FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
BENAS ALKAUSKAS
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA LIUTEINO, TYRIMAS
TAIKANT PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS IR
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Palma Nenortienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof., dr. Ramunė Morkūnienė Data
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA LIUTEINO, TYRIMAS
TAIKANT PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS IR
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODUS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Palma Nenortienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Vardas, pavardė, parašas Magistrantas Benas Alkauskas
Data Data
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 7
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1. Fizikinės ir cheminės liuteino savybės ... 11
1.2. Natūralūs liuteino šaltiniai ... 12
1.3. Liuteinas maisto papilduose ... 13
1.4. Liuteino bioprieinamumas, transportacija ir metabolizmas ... 14
1.4.1. Bioprieinamumas ... 14
1.4.2. Transportacija ... 15
1.4.3. Metabolizmas ... 15
1.5. Makulos pigmentų veikimo mechanizmas ... 16
1.6. Liuteino poveikis sveikatai ... 17
1.6.1. Liuteino poveikis amţinei makulos degeneracijai ... 17
1.6.2. Liuteino įtaka kataraktai ... 18
1.6.3. Liuteinas ir pigmentinis retinitas ... 18
1.6.4. Liuteino vaidmuo kitų akių ligų gydyme ... 18
1.7. Analitinių metodų taikymas liuteino nustatymui ... 19
1.8. Literatūros apţvalgos apibendrinimas ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Tyrimams naudoti reagentai ... 22
2.3. Naudota įranga... 22
2.4. Tyrimų metodai ... 23
2.4.1. Maisto papildų apdorojimas ... 23
2.4.2. Kokybinis liuteino nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 23
2.4.3. Liuteino analizė naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją ... 24
2.5. Metodo validacija ... 26
2.6. Duomenų analizės metodai ... 27
3.1. Kokybinis liuteino identifikavimas taikant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą 28 3.2. Kokybinė liuteino analizė maisto papilduose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu 30 3.3. Liuteino kiekio, išreikšto β-karoteno ekvivalentu, nustatymas maisto papilduose efektyviosios
skysčių chromatografijos metodu ... 31
IŠVADOS ... 35
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 36
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37
SANTRUMPOS
AMD – amţinė makulos degeneracija BCO2 – β-karoteno 9„,10„-dioksigenazė BHT – butilintas hidroksitoluenas DR – diabetinė retinopatija
DTL – didelio tankio lipoproteinas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija MP – maisto papildas
MPOT – makulos pigmentų optinis tankis MTL – maţo tankio lipoproteinas
PC – plonasluoksnė chromatografija r – koreliacijos koeficientas R2 – determinacijos koeficientas Rf – sulaikymo rodiklis SD – standartinis nuokrypis UV – ultravioletinė šviesa
SANTRAUKA
B. Alkausko magistro baigiamasis darbas: maisto papildų, kurių sudėtyje yra liuteino, tyrimas taikant plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus. Mokslinė vadovė lekt. dr. Palma Nenortienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.
Tyrimo tikslas. Įvertinti liuteino kokybinę ir kiekybinę sudėtį Lietuvoje notifikuotuose
maisto papilduose taikant plonasluoksnę chromatografiją ir efektyviąją skysčių chromatografiją.
Darbo uţdaviniai. Plonasluoksnės chromatografijos metodu identifikuoti liuteiną maisto papilduose; parinkti optimalias sąlygas liuteino ekstrakcijai iš maisto papildų; taikant efektyviąją skysčių chromatografiją atlikti liuteino maisto papildų kokybinę ir kiekybinę analizę; palyginti skirtinguose, Lietuvoje notifikuotuose, maisto papilduose esančio liuteino kiekybinę sudėtį su gamintojų deklaruojama informacija.
Tyrimo objektas. Aštuoni Kauno miesto vaistinėse pirkti įvairių gamintojų, farmacinių
formų ir sudėčių maisto papildai akims, kurių sudėtyje yra liuteino.
Metodai. Buvo taikoma plonasluoksnė chromatografija kokybiniam liuteino nustatymui ir
efektyvioji skysčių chromatografija kokybinei ir kiekybinei liuteino analizei maisto papilduose. Plonasluoksnės chromatografijos metodu analizuoti ekstraktai buvo gauti naudojant etilacetatą kartu su jame ištirpintu BHT (jo koncentracija tirpale 0,1 proc.), metodo tirpiklių sistema buvo sudaryta iš petrolio eterio-acetonitrilo-metanolio (1:1:2) mišinio. Efektyviosios skysčių chromatografijos tirpiklių sistema buvo sudaryta iš eliuento A – acetonitrilo ir distiliuoto vandens santykiu 9:1 kartu su trietilaminu, kurio koncentracija tirpale 0,25 proc. ir eliuento B – etilacetato su trietilaminu (jo koncentracija tirpale 0,25 proc.), maisto papildų ekstrakcijai naudotas chloroformas ir jame ištirpintas BHT, kurio koncentracija tirpale 0,1 proc.
Rezultatai ir išvados. Plonasluoksnės chromatografijos metodu liuteinas identifikuotas
penkiuose iš septynių analizuotų mėginių. Atliekant optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimą nustatyta, kad didţiausias medţiagos kiekis ekstrahavosi naudojant chloroformą ir jame ištirpintą BHT, kurio koncentracija tirpale 0,1 proc. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu liuteinas nustatytas visuose aštuoniuose maisto papilduose. Didţiausias jo kiekis, aptiktas vienoje farmacinė formoje, buvo 19,85 mg, o maţiausias – pėdsakai. Pusėje tirtų maisto papildų liuteino kiekis atitiko (99,3–107,4 proc.) gamintojo deklaruojamą kiekį ant pakuotės. Likusiuose keturiuose mėginiuose liuteino kiekis svyravo nuo pėdsakų iki 16,3 proc. nurodytos informacijos ant pakuotės.
SUMMARY
Aim of the study. To evaluate qualitative and quantitative lutein composition in food
supplements notified in Lithuania using thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography.
Tasks. To identify lutein in food supplements using thin-layer chromatography; to select
optimal conditions for lutein extraction from food supplements; to perform qualitative and quantitative analysis of lutein food supplements using high-performance liquid chromatography; to compare lutein amounts between different food supplements, notified in Lithuania, and information declared by manufacturers.
Object. Eight food supplements for eyes containing lutein of various manufacturers,
pharmaceutical dosage forms and ingredients, bought in Kaunas city drugstores.
Methods. There were used thin-layer chromatography for lutein identification and
high-performance liquid chromatography for qualitative and quantitative lutein analysis in food supplements. Extract, used for thin-layer chromatography, was obtained using ethyl acetate and 0.1 % BHT mixture, solvent system, used for this method, was made of petroleum ether-acetonitrile-methanol (1:1:2) mixture. High-performance liquid chromatography solvent system was made of eluent A – acetonitrile and distillated water (9:1) with 0.25 % triethylamine and eluent B – ethyl acetate with 0.25 % triethylamine, chloroform with 0.1 % BHT was used for food supplements extraction.
Results and conclusions. Using thin-layer chromatography method lutein was identified in
five out of seven analyzed samples. While determining optimal conditions for extraction, highest amount of lutein was extracted using chloroform and 0.1 % BHT mixture. Using high-performance liquid chromatography method lutein was identified in all eight food supplements. Highest amount, determined in one pharmaceutical dosage form, was 19.85 mg, lowest amount – traces. In half food supplements lutein amount agreed (99.3–107.4 %) with amount, declared by manufacturer on package. In rest four food supplements lutein amount ranged from traces to 16.3 % of declared information on package.
PADĖKA
Dėkoju darbo vadovei, lekt. dr. Palmai Nenortienei uţ vertingas ir informatyvias konsultacijas bei pagalbą rašant magistro baigiamąjį darbą. Taip pat dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof., dr. Liudui Ivanauskui ir lekt. Mindaugui Marksai uţ pagalbą bei patarimus atliekant analizę laboratorijoje ir vertinant gautus tyrimo rezultatus.
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos (angl. World Health Organization) duomenimis apie 1,3 milijardo ţmonių pasaulyje kenčia nuo regėjimo sutrikimų, kurių apie 80 proc. galėtų būti išvengiama imantis tinkamų profilaktikos ar gydymo priemonių [11]. 2017 metų duomenimis 16,6 proc. Lietuvoje uţregistruotų ligos atvejų buvo akių ir jų priedinių organų ligos [2]. Šiuo metu vaistinėse galima rasti nemaţą skaičių vaistų ir maisto papildų, kurių sudėtyje esančios medţiagos teigiamai veikia akies organus, gydo akių ligas ir padeda jų profilaktikai bei prevencijai.
Viena tokių medţiagų yra liuteinas – augaluose sintezuojamas pigmentas, kuris priklauso oksiduotų karotenoidų grupei – ksantofilams [26]. Jis specifiškai kaupiasi ţmogaus akies makuloje, kurioje veikia kaip ţalingos šviesos filtras, pasiţymi antioksidaciniu ir antiuţdegiminiu poveikiu akies tinklainėje [53]. Moksliniai tyrimai rodo, kad dėl šių poveikių liuteinas gali būti veiksmingai vartojamas įvairių akių ligų, tokių kaip amţinės makulos degeneracijos [48], kataraktos [35], pigmentinio retinito [9], prevencijai bei regėjimo funkcijos gerinimui jomis sergant. Taip pat šis ksantofilas pasiţymi ir plačiu sisteminiu poveikiu, tokiu kaip antihipertenziniu [72], priešvėţiniu [64], priešopiniu [71], antihepatotoksiniu [42], antidiabetiniu [21] ir kt. Be to, liuteinas Europos sąjungoje yra įregistruotas kaip maisto priedas (E 161b) [20].
Negaunant pakankamo liuteino kiekio su vaisiais ir darţovėmis, neretai vartojami šios medţiagos turintys maisto papildai. Liuteinas įeina į beveik kiekvieno Lietuvoje notifikuotuo maisto papildo akims sudėtį – tokių preparatų šalies rinkoje skaičiuojama daugiau kaip keturiasdešimt [3]. Esant tokiam dideliam maisto papildų pasirinkimui svarbu ţinoti ar vartojamas preparatas yra kokybiškas ir ar medţiagos kiekis, esantis farmacinėje formoje, atitinka gamintojo deklaruojamą informaciją ant pakuotės. Tai yra ypač aktualu karotenoidams, nes šie junginiai yra nestabilūs oro deguonies, šviesos ir temperatūros poveikyje [41], o tai gali turėti įtakos karotenoidų kiekio svyravimui maisto papilduose.
Uţsienio literatūroje galima rasti daug liuteino nustatymo augalinėse ţaliavose tyrimų, tačiau yra tik keletas tyrimų, kuriuose nagrinėjama šios medţiagos sudėtis maisto papilduose. Lietuvoje, literatūros šaltinių duomenimis, nėra atliktų mokslinių tyrimų su liuteinu ir jo maisto papildais.
Darbo tikslas – įvertinti liuteino kokybinę ir kiekybinę sudėtį Lietuvoje notifikuotuose maisto papilduose taikant plonasluoksnę chromatografiją ir efektyviąją skysčių chromatografiją.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti liuteino kokybinę ir kiekybinę sudėtį Lietuvoje notifikuotuose maisto
papilduose taikant plonasluoksnę chromatografiją ir efektyviąją skysčių chromatografiją.
Darbo uţdaviniai:
1. Plonasluoksnės chromatografijos metodu identifikuoti liuteiną maisto papilduose. 2. Parinkti optimalias sąlygas liuteino ekstrakcijai iš maisto papildų.
3. Taikant efektyviąją skysčių chromatografiją atlikti liuteino maisto papildų kokybinę ir kiekybinę analizę.
4. Palyginti skirtinguose, Lietuvoje notifikuotuose, maisto papilduose esančio liuteino kiekybinę sudėtį su gamintojų deklaruojama informacija.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Fizikinės ir cheminės liuteino savybės
Liuteinas yra lipofilinė medţiaga, kurios raudonai oranţinės spalvos kristaliniai milteliai gerai tirpsta riebaluose, chloroforme, tetrahidrofurane ir kituose organiniuose tirpikliuose. Šio karotenoido molekulinė masė yra 568,87 g/mol, milteliai lydosi esant 190 °C temperatūrai [16, 36, 68].
Liuteinas turi 40 anglies atomų struktūrą (C40H56O2), sudarytą iš aštuonių izopreno fragmentų,
kurios galuose yra α ir β jononų ciklinės grupės. Dėl trijų chiralinių centrų junginys gali egzistuoti aštuoniose stereoizometrinėse formose, molekulės aciklinėje grandinėlėje esantys dvigubieji ryšiai gali sudaryti cis arba trans konformacijas, tačiau daţniausiai jis egzistuoja trans formoje [4, 68].
Pagal cheminę struktūrą karotenoidai yra skirstomi į ksantofilus ir karotenus. Liuteinas (β,ε-karoten-3,3„-diolis) ir jo izomeras zeaksantinas (β,β-(β,ε-karoten-3,3„-diolis) yra priskiriami ksantofilams, dar kitaip vadinamais oksikarotenoidais [36, 68]. Jie yra α-karoteno ir β-karoteno dariniai, tačiau skiriasi tuo, kad savo šoniniuose ţieduose turi dvi hidroksilo grupes, kurių nėra karotenų struktūroje (1 pav.). Kitaip nei karotenai, ksantofilai nėra vitamino A provitaminai [4, 26], nes dėl jononų ţieduose esančių oksiduotų grupių specifinis fermentas negali nutraukti 15-15„ ryšio ir sudaryti vitamino A aldehido. Be to, ksantofilų atstovai pasiţymi labiau hidrofilinėmis savybėmis ir yra poliškesnės molekulės nei karotenai. Ši savybė iš dalies nulemia jų specifines charakteristikas, tokias kaip šviesos absorbcija, metabolizmo ypatybės ar stabilumas audiniuose [51].
1 pav. Karotenoidų struktūrinės formulės (adaptuota pagal Lipkie et al., 2015 [47])
1.2. Natūralūs liuteino šaltiniai
Pats ţmogaus organizmas liuteino negamina, todėl šios medţiagos jis turi gauti kartu su maistu [73]. Maisto produktuose daţniausiai sutinkami ksantofilai yra liuteinas ir trans-zeaksantinas, cis formos beveik nerandama. Didţiausi jų kiekiai yra ţaliose lapinėse darţovėse ir geltonos ar oranţinės spalvos vaisiuose. Kiaušinio tryniuose aptinkamas maţesnis kiekis, tačiau šių karotenoidų prieinamumas yra didesnis nei iš vaisių ar darţovių [61].
Zeaksantino daugiausia randama aliejuje virtuose laiškiniuose svogūnuose 2,48 mg/100 g, oranţinėse paprikose 1,66 mg/100 g bei neapdorotuose kiaušinio tryniuose 0,78 mg/100 g [61]. Tuo tarpu liuteinas aptinkamas didesniais kiekiais ir įvairesniuose maisto produktuose. Daugiausia jo yra lapinėse darţovėse: krapuose 13,8 mg/100 g, keptuose špinatuose 12,6 mg/100 g, lapiniuose kopūstuose 11,5 mg/100 g, petraţolėse 10,7 mg/100 g, taip pat nemaţą jo kiekį kaupia kalendros, pipirnės, bazilikai, trūkaţolės, salotos, porai, brokoliai. Nemaţais kiekiais liuteinas kaupiamas ir kituose maisto produktuose: raudonosiose paprikose 8,5 mg/100 g, pistacijose kiekis gali siekti 4,9 mg/100 g, o kiaušinių tryniuose galima aptikti 1,3 mg/100 g [52, 61].
Liuteinas augaluose gali būti laisvos formos arba kaip esteris, kurio hidroksigrupė yra sujungta su riebalų rūgštimi. Tai priklauso nuo augalo rūšies: lapinėse darţovėse, tokiose kaip špinatai, brokoliai ar kopūstai, jis yra laisvos formos, tuo tarpu kaip esteris liuteinas maţais kiekiais dominuoja apelsinuose, paprikose, kukurūzuose ir kitose oranţinės ar geltonos spalvos maistiniuose augaluose [73].
Liuteino gausa pasiţymi astrinių šeimos augalas – didysis serentis (Tagetes erecta L.). Dideliais kiekiais jis yra auginamas Meksikoje, Peru, Ekvadore, Ispanijoje, Indijoje ir Kinijoje. Paprastai maţdaug 0,1–0,2 proc. augalo vainiklapių sudedamųjų medţiagų sudaro karotenoidai, iš kurių 80 proc. yra liuteino esteriai (80–160 mg/100 g), todėl daţniausiai būtent serentis yra naudojamas liuteino papildų gamybai [73]. Atlikti tyrimai rodo, kad priklausomai nuo auginimo salygų ir augalo rūšies liuteino koncentracija šiame augale gali svyruoti nuo 161 iki 611 mg/100 g [43], o gvazdikinis serentis gali kaupti net iki 1230,2 mg/100 g liuteino [56]. Remiantis šiais skaičiais galima teigti, kad Tagetes šeimos augalai puikiai tinka komercinei papildų gamybai.
Kaip alternatyva serenčiui ir jam giminingiems augalams, liuteino išgavimo šaltinis galėtų būti naudojami mikro dumbliai (angl. microalgae). Ši ţaliava yra pranašesnė, nes auga 3–6 kartus greičiau nei augalai, reikalauja maţiau ţemės ploto bei vandens, visa gamyba yra automatizuota, todėl darbuotojų skaičius sumaţėja iki minimumo. Kita vertus, išgavimas kainuoja brangiai, gamybai sunaudojama daugiau maisto medţiagų, energijos ląstelių suardymui ir ekstrakcijai, dumbliai turi
maţesnį kiekį liuteino. Atsiţvelgiant į tai, kad augalų kultivavimas labai priklauso nuo ţemės prieinamumo bei darbo kainos, ši ţaliava galėtų būti svarstoma kaip kitas liuteno išgavimo šaltinio pasirinkimas [23, 46].
1.3. Liuteinas maisto papilduose
Liuteinas įeina į didţiają dalį Lietuvoje notifikuotų maisto papildų (MP) akims sudėtį, kartu su juo daţniausiai galima rasti ir jo izomero zeaksantino, tačiau maţesniais kiekiais. Tokių papildų Lietuvos rinkoje yra daugiau nei 40. Beveik visi papildai akims yra kompleksiniai, todėl be liuteino juose yra ir kitų teigiamai akis veikiančių medţiagų, tokių kaip mėlynių ekstraktas, A, C, E, B grupės vitaminai, cinkas, varis, selenas ir kitos medţiagos. Remiantis informacija, nurodyta ant Lietuvos rinkoje esančių maisto papildų pakuočių, liuteinas daugiausiai egzistuoja laisvos formos, kaip esteris nurodytas tik vieno papildo sudėtyje. Papildai yra daţniausiai tiekiami kietų ir minkštų kapsulių ar tablečių forma, taip pat yra keletas papildų guminukų ar miltelių pavidalu [3].
Liuteino referencinė maistinė vertė nėra nustatyta. Lietuvos rinkos maisto papilduose liuteino kiekis vienoje farmacinėje formoje svyruoja nuo 1,25 mg iki 33 mg. Daţniausiai gamintojai į vieną tabletę/kapsulę deda po 5-15 mg liuteino [3]. Išsami informacija apie Lietuvos rinkoje esančius papildus su liuteinu pateikta 1 priede.
Pasak Europos maisto saugos tarnybos (angl. European Food Safety Authority) ţmogus gali saugiai suvartoti 1 mg/kg/d liuteino, pavyzdţiui, 70 kg sveriančiam ţmogui per dieną yra saugu išgerti 70 mg liuteino [20]. Taip pat jie teigia, kad sveikų akių palaikymui reikėtų suvartoti 6–12 mg liuteino per dieną [19]. Atliktuose tyrimuose su pelėmis nustatyta, kad joms suvartojant net 400 mg/kg/d nebuvo pastebėta jokių šalutinių poveikių [65]. Šie rezultatai rodo, kad organizmas gali toleruoti net ir didelius kiekius liuteino, todėl ši medţiaga yra pakankamai saugi ir apsinuodyti ja yra sudėtinga.
1.4. Liuteino bioprieinamumas, transportacija ir metabolizmas
1.4.1. Bioprieinamumas
Bioprieinamumas gali būti apibūdinamas kaip medţiagos frakcija, kuri pasiekia sisteminę kraujotaką nepakitusi. Junginio apdorojimas virškinamąjame trakte ir absorbcija yra dalis faktorių, kurie lemia junginio biologinį prieinamumą [14].
Maistui patekus į virškinamąjį traktą, karotenoidai atpalaiduojami iš maisto sudėties, tačiau iš skirtingų rūšių medţiagos gali atsipalaiduoti nevienodai efektyviai [38]. Neapdirbtų darţovių bioprieinamumas yra maţesnis nei termiškai apdorotų, kadangi apdorojant maistą yra suardomos ląstelių sienelės ir liuteinas iš maisto yra atpalaiduojamas efektyviau [61, 38]. Be to, vaisiuose esančių ksantofilų bioprieinamumas (50–100 proc.) yra didesnis nei ţaliose darţovėse (19–38 proc.). Skirtumas gali vyrauti dėl darţovėse esančio didesnio skaidulų kiekio bei medţiagos lokalizacijos jose – susijungusi su baltymais ir skaidulinėmis medţiagomis ji yra chloroplastuose, tuo tarpu vaisiuose esti chromoplastuose aliejaus lašelių pavidalu [58]. Nors liuteino bioprieinamumas iš vaisių yra didesnis nei iš ţalių darţovių, daugumoje ţalių lapinių darţovių jo kiekis yra didesnis nei vaisiuose, todėl valgant darţoves organizmas gauna didesnį jo kiekį.
Bioprieinamumui taip pat didelę įtaką turi medţiagų tirpumas virškinamojo trakto skysčiuose. Izoprenoidinė karotenoidų struktūra lemia didelį molekulės hidrofobiškumą, todėl šių junginių tirpumas virškinamojo trakto skysčiuose yra labai maţas. Jų tirpumą gerina su maistu suvartojami riebalai, kurie su karotenoidais sudaro emulsijas. Lipolitinių fermentų ir tulţies rūgšties pagalba ši emulsija yra suskaidoma – susidaro mišrios micelės su ištirpusiais karotenoidais, kurias lengviau pasisavina ţarnyno epitelio ląstelės [38].
Liuteinas yra absorbuojamas pasyvios difuzijos būdu [38]. Kaip ir kiti karotenoidai, liuteinas yra absorbuojamas į limfą chilomikronų pavidalu, kuriuos lipoproteinų lipazė suskaido ir liuteinas kartu su kitais chilomikronų likučiais yra gabenamas sistemine kraujotaka į kepenis. Su maţo tankio lipoproteinais (MTL) arba didelio tankio lipoproteinais (DTL) sujungtas liuteinas kepenyse yra kaupiamas arba sekretuojamas į kraujotaką. Karotenoidas tarp šių lipoproteinų pasiskirsto maţdaug lygiai, tačiau šiek tiek dominuoja jo prisijungimas prie DTL [24].
Kaip jau minėta, liuteinas maiste gali egzistuoti ir laisva forma, ir kaip esteris, tačiau į kraujotaką jis gali patekti tik būdamas laisvos formos, todėl ţarnyne fermentų pagalba esteris yra hidrolizuojamas ir į kraują patenka jau laisvos formos. Svarbu tai, kad esterio forma nesumaţina liuteino bioprieinamumo [57].
1.4.2. Transportacija
Luteinas, jo izomeras zeaksantinas ir jų metabolitai specifiškai didelėmis koncentracijomis kaupiasi makuloje. Tikslus šių karotenoidų kaupimosi mechanizmas nėra nustatytas. Manoma, kad ląstelių paviršiuje esantys CD36 ir SR-B1 baltymai-receptoriai palengvina liuteino patekimą į limfinius audinius bei tinklainės ląsteles [8]. Atlikti tyrimai rodo, kad tarp šių specifinių baltymų ir MTL bei DTL yra svarbus ryšys – esant didesniam šių komponentų kiekiui didėja liuteino bei kitų makulos pigmentų įsisavinimas [69].
Taip pat, yra nustatyta, kad specifiškai liuteiną surišantis baltymas yra StARD3. Jis turi didelį afinitetą liuteinui, kas sąlygoja išskirtinį ksantofilo pasiskirstymą ir stabilumą makuloje [40]. Tikėtina, kad šis baltymas sąveikauja su CD36 ir SR-B1 receptoriais ir skatina liuteino transportą į geltonąją dėmę [24].
1.4.3. Metabolizmas
Apie metabolinę ksantofilų transformaciją yra ţinoma maţai. Kitaip nei β-karotenas, liuteinas organizme nėra metabolizuojamas į vitaminą A [38]. Tyrimuose su pelėmis nustatyta, kad oksiduojant antrinę hidroksilo grupę, liuteinas kraujo plazmoje yra skaidomas į keto-karotenoidus, kurių pagrindinis metabolitas yra 3„-oksoliuteinas [32]. Ţmogaus audiniuose aptikti ir kiti metabolitai, kaip kad 3„-epiliuteinas – 3„-oksiliuteino darinys [8].
Be to, liuteno ir zeaksantino metabolitas yra mezo-zeaksantinas, kuris nuo liuteino skiriasi viena dvigubojo ryšio padėtimi. Jis nėra gaunamas su maistu – makuloje jis egzistuoja kaip liuteino metabolitas. Šis junginys išsiskiria tuo, kad kaupiasi specifiškai tik akies tinklainės audiniuose ir yra vienas iš trijų makulos pigmentų [8]. Nustatyta, kad visus šiuos makuloje besikaupiančius ksantofilus metabolizuoja vienintelis fermentas – β-karoteno 9„,10„-dioksigenazė (BCO2). Esant didelėms karotenoidų koncentracijoms jie patys gali sukelti oksidacinį stresą, todėl reguliuodamas karotenoidų kiekį BCO2 fermentas apsaugo nuo ţalingo jų poveikio [6].
1.5. Makulos pigmentų veikimo mechanizmas
Liuteinas, zeaksantinas ir mezo-zeaksantinas yra vieninteliai ksantofilai, kuriuos galime aptikti akies makuloje. Savo struktūroje ksantofilai turi devynis dvigubuosius ryšius, dėl kurių molekulės gali absorbuoti šviesą, o dėl hidroksilo pakaitų α ir β jononų ţieduose junginiai geba įgyti tam tikrą konformaciją akyje sudarydami vandenilinius ryšius su polinėmis grupėmis esančiomis akies membranų paviršiuose [37, 57].
Makulos svarbiausioji dalis yra vidurinė duobutė, kuri yra sudaryta tik iš didelio kiekio kūginių ląstelių – fotoreceptorių, kurie yra atsakingi uţ aštrų regėjimą. Todėl, norint uţtikrinti aukščiausios raiškos matomą vaizdą, labai svarbu, jog šviesa išsisklaidytų būtent vidurinėje makulos duobutėje [28].
Minėti karotenoidai pasiţymi didele mėlynos šviesos absorbcija, todėl ţmogaus tinklainėje suformuoja veiksmingą šviesos, kuri pasiekia uţpakalinę akies dalį, filtrą. Makulos pigmentai yra daugiausiai susitelkę iš fotoreceptorių aksonų sudarytame Henlio pluošto sluoksnyje (angl. Henle fiber
layer), kuris padengia fotoreceptorius. Pigmentai susilpnina mėlynos šviesos bangas ir tokiai šviesai
pasiekus funkcines struktūras – fotoreceptorius ir pigmentines tinklainės epitelio ląsteles – yra sumaţinama chromatinė aberacija, o tai leidţia šviesai išsisklaidyti tik makulos vidurinėje duobutėje. Toks procesas gali turėti teigiamos įtakos regėjimui ir pačiai tinklainės apsaugai [39].
Taip pat liuteinas ir zeaksantinas pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis. Dėl struktūroje esančių dvigubųjų ryšių liuteinas gali jungtis su reaktyviojo deguonies molekulėmis ir slopinti ţalingų laisvųjų radikalų susiformavimą [37]. Laisvieji radikalai gali neigiamai paveikti tinklainėje esančius lipidus, kurių didţiąją dalį sudaro deguonies pokyčiams jautrios polinesočiosios riebalų rūgštys. Reaktyvusis deguonis skatina lipidų degradaciją. Dėl šio proceso gali susiformuoti lipidų peroksidai ir kiti šalutiniai produktai, kurie gali modifikuoti lipidus, baltymus bei DNR ląstelines ir ektraląstelines sudedamąsias dalis [28]. Karotenoidų susijungimas su reaktyviuoju deguonimi sąlygoja tinklainės fotoreceptorių apsaugojimą nuo apoptozės. Liuteinas susijungęs su baltymais gali būti pasiskirstęs visuose tinklainės ląstelių membranos lipidų sluoksniuose. Didesnis transmembraninio liuteino kiekis apsaugo didesnį polinesočiųjų riebalų rūgščių kiekį nuo ţalingo reaktyvaus deguonies poveikio [37].
Makuloje esantys ksantofilai atlieka ir netiesioginę antioksidacinę funkciją. Esant mėlynos šviesos poveikiui didėja ţalingų radikalų susidarymo daţnis, tačiau pigmentams absorbuojant šviesą maţėja radikalų generacija bei galimybė įvykti oksidacinei paţaidai [39].
Liuteinas taip pat pasiţymi antiuţdegiminiu poveikiu. Tinklainėje atsiradęs uţdegimas gali sukelti regėjimo sutrikimus. Liuteinas gali slopinti su tinklainės uţdegimu susijusių baltymų
degradaciją ir apsaugoti tinklainės nervinį audinį. Liuteinas sumaţina oksidacinį stresą ir galimą baltymų praradimą. Jis taip pat palaiko normalias kraujagyslių funkcijas ir gali efektyviai slopinti monocitų atsaką į uţdegimą, atsiradusį dėl MTL cholesterolio modifikacijų kraujagyslėse [60]. Manoma, kad antiuţdegiminis liuteino poveikis pasireiškia dėl jo antioksidacinių savybių. Maţindamas intraląstelinio vandenilio peroksido kiekį liuteinas slopina uţdegiminius procesus [37].
1.6. Liuteino poveikis sveikatai
Atlikti klinikiniai ir ikiklinikiniai tyrimai rodo, kad liuteinas pasiţymi plačiu teigiamu sisteminiu poveikiu sveikatai: antioksidaciniu, priešuţdegiminiu [15, 18], antiaterogeniniu [27], antihipertenziniu [72], priešvėţiniu [64], priešopiniu [71], antihepatotoksiniu [42], antidiabetiniu [21], stimuliuojančiu imuninę sistemą [63], didinančiu fizinį aktyvumą [17] ir kt. Tačiau labiausiai ištirtas šio junginio poveikis yra akių ligų eigai ir jų prevencijai.
1.6.1. Liuteino poveikis amţinei makulos degeneracijai
Amţinė makulos degeneracija (AMD) yra pasaulyje plačiai paplitusi lėtinė liga, laikoma daţniausia regos praradimo prieţastimi ţmonių, kurių amţius virš 50 metų, tarpe [44]. Nustatyta, kad sergant šia liga maţėja makulos pigmentų optinis tankis (MPOT) [34]. Vartojant liuteiną šis tankis bei regėjimo aštrumas didėja, o tai yra galimai susiję su maţėjančiu AMD progresavimu ir regėjimo funkcijos gerėjimu [76].
Atlikti klinikiniai tyrimai rodo, kad liuteino vartojimas sergant net ir ankstyva ligos stadija didina makulos pigmentų optinį tankį, gerina regėjimo aštrumą ir gali lėtinti ligos progresavimą [31, 49, 55], tačiau yra prieštaringų duomenų, jog būtent ankstyvos stadijos AMD liutenas neturi didelės įtakos [50].
Paţengusios ligos atveju, liuteinas daro didesnę įtaką šios ligos progresavimui [50]. 2014 metais atlikto meta-analizės tyrimo metu nustatyta, kad liuteino vartojimas reikšmingai gerina regėjimo aštrumą bei regos kontrasto jautrumą pacientams sergantiems AMD. Šie teigiami efektai taip pat yra tiesiogiai siejami su MPOT pagerėjimu [48].
1.6.2. Liuteino įtaka kataraktai
Katarakta yra dar viena liga, kurios progresavimas gali sąlygoti regėjimo netekimą. Oksidacinis stresas stipriai prisideda prie kataraktos progresavimo ir akies lęšiuko drumstėjimo. Liuteinas yra vienas iš junginių, kuris apsaugo lęšiuką nuo paţaidos [53]. Atlikti tyrimai rodo, kad senyvo amţiaus ţmonių kraujyje, esant didesnei liuteino koncentracijai, rizika susirgti katarakta maţėja 41–42 proc. lyginant su tais, kurių kraujyje esti maţa šio karotenoido koncentracija [35]. Taip pat yra nustatyta, jog senyvo amţiaus moterims, kurios vartoja daugiau ksantofilų turintį maistą, tikimybė susirgti katarakta sumaţėja 32 proc. lyginant su moterimis, kurių maiste oksikarotenoidų nėra [54]. Be to, katarakta sergantiems pacientams liutenas gali gerinti bendrą regėjimo funkciją [59].
1.6.3. Liuteinas ir pigmentinis retinitas
Pigmentinis retinitas yra genetiškai paveldima liga, kurios eigoje pirmiausia yra paţeidţiami fotoreceptoriai stiebeliai, todėl sunkėja akių prisitaikymas tamsoje, silpnėja periferinis matymas. Ligai progresuojant, silpnėja kūgelių funkcija, tuo pačiu ir regėjimo aštrumas, blogėja matymas šviesoje, o galiausiai tai priveda prie aklumo išsivystymo [75]. Liuteinas šios ligos eigoje atlieka tam tikrą vaidmenį – pacientams, sergantiems šia liga, jis gali gerinti regėjimo lauką bei aštrumą [7]. 2010 metais atlikto tyrimo rezultatai rodo, kad liuteino vartojimas ir MPOT padidėjimas lėtina regėjimo prastėjimo procesą pacientams, sergantiems pigmentiniu retinitu [9].
1.6.4. Liuteino vaidmuo kitų akių ligų gydyme
Liutenas gali turėti teigiamą efektą glaukomos patogenezei, kadangi, sergant šia liga, hipoksija, oksidacinis stresas ir uţdegimas sukelia paţaidą tinklainės ganglijų ląstelėse, nuo kurios gali apsaugoti būtent ksantofilai [53]. Liuteinas pasiţymi neuroprotekciniu poveikiu akies tinklainės ganglijų ląstelėms [79].
Taip pat liutenas gali turėti įtakos diabetinei retinopatijai (DR). Antro tipo diabetu sergantiems ţmonėms, kartu ar be DR, nustatytas maţesnis MPOT nei tų, kurie diabetu neserga [45]. Vartojant daugiau liuteno bei kitų vitamino A provitamininiu poveikiu nepasiţyminčių ksantofilų nei
vitamino A provitamininių karotenoidų, pastebėta maţesnė rizika susirgti DR [12]. Be to, nustatyta, kad liuteino papildų vartojimas didina MPOT, pagerina regėjimo aštrumą, kontrasto jautrumą bei duobutės storį pacientams, sergantiems DR [30].
Neišnešiotų naujagimių retinopatija yra dar vienas sutrikimas, kurio vystymąsi gali sutrikdyti liuteinas. Hipoksinė paţaida ne iki galo išsivyščiusiose naujagimių tinklainėse gali sutrikdyti tinklainės kraujagyslių tinklo vystymąsi, kas gali lydėti iki regėjimo sutrikimų ar net aklumo [29]. Tyrimuose su naujagimiais nustatyta, kad liuteinas pasiţymi antioksidaciniu poveikiu ir jo vartojimas maţina oksidacinį stresą [62], o karotenoidai, tarp jų ir liuteinas, maţina uţdegiminius rodiklius [67]. Liuteinas gali sumaţinti šios ligos sunkumą bei padėti jos išvengti [25].
1.7. Analitinių metodų taikymas liuteino nustatymui
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – šis metodas laikomas „auksiniu standartu“
karotenoidų nustatymui, kadangi jis suteikia galimybę tiksliai nustatyti tiriamąją medţiagą tiek kokybiškai, tiek kiekybiškai [8]. Naudojant ESC, makulos pigmentai liuteinas ir zeaksantinas pirmą kartą buvo identifikuoti 1985 metais [10]. Šių medţiagų analizei daţniausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija, kai judančioji fazė yra polinė, o nejundančioji fazė – nepolinė. Tyrimai daţniausiai atliekami su atvirkštinių fazių C18 ir C30 kolonėlėmis taikant gradientinę eliuciją [8, 74]. Be kolonėlių pasirinkimo, kiti svarbūs faktoriai, darantys svarbią įtaką medţiagų detekcijai, yra tirpikliai ir temperatūra. Dėl didelio karotenoidų hidrofobiškumo rekomenduojama kaip judančią fazę naudoti nevandeninius tirpalus. Kaip tirpiklių sistemos paprastai naudojami mišiniai su metanoliu, acetonitrilu ir tetrahidrofuranu. Kad būtų palaikomas junginių stabilumas į judančią fazę yra dedama butilinto hidroksitolueno (BHT) ar kito antioksidanto, o kolonėlės temperatūra palaikoma apie 20°C [22]. Detekcijai gali būti naudojami masių spektrometriniai, elektrocheminiai, branduolinio magnetinio rezonanso, fotodiodų matricos detektoriai, o daţniausiai taikomi yra UV/regimosios šviesos detektoriai. Liuteino nustatymui tyrimuose daţniausiai yra naudojamas fotodiodų matricos detektorius [22, 77].
Taikant ESC metodą karotenoidų analizei yra susiduriama su tam tikromis problemomis. Šios medţiagos pasiţymi prastu stabilumu oro deguonies, šviesos ir temperatūros poveikyje bei aukštu cheminės struktūros kintamumu [5, 41]. Be to, karotenoidų analizę apsunkina jų esterifikuotos formos. Kadangi esterių smailių analizė ir vertinimas chromatogramose yra sudėtingas, analizės supaprastinimui atliekama saponifikacija – esterinės grupės atskyrimas. Deja, atliekant šį procesą
suyra dalis tiriamosios medţiagos, todėl norint išvengti šio proceso siūloma vienu metu analizuoti laisvos ir esterifikuotos formos karotenoidus. Esterifikacijos laipsnis priklauso nuo hidroksigrupių skaičiaus molekulėje, todėl svarbu paminėti, kad ši problema yra aktuali ksantofilams [22].
Plonasluoksnė chromatografija (PC) – analizės metodas, plačiai taikomas įvairių junginių
atskyrimui bei kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui. Karotenoidų nustatymas šiuo metodu yra palankus savo paprastumu, efektyvumu, atlikimo greičiu (sumaţinama šių nestabilių junginių suardymo rizika), galimybe tirti daug mėginių vienu metu ir metodo jautrumu daugeliui karotenoidų [78].
Karotenoidų analizei gali būti taikoma normalių fazių arba atvirkštinių fazių PC. Normalių fazių PC atliekama naudojant polinę stacionarią fazę ir judančią fazę, sudarytą iš nepolinių tirpiklių mišinio. Atvirkštinių fazių atveju kaip nejudančioji fazė daţniausiai naudojama modifikuota C18 silikagelio plokštelė, o kaip mobili fazė naudojamas tirpiklių, tokių kaip metanolis, acetonitrilas, acetonas, petrolio eteris ir n-heksanas, mišinys [66, 78]. Šiuo atveju poliškesnių molekulių sulaikymo rodiklių (Rf) reikšmės bus didesnės, o maţiau polinių molekulių – maţesnės. Karotenoidų nustatymui daţniau yra taikoma normalių fazių PC [78], tačiau šios medţiagos yra stabilesnės ant atvirkštinių fazių silikagelio plokštelės [66], todėl atsiţvelgiant į molekulių nestabilumą analizei vertėtų rinktis atvirkštinių fazių PC.
1.8. Literatūros apţvalgos apibendrinimas
Prieš pradedant eksperimentinius tyrimus, buvo išanalizuotos uţsienio mokslininkų publikacijos. Literatūros šaltiniai apibūdina liuteiną kaip ksantofilų grupės karotenoidą, kuris specifiškai kaupiasi akies makuloje. Plačiau nagrinėjamos junginio antioksidacinės ir antiuţdegiminės savybės, dėl kurių liuteinas gali būti naudojamas akių ligų, tokių kaip amţinės makulos degeneracijos, kataraktos ar pigmentinio retinito, prevencijai bei regėjimo funkcijos gerinimui jomis sergant. Be to, liuteinas pasiţymi antihipertenziniu, antiaterogeniniu, priešvėţiniu, priešopiniu, antihepatotoksiniu, antidiabetiniu ir kt. poveikiais. Didţiausią medţiagos kiekį organizmas gauna iš ţalių lapinių darţovių ir vaisių, o mitybos papildymui galima vartoti maisto papildus, kurių gamybai liuteinas yra išgaunamas iš didţiojo serenčio. Liuteino kokybinei ir kiekybinei analizei augalinėse ţaliavose ir maisto papilduose daţniausiai naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos ir plonasluoksnės chromatografijos metodai.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Buvo tiriami įvairių gamintojų, farmacinių formų ir sudėčių maisto papildai akims, kurių sudėtyje yra liuteino ir kitų regėjimui teigiamą įtaką turinčių medţiagų. Šie maisto papildai buvo įsigyti Kauno miesto vaistinėse. Keturi maisto papildai buvo minkštos kapsulės su skystu turiniu apvalko viduje, vienas papildas – kietos kapsulės su miltelių pavidalo turiniu kapsulės viduje, du papildai tablečių forma ir vienas papildas miltelių forma. Visuose tirtuose preparatuose deklaruojama, kad liuteinas yra laisvos formos. Medţiagos kiekis juose svyruoja nuo 6 iki 20 mg vienoje farmacinėje formoje.
Tyrimui naudoti maisto papildai:
MP-1. Farmacinė forma: minkštos kapsulės. Pagaminta Lenkijoje. Sudedamosios dalys 1
kapsulėje: liuteinas 20 mg, cinkas 10 mg, selenas 55 µg, kofermentas Q10 (ubichinonas) 20 mg, citrusinių vaisių bioflavonoidai 50 mg, beta karotenas 5 mg, vitaminas A 1,6 mg, vitaminas E 24 mg, vitaminas C 240 mg.
MP-2. Farmacinė forma: minkštos kapsulės. Pagaminta ES. Sudedamosios dalys 1 kapsulėje: liuteinas 20 mg, zeaksantinas 3 mg, cinkas 10 mg, varis 1 mg, selenas 55 µg, mėlynių uogų
milteliai 100 mg, vitaminas E 12 mg, vitaminas C 80 mg.
MP-3. Farmacinė forma: kietos kapsulės. Pagaminta Lietuvoje. Sudedamosios dalys 1
kapsulėje: liuteinas 12 mg, zeaksantinas (iš didţiųjų serenčių ţiedų ekstrakto) 1 mg, cinkas 10 mg, smulkiaţiedės akišveitės ţolės sausasis ekstraktas 100 mg, mėlynių uogų sausasis ekstraktas 50 mg, dviskiaučio ginkmedţio lapų sausasis ekstraktas 30 mg, vitaminas B2 1,4 mg, vitaminas B12 2,5 µg, vitaminas A 0,5 mg, vitaminas E 6 mg, vitaminas C 75 mg
MP-4. Farmacinė forma: tabletės. Pagaminta Lenkijoje. Sudedamosios dalys 1 tabletėje: liuteinas 10 mg, zeaksantinas 1 mg, cinkas 10 mg, mėlynių uogų ekstraktas 300 mg, vynuogių
sėklų ekstraktas 5 mg, vitaminas B1 0,7 mg, vitaminas B2 0,8 mg, vitaminas B6 1 mg, vitaminas B12 0,5 µg, vitaminas C 32 mg, vitaminas E 6 mg, β-karotenas 2,5 mg.
MP-5. Farmacinė forma: minkštos kapsulės. Pagaminta Lenkijoje. Sudedamosios dalys 1
kapsulėje: liuteinas 6 mg, vitaminas E 10 mg, vitaminas A 0,6 mg.
MP-6. Farmacinė forma: minkštos kapsulės. Pagaminta Vokietijoje. Sudedamosios dalys 1
kapsulėje: liuteinas 15 mg, zeaksantinas 0,8 mg, cinkas 2,5 mg, vitaminas A 0,4 mg, vitaminas E 36 mg, vitaminas C 120 mg.
MP-7. Farmacinė forma: tabletės. Pagaminta Lenkijoje. Sudedamosios dalys 1 tabletėje: liuteinas 6 mg, zeaksantinas 0,5 mg, selenas 20 mg, vitaminas E 8,8 mg, vitaminas C 60 mg.
MP-8. Farmacinė forma: milteliai. Pagaminta ES. Sudedamosios dalys 1 maišelyje: liuteinas 10 mg, zeaksantinas 2 mg, cinkas 15 mg, vitaminas E 30 mg, doksozaheksaeno rūgštis 150 mg,
vitaminas C 180 mg.
2.2. Tyrimams naudoti reagentai
Distiliuotas vanduo, išgrynintas vandens valymo sistema „Millipore“ (Bedford, JAV); Heksanas (≥95 proc., Sigma-Aldrich, Izraelis);
Butilintas hidroksitoluenas (≥99 proc., Kosher, Rusija); Chloroformas (≥99,8 proc., Sigma-Aldrich, Izraelis); β-karotenas (≥97 proc., Sigma-Aldrich, JAV); Liuteinas (≥96 proc., Sigma-Aldrich, JAV); Azoto dujos;
Acetonitrilas (≥99,9 proc., Sigma-Aldrich, Izraelis); Etilacetatas (≥99,7 proc., Sigma-Aldrich, Izraelis); Dichlormetanas (≥99,8 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija); Metanolis (≥99,9 proc., Sigma-Aldrich, Prancūzija); Petrolio eteris (≥99,8 proc., Lachema, Čekija); Trietilaminas (≥99,5 proc., Sigma-Aldrich, Belgija).
2.3. Naudota įranga
Liuteino ekstraktų paruošimui iš papildų buvo naudojama ultragarso vonelė „WiseClean“ (Witeg, Vokietija), elektrinės svarstyklės (Shimadzu, Japonija), elektrinė maišyklė „MS2 Minishaker“ (Ika, JAV), laboratorinė centrifuga „C2 Series“ (Centurion Scientific, Jungtinė Karalystė).
Liuteino kokybiniam nustatymui, taikant plonasluoksnę chromatografiją, naudota mėginio uţnešimo sistema „Linomat 5“ (Camag, Šveicarija), 10×10 cm atvirkštinių fazių C18 modifikuota silikagelio plokštelė (Macherey-Nagel, Vokietija), 10×10 cm chromatografavimo kamera „Twin
Trough chamber“ (Camag, Šveicarija), plokštelės dţiovinimui naudota kaitlentė „TLC Plate Heater“ (Camag, Šveicarija), plokštelės analizė atlikta dokumentavimo sistema „TLC Visualizer“ (Camag, Šveicarija) ir įdiegta programinė įranga VisionCATS v2.0.
Liuteino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui, atliekant efektyviąją skysčių chromatografiją, naudotas „Waters e2695“ chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998“ (Waters Corporation, Milford, JAV), 150×4,6 mm, 3 µm C18 chromatografinė kolonėlė (YMC Europe GmbH, Vokietija) ir išorinis termostatas (Waters
Corporation, Milford, JAV).
2.4. Tyrimų metodai
Kadangi karotenoidai yra nestabilūs oro deguonies ir šviesos poveikyje [41], visos ekstrakcijos ir analizės procedūros atliekamos kaip galima greičiau ir sumaţinto apšvietimo aplinkoje, kad medţiagos būtų kuo labiau apsaugotos nuo degradacijos ir būtų išvengiama kiekybinės sudėties nuostolių.
2.4.1. Maisto papildų apdorojimas
Prieš vykdant liuteino ekstrakciją iš maisto papildų, skirtingų farmacinių formų maisto papildai buvo skirtingai apdorojami ir jų turinys perkeliamas į matavimo kolbas ar laboratorines stiklinėles. Tabletės buvo sutrinamos grustuvėje iki homogeniškų miltelių pavidalo, kietos kapsulės išardomos, minkštose kapsulėse iš vieno galo smeigtuku praduriama maţa skylutė ir turinys išspaudţiamas, o iš maišelių milteliai suberiami tiesiai į laboratorinį indą.
2.4.2. Kokybinis liuteino nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu
Ekstrakcija. Kiekvienas maisto papildo vienetas atitinkamai apdorojamas, visas jo turinys
koncentracija tirpale 0,1 proc.) iki ţymos. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 30 min. Po ekstrakcijos mėginiai centrifuguojami ir viršutinis gauto tirpalo sluoksnis filtruojamas pro 0,45 µm filtrą. Nufiltruotas tirpalas naudojamas tolimesniam plonasluoksnės chromatografijos tyrimui [66].
Tirpiklių sistema: petrolio eterio-acetonitrilo-metanolio (1:1:2) mišinys. Ryškiklis: nenaudojamas, dėmės matomos regimojoje šviesoje.
Analizė. Analizė atliekama ant 10×10 cm atvirkštinių fazių C18 modifikuotos silikagelio
plokštelės, kuri pirmiausiai yra apipurškiama dichlormetano-metanolio (1:1) mišiniu ir išdţiovinama ant kaitlentės 20 min esant 100 °C temperatūrai. Ant plokštelės, mėginio uţnešimo sistemos pagalba, uţnešama po 4 µl kiekvieno mėginio ir toks pat kiekis β-karoteno ir liuteino etaloninų tirpalų mišinio. Plokštelė su mėginiais dedama į kamerą, pripildytą 40 ml tirpiklių sistemos. Po 20 min, tirpiklių sistemai pakilus 7 cm nuo starto linijos, plokštelė išimama ir išdţiovinama ant kaitlentės 20 min esant 100 °C temperatūrai. Tiriamosios medţiagos ant plokštelės matomos kaip geltonos juostelės baltame fone [33, 66]. Kokybinis liuteino identifikavimas patvirtinamas lyginant tiriamuosiuose ekstraktuose gautas Rf reikšmes su liuteino standarto Rf reikšmėmis.
2.4.3. Liuteino analizė naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją
Ekstrakcija. Ekstrakcija buvo vykdoma remiantis literatūros šaltinyje (Dautartaitė, 2017)
nurodyta metodika, kurioje kaip pagrindinis tirpiklis naudotas heksanas ir jame ištirpintas BHT, kurio koncentracija tirpale 0,1 proc. [1], tačiau siekiant didesnės ekstrakcijos išeigos pasirinktas tinkamesnis tirpiklis liuteinui – chloroformas ir jame ištirpintas BHT, kurio koncentracija tirpale 0,1 proc. Kiekvienas maisto papildo vienetas atitinkamai apdorojamas ir visas jo turinys perkeliamas į laboratorinę stiklinėlę. Ant turinio uţpilama 10 ml chloroformo ir 0,1 proc. BHT mišinio, ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 30 min esant 25 °C temperatūrai. Gautas ekstraktas nupilamas į 20 ml matavimo kolbutę, o ant mėgintuvėlyje likusių nuosėdų uţpilama 5 ml tirpiklio ir ekstrakcija tęsiama ultragarso vonelėje 15 minučių. Šis 15 minučių ekstrakcijos procesas pakartojamas dar kartą, o gauti ekstraktai supilami į tą pačią 20 ml matavimo kolbutę ir skiedţiama chloroformo ir 0,1 proc. BHT mišiniu iki ţymės. Pipete paimama 4 ml gauto ekstrakto ir dţiovinama iki sauso likučio azoto aplinkoje. Sausas likutis elektrinės maišyklės pagalba tirpinamas 2 ml acetonitrilo tirpalo. Šis tirpalas yra filtruojamas pro 0,45 µm filtrą ir naudojamas tolimesniam ESC tyrimui.
Analizė. Tyrimui atlikti taikomas gradientinis eliuavimas. Judančioji fazė sudaryta iš dviejų
eliuentų. Eliuentas A – acetonitrilas ir distiliuotas vanduo santykiu 9:1 kartu su trietilaminu (jo koncentracija tirpale 0,25 proc.). Eliuentas B – etilacetatas su trietilaminu (jo koncentracija tirpale 0,25 proc.). Eliuavimo gradientas nurodytas 1 lentelėje.
1 lentelė. Judančios fazės gradientinės sistemos sudėties kitimas
Laikas, min Judančioji fazė A, proc. Judančioji fazė B, proc.
0 90 10
10 50 50
20 10 90
21 90 10
25 90 10
Tiriamosios medţiagos atskyrimui naudojama C18 kolonėlė; Eliuentų tėkmės greitis – 1,0 ml/min;
Injekcijos tūris – 10 µl; Kolonėlės temperatūra 25 °C;
Vieno mėginio chromatografavimo trukmė – 25 min;
Detekcija – fotodiodų matricos detektoriumi, esant 450 nm bangos ilgiui.
Kiekybiškai liuteinas nustatomas jo kiekį išreiškiant β-karoteno ekvivalentu, tam naudojamas etaloninis β-karoteno tirpalas. Jis ruošiamas β-karoteno standartą tirpinant chloroformo ir 0,1 proc. BHT mišinyje. Paruošiami skirtingų koncentracijų standarto tirpalai, vykdomas jų chromatografavimas (2 pav.). Tirpalų koncentracijos ribos: 3,13 – 200 µg/ml. Remiantis šiomis koncentracijomis ir gautais smailių plotais, sudaromas kalibracinis grafikas (3 pav.).
3 pav. β-karoteno kalibracinė kreivė
Gauti tyrimo duomenys (liuteino smailių plotai) vertinami pagal β-karoteno kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: y = 8,79×103
x + 5,84×103, čia: y – β-karoteno smailės plotas; x – etaloninio β-karoteno tirpalo koncentracija. Gautas kalibracinės kreivės determinacijos koeficientas R2
= 0,999974. Remiantis šia regresijos lygtimi apskaičiuojamos liuteino koncentracijos maisto papildų ekstraktuose.
2.5. Metodo validacija
Analizei taikytam efektyviosios skysčių chromatografijos metodui buvo atlikta validacija. Nustatyti šie parametrai:
Tiesiškumas. Gautas β-karoteno kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas r > 0,99, todėl
tiesiškumo kriterijus atitinka reikalavimus.
Glaudumas (preciziškumas). Vertinama pagal standartinį nuokrypį (angl. Standard
deviation) (SD) (proc.). Kiekybiniame tyrime šios reikšmės turėtų būti ≤ 5 proc. β-karoteno vienos
dienos (mėginiai injekuojami tą pačią dieną) atsikartojamumas 0,8 proc., dviejų dienų (mėginiai injekuojami dvi dienas iš eilės) – 1,5 proc. Šis kriterijus buvo nustatomas ir liuteino standarto tirpale vertinant medţiagos glaudumą. Nustatytas vienos dienos atsikartojamumas 0,1 proc., dviejų dienų – 0,5 proc. Šiems parametrams įvertinti mėginiai buvo injekuojami po penkis kartus esant tokioms pačioms eksperimentinėms sąlygoms.
A
bs
o
rb
ci
jo
s dyd
is
β-karoteno koncentracija, µg/ml
y = 8,79×103x + 5,84×103; R2 = 0,999974Aptikimo riba – 0,094 µg/ml Nustatymo riba – 0,253 µg/ml
2.6. Duomenų analizės metodai
Gautų eksperimentinių duomenų apdorojimas, analizė ir vertinimas buvo atliktas naudojant „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) programą bei IBM SPSS Statistics v.24 statistinę programą. Kiekybiniai duomenys buvo vertinami remiantis vidurkiu (bandymai buvo kartojami po tris kartus) ir standartiniu nuokrypiu. Nustatant sąsajas tarp gautų rezultatų ir gamintojo deklaruojamo kiekio buvo naudotas Pearson koreliacijos koeficientas. Tikrinant hipotezes, buvo naudojamas p=0,05 patikimumo lygmuo.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Naudojant PC ir ESC metodus darbe buvo atliekama kokybinė ir kiekybinė liuteino analizė maisto papilduose. Eksperimentinio tyrimo metu gauti kiekybiniai rezultatai buvo lyginami su deklaruojamais liuteino kiekiais, nurodytais ant maisto papildų pakuočių.
3.1. Kokybinis liuteino identifikavimas taikant plonasluoksnės chromatografijos
analizės metodą
Taikant PC metodą buvo analizuojama kokybinė liuteino sudėtis septyniuose maisto papilduose. Analizės metu ant silikagelio plokštelės atsiskyrė dvi medţiagos (4 pav.).
4 pav. PC eksperimento metu gauta chromatograma
Vienos iš mėginiuose esančių medţiagų Rf reikšmė sutapo su liuteino standarto Rf reikšme (RfL = 0,69), todėl galima teigti, kad ši atsiskyrusi medţiaga yra liuteinas. Ryškiausios dėmės su šia Rf
reikšme gautos ties MP-2, MP-3, MP-4 ir MP-5 mėginiais. Maţiau ryški, bet taip pat aptikta liuteino dėmė ties MP-1 mėginiu. MP-6 ir MP-7 mėginiuose liuteino šiuo metodu neaptikta. Tai gali būti paaiškinama tuo, kad šiuose maisto papilduose liuteino kiekis yra labai maţas ir PC metodas yra nepakankamai jautrus aptikti tokį medţiagos kiekį.
Kita identifikuota medţiaga buvo β-karotenas, kurio standarto Rf reikšmė buvo Rfβ = 0,29.
Ties ta pačia Rf reikšme pastebėtos išryškėjusios dėmės ties MP-1, MP-6 ir MP-7 mėginiais. Ant
MP -5 MP -6 MP -7 Liu te in a s ir β-k a ro te n a s MP -1 MP -2 MP -3 MP -4
MP-1 pakuotės deklaruojama, kad kapsulėje yra β-karoteno, todėl galima teigti, jog papildo sudėtyje yra šios medţiagos. Ant MP-6 ir MP-7 pakuočių nėra deklaruojama, kad papildų sudėtyje yra β-karoteno, nors chromatogramoje matyti, kad mėginiuose yra maţi šios medţiagos kiekiai. Tai gali būti paaiškinama tuo, kad gamybai naudojama galbūt nepakankamai kokybiška ţaliava, todėl β-karotenas papilduose atsiranda kaip priemaiša ar yra kitų medţiagų skilimo produktas.
Rodić et al., 2012 atliktame tyrime taip pat PC metodu buvo vertinama maisto papildų, kuriuose yra liuteino, kokybinė sudėtis. Rezultatuose aptariama, kad ne visuose mėginiuose rasta tokia liuteino forma, kokią deklaruoja gamintojas ant papildo pakuotės. Viename mėginyje aptiktas laisvos formos liuteinas vietoj deklaruojamų liuteino esterių, o kitame atvirkščiai – liuteino esteriai vietoj laisvo liuteino. Be to, viename iš šešių tirtų papildų nebuvo aptiktas nei liuteinas, nei kiti karotenoidai [66]. Ir minėtame literatūros šaltinyje (5 pav), ir atliktame tyrime gautose chromatogramose matoma ta pati karotenoidų išsidėstymo tendencija – liuteino Rf reikšmė yra didesnė uţ β-karoteno Rf reikšmę.
5 pav. Užsienio mokslininkų atlikto tyrimo metu gauta PC chromatograma (adaptuota pagal Rodić et al., 2012 [66])
Apibendrinant eksperimento metu gautus ir literatūroje pateiktus duomenis galima teigti, jog gauti rezultatai yra panašūs. Daugumoje maisto papildų yra tie karotenoidai, kuriuos gamintojas deklaruoja ant produkto pakuotės, tačiau keliuose papilduose identifikuotos medţiagos ar jų formos neatitinka gamintojo deklaruojamos informacijos. Plonasluoksnė chromatografija yra pakankamai selektyvus ir efektyvus metodas, kurį galima naudoti karotenoidų atskyrimui ir kokybiniam nustatymui maisto papilduose. Liuteinas Likopenas β-karotenas Liuteino esteriai Ma is to p ap ild as 1 Ma is to p ap ild as 2 Ma is to p ap ild as 3 Ma is to p ap ild as 4 Ma is to p ap ild as 5 Ma is to p ap ild as 6 Ma is to p ap ild as 1 Ma is to p ap ild as 2 Ma is to p ap ild as 3 Ma is to p ap ild as 4 Ma is to p ap ild as 5 Ma is to p ap ild as 6 L iu tein as 3 0 n g β-k ar o ten as 3 0 n g L ik o p en as 3 0 n g L iu tein as 2 5 n g L iu tein as 2 0 n g L iu tein as 1 5 n g L iu tein as 1 0 n g L iu tein as 5 n g
3.2. Kokybinė liuteino analizė maisto papilduose efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu
Kaip ir analizėje PC metodu, taip ir ESC metodu tirtų maisto papildų ekstraktuose nustatyta iki dviejų medţiagų. Jų sulaikymo laikų vidurkiai yra 8,156 ir 17,265. Lyginant su β-karoteno etaloniniu tirpalu (2 pav.), medţiaga su 17,265 sulaikymo laikų vidurkiu identifikuota kaip β-karotenas. Liuteinas identifikuotas lyginant jo sulaikymo laikus ir UV šviesos absorbcijos spektrus maisto papildų ekstraktų mėginiuose (6A pav.) ir liuteino standarto tirpale (6B pav). Remiantis sutapusiais sulaikymo laikais ir UV šviesos absorbcijos spektrais galima teigti, jog mėginiuose nustatyta medţiaga, kurios sulaikymo laikų vidurkiai yra 8,156, identifikuota kaip liuteinas. Liuteinas identifikuotas visuose maisto papilduose.
6 pav. Tiriamojo (MP-5) ekstrakto (A) ir liuteino standarto (B) chromatogramos, kuriose L raide pažymėtas liuteinas
A
B L
3.3. Liuteino kiekio, išreikšto β-karoteno ekvivalentu, nustatymas maisto
papilduose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Prieš atliekant liuteino kiekybinę analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo siekiama kuo efektyviau įvykdyti veikliosios medţiagos ekstrakciją ir perkelti kuo didesnį kiekį liuteino iš maisto papildo į mėginio ekstraktą. Daliai tiriamųjų maisto papildų buvo pritaikytos dvi ekskrakcijų metodikos tam, kad būtų pasiekta maksimali išeiga. Ekstrakcijos skyrėsi pagrindiniais tirpikliais: buvo naudotas heksanas ir chloroformas, į abiejų sudėtį įėjo 0,1 proc. BHT. Gauti rezultatai parodė, kad didesnis liuteino kiekis ekstrahuojasi naudojant chloroformo ir 0,1 proc. BHT mišinį (2 lentelė), todėl šis tirpiklis pasirinktas visų maisto papildų ekstrakcijai.
2 lentelė. Liuteino kiekio varijavimas maisto papildų mėginiuose ekstrakcijai naudojant skirtingus tirpiklius
Maisto papildo
Nr. Pagrindinis tirpiklis Liuteino kiekis, mg/g
1 Heksanas + 0,1 proc. BHT 5,45 Chloroformas + 0,1 proc. BHT 6,39 2 Heksanas + 0,1 proc. BHT 12,38 Chloroformas + 0,1 proc. BHT 29,72 3 Heksanas + 0,1 proc. BHT 12,43 Chloroformas + 0,1 proc. BHT 23,42
Parinkus tinkamiausią tirpiklį liuteino ekstrakcijai iš maisto papildų, atlikta efektyvioji skysčių chromatografija ir nustatyta kiekybinė liuteino sudėtis, išreikšta β-karoteno ekvivalentu (3 lentelė).
3 lentelė. Liuteino kiekybinė sudėtis maisto papilduose
Maisto papildo nr.
Nustatytas liuteino kiekis vienoje farmacinėje formoje, mg Deklaruojamas liuteno kiekis vienoje farmacinėje formoje, mg 1 3,26 ± 0,04 20 2 19,85 ± 0,21 20 3 12,81 ± 0,31 12 4 10,74 ± 0,14 10 5 6,36 ± 0,12 6 6 0,85 ± 0,01 15 7 Pėdsakai 6 8 0,18 ± 0,003 10
16,3 99,3 106,8 107,4 106 8,5 0 1,8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
P
ro
centa
i
MP-1 MP-2 MP-3 MP-4 MP-5 MP-6 MP-7 MP-8Atlikus tyrimą ir palyginus aptiktą liuteino kiekį su ant maisto papildo pakuotės gamintojo deklaruojamu kiekiu nustatyta, jog viename papilde kiekis skiriasi maţiau nei 1 proc., trijuose – aptiktas iki 8 proc. didesnis kiekis, viename papilde kiekis maţesnis daugiau kaip 80 proc., dviejuose – maţesnis daugiau kaip 90 proc., o viename papilde aptikti tik liuteino pėdsakai (7 pav.). Iš šių rezultatų matyti, kad tik keturiuose iš aštuonių maisto papildų liuteino kiekis beveik atitiko gamintojo deklaruojamą kiekį – juose medţiagos kiekis svyravo nuo 99,3 iki 107,4 proc. ant pakuotės nurodyto kiekio.
7 pav. Liuteino kiekio, aptikto tyrimo metu, procentinė išraiška.
Vertinant sąsajas tarp šio tyrimo metu gautų rezultatų ir gamintojo deklaruojamo kiekio nebuvo nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys, p>0,05.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu gautose chromatogramose matyti kaip varijuoja liuteino smailių plotai skirtinguose maisto papilduose, pavyzdţiui, 8 pav. pateikta maisto papildo chromatograma, kuriame aptiktas liuteino kiekis maţai skiriasi nuo gamintojo deklaruojamos informacijos, 9 pav. nurodyta maisto papildo chromatograma, kuriame liuteino kiekis skiriasi daugiau nei 80 proc., o 10 pav. pateikta maisto papildo chromatograma, kuriame aptikti liuteino pėdsakai.
8 pav. MP-3 ekstrakto chromatograma, kuriame nustatyta 106,8 proc. liuteino
9 pav. MP-1 ekstrakto chromatograma, kuriame nustatyta 16,3 proc. liuteino. 1) liuteino smailė; 2) β-karoteno smailė
10 pav. MP-7 ekstrakto chromatograma, kuriame nustatyti liuteino pėdsakai. 1) liuteino smailė; 2) β-karoteno smailė
Vokietijoje atliktame tyrime (Breithaupt & Schlatterer, 2004) buvo vertinama 14 maisto papildų, savo sudėtyje turinčių liuteino, kiekybinė sudėtis. Tyrimo metu nustatyta, kad septyniuose papilduose liuteino kiekis neatitinka deklaruojamos informacijos ir svyruoja nuo 11 iki 93 proc. gamintojo nurodyto kiekio. Kituose septyniuose papilduose liuteino kiekis viršija nurodytą kiekį ir varijuoja nuo 102 iki 136 proc. [13].
Čekijoje buvo atliktas tyrimas (Šivel et al., 2014), kurio metu buvo nustatomas liuteino kiekis serenčio ekstraktuose, naudojamuose šio karotenoido papildų gamybai. Buvo tiriami 34 ekstraktai: 18 miltelių forma ir 16 granulių forma kapsulėse. Tyrimo rezultatai parodė, kad liuteino kiekis atitiko gamintojo deklaruojamą kiekį ir jį viršijo 9 ekstraktuose iš 18 kapsulių forma ir tik 1 ekstrakte iš 16 miltelių forma. Nekokybiškuose ekstraktuose liuteino kiekis svyravo nuo 0,31 iki 95,3 proc., tačiau net 7 ekstraktai nesiekė 12 proc. gamintojo nurodyto kiekio. Dešimtyje serenčio ekstraktų liuteino viršytas kiekis svyravo nuo 101,1 iki 109,1 proc. [73].
Lyginant eksperimentinio tyrimo ir uţsienio mokslininkų atliktų tyrimų rezultatus galima teigti, kad rezultatai kardinaliai nesiskiria. Visuose tyrimuose nustatyta, jog liuteino kiekis maisto papilduose ar jam gaminti naudojamuose ekstraktuose atitinka gamintojo deklaruojamą informaciją iki 50 proc. tiriamųjų objektų. Nepakankamas liuteino kiekis papilduose gali būti paaiškinamas tuo, kad produktų gamybai naudojama nekokybiška ţaliava. Be to, ši medţiaga yra nestabili, todėl reiktų atkreipti dėmesį į produktų laikymo sąlygas ir galiojimo terminą.
Efektyvioji skysčių chromatografija yra pakankamai tikslus ir atrankus metodas, kuris gali būti puikiai pritaikomas liuteino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui maisto papilduose.
IŠVADOS
1. Plonasluoksnės chromatografijos metodu liuteinas buvo identifikuotas penkiuose iš septynių tirtų maisto papildų. Dviejuose mėginiuose medţiaga šiuo metodu nebuvo aptikta.
2. Nustatytos optimalios sąlygos liuteino ekstrakcijai iš maisto papildų. Didţiausias medţiagos kiekis gautas ekstrakcijai naudojant chloroformo ir 0,1 proc. BHT mišinį.
3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu atlikta kokybinė ir kiekybinė liuteino analizė. Liuteinas buvo identifikuotas visuose aštuoniuose maisto papilduose, jo kiekis svyravo nuo pėdsakų iki 19,85 mg vienoje farmacinėje formoje.
4. Lyginant eksperimento metu gautus liuteino kiekius ir ant maisto papildų pakuočių deklaruojamus kiekius nustatyta, jog keturiuose maisto papilduose kiekiai beveik atitiko (99,3– 107,4 proc.) pateiktą informaciją, o likusiuose keturiuose – neatitiko (pėdsakai–16,3 proc.) nurodytos informacijos.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Pasirenkant tirpiklį, naudojamą liuteino maisto papildų ekstrakcijai, reikia atsiţvelgti į ekstrahuojamos medţiagos savybes, tirpumą ir poliškumą. Tam gali būti naudojamas chloroformas, kuris atlikto tyrimo metu ekstrahavo didţiausią kiekį liuteino iš maisto papildų.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Dautartaitė I. Karotenoidų nustatymas vaistinių medetkų (Calendula Officinalis L.) ţieduose. Magistro darbas. 2017:26.
2. Gaidelytė R, Garbuvienė M, Zavackaitė A. Lietuvos sveikatos statistika 2017. Vilnius. 2018.79 3. Notifikuotų maisto papildų sąrašas. [cited 2019 Jan 26]. Prieiga per internetą:
http://www.vet.lt/maisto-papildai/
4. Abdel-Aal el-SM, Akhtar H, Zaheer K, Ali R. Dietary sources of lutein and zeaxanthin carotenoids and their role in eye health. Nutrients. 2013 Apr;5(4):1169-85.
5. Amorim-Carrilho K, Cepeda A, Fente C, Regal P. Review of methods for analysis of carotenoids. TrAC Trend Anal Chem. 2014 Apr;56:49-73.
6. Babino D, Palczewski G, Widjaja-Adhi MA, Kiser PD, Golczak M, Lintig J. Characterization of the role of β-carotene 9,10-dioxygenase in macular pigment metabolism. J Biol Chem. 2015 Oct;290(41):24844-57.
7. Bahrami H, Melia M, Dagnelie G. Lutein supplementation in retinitis pigmentosa: PC-based vision assessment in a randomized double-masked placebo-controlled clinical trial [NCT00029289]. BMC Ophthalmol. 2006 Jun;6:23.
8. Bernstein PS, Li B, Vachali PP, Gorusupudi A, Shyam R, Henriksen BS, et al. Lutein, zeaxanthin, and meso-zeaxanthin: the basic and clinical science underlying carotenoid-based nutritional interventions against ocular disease. Prog Retin Eye Res. 2016 Jan;50:34-66.
9. Berson EL, Rosner B, Sandberg MA, Weigel-DiFranco C, Brockhurst RJ, Hayes KC, et al. Clinical trial of lutein in patients with retinitis pigmentosa receiving vitamin A. Arch Ophthalmol. 2010 Apr;128(4):403-11.
10. Bone RA, Landrum JT, Tarsis SL. Preliminary identification of the human macular pigment. Vision Res. 1985;25(11):1531-5.
11. Bourne RRA, Flaxman SR, Braithwaite T, Cicinelli MV, Das A, Jonas JB, et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Health. 2017 Sep;5(9):e888-97.
12. Brazionis L, Rowley K, Itsiopoulos C, O'Dea K. Plasma carotenoids and diabetic retinopathy. Br J Nutr. 2009 Jan;101(2):270-7.
13. Breithaupt DE, Schlatterer J. Lutein and zeaxanthin in new dietary supplements – analysis and quantification. Eur Food Res Technol. 2004 Dec;220(5-6):648-52.
14. Carbonell-Capella JM, Buniowska M, Barba FJ, Esteve MJ, Frígola A. Analytical methods for determining bioavailability and bioaccessibility of bioactive compounds from fruits and vegetables: a review. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2014 Feb;13(2):155-71.
15. Cheng F, Zhang Q, Yan FF, Wan JF, Lin CS. Lutein protects against ischemia/reperfusion injury in rat skeletal muscle by modulating oxidative stress and inflammation. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2015;37(4):329-34.
16. Craft NE, Soares JH. Relative solubility, stability, and absorptivity of lutein and .beta.-carotene in organic solvents. J Agric Food Chem. 1992;40(3):431-4.
17. Crichton G, Elias M, Alkerwi AA, Buckley J. Intake of lutein-rich vegetables is associated with higher levels of physical activity. Nutrients. 2015 Sep;7(9):8058-71.
18. Du SY, Zhang YL, Bai RX, Ai ZL, Xie BS, Yang HY. Lutein prevents alcohol-induced liver disease in rats by modulating oxidative stress and inflammation. Int J Clin Exp Med. 2015 Jun;8(6):8785-93.
19. European food safety authority (EFSA). Scientific opinion on the substantiation of health claims related to lutein and protection of DNA, proteins and lipids from oxidative damage (ID 3427), protection of the skin from UV-induced (including photo oxidative) damage (ID 1605, 1779) and maintenan. EFSA J. 2011;9(4):2030.
20. European food safety authority (EFSA). Scientific opinion on the re-evaluation of lutein preparations other than lutein with high concentrations of total saponified carotenoids at levels of at least 80%. EFSA J. 2011;9(5):2144.
21. Fatani AJ, Al-Rejaie SS, Abuohashish HM, Al-Assaf A, Parmar MY, Ahmed MM. Lutein dietary supplementation attenuates streptozotocin-induced testicular damage and oxidative stress in diabetic rats. BMC Complement Altern Med. 2015 Jun;15:204.
22. Feltl L, Pacakova V, Stulik K, Volka K. Reliability of carotenoid analyses: a review. Curr Anal Chem. 2005 Jan;1(1):93-102.
23. Fernández-Sevilla JM, Acién Fernández FG, Molina Grima E. Biotechnological production of lutein and its applications. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Mar;86(1):27-40.
24. Giordano E, Quadro L. Lutein, zeaxanthin and mammalian development: metabolism, functions and implications for health. Arch Biochem Biophys. 2018 Jun;647:33-40.
25. Gong X, Rubin LP. Role of macular xanthophylls in prevention of common neovascular retinopathies: retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy. Arch Biochem Biophys. 2015 Apr;572:40-8.
26. Granado F, Olmedilla B, Blanco I. Nutritional and clinical relevance of lutein in human health. Br J Nutr. 2003 Sep;90(3):487-502.
