LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
DOVILĖ ČIULADAITĖ
BROMAZEPAMO, RISPERIDONO IR FLUOKSETINO MIŠINIO ANALIZĖ
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS BEI ULTRAEFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas:
Doc. Dr. Andrejus Ţevţikovas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
BROMAZEPAMO, RISPERIDONO IR FLUOKSETINO MIŠINIO ANALIZĖ
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS BEI ULTRAEFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas:
Doc. Dr. Andrejus Ţevţikovas _________ _______
(Parašas) (Data)
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Dovilė Čiuladaitė Data
Turinys
SANTRUMPOS ... 8
1. ĮVADAS ... 9
2. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
3. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
3.1. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino vartojimo paplitimas ... 11
3.1.1. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino vartojimo paplitimas Lietuvoje ... 11
3.1.2. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino vartojimo paplitimas ir palyginimas su kitomis šalimis ... 13
3.2. Apsinuodijimų bromazepamu, risperidonu ir fluoksetinu statistika ... 17
3.3. Tiriamosios medţiagos ... 17
3.3.1. Bromazepamas ... 17
3.3.2. Risperidonas ... 19
3.3.3. Fluoksetinas ... 21
3.4. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 22
3.4.1. Plonasluoksnė chromatografija (PC) ... 22
3.4.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti bromazepamą, risperidoną ir fluoksetiną ... 23
3.5. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino kokybinis vertinimas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 24
3.5.1. Ultraefektyvioji skysčių chromatografija (UESC) ... 24
3.5.2. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti bromazepamą, risperidoną ir fluoksetiną ... 25
4. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 27
4.1. Tyrimo objektas ir metodika ... 27
4.1.1. Tyrimo objektas ... 27
4.1.2. Kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodu ... 27
4.1.4. Duomenų apdorojimas ... 30
4.2. Rezultatai ir aptarimas ... 31
4.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos parinkimas ... 31
4.2.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 34
4.2.3. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos parinkimas ... 35
4.2.4. Pritaikytos UESC metodikos validacija ... 37
4.2.4.1. Specifiškumas ... 37
4.2.4.2. Metodo glaudumas (preciziškumas) ... 38
4.2.4.3. Tiesiškumas ... 39
4.2.4.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 41
4.2.5. Vaistinių preparatų analizė ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 41
4.2.5.1. Kokybinė vaistinių preparatų analizė ... 41
4.2.5.2. Kiekybinė vaistų mišinio analizė ... 43
5. Išvados ... 44
6. Praktinės rekomendacijos ... 46
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 47
SANTRAUKA
BROMAZEPAMO, RISPERIDONO IR FLUOKSETINO MIŠINIO KOKYBINĖ ANALIZĖ PLONASLUOKSNĖS IR ULTRAEFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS
METODAIS
D. Čiuladaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. A. Ţevţikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai ţodţiai: bromazepamas, risperidonas, fluoksetinas, plonasluoksnė chromatografija, ultraefektyvioji skysčių chromatografija, kokybinis vertinimas.
Darbo tikslas: pritaikyti plonasluoksnės ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijų metodikas, tinkamas bromazepamo, risperidono bei fluoksetino mišinio kokybiniam įvertinimui.
Tyrimo objektas ir metodai: parenkant plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodiką, analizuoti etaloniniai 0,2 mg/ml koncentracijos bromazepamo, risperidono, ir fluoksetino metanoliniai tirpalai ir jų mišinys. Tirpiklių sistemoms naudoti etilo acetatas, metanolis, 25 proc. amonio hidroksidas, dichlormetanas, cikloheksanas, acetonas, dietilaminas. Dėmių ryškinimui naudota UV šviesa (254nm). Parinktos PC metodikos pritaikytos tiriant metanolinius darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų „Bromazepam Lannacher‖, „Rispolept ― ir „Fluoxetine Lannacher―.
Siekiant pritaikyti ultraefektyviosios skysčių chromatografijos (UESC) metodiką tiriamųjų junginių analizei, buvo tirti etaloniniai 0,1 mg/ml koncentracijos bromazepamo, risperidono ir fluoksetino metanoliniai tirpalai bei jų mišinys. Medţiagų atskyrimui ir identifikavimui naudotas chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996. Chromatografavimui naudoti tirpikliai – eliuentai acetonitrilas ir fosforo rūgštis. Parinkta UESC metodika pritaikyta tiriant metanolinius darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų „Bromazepam Lannacher‖, „Rispolept ― ir „Fluoxetine Lannacher ―.
Rezultatai ir išvados: tinkamiausios tirpiklių sistemos bromazepamo, risperidono ir fluoksetino mišinio kokybiniam vertinimui PC metodu – TS-3 (etilo acetatas: metanolis: 25 proc. amonio hidroksidas: dichlormetanas (13:2:1:4)) ir TS-5 (cikloheksanas: acetonas: dietilaminas (16:1:3)). Šios tirpiklių sistemos yra tinkamos tiriamųjų medţiagų mišinio kokybiniam įvertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose.
Tiriamų medţiagų kokybiniam vertinimui UESC metodu, naudota Waters Acquity C18 2,1 x 50 mm, 1,7 µm chromatografinė kolonėlė. Gradientinis eliuavimo reţimas (acetonitrilo ir 0,025proc. fosforo rūgštimi). Tėkmės greitis 0,4 ml/min. Injekcijos tūris 1 μl. Fotodiodų matricos detektorius. Medţiagų UV absorbcijos spektrai, išmatuoti fotodiodų matricos detektoriumi, identiški pateiktiems mokslinėje literatūroje. Metodika yra tinkama bromazepamo, risperidono ir fluoksetino mišinio kokybiniam vertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose.
SUMMARY
BROMAZEPAM, RISPERIDONE AND FLUOXETINE MIXTURE QUALITATIVE
ANALYSIS USING TLC AND UHPLC METHODS
Key words: bromazepam, risperidone, fluoxetine, thin-layer chromatography, ultrahigh-performance liquid chromatography, qualitative determination.
Aim: to personalise thin-layer chromatography and ultrahigh-performance liquid chromatography methodics for bromazepam, risperidone, fluoxetine and their mixture qualitative analysis.
Object and methods: for TLC method adaptation bromazepam, risperidone, fluoxetine and their mixture stock solutions (0,2 mg/ml) in methanol were analysed. As mobile phases were used: ethyl acetate, methanol, strong ammonia solution, dichlormethane, cyclohexane, acetone, diethylamine. For spots visualization was used UV light lamp (254 nm). Personalised investigation methodics were applied for pharmaceutical products ―Bromazepam Lannacher‖, ―Rispolept ―and ―Fluoxetine Lannacher ― solutions.
For UHPLC method adaptation bromazepam, risperidone, fluoxetine and their mixture stock solutions (0,1 mg/ml) in methanol were analysed. Chromatograph Waters 2695 with photo diode array detector Waters 996 was used for qualitative determination. Analysis was made by using acetonitrile and phosphoric acid aqueous solution as eluents. Personalised method was applied in analysis of pharmaceutical products products ―Bromazepam Lannacher‖, ―Rispolept ―and ―Fluoxetine Lannacher― solutions.
Results: suitable TLC solvent systems for bromazepam, risperidone and fluoxetine mixture qualitative analysis were: TS-3 (ethyl acetate: methanol: strong ammonia solution: dichlormethane (13:2:1:4)) and TS-5 (cyclohexane: acetone: diethylamine (16:1:3)). TS – 3 and TS – 5 mobile phases are suitable for examined substances qualitative analysis in mixture and determination in pharmaceutical products.
UHPLC method was developed using Waters Acquity C18 2,1 x 50 mm, 1,7 µm chromatographic column. Gradient elution mode was used (mixture of acetonitrile and 0,025proc. phosphoric acid). Flow rate 0,4 ml/ml. Injection volume 1 μl. Photo diode array detector. Bromazepam, risperidone and fluoxetine absorbtion of UV light were similar as noted in scientific literature. UHPLC method is suitable for examined substances qualitative analysis in mixture and determination in pharmaceutical product.
PADĖKA
Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems rengiant magistro baigiamąjį darbą. Nuoširdţiai dėkoju savo magistro baigiamojo darbo vadovui doc. dr. Andrejui Ţevţikovui uţ visapusę pagalbą, patarimus ir konsultacijas, atliekant tyrimus ir rašant baigiamąjį magistro darbą. Esu dėkinga visai Analizinės ir toksikologijos chemijos katedrai, ypatingai katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui ir asist. lab. Mindaugui Marksai uţ pagalbą, atliekant eksperimentinius tyrimus.
SANTRUMPOS
AAKC – Amerikos apsinuodijimų kontrolės centras (angl. American Association of Poison Control Centers)
AMTK – Amerikos medicinos toksikologijos kolegija (angl. American College of Medical Toxicology)
DDD – nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas UESC – ultraefektyvioji skysčių chromatografija
LTVSPĮ – Lietuvos teritorinių visuomenės sveikatos prieţiūros įstaigos PC – plonasluoksnė chromatografija
Rf – sulaikymo rodiklis TS – tirpiklių sistema UV – ultravioletinė šviesa
1. ĮVADAS
Visame pasaulyje pastebimas vaistų suvartojimo didėjimas, turintis neigiamos įtakos visuomenei. Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) vaistų suvartojimo ataskaita – 2014 metais Lietuvoje parduotos 72 302 628 vaistinių preparatų pakuotės. Lyginant keturių metų
(2010 – 2014 metų) parduotų vaistinių preparatų pakuočių statistiką, pastebimas 2014 metais bendrai parduotų pakuočių kiekio sumaţėjimas, tačiau išlieka suvartotų vaistų vidutinės paros dozės (DDD) tendencijos didėjimas. Šiuo laikotarpiu vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje išaugo nuo 826 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2010 m.) iki 1065 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2014 m.) [1].
Vaistinių preparatų vartojimas neatsiejamas nuo apsinuodijimų vaistiniais preparatais rizikos. Lietuvos sveikatos apsaugos ministerijos pateiktoje „2015 metų III ketvirčio Apsinuodijimo atvejo tyrimo protokolų apţvalgoje― matyti, kad apsinuodijimas medikamentais sudaro 70,83 proc. visų apsinuodijimų (204 atvejai iš 288) [2]. Vaistiniais preparatais galima apsinuodyti neteisingai juos vartojant: netinkama doze, ne pagal indikaciją, dėl pasireiškusios vaistų sąveikos, netyčia. Tačiau vis daţniau apsinuodijama medikamentais tyčia. Daţniausiai tyčiniai apsinuodijimai pasitaiko suaugusiųjų ir paauglių tarpe (atitinkamai 50 proc. ir 43 proc.), o vaikų tarpe atsitiktiniai – dėl netinkamai laikomų preparatų [3,4]. Taip pat pastebima ne tik pavienių vaistų apsinuodijimų, bet vis daţniau apsinuodijama vaistų mišiniais [2].
Dėl didėjančio medikamentinių apsinuodijimų skaičiaus, tikslinga diegti prevencines sistemas – informuoti visuomenę apie galimą pavojų, galimas atsargumo priemones. Taip pat reikia greitų ir tikslių apsinuodijimų nustatymo būdų, siekiant nustatyti apsinuodijimą sukėlusią medţiagą, taip išvengiant nepalankių baigčių. Todėl reikalingi metodai, kurie galėtų identifikuoti kelias medţiagas vienu metu. Šio darbo tikslas atrinkti ir pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, tinkamas psichotropinių vaistų mišinio – bromazepamo, risperidono ir fluoksetino kokybinei analizei su galimybe pritaikyti toksikologijos laboratorijos tyrimų praktikoje.
Darbo tikslas: pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, tinkamas bromazepamo, risperidono ir fluoksetino mišinio kokybiniam įvertinimui.
2. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: parinkti plonasluoksnės chromatografijos ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, tinkamas bromazepamo, risperidono ir fluoksetino kokybiniam įvertinimui.
Darbo uţdaviniai:
1. Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama bromazepamo, risperidono, fluoksetino ir šių medţiagų mišinio kokybiniam įvertinimui.
2. Pritaikyti ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama bromazepamo, risperidono, fluoksetino ir šių medţiagų mišinio kokybiniam įvertinimui.
3. Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos metodiką bromazepamo, risperidono ir fluoksetino, išskirtų iš vaistinių preparatų, kokybiniam įvertinimui.
4. Pritaikyti ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką bromazepamo, risperidono ir fluoksetino, išskirtų iš vaistinių preparatų, kokybiniam įvertinimui. 5. Pritaikyti validuotą ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką
3. LITERATŪROS APŢVALGA
3.1. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino vartojimo paplitimas
3.1.1. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino vartojimo paplitimas Lietuvoje
Siekiant įvertinti ir palyginti vaistų suvartojimo statistiką, tikslinga naudoti Pasaulinės sveikatos organizacijos rekomenduojamą ATC/DDD metodologiją (ATC –anatominę – terapinę – cheminę klasifikaciją, DDD – nustatytai paros dozei). Vaistų suvartojimo tendencijos analizuojamos pateikiant ATC/DDD/1000 – tai parodo vidutinę terapinę paros dozę, tenkančią 1000 – čiui gyventojų per dieną [3], [4]. ATC/DDD/ 1000 gyv./ per dieną apskaičiuojama dviem etapais:
Apskaičiuojama terapinė dienos dozė (DDD) pakuotėje
𝑥 =Vaistinio preparato stiprumas ∗ N (kiekis, pvz. : tab. , kaps. ) DDD (veikliosios medžiagos)
DDD suvartojimas per metus
𝑥 =DDD pakuotėje ∗ parduotų pakuočių kiekis per metus gyventojų skaičius tūkst.∗ dienų skaičius per metus
Valstybinės vaistų kontrolės pateiktoje vaistų suvartojimo statistikoje, 2015 metais Lietuvoje nervų sistemą veikiančių vaistų (N (pagal ATC klasifikaciją)) suvartota 153,528 DDD/1000 gyventojų/ per dieną. Tai antra daugiausiai suvartojama ATC grupė, po širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų grupės ( C grupė pagal ATC). Lyginant 2011 – 2015 metų pardavimus, nervų sistemą veikiančių vaistų suvartojimas išaugo 23,95 proc. (1 diagrama), o širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų – 17,79 proc.. Tačiau lyginant 2014 ir 2015 metų suvartojimo statistiką matyti, kad nervų sistemą veikiančių vaistų suvartojimas padidėjo 2,63 proc., o širdį ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų suvartojimas sumaţėjo 2,72 proc. [1], [4].
1 diagrama. 2011 -2015 metų nervų sistemą veikiančių vaistų suvartojimo statistika Lietuvoje[4] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2011 2012 2013 2014 2015 Psicholeptikai Psichoanaleptikai Nervų sistemą veikiantys vaistai
Bromazepamas priskiriamas benzodiazepino darinių pogrupiui, pagal ATC klasifikaciją N05BA. Bendras benzodiazepinų suvartojimas 2015 metais buvo 40,960 DDD/ 1000 gyv./ per dieną [4]. Tai sudaro 26,68 proc. visų nervų sistemą veikiančių vaistų – daugiausia suvartojamas N05 farmakologinio pogrupio atstovų. Pagal 2015 metų vaistų suvartojimo ataskaitą, populiariausi benzodiazepinai yra: lorazepamas (18,899 DDD/1000 gyv./per dieną), alprazolamas (8,578 DDD/1000 gyv./per dieną), bromazepamas (6,168 DDD/1000 gyv./ per dieną) ir diazepamas (5,423 DDD/1000 gyv./ per dieną) (1 lentelė). Lyginant 2011 – 2015 metų benzodiazepinų suvartojimą, pastebima, kad daugiausia padidėjo alprazolamo (57,95 proc.) ir bromazepamo (18,46 proc.) suvartojimas, lorazepamo kito neţymiai (1,80 proc.), o diazepamo vartojimas sumaţėjo (-7,19 proc.) [4].
1 lentelė. Benzodiazepino darinių suvartojimas Lietuvoje 2011 – 2015 metais (šaltinis: VVKT Vaistų vartojimo Lietuvoje 2012 m. ataskaita) [4]
ATC
kodas Pavadinimas
DDD/1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai
N05BA Benzodiazepinų dariniai 37,099 40,463 41,371 41,604 40,960
N05BA01 Diazepamas (DDD 10 mg) 5,843 6,083 5,913 5,738 5,423 N05BA02 Chlordiazepoksidas (DDD 30 mg/O; 50 mg/P) 0,115 0,115 0,108 0,094 0,081 N05BA03 Medazepamas (DDD 20 mg) 0,895 0,795 0,871 0,862 0,855 N05BA04 Oksazepamas (DDD 50 mg) 0,333 0,332 0,301 0,265 0,228
N05BA05 Klorazepato kalio druska (DDD
20 mg) 0,710 0,773 0,798 0,772 0,728
N05BA06 Lorazepamas (DDD 2,5 mg) 18,565 19,973 19,880 19,479 18,899
N05BA08 Bromazepamas (DDD 10 mg) 5,207 5,907 6,071 6,201 6,168
N05BA12 Alprazolamas (DDD 1 mg) 5,431 6,485 7,429 8,193 8,578
Risperidonas priskiriamas prie kitų antipsichotinių vaistų, pagal ACT klasifikaciją priklauso N05AX pogrupiui. 2015 metų duomenimis bendrai kitų antipsichotinių vaistų suvartota 1,610 (DDD/1000 gyv./ per dieną) [4]. Stebint 2011 -2015 metų pardavimus matyti, kad šio pogrupio pardavimai išaugo 50,19 proc.. Iš šio pogrupio daugiausia suvartojama risperidono – 0,889 (DDD/1000 gyv./ per metus), kas sudaro 55,22 proc. viso pogrupio. Lyginant 2011 – 2015 metų suvartojimo tendencijas matyti, kad risperidono suvartojimas padidėjo 10,16 proc., aripiprazolo 18,03 proc., o paliperidono net 1704,17 proc. (2 lentelė) [4].
2 lentelė. Kitų antipsichotinių vaistų suvartojimas Lietuvoje 2011 – 2015 metais (šaltinis: VVKT Vaistų vartojimo Lietuvoje 2015 m. ataskaita) [4]
ATC kodas Pavadinimas
DDD/1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai
N05AX Kiti antipsichotiniai vaistai 1,051 1,177 1,266 1,273 1,610
N05AX08 Risperidonas (DDD 5 mg/O; 1,8 mg/P) 0,807 0,895 0,909 0,897 0,889
N05AX12 Aripiprazolas (DDD 15 mg) 0,244 0,258 0,244 0,230 0,288
N05AX13 Paliperidonas (DDD 2,5 mg/P) * 0,024 0,113 0,146 0,433
Fluoksetinas priklauso SSRI (selektyvūs serotonino receptorių inhibitoriai) pogrupiui, pagal ATC klasifikaciją N06AB. Tai yra antras daţniausiai vartojamas nervų sistemą veikiančių vaistų farmakologinis pogrupis (18,15 proc.). Populiariausi šio pogrupio junginiai – escitalopramas (7,246 DDD/1000 gyv./ per dieną), sertralinas (5,128 DDD/1000 gyv./ per dieną), paroksetinas (3,097 DDD/1000 gyv./ per dieną), citalopramas (2,066 DDD/1000 gyv./ per dieną), fluoksetinas (0,661 DDD/1000 gyv./ per dieną) ir fluvoksaminas (0,420 DDD/1000 gyv./ per dieną) (3 lentelė). Lyginant 2011 – 2015 metų šių vaistų suvartojimą, pastebimas suvartojimo augimas – fluvoksamino 118,75 proc., citalopramo 90,24 proc., escitalopramo 45,06 proc., fluoksetino 33,27 proc., paroksetino 29,15 proc., sertralino 25,50 proc. [4].
3 lentelė. Selektyvių serotonino receptorių inhibitorių suvartojimas Lietuvoje 2011 – 2012 metais (šaltinis: VVKT Vaistų vartojimo Lietuvoje 2015 m. ataskaita) [4]
ATC
Grupė Pavadinimas
DDD/1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai N06AB Selektyvūs serotonino receptorių
inhibitoriai 13,253 14,939 15,916 16,611 18,618 N06AB03 Fluoksetinas (DDD 20 mg) 0,496 0,529 0,572 0,622 0,661 N06AB04 Citalopramas (DDD 20 mg) 1,086 1,116 1,089 1,083 2,066 N06AB05 Paroksetinas (DDD 20 mg) 2,398 2,649 2,891 3,018 3,097 N06AB06 Sertralinas (DDD 50 mg) 4,086 4,401 4,639 4,859 5,128 N06AB08 Fluvoksaminas (DDD 0,1 g) 0,192 0,168 0,164 0,151 0,420 N06AB10 Escitalopramas (DDD 10 mg) 4,995 6,076 6,561 6,878 7,246
3.1.2. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino vartojimo paplitimas ir palyginimas su kitomis šalimis
Norint įvertinti bromazepamo, fluoksetino ir risperidono vaistinių preparatų suvartojimą pasaulio mastu, išanalizuotos Estijos (2011 – 2015 m.), Latvijos (2011 – 2015 m.), Norvegijos (2011 –
2015 m.) ir Australijos (2009 – 2011 m.) vaistų suvartojimo ataskaitos bei palyginta su Lietuvos vaistų suvartojimu.
Bromazepamo suvartojimas Estijoje išaugo nuo 1,41 DDD/ 1000 gyv./per dieną (2011 metais) iki 1,462 DDD/ 1000 gyv./ per dieną (2015 metais) [5]. Tuo tarpu Latvijoje per tą patį laikotarpį atitinkamai 2,54 – 3,26 DDD/ 1000 gyv./ per dieną [6]. Norvegijoje bromazepamas neregistruotas. Australijoje dar 2008 – 2011 metais buvo stebimas bromazepamo vartojimo sumaţėjimas atitinkamai 0,135 – 0,128 DDD/1000 gyv./ per dieną [7]. Tarptautinės narkotikų kontrolės vadybos (INCB) pateiktoje 2014 metų psichotropinių medţiagų ataskaitoje, bromazepamas sudarė 7 proc. visų 2013 metais pagamintų benzodiazepinų grupės anksiolitikų kiekio (2 diagrama). O pasaulinis bromazepamo suvartojimas išaugo nuo 1,3 milijono DDD 2004 metasi iki 1,5 milijono DDD 2013 metais [8].
2 diagrama. 2013 m. pasaulyje pagamintų benzodiazepino junginių pasiskirstymas pagal kiekius (šaltinis: Jungtinių Tautų Tarptautinės narkotikų valdybos 2014 m. psichotropinių medžiagų
suvartojimo ataskaita) [8]
Vertinant surinktus duomenis, bromazepamas nėra plačiausiai vartojamas benzodiazepinas, tačiau jo vartojimas vis auga. Analizuojant įvairių šalių DDD tenkančią 1000 gyventojų per dieną, ryškiai išsiskiria Baltijos valstybės, kuriose suvartojimas yra didţiausias ir vis dar didėjantis, kuomet kitos šalys suvartoja maţiau ir pastebimas maţėjimas (3 diagrama). Daugiausia bromazepamo suvartojama Lietuvoje, tačiau augimas nebe toks staigus, Latvijoje taip pat išlieka didesnis suvartojimas ir augimas nei Estijoje, kur pokytis labai neryškus.
Alprazolamas 41 proc. Diazepamas 23 proc. Lorazepamas 17 proc. Bromazepamas 7 proc. Oksazepamas 3 proc. Chlordiazepoksidas 2 proc. Klobazepamas 1 proc. Klorazepamas
3 diagrama. Bromazepamo suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2009 – 2015 metais Analizuojant Baltijos valstybių, Norvegijos ir Australijos vaistų suvartojimo tendencijas, pastebimas nuoseklus fluoksetino kasmetinis pardavimų didėjimas (4 diagrama). Išskyrus Latviją, kur fluoksetino DDD 1000 gyventojų per dieną nuo 2011 metų iki 2015 metų sumaţėjo 3,2 proc. nuo 0,31 DDD/1000 gyv./ per dieną iki 0,30 DDD/1000 gyv./ per dieną [6]. Tuo tarpu Estijoje pastebimas didţiausias progresas – 2015 metais suvartojimas siekė 2,88 DDD/1000 gyv./ per dieną, tai 18 proc. daugiau nei 2011 metais [5]. Australijoje 2011 metais fluoksetino vartojimas išaugo 16,3 proc. iki 2,448 DDD/100 gyv./ per dieną, lyginant su 2009 metais [7]. Lyginant 2011 – 2015 metų vaistų suvartojimo statistiką Norvegijoje, fluoksetino vartojimas išaugo nuo 2,02 DDD/1000 gyv./ per dieną iki 2,25 DDD/1000 gyv./ per dieną, t.y. 11,4 proc. [9].
Didţiausias DDD tenkantis 1000 gyventojui per dieną fiksuojamas Estijoje, kiek maţesnės Norvegijoje ir Australijoje. Tuo tarpu Lietuvoje ir Latvijoje fluoksetino suvartojama atitinkamai 5 ir 8 kartus maţiau. Tačiau Lietuvoje pastebimas tendencingas vartojimo didėjimas, o Latvijoje neryškus maţėjimas.
Risperidono pardavimai Latvijoje 2011 – 2015 metais išaugo ketvirtadaliu nuo 0,73 DDD/1000 gyv./per dieną iki 0,92 DDD/1000 gyv./per dieną [6]. Estijoje taip pat pastebimas nuoseklus vartojimo didėjimas nuo 0,5 DDD/1000 gyv./ per dieną iki 0,6172 DDD/1000 gyv./ per dieną [5]. Maţiausias pokytis pastebėtas 2009 – 2011 metų Australijos vaistų suvartojimo ataskaitoje. Čia risperidono vartojimas kito neţymiai nuo 0,018 DDD/1000 gyv./ per dieną iki 0,022 DDD/ 1000 gyv./ per dieną [7]. Vienintelėje Norvegijoje 2011 – 2015 metų laikotarpiu risperidono vartojimas sumaţėjo 21,95 proc., nuo 0,82 DDD/1000 gyv./per dieną iki 0,64 DDD/ 1000 gyv./ per dieną (5 diagrama) [9]. 0 1 2 3 4 5 6 7
Lietuva Latvija Estija Australija
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
4 diagrama. Fluoksetino suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2009 – 2015 metais Risperidono suvartojimas Baltijos šalyse ir Norvegijoje yra ganėtinai panašus. Tik Australijoje yra labai maţas risperidono suvartojimas. Daugumoje šalių vis dar pastebimas tendencingas risperidono vartojimo didėjimas, išskyrus Lietuvą ir Norvegiją. Lietuvoje vartojimo maţėjimas pastebimas nuo 2014 metų, o Norvegijoje nuo 2012 metų. Šiuos metu didţiausias suvartojimas fiksuojamas Latvijoje, kur pastebimas spartus suvartojimo augimas. Pats maţiausias suvartojimas Australijoje, tačiau po truputi, ne ţymiai didėja.
5 diagrama. Risperidono suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2009 – 2015 metais 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Lietuva Latvija Estija Norvegija Australija
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Lietuva Latvija Estija Norvegija Australija
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
3.2. Apsinuodijimų bromazepamu, risperidonu ir fluoksetinu statistika
Viena pagrindinių sergamumo ir mirtingumo prieţasčių Lietuvoje ir pasaulyje yra apsinuodijimas vaistiniais preparatais. Remiantis sveikatos apsaugos ministerijos Ekstremalių sveikatai situacijų centro (ESSC) duomenimis, per pirmąjį 2014 metų ketvirtį teritorinės sveikatos įstaigos ištyrė 376 apsinuodijimų atvejus, iš kurių 166 atvejai yra apsinuodijimai medikamentais, kas sudaro 46 proc. visų pasinuodijimų. Amerikos medicinos toksikologijos (AMTK) apsinuodijimų registracijos sistemoje (ToxIC) 2014 metais uţregistruota 9172 apsinuodijimo atvejai, kurių 61,7 proc. buvo susiję su medikamentais. [10] Nacionalinio statistikos ofiso duomenimis, Anglijoje ir Velse 2014 metais buvo uţregistruota 3346 mirtini apsinuodijimai medikamentais, tai sudaro 39,9 proc. visų apsinuodijimų [11]. Norvegijos statistikos duomenimis, 2012 metais buvo uţregistruotos 246 su vaistais susijusios mirtys [12].
Bene didţiausia apsinuodijimų vaistais dalį sudaro vaikai. LTVSPĮ duomenimis net 56 proc. atvejų 2014 metais apsinuodijo vaikai. Tiriant apsinuodijimų aplinkybes išaiškėja, kad vaikai iki 7 metų daţniausiai apsinuodija dėl netinkamai saugoti paliktų medikamentų (51 proc.), o 11 – 17 metų vaikų tarpe dėl piktnaudţiavimo ir suicidinių bandymų (46 proc.). Tuo tarpu suaugusiųjų tarpe vyrauja tyčiniai apsinuodijimai, dėl piktnaudţiavimo ir siekiant nusiţudyti (54 proc.). AMTK duomenimis, iš visų 2014 metais uţregistruotų apsinuodijimų 62,4 proc. buvo apgalvoti [10].
Opioidiniai analgetikai, nenarkotiniai analgetikai, psichotropiniai vaistai, nenarkotiniai vaistai – tai vaistiniai preparatai, kuriais daţniausiai apsinuodijama. VVSPT ištirtų 2007 - 2011 metų apsinuodijimų vaistais duomenimis, psichotropiniai vaistai sudarė 18,8 proc., o antiepilepsiniai, sedatyviniai ir prieštraukuliniai vaistai 5,2 proc.. AMTK duomenimis NVNU sukelia 12,8 proc., sedatyviniai – hipnotiniai 12,4 proc., opioidai 10,5 proc., antidepresantai 10,4 proc., antipsichotiniai 5,5 proc. medikamentinių apsinuodijimų [10]. Anglijoje ir Velse apsinuodijimas antidepresantais sudarė 15,45 proc., o iš jų 30,7 proc. selektyvūs serotonino reabsorbcijos inhibitoriai, antipsichotiniai vaistai sudarė 3,76 proc. medikamentinių apsinuodijimų [11].
3.3. Tiriamosios medţiagos
3.3.1. Bromazepamas
Bromazepamas priklauso benzodiazepinų darinių grupei. Tai nervų sistemą veikiantis psicholeptinis vaistas, priskiriamas terapiniam antipsichozinių vaistų pogrupiui. Skirtas gydyti nerimui, panikai ir nemigai.[13] Lietuvoje bromazepamas registruotas šiais vaistinių preparatų pavadinimais: „Bromazepam Ingen Pharma―, „Bromazepam Lannacher―, „Lexotanil― [14].
C14H10BrN3O
MR: 316.2
UIPAC: 7–Bromo–5–piridin–2–il–1,3–dihidro–1,4– benzodiazepin–2–onas [15].
Bromazepamas yra balti ar gelsvi kristaliniai milteliai. Beveik netirpūs vandenyje, ribotai tirpūs alkoholyje ir dichlormetane [15].
Tai lipofilinis, ilgai veikiantis benzodiazepinas, pereinantis hematoencefalinį barjerą ir pasiţymintis raminamuoju, hipnotizuojančiu bei skeleto raumenis atpalaiduojančiu poveikiu. Dėl greitos reabsorbcijos ir greito poveikio pasiţymi didesniu piktnaudţiavimo potencialu nei kiti benzodiazepinai [14].
Bromazepamo veikimo mechanizmas pagrįstas jungimusi su gama amino sviesto rūgšties (GABA) receptoriais. Didindamas natūralų GASR aktyvumą, slopina neutronų jautrumą, nes prisijungus prie GABAA receptoriaus, padidinamas Cl- jonų laidumas. Tai sukelia postsinapsinrės
membranos hiperpoliarizaciją, dėl ko maţėja neurono aktyvumas ir jaudrumas. Kitų neurotransmiterių neveikia [16].
Bromazepamas pasiţymi dideliu bioprieinamumu – 84 proc. absorbuojama iš virškinamojo trakto. Kraujyje 70 proc. jungiasi su plazmos baltymais [17]. Įvairių šaltinių duomenimis, išgėrus vienkartinę 12 mg bromazepamo dozę, koncentracijos maksimumas (Cmax) 140 ng/ml pasiekiamas po
1 – 4 valandų (Tmax) [18]. Pasiskirstymo tūris (Vd) yra apie 50 litrų [19]. Pusiausvyrinė koncentracija
plazmoje pasiekiama per maţdaug 5 - 9 dienas. Pusinės eliminacijos laikas, priklausomai nuo individualaus metabolizmo, yra apie 10 – 20 valandų (t1/2). Klirensas 40 ml/min, tačiau senyviems
pacientams gali sumaţėti iki 50proc. lyginant su jaunais pacientais, taip pat pakinta ir pusinės eliminacijos laikas, dėl to reikia koreguoti dozes.
Metabolizuojamas kepenyse, vykdant oksidaciją citochromo P450 sistemai. Susidaro du pagrindiniai metabolitai – 3–hidroksi–bromazepamas ir 2–amino–5–brom–3–hidroksibenziolo piridinas, kurie konjugavus su gliukuranidu pašalinami su šlapimu [20]. Iš metabolitų farmakologiniu poveikiu pasiţymi tik 3–hidroksi–bromazepamas. Maţiau nei 2 proc. išsiskiria nepakitusios formos [21], [22].
Toksinis bromazepamo poveikis pasireiškia perdozavus, dėl per stipraus centrinės nervų sistemos slopinimo. Vartojamas vienas bromazepamas labai retai sukelia sunkių perdozavimo komplikacijų. Statistiškai visi benzodiazepinai atsakingi uţ 3,8 proc. visų mirtinų apsinuodijimų Anglijoje, vartojant vieną vaistą. Tačiau vartojant šiuos vaistus kartu su alkoholiu, opiatais ar tricikliais antidepresantais ţenkliai padidėja toksinis poveikis. Taip pat šalutiniam bromazepamo poveikiui yra jautresni vyresnio amţiaus ţmonės, kurie apsinuodyti gali dėl ilgalaikio jų vartojimo [23].
Apsinuodijus pasireiškia mieguistumas, nerišli kalba, nistagmas, hipotenzija, ataksija, koma, kvėpavimo slopinimas ir širdies bei kvėpavimo sustojimas [24].
Bromazepamas kelią rimtą pavojų dėl netyčinio perdozavimo, dėl sukeliamos priklausomybės. Nustatyta, kad net 30 proc. pacientų bromazepamas sukelia fizinę ir psichinė priklausomybę. Staiga vartoti nutraukus net ir terapinę dozę gali pasireikšti abstinencijos simptomai – nemiga, dirglumas, nerimas ir įtampa, panika, prakaitavimas, drebulys, galvos skausmas, raumenų skausmas, pykinimas, svorio netekimas, širdies plakimas, suvokimo sutrikimas, traukuliai, psichozė ir saviţudybė. Tai vienas daţniausiai pasitaikančių vaistų perdozuoti, vartojant kelis vaistus. Daţnai vartojamas siekiant nusiţudyti. Prancūzijoje bromazepamas yra daţniausiai pasitaikantis benzodiazepinas, siekiant tyčinio apsinuodijimo [25]. Esant sunkiam bromazepamo perdozavimui atsiranda alfa modelio komos tipas [26]. Vartojant kartu su opioidais, tricikliais antidepresantais ar alkoholiu didėja bromazepamo perdozavimo toksiškumas, kuris gali būti mirtinas dėl kvėpavimo slopinimo, kai nepakankamai deguonies pasiekia smegenis ir kūną.
3.3.2. Risperidonas
Risperidonas – benzizoksazolo darinys pasiţymintis antipsichotiniu poveikiu. Tai nervų sistemą veikiantis psicholeptinis vaistas, priskiriamas terapiniam antipsichozinių vaistų pogrupiui, atipiniams antipsichotikams. Skirtas gydyti šizofrenijai, bipoliniam sutrikimui, autizmu sergančių vaikų irzlumui maţinti [13]. Lietuvoje risperidonas registruotas šiais vaistinių preparatų pavadinimais: „Aleptolan―, Medorisper―, „Rispolept consta―, „Rileptid―, „Risperidon actavis―, „Rispolept― ir „Torendo― [14].
C23H27FN4O2
MR: 410,48
UIPAC: 4-[2-[4-(6-fluorobenzo[d]izoksazol-3-il)-1-piperidil]etil]-3-metil-2,6-diazabiciklo [4.4.0] deka-1,3-dien-5-onas.
Risperidonas yra balti ar beveik balti milteliai, tirpūs metileno chloride, metanolyje ir vandenilio chlorido rūgštyje, beveik netirpūs vandenyje.[27]
Risperidonas atipinis antipsichotinis vaistas, turintis didelį giminingumą 5–hidrotriptamino (5–HT) ir dopamino D2 receptoriams. Dėl to yra tinkamas gydyti teigiamus ir neigiamus šizofrenijos
simptomus, nes turi maţiau šalutinių poveikių, nei pirmos kartos vaistai nuo psichozės, kurie yra stiprūs nespecifiniai dopamino D2 receptorių antagonistai. Tai daţniausiai skiriamas antipsichotinis
Risperidonas veikia blokuodamas dopaminerginius D2 receptorius limbinėje sistemoje, taip
palengvina teigiamus šizofrenijos simptomus – haliucinacijas, kliedesius, chaotišką elgesį ir kalbą. Taip pat blokuoja serotoninerginius 5–HT2 receptorius mezokortikaliniame trakte, dėl to padidėja
dopamino perdavimas, tai sukelia dopamino perteklių, kuris slopina neigiamus šizofrenijos simptomus. Tačiau dopamino receptoriai, veikiantys nigrostrialiniu keliu, nėra veikiami risperidono, dėl to išvengiama ekstrapiramidinių reiškinių. Kaip ir kiti – HT2 receptorių antagonistai, truputį silpniau
jungiasi prie alfa adrenerginių ir histamino H1 receptorių [29].
Pasiţymi geru biologiniu prieinamumu – 70 proc. absorbuojama iš virškinamojo trakto. Santykinis risperidono biologinis prieinamumas lyginant išgėrus tabletę su tirpalu – 94 proc.. Greitai pasiskirsto, nes pasiskirstymo tūris Vd 1-2 l/kg. Plazmoje risperidonas jungiasi su albuminais ir A1
rūgšties glikoproteinu. Prie kraujo plazmos baltymų jungiasi 88 proc. risperidono ir 77 proc. jo aktyvaus metabolito 9–hidroksirisperidono [29]. Risperidono koncentracijos maksimumas (Cmax)
kraujo plazmoje pasiekiamas po 1 valandos (Tmax), 9–hidroksirisperidono po 3h (esant plačiam
metabolizmui, turint daug fermentų, metabolizuojančių risperidoną) arba 17h (esant blogam metabolizmui, turint maţai risperidoną metabolizuojančių fermentų). Pusiausvyrinė koncentracija atitinkamai pasiekiama po dienos risperidonui ir po 5 – 6 dienų jo metabolitui [30]. Pusinės eliminacijos laikas (t1/2), priklausomai nuo individualaus metabolizmo, risperidonui 3 – 20 h, o 9 –
hidroksirisperidonui 21 – 30 h. Klirensas (CL) 36 ml/min, tačiau senyviems pacientams sumaţėja iki 60 proc., dėl to reikia koreguoti doze [31].
Risperidonas intensyviai metabolizuojamas kepenyse. Pagrindinis metabolizmo kelias – hidroksilinti risperidoną į 9 – hidroksirisperidoną per citochromo P450 2D6 (CYP2D6) sistemą. Antraeilis metabolizmo kelias yra N – dealkilinimas. Metabolizuojant susidaro aktyvus metabolitas 9 – hidroksirisperidonas. Dėl to klinikinis poveikis yra kombinuotas ir priklauso tiek nuo vaisto, tiek nuo jo metabolito. Daţniausiai CYP2D6 pasiţymi genetiniu polimorfizmu. Dėl to ţmonės, turintys daug CYP2D6 fermentų, pasiţymi geru metabolizmu, o turintys nedaug – silpnu. Su šlapimu pašalinama 70 proc. vaisto, o su išmatomis 14 proc. [32].
Toksinis risperidono poveikis pasireiškia perdozavus. Kadangi turi silpną anticholinerginį poveikį, bet yra stiprus dopamino ir serotonino receptorių antagonistas ir taip pat veikia alfa adrenerginius receptorius, dėl to gali sukelti sunkias širdies ir kraujagyslių komplikacijas [33]. Atsiranda tokie simptomai kaip mieguistumas, sedacija, tachikardija, hipotenzija ir ekstrapiramidiniai simptomai. Nustatyta, kad toksinė risperidono dozė pelėms yra LD50= 82,1 mg/kg [34]. Apsinuodijus
nėra specifinio priešnuodţio, taikomas tik simptominis ir palaikomasis gydymas [35].
Teksaso apsinuodijimų centras 2001 – 2007 metais Amerikoje išanalizavo 2611 apsinuodijimo atvejus, susijusius su atipinių antipsichotinių vaistų vartojimu. Iš jų – vienas risperidonas ar derinyje su kitais vaistais sudarė per 65,5 proc. visų atvejų [36]. Australijoje buvo tirti
157 apsinuodijimai vaistais, iš jų vienu risperidonu apsinuodijo 38 pacientai. Šie tyrimai įrodė, kad perdozavus vieno risperidono atsiranda minimalūs toksiniai efektai, tokie kaip tachikardija ir distoninė reakciją. Tai įrodo risperidono sukeliamus ekspiramidinius reiškinius, o ne toksinius širdies paţeidimus [37].
3.3.3. Fluoksetinas
Fluoksetinas priklauso fenilpropilaminų darinių grupei. Tai nervų sistemą veikiantis psicholeptinis vaistas, priskiriamas terapiniam antidepresantų vaistų pogrupiui, selektyviems serotonino receptorių inhibitoriams. Skirtas gydyti didţiosios depresijos sutrikimą, vidutinio sunkumo ar sunkią nervinę bulimiją, obsesinį – kompulsinį sutrikimą, priešmenstruacinį disforinį sutrikimą, paniką su agorafobija ar be jos [13]. Lietuvoje fluoksetinas registruotas šiais vaistinių preparatų pavadinimais: „Fluoxetine Lannacher―, „Fluoxetine Vitabalans―, „Flux―, „Magrilan― [14].
C17H18F3NO
MR : 309.32613 g/mol
UIPAC: N-metil-3-fenil-3-[4-(trifluormetil)fenoksi] propan-1-aminas [38].
Fluoksetinas vartojamas chlorido druskos pavidalu. Tai yra balti ar balkšvi kristaliniai milteliai. Tirpsta metanolyje, etanolyje, acetonitrile, trichlormetane ir acetone, lengvai tirpsta etilo acetate, dichlormetane ir vandenyje. Visiškai netirpsta toluene, cikloheksane ir heksane [27].
Fluoksetinas yra raceminis mišinys sudarytas iš R ir S enantiomerų, kurie pasiţymi lygiaverčiu farmakologiniu aktyvumu. Kaip ir kitų antidepresantų, klinikinis poveikis pasireiškia po dviejų gydymo savaičių. Tai yra stiprus ir selektyvus serotonino inhibitorių receptorių blokatorius, kuris silpnai arba visiškai neveikia norepinefrino ir dopamino receptorių, bei visiškai neslopina α ir β adrenoreceptorių, histamino H1 ir dopamino D2 receptorių. Dėl to turi maţesnį šalutinį poveikį nei
tradiciniai antidepresantai [39].
Fluoksetino, kaip ir jo metabolito norfluoksetino, veikimo mechanizmas pagrįstas neuronų membranoje esančio serotonino siurblio blokavimu – dėl ko didėja serotonino kiekis tarp membraninėje erdvėje ir stiprėja poveikis į presinapsinius 5HT receptorius [40]. Todėl pagal aminų teorija, padidėjus funkcinių aminų kiekiui (serotonino ir norepinefrino) gerėja nuotaika, o sumaţėjus – atsiranda depresija [41].
Fluoksetino biologinis prieinamumas yra geras, jis lengvai absorbuojamas iš virškinamojo trakto 60 – 80 proc.. Kraujyje 94,5 proc. jungiasi su albuminais ir alfa glikoproteinais [42].
Koncentracijos maksimumas (Cmax) kraujo plazmoje pasiekiamas po 6 – 8 valandų (Tmax), pavartojus
vienkartinę 40 mg dozę [43]. Tai lipofilinis vaistas, turintis didelį pasiskirstymo tūrį (Vd) 20 – 45 l/kg [44]. Priklausomai nuo individualaus pacientų metabolizmo, pusinės eliminacijos laikas, esant greitam metabolizmui yra 1 – 3 dienos, o esant lėtam metabolizmui 4 – 6 dienos, o norfluoksacinui 4 – 16 dienų. Dėl ilgo pusinio eliminacijos laiko, reikia 1 – 22 mėnesių, norint pasiekti pusiausvyrinę koncentraciją kraujyje [45].
Fluoksetinas daugiausia metabolizuojamas kepenyse, N – dimetilinimo reakcijos metu, gaunamas pagrindinis aktyvus metabolitas – norfluoksacinas. Svarbiausi metabolizmą veikiantys fermentai citochromo CYP2D6 bei CYP2C19 ir CYP2C9 [46]. Abu junginiai toliau dalyvauja II metabolizmo reakcijose, kur sujungiami su gliukurono rūgštimi. Vėliau O – dealkilinimo reakcijos metu gauti neaktyvūs metabolitai pašalinami su šlapimu. Nepakitusio vaisto pašalinama tik apie 10 proc. [42].
Daţniausiai fluoksetino toksiškumas pasireiškia dėl perdozavimo. Dėl serotonino reabsorbcijos slopinimo ir stipraus serotonerginio poveikio gali atsirasti gyvybei pavojingas serotonino sindromas [47]. Tai būklė, kuri daţniausiai pasireiškia nervų ir raumens, autonominės ir virškinimo sistemos simptomais, nes juose daug serotonino receptorių. Dėl kritiškai padidėjusio serotonino kiekio, atsiranda psichinės būklės pokyčiai, raumens nervų hiperaktyvumas ir autonominės sistemos nestabilumas [48]. Pasireiškia tokie simptomai, kaip nerimas, nervingumas, nemiga, mieguistumas, nuovargis ar astenija, tremoras ir galvos svaigimas ar apsvaigimas, anoreksija, pykinimas ir viduriavimas, burnos dţiūvimas, nenormalus regėjimas, sumaţėjęs lytinis potraukis, nenormali ejakuliacija, bėrimas ir prakaitavimas [49]. Nustatyta, kad toksinė fluoksetino dozė pelėms yra LD50=284 mg / kg kūno svorio [39].
3.4. Bromazepamo, risperidono ir fluoksetino kokybinis vertinimas plonasluoksnės
chromatografijos metodu
3.4.1. Plonasluoksnė chromatografija (PC)
Chromatografija yra fizikocheminės analizės metodas, paremtas skirtingu komponentų pasiskirstymu tarp nejudrios ir judrios fazių. Po atskyrimo, komponentus galima nustatyti kokybiškai ir kiekybiškai.
Viena iš chromatografijos metodikų – plonasluoksnė chromatografija (PC). Tai vienas paprasčiausių ir lengviausiai atliekamų metodų. Pirmą kartą paskirstomąją chromatografiją 1941 metais pristatė Mertin ir Singe. Tai metodas, kurio nejudri fazė yra lakšto pavidalo arba sudaro dangą ant plokštumos. Pagrindiniai chromatografavimo principai nesikeičia nuo sukūrimo [50].
Plonasluoksnės chromatografijos esmę sudaro stiklinė plokštelė, aliuminio folija ar plastikas, padengtas plonu (~0,25 mm) sorbento sluoksniu – nejudančiąja faze. Daţniausiai naudojami sorbentai – silikagelis ar aliuminio oksidas. Judančiąja fazę daţniausiai sudaro organinių tirpiklių mišinys, kuriuo įsotinama chromatografavimo kamera. Nedidelis kiekis tiriamosios medţiagos tirpalo mikrokapiliaru uţnešama ant chromatografinės plokštelės starto linijos. Leidţiama nudţiūti ir dedama į chromatografavimo kamerą, pripildytą tirpiklių sistemos. Tirpiklių sistema, neturėtų siekti starto linijos. Dėl absorbcijos jėgos veikimo, mobili fazė kyla plokštele, kartu keldama ir tiriamąsias medţiagas. Mėginių pasiskirstymas įvyksta dėl skirtingo giminingumo stacionariai ir judančiai fazei. Tirpiklių sistemai pasiekus finišo liniją, plokštelė išimama ir išdţiovinama. Išdţiuvus, medţiagų dėmės ryškinamos UV šviesa ar daţoma cheminiais reagentais – ryškikliais.
Plonasluoksnė chromatografija pasiţymi paprasta atlikimo technika, nesudėtinga aparatūra, greitu atlikimu, atrankumu. Dėl to tinkama naudoti medţiagų atskyrimui, identifikavimui biologiniuose skysčiuose, cheminių ir botaninės kilmės vaistų sudėčiai vertinti, junginių valymui ir priemaišų nustatymui.
3.4.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti bromazepamą, risperidoną ir fluoksetiną
Įvairiuose mokslinės literatūros šaltiniuose yra pateikta įvairių plonasluoksnės chromatografijos analizės metodikų, skirtų nustatyti bromazepamui, risperidonui ir fluoksetinui biologiniuose skysčiuose ar vaistiniuose preparatuose. Daţniausiai pateikti analizės metodai yra skirti identifikuoti atskirus arba panašią cheminę struktūrą bei chemines savybes turinčius junginius, dauguma skirta analizuoti konkrečias vaistinių medţiagų grupes. Lentelėje (Nr. 4) pateikiama susisteminta įvairių literatūros šaltinių informacija apie plonasluoksnės chromatografijos metodikas pritaikytas analizuoti pavienius bromazepamo, risperidono ir fluoksetino junginius.
Kaip matyti iš lentelėje pateiktų duomenų, literatūroje nėra aprašyta mobili fazė tinkama bromazepamo, risperidono ir fluoksetino mišinio atskyrimui. Tai sudėtinga dėl artimų Rf reikšmių arba išvis nėra tinkamos sistemos visoms trims medţiagoms atskirti, esant joms mišinyje. Apibendrinant lentelės duomenis, galima teigti, kad daţniausiai plonasluoksnės chromatografijos mobiliai fazei naudojama: metanolis, trichlormetanas, koncentruotas amonio hidroksidas, cikloheksanas ir acetonas.
Kadangi atlikus mokslinės literatūros analizę, nebuvo rasta tinkamos plonasluoksnės chromatografijos metodikos mobilios fazės bromazepamo, risperidono ir fluoksetino mišinio kokybiniam įvertinimui ir atskyrimui, dėl to buvo nuspręsta, kad tinkama mobili fazė mišinio išskirstymui bus ieškoma eksperimento būdu.
4 lentelė. PC mobilios fazės tinkamos bromazepamo, risperidono ir fluoksetino kokybinei analizei [27]
Mobili fazė Bromazepamo
Rf reikšmė
Risperidono Rf reikšmė
Fluoksetino Rf reikšmė Metanolis: koncentruotas amonio
hidroksidas (100:1,5) 0,61 - -
Cikloheksanas: toluenas: dietilaminas
(75:15:10) 0,06 - 0,13
Trichlormetanas: metanolis (90:10) 0,41 - -
Trichlormetanas: Acetonas (80:20) 0,13 - -
Etilo acetatas: metanolis: koncentruotas
amonio hidroksidas (85:10:5) 0,63 - 0,47
Acetonas 0,73 - 0,11
Metanolis 0,53 - -
Metanolis: n-butanolis (60:40) ir 0,1
mol/l natrio bromido tirpalo 0,69 - -
Trichlormetanas: etanolis (90:10) 0,34 - -
Trichlormetanas: metanolis: propiono rūgštis
(72:18:10) 0,63 - -
3.5.
Bromazepamo,
risperidono
ir
fluoksetino
kokybinis
vertinimas
ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu
3.5.1. Ultraefektyvioji skysčių chromatografija (UESC)
Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos sąvoka (UESC) (angl. Ultrahigh – perfomance liquid chromatography (UHPLC)) pirmą kartą paminėtą 2004 metais Waters korporacijos Pitkono parodoje, geriau ţinomojoje kaip Pitsburgo konferencija, Čikagoje [51]. Siekiant išskirti modernią UESC nuo klasikinės kolonėlinės skysčių chromatografijos, naudojamos nuo XX amţiaus 4 – ojo dešimtmečio. Tai chromatografijos metodas, naudojant kolonėlę, tačiau pasiţymintis itin dideliu efektyvumu ir analizės greičiu. Dėl šio patobulėjimo, UESC tapo vienu plačiausia naudojamu analizės metodu, skirtu kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui įvairiuose pramonės srityse.
Pagrindiniai skirtumai, dėl ko ultraefektyvioji skysčių chromatografija pasiţymi greitesniu išskirstymu ir geresne skiriamąja geba – trumpos (5 – 20 cm) ir siauro (2 – 6 mm) vidinio skersmens plieninės kolonėlės, pripildytos labai maţo (2 – 1,8 µm) skersmens nejudrios fazės granulėmis. Tačiau dėl maţo granulių dydţio susidaro hidrodinaminis pasipriešinimas kolonėlėje. Dėl to, siekiant įveikti hidrodinaminį pasipriešinimą – judri fazė pumpuojama per kolonėlę didelio slėgio (~19,000 MPa) siurbliais. Ko pasekoje linijinis tėkmės greitis UESC kolonėlėse yra apie 10 kartų spartesnis nei efektyviojoje skysčių chromatografijoje. Taip pat dėl maţų sorbentų dalelių dydţio, atskyrimas UESC
yra efektyvesnis. Viso to pasekoje, UESC pasiţymi didesniu skirstymo efektyvumu ir trumpesniu analizės laiku [52].
Chromatografinio skirstymo analizė apima bandinio įleidimą, skirstymą, detekciją ir gautų duomenų apdorojimą. Analizuojamas mišinys yra teikiamas kartu su eliuentu, kuris iš mobilios fazės rezervuaro, aukšto slėgio siurbliu, teka pro kolonėlę. Skirstymo pagrindą sudaro analičių plovimas iš nejudančios fazės, kuri daţniausia būna silikagelis (su įvairiomis cheminėmis modifikacijomis). Priklausomai nuo analizuojamos medţiagos giminingumo sorbentui, ji iš kolonėlės išplaunama skirtingu laiku, vadinamu sulaikymo laiku. Medţiagų išskirstymui galima naudoti absorbciją, ekskliuziją, pasiskirstymą, jonų mainus ir kt. Kuo maţesnis tiriamosios medţiagos afinitetas sorbentui, tuo greičiau ji išplaunama iš kolonėlės. Tuomet detektorius fiksuoja tiriamąją medţiagą kaip signalą ir kompiuteris konvertuoja į chromatogramą – signalo stiprumo priklausomybę nuo laiko grafiką.
3.5.2. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti bromazepamą, risperidoną ir fluoksetiną
Kaip pagrindas. kokybiniam ir kiekybiniam bromazepamo, fluoksetino ir risperidono tyrimui UESC metodu, naudota ESC metodika. Buvo tiriamos ir analizuojamos aprašytos įvairios ESC metodikos, tačiau kiekvienam junginiui individualiai. 5 lentelėje pateiktos ESC metodikos, kurios gali būti naudojamos bromazepamo, fluoksetino ir risperidono kokybinei analizei biologiniuose skysčiuose ar vaistiniuose preparatuose. Sekančioje 6 lentelėje pateiktos ESC metodikų charakteristikos.
5 lentelė. UESC metodikos tinkamos bromazepamo, risperidono ir fluoksetino kokybinei analizei [27] Metodika Bromazepamo sulaikymo laikas Risperidono sulaikymo laikas Fluoksetino sulaikymo laikas HI 2,32 min HK 2,99 min
HZ – RT 3,0 min 3,1 min 7,6 min
HAA – RT 14,7 min 16,2min
HAF – RT 6,6 min
HAX – RT 5,8 min 9,1 min 12,2 min
HAY – RT 5,1 min 4,6 min 7,07 min
HBH 1,63 min
HAL – RT 8,1 min
HBI 0,80 min
Atlikus literatūros analizę nerasta tyrimų, kuriuose būtų analizuotas bromazepamo, fluoksetino ir risperidono mišinys. 5 lentelėje pateiktos ESC metodikos pritaikytos analizuoti visas tris medţiagas atskirai, tačiau medţiagų sulaikymo laikai daugelyje sistemų yra artimi, todėl mišinio analizei aprašytos metodikos nėra tinkamos. Literatūroje pateiktos ESC metodikos buvo naudojamos
kaip pamatas, kuriant ir tobulinant tinkamiausią UESC metodiką, tinkančią bromazepamo, fluoksetino ir risperidono kokybinei ir kiekybinei analizei esant jiems mišinyje.
6 lentelė. ESC metodikų charakteristika [27] Kolonėlė Mobili fazė Gradientinis
eliuavimas Tekėjimo greitis Detektorius H HI ODS Hypersil (200 x 5,0 mm, 5 µm) Metanolis: vanduo: fosfato buferis H HK Silica Spherisorb (250 × 5,0 mm, 5 µm) Metanolis: perchlorato rūgštis H HZ C18 LiChrospher 100
Rp-18e (125 × 4,0 mm, 5 µm) Vanduo 0,6 ml/min
Fotodiodų matricos H HAA C8 Symmetry (250 × 4,6 mm, 5 µm),30° C. Fosfatinis buferis (A): acetonitrilas (B)
Per 6,5 min nuo 85:15 iki 65:35, o 25 min iki 20:80 1 ml/min, 1,5 ml/min Fotodiodų matricos H HAF
ODS TSK-gel Super (100 × 4,6 mm, 2 µm) Acetonitrilas (A): divandenilio fosfatas (B) 45:55 0,65ml/min UV 254 nm H HAX Supelcosil LC – DP (250 × 4,6 mm, 5µm) Acetonitrilas: fosforo rūgštis: trietilamino buferis 0,6 ml/min Fotodiodų matricos H HAY LiChrospher 100 RP – 8 (250 × 4,0 mm, 5 µm) Acetonitrilas: fosforo rūgštis: trietilamino buferis 0,6 ml/min Fotodiodų matricos H HBH ODS (25 x 05mm, 5 µm) Metanolis: vanduo:
fosfato buferis 1 ml/min UV 240 nm
H HAL C18 Novapak (150 × 4,6 mm, 5 µm) Acetonitrilas: metanolis: fosfato buferis 1,3 ml/min Fotodiodų matricos H HBI ODS (25 x 05mm, 5 µm) Metanolis: vanduo:
4. EKSPERIMENTINĖ DALIS
4.1. Tyrimo objektas ir metodika
4.1.1. Tyrimo objektas
Siekiant sukurti optimalias kokybinio įvertinimo plonasluoksnės ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikas bromazepamui, risperidonui ir fluoksetinui, buvo tiriamas šių vaistinių medţiagų mišinys. Medţiagos buvo ekstrahuojamos iš „Bromazepam Lannacher‖ ir „Rispolept― tablečių bei „Fluoxetine Lannacher― kapsulių. Standartinės medţiagos – bromazepamas (Sigma-Aldrich, JAV), risperidonas (Sigma – (Sigma-Aldrich, JAV), fluoksetinas (Alfa Aesar – Termo Fisher, Vokietija).
4.1.2. Kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodu Įranga
Tyrimo pradţioje, ieškant optimalios tirpiklių sistemos, buvo naudojama aliuminės chromatografinės plokštelės (DC – Fertigfolien Alugram SIL G/UV254), padengtos silikageliu F60254,
sorbento sluoksnis 0,2 mm, matmenys 10×10 cm. Vėliau, radus tinkamas tirpiklių sistemas, siekiant kokybės ir tikslumo naudotos stiklinės plokštelės. Tiriamųjų ir standartinių medţiagų tirpalų uţnešimui ant plokštelės naudotas pusiau automatinis mėginių uţnešėjas CAMAG Linomat 5, kuris mėginius uţneša suformuodamas brūkšnelio formos dėmę. Mėginių turis 10 µl. Chromatografavimas atliktas CAMAG Twin Trough Chamber 20 x 20 cm chromatografavimo kameroje. Tirpiklių sistemos tūris 20 ml.
Tirpikliai
Tiriamieji bei standartiniai medţiagų tirpalai buvo ruošiami naudojant tirpiklį metanolį. Mobiliajai tirpiklių sistemai buvo naudota: etilo acetatas, metanolis, 25 proc. amonio hidroksidas, dichlormetanas, cikloheksanas, acetonas, dietilaminas.
Ryškikliai
Išdţiovintų chromatografinių plokštelių ryškinimui naudota:
UV šviesa (254 nm).
Tiriamųjų mišinių vaistinių medţiagų dėmių Rf reikšmės nustatomos naudojant vizualizavimo prietaisą CAMAG TLC Visualizer kartu su programine VideoScan įranga.
Etaloniniai tirpalai
Etaloniniai tiriamųjų medţiagų tirpalai paruošti ištirpinus jų standartus metanolyje. Paruošti 0,2 mg/ml koncentracijos etaloniniai bromazepamo (BE02), risperidono (RE02) ir fluoksetino (FE02)
tirpalai. Etaloninis medţiagų mišinio tirpalas (ME02) buvo paruoštas, sumaišius po 1 ml etaloninių tirpalų.
Tiriamieji tirpalai
Tiriamųjų medţiagų darbiniai tirpalai buvo paruošti iš Lietuvos vaistinėse parduodamų vaistinių preparatų.
Bromazepamo darbinis tirpalas (B1) buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Bromazepam Lannacher― (Lannacher) 6 mg stiprumo tablečių. Buvo paimtos 5 „Bromazepam Lannacher― tabletės, kurių bendras svoris sudarė 1,06830 g, ir disperguotos grūstuvėje. 0,3561 g gautų miltelių, atitinkančių 10 mg perkelta į analitinę kolbutę ir uţpilta 25 ml metanolio. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 15 minučių. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. 10 ml centrifugato filtruota per PVDF filtrą, kurio porų dydis 0,45 µm. Gautas metanolinis bromazepamo tirpalas naudotas tolimesniems tyrimams. Risperidono darbinis tirpalas (R1) buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Rispolept― (Johnson & Jahnson) 4 mg stiprumo tablečių. Buvo paimtos 5 tabletės, kurių bendras svoris 2,0192 g, ir disperguotos grūstuvėje. 1,009 g gautų miltelių, atitinkančių 10 mg risperidono perkelta į analitinę kolbutę ir uţpilta 25 ml metanolio. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 15 minučių. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. 10 ml centrifugato filtruota pro PVDF filtrą (0,45 µm). Gautas metanolinis risperidono tirpalas naudotas tolimesniuose tyrimuose.
Fluoksetino darbinis tirpalas (F1) buvo pagamintas is vaistinio preparato „Fluoxetine Lannacher― (Lannacher) 20 mg stiprumo kapsulių. Buvo paimta 1 „Fluoxetine Lannacher― kapsulė ir išardţius pasverta miltelių masė, kurių svoris buvo 0,2592 g. Iš jų atsverta 0,1296 g miltelių, atitinkančių 10 mg fluoksetino ir perkelta į analitinę kolbutę bei uţpilta 25 ml metanolio. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 15 minučių. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. 10 ml centrifugato filtruota pro PVDF filtrą (0,45 µm). Gautas metanolinis fluoksetino tirpalas naudotas tolimesniuose tyrimuose.
Analizė
Naudojant etaloninius tirpalus – BE1, RE1, FE1 ir ME1, nustatytos optimalios chromatografavimo sąlygos. Ant chromatografinės, plokštelės, padengtos silikageliu, naudojant pusiau automatinį mėginių uţnėšėją CAMAG Linomat 5 buvo uţnešami mėginiai. 10 µm mėginio išpurkšta didelio azoto slėgiu. Mėginiai uţdedami ant plokšteles „starto linijos― (1,5 cm nuo plokšteles apačios). Plokštelė su uţdėtais mėginiais perkeliama į chromatografavimo kamerą su atitinkamomis tirpiklių sistemomis (TS) ir laikoma, kol TS plokštele pakyla 10 cm (poslinkis matuojamas „starto linijos― atţvilgiu). Po to chromatografavimo plokštelės išimamos, dţiovinamos ir ryškinamos UV šviesa (254 nm). Nustačius ir atskyrus, medţiagų dėmes, buvo apskaičiuojamos jų sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės.
Pagrindinis plonasluoksnės chromatografijos vertinimo rodiklis – sulaikymo rodiklis (Rf), kuris išreikštas tiriamosios medţiagos fronto poslinkio atstumo (L1) ir tirpiklių sistemos fronto poslinkio atstumo (L2) santykiu.
Rf = 𝐿1 (𝑚𝑚 )𝐿2 (𝑚𝑚 )
Eksperimentinio tyrimo metodu nustatytos tinkamiausios tirpiklių sistemos bromazepamo, risperidono ir fluoksetino atskyrimui mišinyje. Siekiant įvertinti metodikos tinkamumą medţiagoms išskirtoms iš vaistinių preparatų analizei, buvo atliekami pakartotiniai tyrimai su darbiniais tiriamaisiais tirpalais. Etaloninių (BE1, RE1, FE1) ir darbinių (B1, R1, F1) tirpalų bei jų mišinių (ME1 ir M1) mėginiai buvo uţdėti ant chromatografavimo plokštelės. Chromatografavimo sąlygos keičiamos nebuvo (tokia pati kiekybinė sudėtis, uţnešimo būdas, tirpiklių tūrio dalių santykiai, kameros pripildymas garais). Chromatografavimo laikas – tirpiklių sistemos pakilimas 10 cm nuo „starto linijos―. Po to plokštelės buvo dţiovinamos ir ryškinamos UV šviesa (254 nm). Nustačius ir atskyrus medţiagų dėmes, apskaičiuojamos Rf reikšmės ir lyginamos su atitinkamomis etaloninių tirpalų Rf reikšmėmis.
4.1.3 Kokybinis ir kiekybinis vertinimas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Įranga
Vertinant kiekybinį nustatymą ultraefektyviąja skysčių chromatografija (UESC), optimalioms sąlygoms nustatyti buvo naudojamas chromatografas (Waters 2695) su fotodiodų matricos detektoriumi (Waters 996, 210 – 400 nm bangų ilgio diapazonas). O medţiagų atskyrimui naudota chromatografavimo kolonėlė Waters Acquity C18 (2,1 mm x 5,0 cm), kurios sorbento dalelių dydis 1,7 µm.
Tirpikliai
Darbinių ir etaloninių tirpalų paruošimui buvo naudojamas metanolis.
Chromatografavimui buvo naudoti: acetonitrilas, išgrynintas vanduo, pagamintas „Millipore― (JAV) vandens gryninimo sistema, 0,0253 proc. fosforo rūgšties vandeninis tirpalas.
Etaloniniai tirpalai
Tirpinant metanolyje bromazepamo (Sigma – Aldrich, JAV), risperidono (Sigma – Aldrich, JAV) ir fluoksetino (Alfa Aesar – Termo Fisher, Vokietija) medţiagų standartus, gauti etaloniniai tiriamieji tirpalai. Pagaminti 0,1 mg/ml koncentracijos bromazepamo (BE2), risperidono (RE2) ir fluoksetino (FE2) standartiniai tirpalai. Sumaišius standartinius medţiagų tirpalus vienodomis dalimis, gautas etaloninių medţiagų mišinys (ME2).
Tiriamieji tirpalai
Iš Lietuvos vaistinėse parduodamų vaistinių preparatų pagaminti tiriamieji tirpalai.
Bromazepamo darbinis tirpalas (B2) paruoštas iš vaistinio preparato „Bromazepam Lannacher― (Lannacher) 6 mg stiprumo tablečių. Buvo paimtos 5 „Bromazepam Lannacher― tabletės, kurių bendras svoris sudarė 1,06830 g, ir disperguotos grūstuvėje. 0,3561 g gautų miltelių, atitinkančių 10 mg bromazepamo, perkelta į analitinę kolbutę ir uţpilta 10 ml metanolio. Suspensija laikyta ultragarso vonelėje 15 minučių. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. 5 ml centrifugato filtruota per PVDF filtrą, kurio porų dydis 0,45 µm. Paimtas 1 ml filtruoto tirpalo ir praskiestas metanoliu iki 10 ml tūrio. Gautas metanolinis bromazepamo tirpalas naudotas ultraefektyviajai skysčių chromatografijai.
Risperidono darbinis tirpalas (R2) pagamintas iš vaistinio preparato „Rispolept― (Johnson & Johnson) 4 mg stiprumo tablečių. Buvo paimtos 5 tabletės, kurių bendras svoris 2,0189 g, ir disperguotos grūstuvėje. 1,009 g gautų miltelių, atitinkančių 10 mg risperidono, perkelta į analitinę kolbutę ir uţpilta 10 ml metanolio. Suspensija maišyta ultragarso vonelėje 15 minučių. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. 5 ml centrifugato filtruota per PVDF filtrą (0,45 µm). Paimtas 1 ml filtrato ir praskiestas metanoliu iki 10 ml tūrio. Gautas metanolinis risperidono tirpalas naudotas ultraefektyviajai skysčių chromatografijai.
Fluoksetino darbinis tirpalas (F2) buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Fluoxetine Lannacher― (Lannacher) 20 mg stiprumo kapsulių. Buvo paimta 1 „Fluoxetine Lannacher― kapsulė ir ją išardţius pasverta miltelių masė, kurių svoris buvo 0,2592 g. Iš jų atsverta 0,1296 g miltelių, atitinkančių 10 mg fluoksetino ir perkelta į analitinę kolbutę bei uţpilta 10 ml metanolio. Suspensija maišyta ultragarso vonelėje 15 minučių. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. 5 ml centrifugato filtruota per PVDF filtrą (0,45 µm). 1 ml filtruoto tirpalo praskiestas metanoliu iki 10 ml tūrio. Gautas metanolinis fluoksetino tirpalas naudotas tolimesniuose tyrimuose.
Analizė
Tiriant etaloninių medţiagų – bromazepamo, risperidono ir fluoksetino tirpalų mišinį (ME2), buvo nustatytos optimalios ultraefektyviosios skysčių chromatografijos sąlygos. Ieškant geriausios metodikos buvo keičiama eliuento sudėtis ir eliuavimo metodas. Tačiau infekcijos tūris keičiamas nebuvo. Medţiagos mišinyje identifikuotos pagal UV absorbcijos spektrus, esant maksimaliai šviesos sugerčiai 210 – 400 nm ilgio šviesos bangų diapazone, ir sulaikymo laikus.
4.1.4. Duomenų apdorojimas
Duomenys rinkti ir analizuoti naudojant Microsoft Office Excel 2007, Empower 3, winCATS
4.2. Rezultatai ir aptarimas
4.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos parinkimas
Ryškiklio parinkimas
Siekiant atskirti ir identifikuoti bromazepamą, risperidoną ir fluoksetiną bei jų mišinį plonasluoksnės chromatografijos metodu, reikia parinkti tinkamą ryškinimo regentą. Dėl to nustatant tinkamiausią PC metodiką, atliekami bandymai, norint įvertinti ryškiklių tinkamumą visoms trims medţiagoms identifikuoti. Atlikus eksperimentinius bandymus, pasirinktas apšvietimas UV šviesa (254 nm). Gautos aiškiai matomos vaistinių medţiagų dėmės chromatografavimo plokštelėje (1 pav.). Išbandţius Dragendorfo reagentą arba Dragendorfo reagentą, modifikuotą pagal Munje, nustatyta, kad jie bromazepamo, fluoksetino ir risperidono mišiniui ryškinti netinkami (2 pav).
1 pav. Bromazepamo (BE1) – 1A,
fluoksetino (FE1) – 2B ir risperidono (RE1) – 3C dėmės (TS – 3) ant chromatografinės plokštelės apšvietus ją UV šviesa (254 nm).
2 pav. Netinkamas ryškinamas Dragendorfo reagentu (TS – 3 ).
Ryškinimui naudojant apšvietimą UV šviesa (254 nm) išryškėja pilkos spalvos (ryškumas priklauso nuo koncentracijos) tiriamųjų medţiagų dėmės (1 pav.). Šis ryškinimo būdas yra pigesnis, lengviau pritaikomas ir maţiau kenksmingas, nei ryškinimas cheminiais reagentais.
Eliuento parinkimas
Buvo atliekami nuoseklūs eksperimentiniai tyrimai, siekiant nustatyti tinkamiausią tirpiklių sistemą (TS), leidţiančią atskirti ir identifikuoti bromazepamą, risperidoną ir fluoksetiną bei jų mišinį. Siekiant rasti tinkamą tirpiklių sistemą, buvo keičiami tirpikliai bei jų santykis sistemoje. Pagal bromazepamo, risperidono ir fluoksetino etaloninių dėmių padėtį chromatogramoje, buvo vertinamas
TS tinkamumas. Įvertinus dėmių poslinkio reikšmes chromatogramoje buvo atrinktos septynios TS, tinkamos junginių identifikavimui mišinyje (7 lentelė).
7 lentelė. Vidutinės bromazepamo, risperidono ir fluoksetino Rf reikšmės skirtingose tirpiklių sistemose.
Tirpiklių sistema Bromazepamo
vid. Rf
Risperidono vid. Rf
Fluoksetino vid. Rf Etilo acetatas – metanolis – koncentruotas amonio
hidroksidas (14:2:1) (TS – 1) 0,52 0,66 0,68
Etilo acetatas – metanolis – dichlormetanas (12:2:6)
(TS – 2) 0,44 0,32 0,30
Etilo acetatas – metanolis – koncentruotas amonio
hidroksidas – dichlormetanas (13:2:1:4) (TS – 3) 0,68 0,42 0,50
Cikloheksanas – toluenas – dietilaminas (16:3:2)
(TS – 4) 0,01 0,09 0,08
Cikloheksanas – acetonas – dietilaminas (16:1:3)
(TS – 5) 0,11 0,27 0,19
Metanolis (TS – 6) 0,80 0,88 0,86
Trichlormetanas – acetonas (12:8) (TS – 7) 0,15 0,28 0,31
Siekiant įvertinti TS patikimumą, ME tirpalo analizė, naudojant skirtingas tirpiklių sistemas, buvo atliekama kartojant po 5 kartus. Gauti duomenys statistiškai apskaičiuojant gautų Rf reikšmių aritmetinį vidurkį X, standartinį nuokrypį SD, santykinę paklaidą SE, esant 0,95 pasikliautinajam lygmeniui. Taip pat apskaičiuotas pasikliautinasis intervalas, kuomet klaidos tikimybė p=0,05 (8 lentelė).
8 lentelė. Statistinis tiriamųjų junginių Rf reikšmių, naudojant 1, 2, 3, 4, TS-5, TS-6 ir TS-7tirpiklių sistemas vertinimas.
Tirpiklių sistema Tiriamoji medţiaga Rf vidurkis Standartinis nuokrypis Paklaida Pasikliautinasis intervalas TS – 1 Bromazepamas 0,52 0,007 0,003 0,52 – 0,53 Fluoksetinas 0,68 0,009 0,004 0,67 – 0,69 Risperidonas 0,66 0,005 0,003 0,65 – 0,66 TS – 2 Bromazepamas 0,44 0,006 0,003 0,44 – 0,45 Fluoksetinas 0,30 0,009 0,004 0,30 – 0,31 Risperidonas 0,32 0,005 0,002 0,30 – 0,32 TS – 3 Bromazepamas 0,68 0,007 0,003 0,67 – 0,69 Fluoksetinas 0,50 0,006 0,003 0,50 – 0,51 Risperidonas 0,42 0,008 0,004 0,41 – 0,43 TS – 4 Bromazepamas 0,01 0,004 0,002 0,01 – 0,01 Fluoksetinas 0,08 0,008 0,004 0,08 – 0,09 Risperidonas 0,09 0,006 0,003 0,08 – 0,10
TS – 5 Bromazepamas 0,11 0,004 0,002 0,11 – 0,12 Fluoksetinas 0,19 0,007 0,004 0,18 – 0,20 Risperidonas 0,27 0,008 0,004 0,27 – 0,28 TS – 6 Bromazepamas 0,80 0,012 0,006 0,79 – 0,81 Fluoksetinas 0,86 0,009 0,005 0,86 – 0,87 Risperidonas 0,88 0,010 0,005 0,87 – 0,89 TS – 7 Bromazepamas 0,15 0,008 0,004 0,15 – 0,16 Fluoksetinas 0,31 0,006 0,003 0,30 – 0,32 Risperidonas 0,28 0,009 0,0040,52 0,28 – 0,30
Visų pakartotiniams bandymams naudotų TS atsikartojamumo paklaidos neviršijo leistinos 0,05 ribos. Šios tirpiklių sistemos yra tinkamos bromazepamo, fluoksetino ir risperidono kokybiniam įvertinimui, jiems esant mišinyje.
Norint įvertinti TS efektyvumą, atskiriant bromazepamą, fluoksetiną ir risperidoną, jiems esant mišinyje, pateikiama 6 diagrama, kurioje pateikiamos vidutinės junginių Rf reikšmės konkrečioje TS ir matyti, kad tirpiklių sistemos nėra lygiavertės tarpusavyje.
6 diagrama. Skirtingų tirpiklių sistemų tiriamųjų medžiagų (bromazepamo, fluoksetino ir risperidono) vidutinės Rf reikšmės.
Kaip matyti iš pateiktos diagramos (6 diagrama), TS – 1, TS – 2, TS – 4, TS – 6 ir TS – 7 nėra tinkamos vaistų mišinio analizei dėl santykinai artimų fluoksetino ir risperidono Rf reikšmių (vidutinių Rf reikšmių skirtumas <0,03). Jos labiau tinkamos atskirti bromazepamą nuo fluoksetino ar risperidono (vidutinių reikšmių skirtumas >0,06). TS – 4 sistema netinka analizei, dar ir dėl santykinai maţų tiriamųjų medţiagų Rf reikšmių (vidutinės Rf reikšmės <0,1).
Tinkamiausios tirpiklių sistemos bromazepamo, fluoksetino ir risperidono mišinio išskirstymui yra TS – 3 ir TS – 5 (3 pav. ir 4 pav.). Naudojant TS – 3 sistemą kaip eliuentą, mišinio
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 TS - 1 TS - 2 TS - 3 TS - 4 TS - 5 TS - 6 TS - 7 R f re ikšm ė Tirpiklių sistema Bromazepamo vid. Rf Fluoksetino vid. Rf Risperidono vid. Rf
