiamąjį magistro darbą. Didelę padėką reiškiu visai Analizinės ir toksikologinės chemijos katedrai, ypatingai katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui ir asist. lab. Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant eksperimentinius tyrimus. Taip pat esu labai dėkinga Kauno „Ąžuolyno“ vaistinei, pagaminusiai tiriamąjį ekstemporalų vaistinį preparatą.
SANTRUMPOS
DDD – nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
PC – plonasluoksnė chromatografija Rf – sulaikymo rodiklis
TS – tirpiklių sistema UV – ultravioletinė šviesa
1. ĮVADAS
Pagal Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenis, vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje per ketverius metus nuo 2011 metų iki 2015 metų išaugo nuo 885 DDD/1000 gyventojų per dieną (2011 m.) iki 1063 DDD/1000 gyventojų per dieną (2015 m.). Kodeino fosfato hemihidrato suvartojimas padidėjo nuo 0,106 DDD/1000 gyventojų/per dieną iki 0,225 DDD/1000 gyventojų/per dieną. Difenhidramino vaistinių preparatų vartojimas sumažėjo per pastaruosius metus, tačiau ši medžiaga yra viena dažniausiai nustatomų mišinių teismo ekspertizėje sudedamoji dalis. Difenhidramino ir kodeino mišinys yra vienas dažniausiai pasitaikančių teismo medicinoje. Vis didėjantis šių preparatų vartojimas yra susijęs ir su medicininiais, ir su toksiniais apsinuodijimais. Todėl yra svarbu tiksliai ir greitai nustatyti apsinuodijimą sukėlusias medžiagas, kad būtų galima išvengti nepageidaujamų reiškinių ar mirties. Darbe pateikiama bei nagrinėjama literatūra, susijusi su tiriamųjų preparatų savybėmis, farmakologiniu poveikiu, jų svarba, apsinuodijimų atvejais, paplitimu Lietuvoje bei užsienyje.
Apžvelgiama kodeino ir difenhidramino mišinio kokybinė ir kiekybinė analizė taikant plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodikas. Darbo eksperimentinėje dalyje pateikiamos mišinio komponentų atskyrimo, identifikavimo bei kiekybinio nustatymo metodikos taikant plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimo metodus.
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Taikant kodeino ir difenhidramino mišinio tyrimui plonasluoksnės
chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus, sukurti ir pritaikyti mišinio atskyrimo, identifikavimo bei kiekybinio nustatymo metodikas.
Darbo uždaviniai:
1. Sukurti ir pritaikyti (remiantis atskirų mišinio komponentų analizės rezultatais) plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, tinkamas kodeino ir difenhidramino mišinio kokybinei ir kiekybinei analizei.
2. Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos metodiką kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš vaistinių preparatų, mišinio skirstymui bei komponentų kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui. 3. Adaptuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš
vaistinių preparatų, mišinio skirstymui bei komponentų kokybiniam įvertinimui.
4. Sukurti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš vaistinių preparatų, mišinio komponentų kiekybiniam įvertinimui. Atlikti metodikos validaciją.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Tiriamųjų medžiagų apžvalga
3.1.1. Kodeinas
Kodeinas yra opioidinis analgetikas, panašus į morfiną, bet su silpnesnėmis analgetinėmis savybėmis ir silpnu sedaciniu poveikiu. Veikia centrinę nervų sistemą slopindamas kosulį. Lietuvoje kodeinas yra registruotas kaip šie vaistiniai preparatai: ,,CoCodamol”, ,,Paracetamol/Codeine Torrent”, ,,Ultracod” – sudėtyje kartu yra ir paracetamolis, ,,Solpadeine” – sudėtyje kartu yra parecetamolis bei kofeinas [1].
Cheminė formulė: C18H21NO3.
Molekulinė masė: 299,3642 g/mol.
IUPAC pavadinimas: (5α,6α)-7,8-didehidro-4,5-epoksi- 3-metoksi-17-metilmorfinan-6-olis [2].
Cheminės-fizikinės savybės, tirpumas
Kodeinas yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai arba bespalviai kristalai. Gerai tirpūs verdančiame vandenyje ir lengvai tirpūs etanolyje (96 %) [3].
Farmakologinės savybės
Kodeinas yra gamtoje randamas fenantreno struktūros alkaloidas ir opioidas su analgetiniu, antidiarėjiniu ir kosulį slopinančiu veikimu. Žarnyno mu (μ) receptorių stimuliavimas sukelia sumažėjusį žarnyno judrumą ir uždelstą žarnyno tranzito laiką. Kosulį slopinantis poveikis pasireiškia dėl kosulio centro slopinimo smegenyse [4]. Kodeinas turi palyginti nedidelį analgetinį poveikį. Jis nesukelia stipraus kvėpavimo slopinimo, bet pasižymi veiksmingu kosulį slopinančiu poveikiu. Kodeinas padidina kosulio centro stimulo slenkstį, dėl to ir pasireiškia veikimas. Didžiojoje dalyje populiacijos apie 10 % kodeino yra verčiama į morfiną demetilinimo būdu kepenyse sukeliant analgetinį veikimą [5].
Veikimo mechanizmas
Kodeino veikimo mechanizmas yra panašus į kitų opioidų, tačiau poveikio stiprumas yra lygus tik 1/10 morfino stiprumo. Kodeinas yra lipofilinis, todėl praeina per kraujo-smegenų barjerą [6]. Kodeinas
jungiasi prie opioidinių receptorių daugelyje CNS vietų. Mu receptorių stimuliacija sumažina nociceptinių neurotransmiterių atpalaidavimą, tokių kaip medžiaga P, GABA, dopaminas, acetilcholinas ir noradrenalinas. Kodeino metabolitas morfinas sukelia su G baltymų susijusių vidinių korekcinių kalio kanalų atidarymą ir blokuoja N tipo įtampos valdomus kalcio kanalus, taip sukeldamas hiperpoliarizaciją ir sumažėjusį neuronų sužadinimą [4].
Absorbcija
Virškinimo trakte kodeinas absorbuojamas greitai ir beveik visas. Didžiausia koncentracija kraujo plazmoje atsiranda maždaug po 2 valandų [7].
Pasiskirstymas
Išgėrus vieną 30 mg kodeino fosfato dozę, koncentracija kraujo plazmoje būna maždaug 0,25 mol/l [7].
Metabolizmas
Kodeinas yra metabolizuojamas CYP2D6 kepenų fermentų sistemos, todėl yra vaistų sąveikos rizika (pvz., ta pačia fermentų sistema yra metabolizuojami ir bupropionas, celekoksibas, cimetidinas, kokainas – inhibitoriai ir deksametazonas bei rifampicinas – induktoriai). Dalis kodeino metabolizuojama į morfiną. Manoma, kad yra aktyvus ir kitas kodeino metabolitas – kodeino-6-gliukuronidas (C6G). Kiti metabolitai – morfino-3-gliukuronidas (M3G) ir morfino-6-gliukuronidas (M6G). Tarp žmonių paplitęs didelis fermentų CYP450 heterogeniškumas, todėl kodeinas gali veikti ne visose populiacijose, nes tai yra provaistas. Kodeino gyvavimo pusperiodis trunka 3 valandas [8].
Eliminacija
Didžioji dalis vaisto ir jo metabolitų išsiskiria pro inkstus. Du trečdaliai išskiriamo kiekio išsiskiria per pirmas 6 valandas. Poveikis išsilaiko 4–6 val. [7]. Po IV injekcijos kodeinas yra greitai pašalinamas iš organizmo, gyvavimo pusperiodis trunka 1,22 valandos, klirensas – 29,94 ml/min/kg, pasiskirstymo tūris – 3,17 l/kg. Aptiktas nežymus morfino kiekis, bet didelis C6G kiekis (Cmax = 735,75 ng/ml). Po
peroralinio kodeino pavartojimo, gyvavimo pusperiodis buvo šiek tiek ilgesnis – 1,6 valandos [9].
Difenhidraminas yra H1 receptorių antagonistas, naudojamas esant
alerginėms reakcijoms, kaip hipnotikas, kartais įeina į preparatų nuo peršalimo sudėtį [10]. Lietuvoje difenhidraminas yra registruotas kaip šie vaistiniai preparatai: ,,Coldistan” – sudėtyje kartu su nafazolinu ir ,,Psylo-balsam” [11]. Cheminė formulė: C17H21NO.
Molekulinė masė: 255,3547 g/mol.
IUPAC pavadinimas: [2-(difenilmetoksi)etil]dimetilaminas [10]. Cheminės-fizikinės savybės, tirpumas
Difenhidraminas yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai. Gerai tirpūs vandenyje ir lengvai tirpūs etanolyje [3].
Farmakologinės savybės
Difenhidraminas yra etanolaminų klasės antihistaminas. Etanolamininiai antihistaminai pasižymi antimuskarininiu veikimu ir sukelią sedaciją. Be įprastų alergijos simptomų, difenhidraminas taip pat efektyvus gydant dirginantį kosulį, pykinimą, vėmimą ir svaigulį, susijusį su judėjimu. Jis taip pat naudojamas vaistų sukeltiems ekstrapiramidiniams simptomams, lengvos formos Parkinsonizmui gydyti [12].
Veikimo mechanizmas
Kitaip nei kromolinas, kuris blokuoja histamino išsiskyrimą, difenhidraminas konkuruoja su laisvu histaminu dėl histamino receptorių aktyviųjų centrų. Difenhidraminas konkurenciškai antagonistiškai veikia panaikindamas histamino poveikį histamino receptoriams virškinamajame trakte, gimdoje, kraujagyslėse ir bronchuose. Etanolamino dariniai turi stipresnį anticholinerginį poveikį nei kitos antihistamininės medžiagos. Šis anticholinerginis veikimas pasireiškia dėl centrinio antimuskarininio poveikio, kuris taip pat gali būti atsakingas už antiemetinį poveikį [12].
Absorbcija
Gerai absorbuojamas po peroralinio ar IM vartojimo [13], [14].
Pasiskirsto visame organizme, be to, 85 šios vaistinės medžiagos prisijungia prie plazmos baltymų [14]. Maksimali koncentracija kraujo plazmoje būna apie 133,2 ng/ml. Laikas, kuris trunka, kol pasiekiama ši koncentracija – 1,7 val. Pasiskirstymo tūris - 17,4 l/kg [13].
Metabolizmas
Difenhidramino metabolizmas vyksta kepenyse dalyvaujant citochromo P450 sistemai. Pagrindinis difenhidramino metabolinis kelias – N-demetilinimas. Iš visų fermentų, CYP2D6 parodė didžiausią aktyvumą. Aptikti ir kiti difenhidramino metabolizme dalyvavę, bet mažiau pasižymėję, fermentai: CYP1A2, CYP2C9 ir CYP2C19. Iš pradžių difenhidraminas yra demetilinamas iki N-demetildifenhidramino, tada seka demetilinimas iki didemetildifenhidramino. Tada N,N-didemetildifenhidraminas yra metabolizuojamas oksidacinio deamininimo būdu iki difenilmetoksiacto rūgšties [15].
Eliminacija
Didžioji difenhidramino ir jo metabolitų dalis yra šalinama su šlapimu, tačiau maža dalis yra šalinama ir su tulžimi. Difenhidramino eliminacijos pusperiodis yra 9,2 val. Klirensas = 23,3 ml/min/kg [13].
3.2. Kodeino ir difenhidramino vartojimo paplitimas
3.2.1. Kodeino ir difenhidramino vartojimo paplitimas Lietuvoje
Vaistinių preparatų suvartojimo statistika vertinama ir pateikiama naudojant ATC/DDD metodologiją (ATC – anatominė terapinė cheminė klasifikacija, DDD – nustatyta paros dozė). Šią metodologiją rekomenduoja naudoti Pasaulinės sveikatos organizacija. Vaistų suvartojimas yra pateikiamas DDD skaičiumi, tenkančiu 1000 gyventojų per vieną dieną.
2016 metais Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) ataskaitoje apie suvartotus vaistus nurodoma, kad nervų sistemą veikiančių vaistų (šiai grupei priklauso kodeinas) vartojimas vis didėja. Nuo 2012 m. iki 2016 m. šis vartojimas padidėjo nuo 136,402 DDD/ 1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną iki 155,139 DDD/ 1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną. Kvėpavimo sistemą veikiančių vaistų (šiai grupei
priklauso difenhidraminas) vartojimas taip pat padidėjo – nuo 63,301 DDD/ 1000 gyv./ per dieną iki 69,721 DDD/ 1000 gyv./ per dieną.
Kodeinas priklauso natūralių opijaus alkaloidų pogrupiui, pagal ATC klasifikaciją koduojamam N02AA. Bendras natūralių opijaus alkaloidų suvartojimas nuo 2012 m. iki 2016 m. išaugo 55 % (2012 m. suvartojimas siekė 0,321 DDD/ 1000 gyv./ per dieną, o 2016 m. – 0,496 DDD/ 1000 gyv./ per dieną). Pagal 2016 m. vaistų suvartojimo ataskaitą, paracetamolio ir kodeino mišinio vartojimas pralenkė morfino vartojimą (1 lentelė) [16].
1 lentelė. Natūralių opijaus alkaloidų suvartojimas Lietuvoje 2012 – 2016 metais (šaltinis: VVKT Vaistų vartojimo Lietuvoje 2016 m. ataskaita).
ATC
kodas Pavadinimas
DDD/1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną
2012 m. 2013 m. 2014 m. 2015 m. 2016 m. N02AA Natūralūs opijaus alkaloidai 0,321 0,360 0,391 0,449 0,496 N02AA01 Morfinas (DDD 0,1 g/O; 30
mg/P) 0,196 0,214 0,228 0,224 0,224
N02AA59 Paracetamolis+Kodeino fosfato hemihidratas 0,125 0,146 0,163 0,225 0,272
Difenhidraminas priskiriamas prie derinių su simpatomimetikais (išsk. kortikosteroidus) pogrupio. Nors difenhidramino suvartojimas Lietuvoje nuo 2012 iki 2016 ir sumažėjo, ši medžiaga mišinyje kartu su 7-aminoklonazepamu bei metadonu ir mišinyje kartu su morfinu, kodeinu bei 6-monoacetilmorfinu priklauso vieniems iš dažniausiai aptinkamų mišinių teismo ekspertizėje.
3.2.2. Kodeino ir difenhidramino vartojimo paplitimas kitose šalyse
Globaliu mastu kodeino vartojimas, kaip ir Lietuvoje, kasmet vis didėja. Pagal šalių skaičių, kuriose kodeinas yra vartojamas, jis užima pirmą vietą sąraše iš visų opioidų. Kodeino vartojimas pasaulyje pasiekė piką 2009 metais, kai buvo suvartota 257 tonos šios medžiagos. 2010 metais kodeino vartojimas šiek tiek sumažėjo, siekdamas 254 pagamintas tonas. Toks išaugęs kodeino vartojimas
labiausiai paplitęs turtingesnėse šalyse, tokiose kaip Australijoje, Kanadoje, Japonijoje, Naujojoje Zelandijoje, Jungtinėse Amerikos Valstijose ir keliose Europos šalyse [17].
Norint tiksliau įvertinti kodeino vartojimą užsienio šalyse, buvo analizuotos Suomijos (2014-2017 m.) ir Estijos (2012-2016 m.) vaistų suvartojimo statistikos. Suomijoje kodeinas yra priskiriamas kitam pogrupiui nei Lietuvoje: vietoj priklausomumo „natūralių opijaus alkaloidų“ pogrupiui, Suomijoje kodeinas su paracetamoliu arba ibuprofenu priskiriamas „opioidų kombinacijoje su neopioidiniais analgetikais“ pogrupiui. Suomijoje kodeino su paracetamoliu vartojimas nuo 2014 m. iki 2017 m. šiek tiek sumažėjo. 2014 metais suvartojimas siekė 8,81 DDD/ 1000 gyv./ per dieną, o 2017 m. suvartojimas siekė 7,11 DDD/ 1000 gyv./ per dieną. Panaši tendencija matoma ir kodeino mišiniui su ibuprofenu: 2014 m. suvartojimas siekė 0,28 DDD/ 1000 gyv./ per dieną, o 2017 m. suvartojimas sumažėjo iki 0,10 DDD/ 1000 gyv./ per dieną. Nors kodeino suvartojimas Suomijoje ir mažėja, tačiau palyginus kodeino suvartojimą su Lietuva ar Estija, jis yra daugiau negu 3 kartus didesnis nei Estijoj ir daugiau nei 20 kartų didesnis nei Lietuvoje [18].
Estijoje kodeinas randamas tik mišinyje kartu su paracetamoliu. Šis mišinys priklauso N02AJ pogrupiui, pavadinimu „opioidai kombinacijoje su neopioidiniais analgetikais.“ Kodeino ir paracetamolio mišinio suvartojimas nuo 2012 m. iki 2016 m. padidėjo daugiau nei dvigubai. 2012 m. suvartojimas siekė 0,94 DDD/ 1000 gyv./ per dieną, o 2016 m. suvartojimas siekė 2,4 DDD/ 1000 gyv./ per dieną [19]. Palyginus Lietuvos, Suomijos ir Latvijos kodeino suvartojimą, didžiausias pokytis pastebimas Estijoje (1 diagrama). Suomijoje bei Estijoje difenhidraminas nėra registruotas.
1 diagrama. Palyginamas kodeino suvartojimas Lietuvoje, Suomijoje ir Estijoje 2012- 2017 metais.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2012 m. 2013 m. 2014 m. 2015 m. 2016 m. 2017 m.
Kodeino suvartojimas, išreikštas DDD/ 1000 gyv./ per dieną
Terapijoje difenhidraminas yra mažiau vartojamas nei kodeinas, tikėtina, kad šį antihistamininį vaistą keičia naujesnės kartos antihistamininiai vaistai, turintys mažiau šalutinių poveikių. Tačiau išlikęs difenhidramino vartojimas kelia problemų dėl nelegalios vartojimo paskirties. Tai ypač paplitę Vidurio Azijoje: Kirgizijoje [20] bei Tadžikistane. Šiose šalyse difenhidraminas plačiai paplitęs kalėjimuose tarp kalinių [21].
Atlikus kodeino ir difenhidramino suvartojimo analizę Lietuvoje, Estijoje bei Suomijoje, pastebimas nuoseklus kodeino suvartojimo didėjimas (1 diagrama). Išskyrus Suomiją, kur kodeino DDD/ 1000 gyv./ per dieną nuo 2014 metų iki 2017 metų sumažėjo 20 % nuo 8,81 DDD/ 1000 gyv./ per dieną iki 7,11 DDD/ 1000 gyv./ per dieną. Priešingai nei Suomijoje, Estijoje vartojimas stipriai padidėjo – 2016 metais kodeino suvartojimas siekė 2,4 DDD/ 1000 gyv./ per dieną, t.y. daugiau nei dvigubai lyginant su 2012 metais. Nors Suomijoje ir mažėja kodeino suvartojimas, jis išlieka didesnis nei Lietuvoje ar Estijoje.
3.3. Apsinuodijimo kodeinu ir difenhidraminu statistika
Pagal 2017 metais Jungtinių Tautų paskelbtą ataskaitą apie vaistų suvartojimą, per paskutinius du dešimtmečius Jungtinėse Amerikos Valstijose, Anglijoje bei Velse nuolat didėja mirčių dėl vaistų perdozavimo skaičius [22].
Ekstremalių sveikatai situacijų centro Apsinuodijimų informacijos biuro duomenimis, pagal 2015 metais telefonu suteiktų konsultacijų protokolų analizę dėl apsinuodijimų medžiagomis buvo kreiptasi 2774 kartus. Šis skaičius dvigubai viršija pranešimų skaičių 2007 metais, kuris siekė 1386. Dažniausiai skambinta dėl atsitiktinių apsinuodijimų (62 %), rečiau dėl tikslinių (24 %), apsinuodijimo aplinkybės nežinomos 10 % atvejų, šalutinis vaistų poveikis pasireiškė 1 % skambinusiųjų, likę 3 % apėmė kitas aplinkybes. Apsinuodijimai medikamentais sudarė 33 % visų apsinuodijimų (2 diagrama) [23].
2 diagrama. Apsinuodijimų struktūra pagal apsinuodijimą sukėlusias medžiagas (šaltinis: ESSC Apsinuodijimų informacijos biuro 2015 m. telefonu suteiktų konsultacijų protokolų analizė).
Pagal Australijoje atlikto tyrimo, trukusio nuo 2000 m. iki 2013 m., duomenis, žmonių apsinuodijimas kodeinu didėjo per pastarąjį dešimtmetį. 2000 metais 1 000 000 žmonių teko 3,5 mirtys, susijusios su kodeino perdozavimu, o 2009 metais - 8,7 mirtys. Dažniau pasitaikydavo atsitiktinių perdozavimų (48,8 %) nei bandymų nusižudyti (34,7 %). Didžioji dalis mirčių, susijusių su kodeino perdozavimu (83,7 %), buvo kelių vaistų bendras toksinis poveikis [24].
Nors difenhidraminas vaistiniuose preparatuose aptinkamas vis rečiau, jo mišinys kartu su 7-aminoklonazepamu bei metadonu ir mišinys su morfinu, kodeinu bei 6-monoacetilmorfinu yra vieni dažniausiai pasitaikančių teismo ekspertizėje.
3.4. Kodeino ir difenhidramino toksiškumas
3.4.1. Kodeino toksiškumas
Kodeino toksiškumas pasireiškia tipiniais opioidų apsinuodijimo požymiais: kvėpavimo sutrikimai, susiaurėję vyzdžiai bei prislopinta sąmonė. Taip pat pastebima šalta ir drėgna oda, galvos svaigimas, vidurių užkietėjimas, nuovargis, nukritęs kraujo spaudimas, silpnas pulsas [25]. Paradoksaliai mažesnės kodeino dozės sukelia didesnį emetinį poveikį nei didesnės dozės. Manoma, kad tai vyksta dėl
4 15 16 29 30 31 32 35 37 42 44 63 67 69 79 95 149 411 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Vabzdžių įkandimai
Asmens higienos priemonės Gyvatės įkandimai Naftos produktai Narkotinė medžiaga Metalai Dujos Techninės priemonės Augalai Automobiliuose naudojami skysčiai Maistas/priedai Grybai Buitinė chemija Pesticidai Nepatikslinta medžiaga Alkoholis Kita Medikamentai
konkurencinio poveikio chemoreceptoriuose vėmimo centre. Didesnės nei 65 mg kodeino dozės yra blogai toleruojamos [8]. Svarbiausias pasireiškiantis šalutinis poveikis yra kvėpavimo slopinimas. Šis slopinimas yra priklausomas nuo dozės ir dažnai sukelia mirtinus padarinius. Dalis kodeino yra metabolizuojama į morfiną, morfinas gali prasiskverbti į motinos pieną didelėmis dozėmis, pakankamomis sukelti mirtiną kvėpavimo slopinimą maitinamam kūdikiui [26]. Nustatyta, kad mirtina kodeino dozė vyrauja nuo 0,5 iki 1 gramo [27].
3.4.2. Difenhidramino toksiškumas
Difenhidraminas, blokuodamas H1 ir cholinerginius receptorius, atitinkamai sukelia būdingus
poveikius: sedaciją, mieguistumą, sumažėjusį budrumą, sutrikusią regą, išsiplėtusius vyzdžius, nukritusį kraujo spaudimą, tachikardiją, haliucinacijas, traukulius, kliedėjimą, sausą ir raudoną odą [28]. Ūminis apsinuodijimas difenhidraminu gali būti mirtinas, pasireiškiantis dėl širdies ir kraujagyslių sistemos žlugimo, negydant mirtis ištinka per 2-18 valandų [29]. Manoma, kad difenhidraminas gali blokuoti įtampos valdomus kalio kanalus, taip sukeldamas QT intervalo, atsakingo už širdies aritmijų, tokių kaip torsades de pointes, išsivystymą, pailgėjimą [30]. Nėra žinomo specifinio priešnuodžio difenhidraminui, tačiau pasireiškiantis anticholinerginis sindromas gydomas naudojant fizostigminą [31]. Dažnai skiriami ir benzodiazepinai, kad sumažintų tokius simptomus kaip psichozė, ažitacija ir traukuliai [32]. Toksinė difenhidramino dozė pavartojus peroraliai yra 20-40 mg/kg. Bendrai paėmus, toksiškumas atsiranda pavartojus 3-5 kartus didesnę už paros dozę [31].
3.5. Kodeino ir difenhidramino kokybinė analizė plonasluoksnės
chromatografijos metodu
3.5.1. Plonasluoksnė chromatografija (PC)
Plonasluoksnė chromatografija yra plačiai naudojama technika vaistų atskyrimui ir identifikavimui. Tai chromatografijos tipas, kai nejudri fazė patalpinama ant plono stiklo, plastiko ar aliuminio plokštelės sluoksnio. Tiriamojo pavyzdžio tirpalas yra uždedamas nedidelio taškelio ar siauros linijos pavidalu. Chromatografavimo kamera įsotinama lakių tirpiklių mišinio garais ir į ją statmenai
įstatoma plokštelė. Judančioji fazė (tirpiklių mišinys) kyla nejudrios fazės (plokštelės) kapiliarais, ir tiriamasis pavyzdys yra išskirstomas į atskiras medžiagas. Tos medžiagos aptinkamos arba fizikiniais metodais, arba cheminiu dažymu išdžiovinus plokštelę. Plonasluoksnė chromatografija turi daug privalumų, įskaitant žemą kainą, atlikimo paprastumą, nesudėtingus ir nebrangius naudojamus tirpiklius [33].
3.5.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti kodeiną
ir difenhidraminą.
Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkančios abiem junginiam, kodeinui ir difenhidraminui, nustatyti, buvo rastos mokslinėje literatūroje („Clarke's analysis of drugs and poisons“) [34]. Atrinktos sistemos pasižymėjo didžiausiu skirtumu tarp sulaikymo faktorių, kas geriausiai leistų atskirti medžiagas. Atrinktos 3 teoriškai labiausiai tiriamas medžiagas atskiriančios sistemos:
Sistema TB:
- Plokštelė: silikagelis, 250 µm storio, padengta 0,1 mol/l KOH metanolyje, išdžiovinta. - Judrioji fazė: cikloheksanas – toluenas - dietilaminas (75:15:10).
- Atskyrimas: kodeino Rf – 0,06, difenhidramino Rf – 0,44 (skirtumas – 0,38).
Sistema TE:
- Plokštelės: silikagelis, 250 µm storio.
- Judrioji fazė: etilacetatas – metanolis - koncentruotas amoniako tirpalas (85:10:5). - Atskyrimas: kodeino Rf – 0,35, difenhidramino Rf – 0,65 (skirtumas – 0,30).
Sistema TAF:
- Plokštelės: silikagelis, 250 µm storio.
- Judrioji fazė: metanolis-n-butanolis – 0,1 mol/l NaBr (60:40).
3.6. Kodeino ir difenhidramino kokybinis vertinimas efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu
3.6.1. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)
Efektyvioji skysčių chromatografija yra labai plačiai naudojamas medžiagų atskyrimo metodas. Chromatografijos atlikimo metodika remiasi tiriamųjų medžiagų išskirstymu tarp dviejų fazių: polinės ir nepolinės. Viena fazė, vadinama judriąja faze, nuolatos juda nejudriosios fazės atžvilgiu. Medžiagos, labiau sąveikaujančios su nejudria faze, yra užlaikomos, o medžiagos, labiau sąveikaujančios su judria faze, yra greičiau išplaunamos. Sąveika tarp tiriamosios medžiagos ir nejudrios fazės dažniausiai remiasi adsorbcija. Atskyrimo esmė yra ta, kad skirtingos molekulės praleidžia skirtingą laiką sąveikaudamos su nejudriąja faze. Tos medžiagos, kurios ilgiau sąveikaus su nejudriąja faze, bus vėliau išplaunamos iš kolonėlės nei tos medžiagos, kurios labiau sąveikaus su judriąja faze. Gaunami išplautų iš kolonėlės medžiagų sulaikymo laikai, pagal tai gali būti identifikuojamos medžiagos [35].
3.6.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti
kodeiną ir difenhidraminą
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkančios abiem junginiams, kodeinui ir difenhidraminui, nustatyti, buvo rastos mokslinėje literatūroje „Clarke's analysis of drugs and poisons“ [34]. Atrinktos sistemos pasižymėjo didžiausiu skirtumu tarp sulaikymo faktorių, kas geriausiai leistų atskirti medžiagas. Atrinktos 3 teoriškai labiausiai atskiriančios sistemos:
Sistema HX:
- Kolonėlė: Lichrospher 60 RP-Select B (125 x 4.0 mm v.d., 5 µm) su prieškolonėle Lichrospher 60 RP-Select B (4 x 4.0 mm i.d., 5 µm).
- Judrioji fazė: (A:B) trietilamonio fosfato buferis (25 mmol/l, pH 3.0) – acetonitrilas.
- Eliuavimo programa: (A:B) (100:0) iki (30:70) per 30 min, laikyti 10 min, grįžimas prie pradinių sąlygų per 3 min, 10 min sąlygų išlyginimas prieš kitą injekciją.
- Detektorius: DAD. Sistema HY:
- Kolonėlė: C18 simetriška (250 x 4.6 mm v.d., 5 µm).
- Kolonėlės temperatūra: 40oC.
- Judrioji fazė: (A:B) sieros rūgštis (0.5 ml 2.5 mol/l) vandenyje (500 ml) – sieros rūgštis (0.5 ml 2.5 mol/l) acetonitrile (500 ml).
- Eliuavimo programa: (98:2) 3 min iki (2:98) per 23 min, laikyti 10 min, grįžimas prie pradinių sąlygų per 2 min, 9 min sąlygų išlyginimas prieš kitą injekciją.
- Judriosios fazės tėkmės greitis: 1 ml/min. - Detektorius: DAD.
Sistema HAX:
- Kolonėlė: Supelcosil LC-DP (250 x 4.6 mm v.d., 5 µm).
- Judrioji fazė: (A:B:C) acetonitrilas- fosforo rūgštis (0,025 % v/v)- trietilamino buferis. - Izokratinis eliuavimo režimas: (25:10:5).
- Judriosios fazės tėkmės greitis: 0,6 ml/min. - Detektorius: DAD (λ x 229 nm).
- Pastaba: trietilamino (TEA) buferis ruošiamas į 900 ml vandens pridedant 9 ml koncentruotos fosforo rūgšties ir 10 ml TEA, pH = 3,4 pasiekiamas su praskiesta fosforo rūgštimi, įpilama vandens iki 1000 ml.
4. EKSPERIMENTINĖ DALIS
4.1. Tyrimo objektas ir metodika
4.1.1. Tyrimo objektas
Siekiant optimalaus kokybinio įvertinimo plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikomis kodeinui ir difenhidraminui, buvo tirtas šių medžiagų mišinys. Kodeinas buvo ekstrahuotas naudojant „Ultracod” tabletes, savo sudėtyje turinčias dvi veikliąsias medžiagas: kodeiną (30 mg) ir paracetamolį (500 mg). Difenhidramino tyrimui buvo pagamintas ekstemporalus preparatas – 0,1 % difenhidramino vandeninis tirpalas – 20 ml. Standartinės medžiagos: kodeinas (Sigma-Aldrich, JAV) ir difenhidraminas (Sigma-Aldrich, JAV).
4.1.2. Kokybinis ir kiekybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu
Įranga
Iš pradžių tyrimui buvo naudotos aliuminio chromatografinės plokštelės (DC – Fertigfolien Alugram SIL G/UV254), padengtos silikageliu F60254, sorbento sluoksnis – 0,2 mm, matmenys – 10 x 10
cm. Vėliau suradus ir pritaikius tinkamą tirpiklių sistemą mišinio analizei atlikti, buvo naudotos stiklinės plokštelės siekiant tikslumo ir kokybės. Pusiau automatinis mėginių užnešiklis CAMAG Linomat 5 buvo naudojamas standartinių ir tiriamųjų medžiagų užnešimui ant plokštelių. Jis mėginius ant plokštelės užneša suformuodamas nedidelio brūkšnio formos dėmę. Užneštų mėginių tūris – 10 µl. Chromatografavimas atliktas CAMAG Twin Trough Chamber chromatografavimo kameroje, kurios matmenys – 20 x 20 cm. Tirpiklių sistemos tūris – 50 ml.
Tirpikliai
Standartiniai medžiagų tirpalai buvo ruošiami naudojant tirpiklį 96 % etanolį. Tiriamieji medžiagų tirpalai buvo ruošiami naudojant tirpiklį trichlormetaną.
Mobiliajai tirpiklių sistemai buvo naudojami šie tirpikliai: etilacetatas- metanolis- 25 % amoniako tirpalas (85:10:5). Bendras tirpiklių tūris – 50 ml.
Ryškikliai
Išdžiovintos chromatografinės plokštelės buvo ryškinamos UV šviesa (254 nm). Tiriamųjų vaistinių medžiagų dėmių Rf reikšmės nustatytos naudojant vizualizavimo prietaisą CAMAG TLC
Visualizer kartu su programine VideoScan įranga.
Etaloniniai tirpalai
Tiriamųjų medžiagų etaloniniai tirpalai buvo paruošti ištirpinus jų standartus 96 % etanolyje. Etaloninis kodeino tirpalas buvo pagamintas 1 mg/ml – 20 ml, t.y. 0,1 % koncentracijos tirpalas. Etaloninis difenhidramino tirpalas buvo pagamintas 1 mg/ml – 20 ml, t.y. 0,1 % koncentracijos tirpalas. Etaloninis medžiagų mišinio tirpalas buvo paruoštas sumaišius po 1 ml etaloninių tirpalų.
Tiriamieji tirpalai
Darbiniai tiriamųjų medžiagų tirpalai buvo paruošti iš vaistinio preparato, parduodamo Lietuvos vaistinėse, ir iš gamybinėje vaistinėje pagaminto ekstemporalaus vaistinio preparato. Kodeino darbinis tirpalas buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Ultracod“ – 30 mg stiprumo tablečių, savo sudėtyje turinčių dar vienos veikliosios medžiagos – paracetamolio (500 mg). Buvo paimta 1 “Ultracod“ preparato tabletė (svoris - 0,695 g), kuri buvo sutrinta grūstuvėje. Atsverta 100 mg miltelių, atitinkančių 4,32 mg kodeino, ir perkelta į 20 ml matavimo kolbutę. Milteliai užpilti 20 ml trichlormetano. Tirpalas pašarmintas 25 % amoniako tirpalu iki pH = 8. Tada gauta suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 30 minučių. Suspensijai nusistovėjus, viršutinė suspensijos dalis filtruota per PVDF membraninį filtrą (filtro diametras – 25 mm, membranos storis – 0,22 µm) į buteliuką. Gautas trichlormetaninis kodeino tirpalas, kuris naudotas tolimesniems tyrimams.
Difenhidramino darbinis tirpalas buvo pagamintas iš ekstemporalaus vaistinio preparato – 0,1 % vandeninio difenhidramino tirpalo (tūris - 20 ml). Buvo pamatuota 10 ml difenhidramino vandeninio tirpalo, į jį įpilta 10 ml trichlormetano. Tirpalas pašarmintas 25 % amoniako tirpalu iki pH = 8. Tada gauta suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 30 minučių. Viršutinė suspensijos dalis (vandeninis tirpalas) dekantuotas autosampleriu. Likusi apatinė trichlormetaninė dalis filtruota per PVDF membranį filtrą (filtro diametras – 25 mm, membranos storis – 0,22 µm) į buteliuką. Gautas trichlormetaninis difenhidramino tirpalas, kuris naudotas tolimesniems tyrimams.
Naudojant etaloninius kodeino ir difenhidramino tirpalus, nustatyta tinkama medžiagų mišinio analizės metodika. Pusiau automatinio mėginių užnešiklio pagalba ant chromatografinės plokštelės buvo užneštos tiriamos medžiagos bei jų mišinys. Medžiagos ant plokštelės buvo užneštos 2,5 cm nuo plokštelės apačios (ant „starto linijos“). Pažymima 12,5 cm riba nuo plokštelės apačios – iki šios ribos turės kilti judrioji tirpiklių fazė. Tada į chromatografavimo kamerą su tirpiklių sistema (TS), kuri yra prisotinta lakiųjų tirpiklių garais, perkeliama plokštelė ir laikoma ten, kol TS plokštele pakyla 10 cm nuo „starto linijos“. Kai pasiekiama ši riba, tada chromatografavimo plokštelė išimama iš kameros, išdžiovinama ir ryškinama UV šviesa (254 nm). Nustatytos ir atskirtos medžiagų dėmės bei apskaičiuotos jų sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės.
Pagrindinis plonasluoksnės chromatografijos kokybinis vertinimo rodiklis – tai sulaikymo rodiklis (Rf), kuris yra išreiškiamas tiriamosios medžiagos poslinkio atstumo plokštelėje (L1) ir tirpiklių sistemos
poslinkio atstumo plokštelėje (L2) santykiu:
𝑅𝑓 =𝐿1 (𝑚𝑚) 𝐿2 (𝑚𝑚)
Atliekant eksperimentinį tyrimą, jo metu buvo nustatyta kodeino ir difenhidramino mišiniui atskirti tinkama tirpiklių sistema. Siekiant užtikrinti metodikos tinkamumą medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, analizei, buvo atliekami pakartotiniai tyrimai su darbiniais tiriamaisiais tirpalais. Jokios chromatografavimo sąlygos nebuvo pakeistos: tokia pati tirpiklių sistemos kiekybinė sudėtis, užnešimo ant plokštelės būdas, kameros pripildymas TS garais. Chromatografavimo laikas buvo toks pat – tirpiklių sistemos pakilimas 12,5 cm, t.y. 10 cm nuo „starto linijos“. Tada plokštelės buvo išdžiovintos ir ryškinamos UV šviesa (254 nm). Nustatytos ir atskirtos medžiagų dėmes bei apskaičiuotos jų Rf reikšmės.
Gauti rezultatai buvo lyginami su atitinkamomis etaloninių tirpalų Rf reikšmėmis.
Nustačius optimalias sąlygas kodeino ir difenhidramino mišinio nustatymui, buvo atlikta medžiagų kiekybinė analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu. Naudojant etaloninius kodeino ir difenhidramino tirpalus, ant chromatografinės plokštelės, padengtos silikageliu, buvo uždėti skirtingų koncentracijų standartiniai tirpalai. Uždėtų ant plokštelės taškų koncentracija iš eilės iš kairės į dešinę: 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2 mg/ml, 2,5 mg/ml ir 3 mg/ml. Mėginiai uždėti ant plokštelės „starto linijos“, t.y. 2,5 cm nuo plokštelės apačios. Plokštelė su uždėtais mėginiais perkelta į chromatografavimo kamerą su TS ir laikoma, kol TS plokštele pakyla 10 cm nuo “starto linijos”. Po chromatografavimo plokštelė išimama, išdžiovinama ir ryškinama UV šviesa (254 nm). Nustačius ir atskyrus medžiagų dėmes, sudarytos kalibracinės kodeino ir difenhidramino kreivės.
4.1.3. Kokybinis ir kiekybinis vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos
metodu
Įranga
Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) įvertinimui kokybiniu ir kiekybiniu būdu, buvo naudotas chromatografas Waters 2695. Detekcijai naudotas fotodiodų matricos detektorius Waters 996. Medžiagų atskyrimui naudota kolonėlė Waters Acquity C18 (250 x 4,6 mm), kurios sorbentų dalelių dydis - 5 µm.
Tirpikliai
Etaloninių tirpalų paruošimui buvo naudojamas 96 % etanolis. Darbinių tirpalų paruošimui buvo naudotas trichlormetanas.
Chromatografavimui naudota: sieros rūgšties tirpalas (2,5 mol/l) vandenyje ir acetonitrilas.
Etaloniniai tirpalai
Ištirpinus etanolyje kodeino (Sigma-Aldrich, JAV) ir difenhidramino (Sigma-Aldrich, JAV) medžiagų standartus, gauti etaloniniai tiriamieji tirpalai. 20 ml etanolio ištirpinta po 20 mg medžiagos. Gautų tirpalų koncentracija ta pati – 1 mg/ml. Sumaišius standartinius medžiagų tirpalus vienodomis dalimis, gautas etaloninių medžiagų mišinys.
Tiriamieji tirpalai
Tiriamųjų medžiagų darbiniai tirpalai buvo paruošti iš Lietuvos vaistinėse parduodamo preparato ir iš gamybinėje vaistinėje pagaminto ekstemporalaus vaisto. Kodeino darbinis tirpalas buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Ultracod“ – 30 mg stiprumo tablečių, savo sudėtyje turinčių dar vienos veikliosios medžiagos – paracetamolio (500 mg). Buvo paimta 1 “Ultracod“ preparato tabletė, kurios svoris buvo 0,695 g, buvo sutrinta grūstuvėje. 100 mg miltelių, atitinkančių 4,32 mg kodeino, perkelti į 20 ml matavimo kolbutę ir užpilti 20 ml trichlormetano. Tirpalas pašarminamas 25 % amoniako tirpalu iki pH = 8. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 30 minučių, tada paliekama, kol nuosėdos nusistovi. Viršutinė suspensijos dalis filtruota per PVDF membraninį filtrą (filtro diametras – 25 mm, membranos storis – 0,22 µm) į buteliuką. Gautas trichlormetaninis kodeino tirpalas, toliau naudotas tolimesniems tyrimams efektyviąja skysčių chromatografija.
Difenhidramino darbinis tirpalas buvo pagamintas iš ekstemporalaus vaistinio preparato – 0,1 % vandeninio difenhidramino tirpalo (tūris- 20 ml). Buvo pamatuota 10 ml difenhidramino vandeninio tirpalo, į jį įpilta 10 ml trichlormetano. Tirpalas pašarminamas 25 % amoniako tirpalu iki pH = 8. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 30 minučių, tada paliekama, kol nuosėdos nusistovi. Viršutinė suspensijos dalis filtruota per PVDF membranį filtrą (filtro diametras – 25 mm, membranos storis – 0,22 µm) į buteliuką. Gautas trichlormetaninis difenhidramino tirpalas, toliau naudotas tolimesniems tyrimams efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Analizė
Tiriant kodeino ir difenhidramino etaloninių tirpalų mišinį, buvo nustatytos optimalios efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos sąlygos. Medžiagos mišinyje buvo identifikuotos pagal UV absorbcijos spektrus ir sulaikymo laikus.
4.1.4. Duomenų apdorojimas
Duomenys buvo rinkti ir analizuoti naudojant šias programas: Microsoft Office Excel 2007, Empower
Pro, winCATS 1.4.9 ir SigmaPlot 12.5.
4.2. Rezultatai ir jų aptarimas
4.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodo pritaikymas
Ryškiklio parinkimas
Siekiant atskirti ir identifikuoti kodeiną ir difenhidraminą bei jų mišinį plonasluoksnės chromatografijos metodu, turi būti parinktas tinkamas ryškinimo reagentas. Nustatyta, kad tiek kodeino, tiek difenhidramino dėmės aiškiai ir ryškiai matosi naudojant UV šviesą (254 nm) (1 pav.).
1 pav. Kodeino (1, 3B) ir difenhidramino (2, 3A) dėmės ant chromatografinės plokštelės ją apšvietus UV šviesa (254 nm).
Ryškinimui naudojant UV šviesą (254 nm), išryškėja pilkos spalvos tiriamųjų medžiagų dėmės (1 pav.). Šis ryškinimo būdas yra pigus, patogus, lengviau pritaikomas ir mažiau kenksmingas nei ryškinimas cheminiais reagentais.
Eliuento parinkimas
Siekiant surasti kodeino ir difenhidramino mišinio atskyrimui tinkamą tirpiklių sistemą, iš galimų variantų, rastų mokslinėje literatūroje, buvo pasirinkta patogiausia tirpiklių sistema sudėtingumo ir sulaikymo rodiklių skirtumo atžvilgiu TE sistema (TS – etilacetatas- metanolis- 25 % amoniako tirpalas (85:10:5)). Pagal kodeino ir difenhidramino dėmių formą bei jų padėtį plokštelėje buvo vertinamas TS tinkamumas.
Siekiant įvertinti ir užtikrinti TS patikimumą, etaloninio mišinio tirpalo analizė buvo atlikta 5 kartus. Naudojant gautus duomenis, statistiškai apskaičiuotas gautų Rf reikšmių aritmetins vidurkis,
standartinis nuokrypis SD, santykinė paklaida SE, esant 0,95 pasikliautinajam lygmeniui. Taip pat apskaičiuotas pasikliautinasis intervalas, kai klaidos tikimybė p=0,05 (2 lentelė).
2 lentelė. Kodeino ir difenhidramino charakteristikos naudojant TE tirpiklių sistemą.
Tirpiklių sistema Tiriamoji medžiaga Rf vidurkis Standartinis nuokrypis (SD) Santykinė paklaida (SE) Pasikliautinasis intervalas TE Kodeinas 0,35 0,008 0,004 0,34 – 0,36 Difenhidraminas 0,65 0,007 0,003 0,64 – 0,66
Per pakartotinius tyrimus TE tirpiklių sistemos paklaidos neviršijo leistinos 0,05 ribos. Todėl galima teigti, kad ši sistema yra tinkama kodeino ir difenhidramino bei jų mišinio kokybiniam įvertinimui.
4.2.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu
4.2.2.1. Kokybinė vaistų analizė
Nustačius ir pakartotiniais bandymais patvirtinus tirpiklių sistemą, tinkančią kodeino ir difenhidramino standartų mišinio kokybinei analizei, buvo atlikta analizė su kodeino ir difenhidramino vaistinių preparatų ekstraktais. Analizė buvo vykdoma su TE tirpiklių sistema, ryškinimui naudota UV šviesa (254 nm).
3 lentelė. Kodeino ir difenhidramino standartų ir darbinių tirpalų vidutinės Rf reikšmės naudojant TE
tirpiklių sistemą.
Tiriamoji medžiaga
Kodeinas Difenhidraminas
Standartas Vaistinis preparatas Standartas Vaistinis preparatas
TE 0,35 0,36 0,65 0,64
2 pav. Sistema TE atskirtos ir UV šviesa (254 nm) ryškintos kodeino standarto (1), difenhidramino standarto (4), difenhidramino darbinio tirpalo (2) ir kodeino darbinio tirpalo (3) dėmės. Pastaba: kodeino darbiniame tirpale taip pat matyti ir paracetamolio (sudėtinės vaistinio preparato „Ultracod“
Nustatytos tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės. Jos atitinka
TE sistemos nustatyto pasikliautinojo intervalo ribas (4 lentelė). Todėl galima teigti, kad TE sistema yra tinkama kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš vaistinių preparatų, kokybinei analizei.
4 lentelė. Kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės ir
pasikliautinųjų intervalų ribos.
Tiriamoji medžiaga Vidutinė R TE sistema
f reikšmė Pasikliautinasis intervalas
Kodeinas 0,36 0,34 – 0,36
Difenhidraminas 0,64 0,64 – 0,66
4.2.2.2. Kiekybinė vaistinių preparatų analizė
Siekiant įvertinti parinktos PC metodikos tinkamumą kiekybiniam kodeino ir difenhidramino nustatymui, buvo sudaryti kalibraciniai grafikai dėmės ploto priklausomybei nuo medžiagos koncentracijos. Kuo didesnė medžiagos koncentracija, tuo tamsesnė dėmė chromatogramoje. Ant plokštelės buvo uždėta po 6 kodeino ir difenhidramino standartinių tirpalų skirtingų koncentracijų taškus (3 pav.).
3 pav. Kodeino (1) ir difenhidramino (2) standartinių tirpalų skirtingų koncentracijų dėmės.
Kodeino ir difenhidramino kalibraciniai grafikai sudaryti iš 6 taškų, koncentracijų intervalas – nuo 0,5 mg/ml iki 3 mg/ml. (4 pav., 5 pav.)
4 pav. Kodeino kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y = 1,31 * 104 + 2,27 * 104 * x.
5 pav. Difenhidramino kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y = 1,82 * 103 + 1,2 * 104 * x.
4.2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo pritaikymas
Detektoriaus parinkimas
Pasirenkant detektorių analizei atlikti, buvo remiamasi mokslinėje literatūroje („Clarke's analysis of drugs and poisons“) aprašyta metodika ir naudota įranga [34]. Analizei buvo naudotas fotodiodų matricos detektorius. Šis detektorius gali nustatyti analičių absorbcijos maksimumus UV šviesos spektre. Šis vertinimo kriterijus kartu su sulaikymo laiku leidžia pasiekti aukšto lygio kokybinio vertinimo tikslumą.
Kokybiniame medžiagų tyrime kolonėlė parinkta pagal mokslinėje literatūroje (“Clarke's analysis of drugs and poisons“) aprašytą metodiką [34]. Naudota kolonėlė – Waters Acquity C18 (250 x 4,6 mm), sorbento dalelių dydis – 5 µm.
Eliuento parinkimas
Siekiant atskirti ir identifikuoti vaistinių medžiagų mišinio komponentus, buvo pasiremta mokslinėje literatūroje („Clarke's analysis of drugs and poisons“) aprašytomis sąlygomis [34]. Norint supaprastinti metodiką ir siekiant išvengti galimos neigiamos temperatūros bei rūgštinės terpės įtakos tiriamųjų junginių stabilumui, tyrimo sąlygos buvo šiek tiek modifikuotos. Vietoj 40 oC temperatūros
buvo naudota žemesnė temperatūra 25 oC. Siekiant išvengti neigiamos rūgštinės aplinkos poveikio,
judriojoje fazėje vietoj sieros rūgštimi parūgštinto acetonitrilo naudotas grynas acetonitrilas. Naudota tirpiklių sistema buvo vertinta pagal analičių sulaikymo laikus, smailių simetriškumą ir bazinės linijos stabilumą. Eksperimentų metu buvo pasiektas maksimalus medžiagų atskyrimas.
Optimalus kodeino ir difenhidramino atskyrimas pasiektas kaip eliuentą naudojant tirpiklių sistemą, sudarytą iš sieros rūgšties tirpalo (0,5 ml 2,5 mol/l) vandenyje (A) ir acetonitrilo (B), jos kiekybinei sudėčiai kintant gradientiškai (5 lentelė).
5 lentelė. HY tirpiklių sistemos kiekybinės sudėties kitimas laiko atžvilgiu.
Chromatografavimo laikas (min)
Eliuento tekėjimo greitis (ml/min)
Sieros rūgšties tirpalas vandenyje, proc. (A)
Acetonitrilas, proc. (B) 00:00 1,0 98,0 2,0 3:00 1,0 98,0 2,0 26:00 1,0 2,0 98,0 36:00 1,0 2,0 98,0 38:00 1,0 98,0 2,0
4.2.4. Pritaikytos efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija
Pasirinkta ir pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika buvo validuota pagal šiuos parametrus: specifiškumą, glaudumą, tiesiškumą, aptikimo ribą ir kiekybinio nustatymo ribą.
4.2.4.1. Specifiškumas
Metodo specifiškumas – tai tiriamosios medžiagos atskyrimas nuo priemaišų ir kitų medžiagų. Analizuojamos medžiagos sulaikymo laikas ir UV spektras yra lyginamas su standarto sulaikymo laiku bei UV spektru. Esant analogiškam sulaikymo laikui ir UV spektrui, patvirtinamas metodikos specifiškumas analizuojamai medžiagai.
Pateikiama tiriamojo mėginio medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, chromatograma. Joje matyti, kad kodeino (1) sulaikymo laikas lygus 8,73 min, o difenhidramino (2) – 13,12 min. (6 pav.)
6 pav. Vaistinių preparatų ekstrakto chromatograma. 1 – kodeinas (sulaikymo laikas – 8,734 min.), 2 – difenhidraminas (13,197 min.). Pastaba: 3 – paracetamolis, įeinantis į vaistinio preparato “Ultracod”
sudėtį.
Tiriamųjų medžiagų UV šviesos sugerties spektrai palyginti su mokslinėje literatūroje pateiktais UV šviesos sugerties spektrais (7 pav., 8 pav.)
- Kodeinas
7 pav. Kodeino UV absorbcijos spektras: 1 – išmatuotas fotodiodų matricos detektoriumi, 2 – pateiktas mokslinėje literatūroje („Clarke's analysis of drugs and poisons“) [34].
8 pav. Difenhidramino UV absorbcijos spektras: 1 – išmatuotas fotodiodų matricos detektoriumi, 2 – pateiktas mokslinėje literatūroje („Clarke's analysis of drugs and poisons“) [34].
Patikslinta, kad difenhidramino vaistinio preparato („Ultracod“) priemaiša yra paracetamolis. UV šviesos spektras, gautas atlikus tiriamojo mišinio analizę, yra analogiškas UV šviesos spektrui, pateiktam mokslinėje literatūroje.
9 pav. Paracetamolio UV absorbcijos spektras: 1 – išmatuotas fotodiodų matricos detektoriumi, 2 – pateiktas mokslinėje literatūroje („Clarke's analysis of drugs and poisons“) [34].
Standartinių mėginių chromatograma (10 pav.).
10 pav. Standartinių tirpalų chromatograma. 1 – kodeinas (sulaikymo laikas – 8,731 min.), 2 – difenhidraminas (13,121 min.).
Palyginamos standartinių tirpalų ir vaistinių preparatų ekstraktų mišinių chromatogramos.
11 pav. Standartinių tirpalų ir vaistinių preparatų ekstraktų mišinio chromatogramų palyginimas. 1 – kodeinas, 2 – difenhidraminas.
4.2.4.2. Metodo glaudumas (preciziškumas)
Siekiant įvertinti metodo glaudumą (preciziškumą), reikėjo įvertinti analizės metu gautų rezultatų pakartojamumą ir atkuriamumą. Pakartojamumas apibūdina rezultatų tikslumą, kai eksperimentiniai bandymai yra atliekami tą pačią dieną ir tomis pačiomis sąlygomis. Pakartojamumui įvertinti, etalonų mišiniai buvo analizuojami keturis kartus. Atkuriamumas nusako rezultatų tikslumą, eksperimentinius bandymus atliekant skirtingomis dienomis, bet tomis pačiomis sąlygomis. Atkuriamumui įvertinti, buvo atlikti aštuoni bandymai dviejomis skirtingomis dienomis.
Gauti pakartojamumo ir atkuriamumo rezultatai (6 lentelė) įvertinti pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN), kuris kiekybinio tyrimo metode turi būti ne daugiau kaip 5 % visai dienai ir ne daugiau kaip 10 % skirtingomis dienomis. Santykinis standartinis nuokrypis - tai procentinis smailės ploto vidurkio ir standarto nuokrypio santykis.
6 lentelė. Smailės ploto ir sulaikymo laiko pakartojamumo ir atkuriamumo rezultatai.
Tiriamoji medžiaga
SSN rezultatai, %
Pirma diena Antra diena
Smailės plotas Sulaikymo laikas Smailės plotas Sulaikymo laikas
Kodeinas 0,8 0,1 0,9 0,1
Atsižvelgiant į gautus duomenis, matyti, kad tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikai ir smailės ploto SSN neviršijo 5 % tą pačią dieną ir neviršijo 10 % skirtingų dienų atžvilgiu. Todėl galima teigti, kad šis metodas yra tinkamas kodeino ir difenhidramino kokybiniam tyrimui.
4.2.4.3. Tiesiškumas
Tiesiškumas – tai smailės ploto priklausomybė nuo tiriamojo tirpalo koncentracijos. Siekiant įvertinti tiesiškumą, turi būti sudarytas gradavimo grafikas iš ne mažiau kaip penkių taškų, gaunama kalibracinė kreivė. Kodeino ir difenhidramino kalibracinės kreivės sudarytos iš dešimties taškų. Gautų kalibracinių kreivių charakteristikos pateikiamos 7 lentelėje. Gauti rezultatai atspindi stiprią ir ryškią tiesinę priklausomybę, tinkamą kiekybiniam nustatymui. Tiek kodeino, tiek difenhidramino koreliacijos koeficientai yra didesni nei 0,99. Kodeino ir difenhidramino kalibracinės kreivės pateikiamos 12 ir 13 paveikslėliuose.
7 lentelė. Kodeino ir difenhidramino kalibracinių kreivių charakteristikos.
Tiriamoji medžiaga Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (µg/ml) Kodeinas 0,999073 Y=1,83*104x+7,7*104 0,488281 – 500 Difenhidraminas 0,999352 Y=1,88*104x+6,21*104 0,488281 – 500
13 pav. Difenhidramino kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y=1,88*104x+6,21*104
4.2.4.4. Aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos
Aptikimo riba – tai mažiausias analizuojamos medžiagos kiekis, kurį galima aptikti, tačiau nebūtinai galima įvertinti kiekybiškai. Kiekybinio nustatymo riba – tai mažiausias analizuojamos medžiagos kiekis, kurį galima įvertinti kiekybiškai. Gautos kodeino ir difenhidramino aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos pateiktos 8 lentelėje.
8 lentelė. Kodeino ir difenhidramino aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos.
Tiriamoji medžiaga Aptikimo riba (µg/ml) Kiekybinio nustatymo riba (µg/ml)
Kodeinas 0,08 0,26
Difenhidraminas 0,09 0,93
4.2.5. Vaistinių preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Pritaikyta ir validuota ESC metodika, tinkama kodeino ir difenhidramino standartų mišinio išskirstymui ir identifikavimui, buvo pritaikyta ir darbinių kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš vaistinių preparatų, tirpalų mišinio tyrimui.
Tiriant darbinių tirpalų mišinį, kodeinas identifikuotas pagal sulaikymo laiką ir UV šviesos spektrą. Medžiagos, išskirtos iš vaistinio preparato, sulaikymo laikas (8,734 min.) atitinka kodeino standarto sulaikymo laiką. Gautas kodeino UV absorbcijos spektras yra analogiškas literatūroje pateikiamam kodeino UV absorbcijos spektrui (14 pav.)
14 pav. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, mišinio spektras (kodeino pikas raudoname apskritime) ir kodeino UV absorbcijos spektras.
Difenhidramino, išskirto iš vaistinio preparato, sulaikymo laikas (13,197 min.) atitinka difenhidramino standarto sulaikymo laiką. Difenhidramino UV absorbcijos spektras yra analogiškas literatūroje pateikiamam difenhidramino UV absorbcijos spektrui (15 pav.).
15 pav. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, mišinio spektras (difenhidramino pikas raudoname apskritime) ir difenhidramino UV absorbcijos spektras.
Nustatyta, kad kodeino ir difenhidramino darbinių tirpalų sulaikymo laikai patenka į pasikliautinojo intervalo reikšmes.
9 lentelė. Kodeino ir difenhidramino vidutinis sulaikymo laikas ir pasikliautinųjų intervalų ribos.
Tiriamoji medžiaga Sulaikymo laikas, min Pasikliautinasis intervalas
Kodeinas 8,734 8,728- 8,734
Difenhidraminas 13,197 13,197- 13,125
Atsižvelgiant į gautus rezultatus, galima teigti, kad parinkta ESC metodika yra tinkama kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš vaistinių preparatų, mišinio kokybinei analizei.
4.2.5.2. Kiekybinė vaistinių preparatų analizė
Siekiant įvertinti pritaikytos ESC metodikos tinkamumą kiekybiniam tiriamųjų medžiagų nustatymui, buvo sudaryti šviesos sugerties smailės aukščio priklausomybės nuo medžiagos koncentracijos kalibraciniai grafikai. Kuo didesnė medžiagos koncentracija, tuo aukštesnė smailė. Paruošti standartiniai kodeino ir difenhidramino tirpalai buvo skiedžiami per pusę, taip buvo gaminami skirtingų koncentracijų tirpalai kalibraciniam grafikui sudaryti. Kodeino (12 pav.) ir difenhidramino (13 pav.) kalibraciniai grafikai sudaryti iš 10 taškų, koncentracijų intervalas – 0,488281 µg/ml – 500 µg/ml.
5. IŠVADOS
1. Parinkta plonasluoksnės chromatografijos metodika, kuria pasiektas optimalus kodeino ir difenhidramino mišinio atskyrimas- TE tirpiklių sistema (etilacetatas- metanolis- 25 % amoniako tirpalas (85:10:5)). Nustatytos vidutinės tiriamųjų medžiagų Rf reikšmės TE sistemoje: kodeino
(Rf = 0,36) ir difenhidramino (Rf = 0,64). Tiriamųjų medžiagų Rf atsikartojamumo paklaidos
neviršijo leistinos p < 0,05 ribos. Pritaikyta plonasluoksnės chromatografijos metodika yra tinkama kodeino ir difenhidramino mišinio kokybiniam įvertinimui.
2. Adaptuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, kuria pasiektas optimalus kodeino ir difenhidramino mišinio atskyrimas- HY metodika (judriosios fazės tirpikliai: sieros rūgšties tirpalas (2,5 mol/l) vandenyje ir acetonitrilas). Nustatyti vidutiniai tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikai: kodeino (8,734 min) ir difenhidramino (13,197 min), kurie pakartotinės analizės metu neviršijo leistinos p < 0,05 paklaidos ribos. Pritaikyta ESC metodika yra tinkama kodeino ir difenhidramino mišinio kokybiniam įvertinimui.
3. Pritaikyta plonasluoksnės chromatografijos analizės metodika tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, analizei. Nustatyta, kad tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės pateko į TE sistemos pasikliautinojo intervalo ribas. Parinkta PC metodika
yra tinkama kodeino ir difenhidramino, išskirtų iš vaistinių preparatų, nustatymui.
4. Parinkta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika buvo pritaikyta kodeino ir difenhidramino vaistinių preparatų analizei, kurie nustatyti lyginant jų sulaikymo laikus ir UV šviesos absorbcijos spektrus su standartinių medžiagų. Nustatyta, kad darbinių tirpalų sulaikymo laikai pateko į parinktos ESC metodikos pasikliautinojo intervalo ribas, o UV absorbcijos spektrai buvo analogiški etaloninių medžiagų UV absorbcijos spektrams. Todėl parinkta ESC metodika yra tinkama kodeino ir difenhidramino kokybiniam įvertinimui vaistiniuose preparatuose.
5. Adaptavus plonasluoksnės chromatografijos metodiką ir sudarius gradavimo grafiką, ją galima pritaikyti kodeino ir difenhidramino kiekybiniam tyrimui koncentracijos ribose nuo 0,5 mg/ml iki 3 mg/ml.
6. Pritaikius efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką ir sudarius gradavimo grafiką, ją galima pritaikyti kodeino ir difenhidramino kiekybiniam tyrimui, kai aptikimo riba kodeinui yra 0,08 µg/ml, o difenhidraminui - 0,09 µg/ml. Kiekybinio nustatymo riba kodeinui yra 0,26 µg/ml, o difenhidraminui – 0,93 µg/ml.
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis gautais tyrimo rezultatais, pritaikytos ir modifikuotos plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos yra tinkamos kodeino ir difenhidramino mišinio kokybiniam bei kiekybiniam nustatymams. Tikslinga plėtoti išsamesnius tyrimus kodeino, difenhidramino ir paracetamolio mišinio atskyrimui, kadangi, remiantis pritaikytomis metodikomis, galima teigti, kad šie metodai tinka ir paracetamolio atskyrimui nuo kodeino ir difenhidramino.
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. VVKT - Vaistai [Internet]. Vapris.vvkt.lt. 2018 [cited 16 February 2018]. Available from: https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications/
2. DrugBank [Internet]. Drugbank.ca. 2018 [cited 16 February 2018]. Available from: https://www.drugbank.ca
3. European pharmacopoeia. [Place of publication not identified]: European Pharmacopoeia; 2013. 4. Codeine [Internet]. Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 2018 [cited 16 February 2018]. Available from:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5284371#section=Pharmacology
5. Bentley K, Head T. The additive analgesic efficacy of acetaminophen,1000 mg, and codeine, 60 mg, in dental pain. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 1987;42(6):634-640.
6. Papich M. Saunders handbook of veterinary drugs 2016; 183-184.
7. VVKT - VP peržiūra [Internet]. Vapris.vvkt.lt. 2018 [cited 16 February 2018]. Available from: https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications/view/24869
8. Trescot A. Opioid pharmacology. Pain Physician. 2008.
9. KuKANICH B. Pharmacokinetics of acetaminophen, codeine, and the codeine metabolites morphine and codeine-6-glucuronide in healthy Greyhound dogs. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics. 2010;33(1):15-21.
10. Diphenhydramine - DrugBank [Internet]. Drugbank.ca. 2018 [cited 19 February 2018]. Available from: https://www.drugbank.ca/drugs/DB01075
11. VVKT - Vaistai [Internet]. Vapris.vvkt.lt. 2018 [cited 19 February 2018]. Available from: https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications/
12. Diphenhydramine [Internet]. Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 2018 [cited 19 February 2018]. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/diphenhydramine#section=Pharmacology 13. Simons K, Watson W, Martin T, Chen M, Simons F. Diphenhydramine: Pharmacokinetics and
Pharmacodynamics in Elderly Adults, Young Adults, and Children. The Journal of Clinical Pharmacology. 1990;30(7):665-671.
14. VVKT - VP peržiūra [Internet]. Vapris.vvkt.lt. 2018 [cited 20 February 2018]. Available from: https://vapris.vvkt.lt/vvkt-web/public/medications/view/13722
15. Akutsu T, Kobayashi K, Sakurada K, Ikegaya H, Furihata T, Chiba K. Identification of Human Cytochrome P450 Isozymes Involved in Diphenhydramine N-Demethylation. Drug Metabolism and Disposition. 2006;35(1):72-78.
16. Vartotojui - tik saugūs ir efektyvūs vaistai! - Ataskaitos [Internet]. Vvkt.lt. 2018 [cited 20 February 2018]. Available from: http://www.vvkt.lt/Ataskaitos
17. Comments on the reported statistics on narcotic drugs. 2011;.
18. [Internet]. Raportit.nam.fi. 2018 [cited 21 February 2018]. Available from: http://raportit.nam.fi/raportit/kulutus/laakekulutus_e.htm
19. 2017 [Internet]. 2018 [cited 24 February 2018]. Available from:
http://www.ravimiamet.ee/sites/default/files/ravimiamet_aastaraamat_a5_100lkkaaned_k3_final.p df
20. Boltaev A. Assessment of the medication assisted therapy program in the Kyrgyz republic. Almaty. 2012;.
21. Otiashvili D, Latypov A, Kirtadze I, Ibragimov U, Zule W. Drug preparation, injection, and sharing practices in Tajikistan: a qualitative study in Kulob and Khorog. Substance Abuse Treatment, Prevention, and Policy. 2016;11(1).
22. World Drug Report 2017 [Internet]. Unodc.org. 2018 [cited 25 February 2018]. Available from: https://www.unodc.org/wdr2017/index.html
23. Statistika [Internet]. Apsinuodijau.lt. 2018 [cited 25 February 2018]. Available from: http://www.apsinuodijau.lt/statistika
24. Roxburgh A, Hall W, Burns L, Pilgrim J, Saar E, Nielsen S et al. Trends and characteristics of accidental and intentional codeine overdose deaths in Australia. The Medical Journal of Australia. 2015;203(7):299.
25. overdose C. Codeine overdose: MedlinePlus Medical Encyclopedia [Internet]. Medlineplus.gov. 2018 [cited 26 February 2018]. Available from: https://medlineplus.gov/ency/article/002613.htm 26. Koren G, Cairns J, Chitayat D, Gaedigk A, Leeder S. Pharmacogenetics of morphine poisoning in
a breastfed neonate of a codeine-prescribed mother. The Lancet. 2006;368(9536):704. 27. Kolman A. Codeine. 2006;.
28. overdose D. Diphenhydramine overdose: MedlinePlus Medical Encyclopedia [Internet]. Medlineplus.gov. 2018 [cited 28 February 2018]. Available from:
https://medlineplus.gov/ency/article/002636.htm
29. Goodman L, Brunton L, Chabner B, Knollmann B. Goodman & Gilman's pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; 2011.
