KAUNAS, 2017 ( ECHINACEA PURPUREA L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ EKSTRAHAVIMAS ULTRAGARSU IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

(1)

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

DOMAS OŽEKAUSKAS

FENOLINIŲ JUNGINIŲ EKSTRAHAVIMAS ULTRAGARSU IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA PURPUREA L.) ŽOLĖS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

doc.dr. Giedrė Kasparavičienė

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Data

FENOLINIŲ JUNGINIŲ EKSTRAHAVIMAS ULTRAGARSU IŠ RAUSVAŽIEDŽIŲ EŽIUOLIŲ (ECHINACEA PURPUREA L.) ŽOLĖS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

doc.dr. Giedrė Kasparavičienė

Recenzentas Darbą atliko Magistrantas

Domas Ožekauskas

(3)

Turinys

SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SĄVOKOS ... 8 SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1 Rausvažiedės ežiuolės (Echinacea purpurea L.) apibūdinimas ... 12

1.2 Fenoliniai junginiai ... 13

1.3 Fenolinių junginių ekstrakcija ... 14

1.4 Ekstraktai ... 16

1.5 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas ... 16

1.6 Antioksidacinis aktyvumas ... 17

1.7 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 18

2. TYRIMO METODIKA ... 20

2.1 Tiriamasis objektas ... 20

2.2 Naudota aparatūra ... 20

2.3 Naudoti reagentai ... 20

2.4 Augalinės žaliavos dalelių dydžio nustatymas ... 21

2.5 Tiriamųjų ekstraktų technologija ... 21

2.6 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 21

2.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu ... 22

2.8 Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu ... 22

2.9 Duomenų statistinis įvertinimas ... 23

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24

3.1 Augalinės žaliavos kokybės vertinimas ... 24

(4)

3.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu ... 33

3.4 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 41

3.5 Rezultatų aptarimas ... 50

4. IŠVADOS ... 52

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 53

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 54

(5)

SANTRAUKA

D. Ožekausko magistro baigiamasis darbas/ darbo vadovas doc. dr. G. Kasparavičienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto; Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra – Kaunas.

Darbo pavadinimas: Fenolinių junginių ekstrahavimas ultragarsu iš rausvažiedžių ežiuolių

(Echinacea purpurea L.) žolės.

Darbo tikslas: Naudojant ultragarsą ekstrahuoti fenolinius junginius iš rausvažiedių ežiuolių

žolės; nustatyti tirpiklių, laiko, temperatūros, žaliavos ir tirpiklio santykio, žaliavos dalelių dydžio įtaką fenolinių junginių ekstrahavimui; nustatyti antioksidacinį aktyvumą, taikant DPPH ir FRAP metodus; nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, taikant Folin-Ciocalteu metodiką.

Tyrimo objektai ir metodai: Echinacea purpurea L. žaliava, gamintojas A.Karvelio

terapijos-fitoterapijos įmonė. Spektrofotometrijos metodu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas, naudojant DPPH bei FRAP laisvuosius radikalus.

Tyrimo rezultatai: Bendras fenolinių junginių kiekis rausvažiedės ežiuolės vandeniniame

ekstrakte iš dalelių didesnių negu 1,12mm įvairavo nuo 1,771 iki 0,642 mg/g KRE, iš dalelių iki 1,12mm – 1,496 iki 0,716mg/g KRE, etanoliniame ekstrakte iš dalelių didesnių negu 1,12mm svyravo nuo 1,811 iki 0,544 mg/g KRE, iš dalelių iki 1,12mm – 2,189 iki 0,790 mg/g KRE. Nustatytas antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu svyravo vandeninių ekstraktų iš dalelių didesnių negu 1,12mm buvo nuo 347,071 iki 87,776 µg/ml TE, iš dalelių iki 1,12mm - 130,606 iki 40,868 µg/ml TE, etanolinių ekstraktų iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas svyravo nuo 394,556 iki 127,277 µg/ml TE, iš dalelių iki 1,12mm – 372,520 iki 187,520 µg/ml TE. Nustatytas antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu įvairavo vandeninių ekstraktų iš dalelių didesnių negu 1,12mm buvo nuo 50,367 iki 16,186 mmol/ml TE, iš dalelių iki 1,12mm – 47,330 iki 12,965 mmol/ml TE, etanolinių ekstraktų iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas svyravo nuo 106,131 iki 16,893 mmol/ml TE, iš dalelių iki 1,12mm – 70,254 iki 16,703 mmol/ml TE.

Tyrimo išvados: Didžiausias fenolinių junginių kiekis išsiskiria naudojant tirpiklį etanolį

40% (V/V), esktrahuojant santykiu 1:30, 30 min., iš dalelių iki 1,12 mm, esant 30-35ºC temperatūrai. Tokie ekstrahavimo faktoriai kaip tirpiklis, ekstrakcijos laikas, temperatūra bei žaliavos ir ekstrahento santykis turėjo įtakos fenolinių junginių kiekiui. Buvo nustatyta, jog antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo fenolinių junginių kiekio tiriant tiek DPPH, tiek FRAP metodais.

(6)

SUMMARY

Master thesis by Domas Ožekauskas. The research supervisor is assoc. prof. dr. G. Kasparavičienė; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Kaunas.

The topic of the master thesis: Extraction of phenolic compounds from purple

coneflower (Echinacea purpurea L.) herb using ultrasound.

The aim of the research: Ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from purple

coneflower (Echinacea purpurea L.) herb and the evaluation of following factors influence: extraction time, temperature, material/solvent ratio, particle size of herb and solvent.

The objectives of the research: to extract phenolic compounds from purple coneflower herb

using ultrasound; to evaluate the influence of solvent, particle size, extraction time, temperature and solvent/sample ratio; to determine the total amount of phenolic compounds; to determine the antioxidant activity by DPPH and FRAP methods.

The methods of the research: The total amount of phenolics was determined

spectrophotometrically by Folin-Ciocalteu reagent, content was expressed as caffeic acid equivalents (CAE) mg/g of dry weight of herbal material. The antioxidant activity of echinacea extracts was evaluated in vitro with a method based on the scavenging of an alcoholic DPPH radical solution, result expressed as µg/ml Trolox equivalents (TE), and ferric reducing antioxidant power (FRAP) test, result expressed as mmol/ml Trolox equivalents.

The results of the research: the total amount of phenolic compounds in purple coneflower‘s

aqueous extract made from particles bigger than 1,12mm size varied from 1,771 to 0,642 mg/g CAE, from particles smaller than 1,12mm size – 1,496 to 0,716 mg/g CAE, ethanolic extract made from particles bigger than 1,12mm size varied from 1,811 to 0,544 mg/g CAE, from particles smaller than 1,12mm size – 2,189 to 0,790 mg/g CAE. Antioxidant activity determined via DPPH method varied in aqueous extract made from particles bigger than 1,12mm size - 347,071 to 87,776 µg/ml TE, from particles smaller than 1,12mm size - 130,606 to 40,868 µg/ml TE, ethanolic extract made from particles bigger than 1,12mm size antioxidant activity varied from 394,556 to 127,277 µg/ml TE, from particles smaller than 1,12mm size – 372,520 to 187,520 µg/ml TE. Antioxidant activity determined by FRAP method varied in aqueous extract made from particles bigger than 1,12mm size - 50,367 to 16,186 mmol/ml TE, from particles smaller than 1,12mm size – 47,330 to 12,965 mmol/ml TE, ethanolic extract made from particles bigger than 1,12mm size varied from 106,131 to 16,893 mmol/ml TE, from particles smaller than 1,12mm size – 70,254 to 16,703 mmol/ml TE.

The conclusion: The maximum amount of phenolic compound was extracted using a solvent

(7)

and extraction temperature of 30-35ºC. It was determined that the extraction factors like solvent, extraction time, temperature, solvent to material ratio have effects on total phenolic content. It was also found that total phenolic content has strong correlation with antioxidant activity tested by DPPH and FRAP methods.

(8)

SĄVOKOS

Antiaterogeninis poveikis - cholesterolio pertekliaus pernaša iš audinių atgal į kepenis. Antriniai metabolitai – tai tarpiniai ir galutiniai medžiagų apykaitos produktai.

(9)

SANTRUMPOS

AA Antioksidacinis aktyvumas

AIDS įgyto imuniteto deficito sindromas DNR deoksiribonukleorūgštis

DPPH 2,2-difenil-1-pikril-hidrazilo radikalas

FC Folin – Ciocalteu metodas

FJ fenoliniai junginiai

FJK fenolinių junginių kiekis

FRAP trivalentės geležies jonų redukcijos galia (anglų k. - ferric reducing antioxidant power) KRE kavos rūgšties ekvivalentas

Konc koncentracija

RNS reaktyvios azoto formos

ROS reaktyvios deguonies formos

Se selenas

SOD superoksido dismutazė TE trolokso ekvivalentas

TPTZ 2,4,6-tripiridil-s-triazinas

UE ultragarsinė ekstrakcija VAŽ vaistinė augalinė žaliava

(10)

ĮVADAS

Rausvažiedė ežiuolė yra viena iš perkamiausių vaistinių augalų, norint panaikinti peršalimo, skaudančios gerklės bei kitų viršutinių kvėpavimo takų infekcijų simptomus [1]. Ežiuolės preparatai taip pat naudojami kaip nespecifiniai imuninės sistemos stimuliantai [2]. Imunostimuliuojančios savybės yra siejamos su kavos rūgšties dariniais, kurie atlieka bioaktyvias funkcijas [2]. Dėl šių požymių kavos rūgštis bei jos dariniai yra naudojami nustatyti ežiuolės vaistinės augalinės žaliavos (VAŽ) bei ekstraktų kokybei [2]. Fenoliniai junginiai, kurie yra daugumoje augalų, susideda iš didelio molekulių spektro, kurį sudaro aromatinė grupe bei viena ar daugiau hidroksilo grupių ant aromatinio žiedo [3].

Pasaulyje yra gausybė vaistažolių rūšių bei atmainų, kurioms reikalingi tyrinėjimai. Ypatingai reikalingi natūraliai augančių bei kultivuojamų augalų, turinčių sudėtyje fenolinių junginių bei pasižyminčių antioksidaciniu aktyvumu, tyrimai. Nors yra atliekami bioaktyvių junginių bei bendro kiekio tyrimai, fenolinių junginių identifikacija yra nepakankama ir nepilna, ypač trūksta fenolinių junginių kiekybinės sudėties informacijos [4].

Ultragarsinė ekstrakcija (UE) yra laikoma viena paprasčiausių ekstrakcijos metodų, nes yra lengvai atliekama su laboratorijoje dažnai esančia įranga (pvz. ultragarsinė vonelė). Šiame metode, susmulkintas mėginys yra sumaišomas su tinkamu tirpikliu, įdedamas į ultragarsinę vonelę ir ekstrahuojamas, nustatant norimą temperatūrą bei ekstrakcijos laiką. UE sumažina reikalingą tirpiklio kiekį ir sutrumpina ekstrakcijos laiką. Be to, bandymai parodė, jog ekstrakcijos išeiga padidėja nuo 6% iki 35%. Taip pat UE pasižymi mažesne analičių degradacija, lyginant su kitais metodais [5]. Dėl išvardintų privalumų šis modernus ekstrahavimo būdas buvo pasirinktas.

(11)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Natūralios kilmės aktyvūs junginiai atkreipia vis daugiau mokslininkų dėmesio, dėl stiprių antioksidacinių savybių bei reikšmingo poveikio įvairių ligų, susijusių su oksidaciniu stresu, prevencijai. Pastaruoju metu fenolinių junginių ir jų ekstraktų technologija ir vartojimas tapo labai svarbia tyrimų sritimi farmacijoje. Rausvažiedė ežiuolė yra populiarus tyrimų objektas dėl savo gausios naudos žmogaus sveikatai bei kaupiamų fenolinių junginių. Efektyvi ežiuolės ekstraktų technologija moderniu ektrahavimo metodu tapo šio tiriamojo darbo pagrindu.

Tikslas - naudojant ultragarsą ekstrahuoti rausvažiedžių ežiuolių (Echinacea purpurea L.)

žolę ir įvertinti technologinių veiksnių: tirpiklio, laiko, temperatūros, santykio ir žaliavos dalelių dydžio įtaką ištraukų kiekybei, nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.

Uždaviniai:

1. Fenolinius junginius ekstrahuoti ultragarso aplinkoje iš rausvažiedžių ežiuolių žolės. 2. Nustatyti bendra fenolinių junginių kiekį, taikant Folin-Ciocalteu metodą.

3. Nustatyti tirpiklių, laiko, temperatūros, santykio, žaliavos dalelių dydžio įtaką fenolinių junginių ekstrahavimui.

(12)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1

Rausvažiedės ežiuolės (Echinacea purpurea L.) apibūdinimas

Rausvažiedės ežiuolės tėvynė yra Šiaurės Amerika, kur šis daugiametis sukulentinis augalas yra plačiai paplitęs, dažniausiai auga ant sausų šlaitų. Jau indėnai pastebėjo šio augalo vaistines savybes [6]. Tarp įvairių ežiuolės rūšių, rausvažiedė ežiuolė yra labiausiai naudojama fitofarmacijos srityje Europoje [20].

Rausvažiedė ežiuolė priklauso astrinių šeimai. Ji yra daugiametis 60-100 cm (auginamas kultūroje – daugiau kaip 180 cm) žolinis augalas su šakotine šaknų sistema. Stiebas status, standus, apaugęs smulkiais, trumpais plaukeliais, apatinėje dalyje apvalus, viršutiniame trečdalyje – šakotas, tuščiaviduris, šiek tiek briaunotas. Lapai pražanginiai, raukšlėtu paviršiumi, šiurkštūs, paprasti, ištisiniai, plačiai kiaušiniški arba kiaušiniškai lancetiški, širdiškais pamatais, nusmailėjusia dantyta viršūne, viršutinė pusė ryškiai žalia. Pamatiniai lapai ilgakočiai, 17-24 cm ilgio ir 6-10 cm pločio; stiebų lapai trumpesniais koteliais arba bekočiai. Pavieniai mišriažiedžiai graižai apsupti 10-20 sterilių, rausvai purpuriško raudonumo, 4-6 cm ilgio ir 0,6 cm pločio liežuviškų žiedų. Žydėjimo pradžioje jie būna horizontalioje padėtyje, o pabaigoje nusvyra žemyn. Vidiniai graižo žiedai dvilyčiai, vamzdiški, geltoni, pridengti žvynelių, žydi spirale aukštyn (akropetališkai). Žiedynsostį gaubia linijiškai lancetiški, plaukuoti ar pliki, blakstienoti skraistalapiai, sudarantys dvieilę-ketureilę skraistę. Žiedynsostis žydėjimo pradžioje būna plokščias, 1,5-3,5 cm skersmens, žydėjimo metu – iškilus, 2-3,5 cn aukščio, vaisių brandos metu – kūgiškas su daugybe pažiedžių, šeriuotas. Pažiedės siaurai lancetiškos su yliškais (šerio pavidalo) tamsiai raudonos spalvos smaigaliais. Žydi liepą-rugsėjį. Vaisius – 4,0-5,5 mm ilgio pilkai rudos spalvos lukštavaisis (sėkla) [28].

Skirtingų ežiuolės dalių sudėtis skiriasi. Šaknyse randama daugiau eterinių aliejų ir pirolizidino alkaloidų. Antžeminėse augalo dalyse yra daugiau alkamidų, poliacetilenų, kavos bei ferulo rūgščių darinių, polisacharidų bei glikoproteinų [19]. Pagrindiniai ežiuolės komponentai yra kavos rūgšties dariniai, alkamidai, polisacharidai, baltymai, lektinai, flavonoidai bei eteriniai aliejai, raugai [18, 28].

Rausvažiedė ežiuolė yra populiariausias augalinis imunostimuliatorius. Ji taip pat veikia bakteriocidiškai ir bakteriostatiškai gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas. Buvo pastebėtas ežiuolės specifinis poveikis gripo ir pūslelinio stomatito virusams. Preparatai yra efektyvi priemonė gydant odos (psoriazė, egzema), ginekologines (adneksitas), urologines (prostatitas, cistitas ir kt.), onkologines ligas ir nuo kraujo užkrėtimo. Jais gydo leukopeniją (po švitinimo ir citostatikų gydymo kurso). Pediatrijoje ežiuolės preparatai su pertraukomis vartojami peršalimo ligų profilaktikai ir gydymui – tai yra aktualu darželį ir mokyklą lankantiems vaikams [28].

(13)

Ežiuolė yra kontraindikuotina nėštumo metu; alergiškiems astrinių (Asteraceae) šeimos asmenims, sergantiems tuberkulioze, leukoze, išsėtine skleroze, AIDS [28].

Vaistinių augalų farmakologija yra labai sudėtinga, nes juose yra daugybė cheminių junginių veikiančių kartu. Dažniausiai yra tik nepilnos žinios apie jų biologinį pasisavinimą. Be to, gali būti, jog dalis aktyvių junginių buvo nepastebėti arba poveikis buvo priskirtas ne tam cheminiam junginiui. Dėl šių priežasčių dažnai yra sunku paaiškinti pastebėto poveikio molekulinį mechanizmą. Taip pat, kai kurie veiklieji komponentai gali veikti sinergistiškai, dėl ko dar labiau pasunkėja veikimo supratimas [20].

1.2 Fenoliniai junginiai

Fenoliniai junginiai (FJ) yra labai paplitę augalų karalystėje yra labiausiai paplitę augalų antriniai metabolitai. Šiai dienai yra žinoma daugiau kaip 8000 fenolinių struktūrų. Jie turi vieną arba daugiau aromatinį žiedą su viena ar daugiau hidroksilo grupių [7]. Nors yra labai daug FJ augaluose, tačiau dauguma yra kilę iš amino rūgščių fenilalanino arba tirozino [11]. Polifenoliai yra junginiai, kurie turi daugiau negu vieną prijungtą fenolinę hidroksilo grupę prie benzeno žiedų [9]. FJ kaip grupė dažniausiai yra randama esterių arba glikozidų pavidalų, o ne kaip laisvi junginiai. Tai yra svarbu norint išekstrahuoti fenolinius junginius iš VAŽ [9]. FJ augalams suteikia spalvą, skonį bei sveikatą skatinančias savybes [10].

Fenolinių junginių klasės [31]:  Fenolinės rūgštys  Acetofenonai  Fenilacto rūgštys  Hidroksicinamono rūgštys  Kumarinai  Naftochinonai  Ksantonai  Stilbenai  Flavonoidai  Lignanai  Ligninai

FJ pasižymi gausiomis fiziologinėmis savybėmis – priešalerginėmis, antiaterogeninėmis, priešuždegiminėmis, priešmikrobinėmis, antioksidacinėmis, prieštrombinėmis, kardioprotekcinėmis

(14)

bei kraujagysles plečiančiomis [16]. Fenoliniai junginiai gali veikti kaip antioksidantai keliai būdais. Fenolinė hidroksilo grupė yra gera vandenilio donorė: vandenilį atiduodantys antioksidantai gali reaguoti su ROS ir RNS ir nutraukti reakciją, kurios metu yra gaminami nauji radikalai [11]. FJ antioksidacinė galia taip pat aiškinama jų gebėjimu sudaryti chelatinius junginius su metalų jonais, kurie dalyvauja laisvųjų radikalų gamyboje [11]. Kitas FJ antioksidacinio veikimo būdas susijęs su geba stipriai sąveikauti su baltymais. Tai leidžia inhibuoti fermentus, kurie dalyvauja radikalų gamyboje (lipooksigenazės, ciklooksigenazės) [7].

Augalų polifenoliniai junginiai atkreipia vis daugiau dėmesio, dėl stiprių antioksidacinių savybių bei reikšmingo poveikio įvairių ligų, susijusių su oksidaciniu stresu, prevencijai. Pastaruosius kelis metus fenolinių junginių ar jų ekstraktų identifikacija bei vystymasis tapo labai svarbia su sveikata ir medicina susijusių tyrimų sritimi [7].

1.3 Fenolinių junginių ekstrakcija

Aktyvių cheminių medžiagų ekstrakcija iš natūralių produktų yra viena svarbiausių farmacijos bei cheminių medžiagų pramonės tyrimų sričių [17]. Fenoliniai junginiai gali būti ekstrahuojami iš šviežių, šaldytų arba išdžiovintų augalo mėginių. Yra žinoma, jog ekstrakcijos išeiga priklauso nuo tirpiklių tipo, ekstrakcijos laiko bei temperatūros, mėginio ir tirpiklio santykio, mėginio cheminės sudėties bei fizikinių savybių. Šios ekstrakcijos sąlygos yra vienas geriausių būdų pagerinti antioksidantų gavimo efektingumą iš natūralių šaltinių [36]. Ekstrahavimo procesas labai sudėtingas, ir tik tinkamai derinant visus jį veikiančius veiksnius, galima šį procesą veiksmingai atlikti [35]. Vaistinė augalinė žaliava (VAŽ) gali turėti nuo paprastų (fenolinės rūgštys) iki labai polimerizuotų fenolinių junginių (taninai). Priklausomai nuo ekstrakcijai pasirinkto tirpiklio, ekstrakte bus fenolinių junginių, kurie tirpsta tirpiklyje, mišinys. Taip pat ekstrakte gali būti nefenolinių junginių, pavyzdžiui cukrai, organinės rūgštys bei riebalai. Tinkamo tirpiklio pasirinkimas yra labai svarbus veiksnys, nuo kurio priklauso išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis. FJ išekstrahavimas priklauso nuo trukmės bei temperatūros, kas atspindi priešingus poveikius – pagerėja tirpumas, tačiau gali įvykti degradacija, dėl oksidacijos. Temperatūros padidinimas gali padidinti analizuojamos medžiagos tirpumą, taip pat sumažina klampumą ir paviršiaus įtempimą. To pasekoje, geriau bei greičiau vyksta ekstrakcija. Tačiau dauguma fenolinių junginių lengvai hidrolizuojasi ir oksiduojasi. Ilgi ekstrakcijos laikai ir didelės temperatūros padidina FJ oksidacijos galimybes, dėl ko sumažėja FJ išeiga ekstrakte [7].

Maceracija – pats seniausias, paprasčiausias ir ilgą laiką buvo pagrindinis ekstrakcijos metodas. Klasikinė, daugelyje farmakopėjų aprašyta maceracija atliekama taip: išdžiovinta atitinkamai susmulkinta augalinė žaliava dedama į sandariai uždaromą indą ir užpilamas apskaičiuotas kiekis ekstrahento. Sandariai uždarius ir kas dieną daug kartų sumaišant laikoma, esant kambario

(15)

temperatūrai (15-25ºC – Ph. Eur.) 5-7 paras (jei techninėje dokumentacijoje nenurodyta kita trukmė). Paskui ištrauka nupilama, kita žaliava presuojama (slegiama), išplaunama nedideliu kiekiu švaraus tirpiklio ir vėl slegiama (presuojama). Sujungus presuotas ir nupiltas ištraukas, jos laikomos 5-7 paras vėsioje vietoje 5-15ºC, atsižvelgiant į gaminamos tinktūros reikalavimus. Po to (jei reikia) iki nustatyto tūrio pripilama ekstrahento [35]. Daugiau paplitę vadinamieji dinaminės maceracijos metodai:

 Cirkuliacinė maceracija (iš apatinės maceratoriaus dalies susidariusi ištrauka periodiškai nupilama ir vėl užpilama ant žaliavos iš viršaus);

 Frakcinė, arba daugkartinė, maceracija (ekstrahentas padalijamas į kelias porcijas, kuriomis žaliava užpilama kelis kartus);

 Ultragarsinė maceracija (žaliavos ir ekstrahento mišinys veikiamas ultragarsu)[35].

Perkoliacijos metodo esmė – pro ekstrahuojamos žaliavos sluoksnį tam tikru greičiu košiamas ekstrahentas. Tuo metu ištirpsta ir difunduoja iš žaliavos į tirpiklį ekstrakcinės medžiagos. Metodas pranašesnis negu maceracijos, nes žaliava nuolat plaunama vis naujomis tirpiklio porcijomis, ir šitaip palaikomas didelis koncentracijos skirtumas, sudaromos palankios intensyvios difuzijos ir visiško žaliavos ekstrahavimo sąlygos. Ekstrahuojama žaliava nejuda, o juda sotusis ekstrahuotų medžiagų ekstrahento srautas. Gauta ištrauka koncentruojama vakuuminiu garinimo aparatu [35].

Tradiciniai ekstrakcijos metodai, tokie kaip maceracija ir Soksleto ekstrakcija, yra mažiau efektyvūs bei potencialiai labiau teršia gamtą, dėl naudojamų didelių organinių tirpiklių kiekių bei ilgos ekstrakcijos trukmės [7]. Soksleto ekstrakcija dažniausiai yra atliekama 90º C keletą valandų, o maceracija atliekama kelias dienas, kambario temperatūroje. Dėl šių problemų susijusių su tradiciniais ekstrakcijos metodais, iškilo alternatyvių ekstrakcijos metodų paklausa [29].

Ultragarsinė ekstrakcija yra naudinga technologija, nes nereikalauja sudėtingos įrangos ir atlikimas kainuoja sąlyginai mažai. Ultragarsas pagerina ekstrakciją, nes, sklindant garso bangai, susidaro dujų burbuliukai. Jų sprogimas gali sukelti fizinį, cheminį bei mechaninį efektus, kurie pasireiškia biologinės membranos plyšimu. Dėl ko pagerėja ekstrahuojamų junginių išskyrimas bei tirpiklio patekimas į ląsteles. Pastaruoju metu UE pradėta plačiai naudoti fenolinių junginių ekstrakcijai iš įvairių augalo dalių. Palyginamasis tyrimas parodė, jog UE sukėlė mažesnę FJ degradaciją bei užtruko mažiau laiko ekstrahuojant FJ iš braškių, lyginant su kitais ekstrakcijos metodais [7]. Lyginant su ekstrakcija mikrobangų pagalba UE yra lengvesnė bei užtrunka mažiau laiko. Taip pat UE yra neribojama naudojamo tirpiklio bei matricos tipo, ar drėgmės kiekio [23]. Be viso to UE gali būti sujungta su kitais ekstrakcijos metodais. Taip būtų gaunami grynesni produktai [17].

(16)

1.4 Ekstraktai

Ekstraktai yra kietos, skystos ar tirštos (tarpinės) konsistencijos preparatai, dažniausiai gaminami iš išdžiovintos (sausos) augalinės ar gyvūninės kilmės medžiagos [34]. Ekstraktai paruošiami maceravimo ar kitais tinkamais, įteisintais metodais, vartojant etanolį ar atitinkamą tirpiklį. Gamybos metu ekstrahentas (prireikus) iš dalies arba visas išgarinamas. Po ekstrahavimo, jei būtina, pašalinamos priemaišos [35]. Ekstraktai iš VAŽ dažniausiai yra ruošiami ekstrakcijos tirpikliu metodu. Tai yra dėl lengvo naudojimo, efektyvumo bei plataus pritaikymo [7].

Ekstraktai klasifikuojami įvairiai, pvz., atsižvelgiant į konsistenciją, klasifikuojami taip: 1) Extracta fluida, - skystieji ekstraktai.

2) Extracta spissa – tirštieji ekstraktai. 3) Extracta sicca – sausieji ekstraktai.

4) Extracta tenua s. mollia – pusiau tirštieji (pusiau skystieji) ekstraktai, turintys daugiau kaip 30% drėgmės [35].

Ekstraktai, kaip ir daugelis ekstrakcinių preparatų, gaminami atsižvelgiant į tipišką technologinę schemą: pirmoji stadija – ekstrakcija, antroji – išvalymas, trečioji (beveik vien tik tirštųjų, pusiau skystų bei sausų ekstraktų) – sutirštinimas (ir/ar džiovinimas – sausųjų), ketvirtoji – tyrimai [35].

Ekstrahuojant žaliavą dažnai vartojamas įvairios koncentracijos etanolis, vanduo, rečiau – eteris bei kiti ekstrahentai. Gaminant skystuosius ekstraktus, ištraukos išvalomos tokiais pačiais būdais, kaip ir gaminant tinktūras: nusodinimas vėsioje vietoje, dekantavimas ir filtravimas. Visi ekstraktai turi būti laikomi hermetiškai uždarytuose induose, tamsioje vietoje, oranžinio stiklo buteliukuose, esant 12-15 ºC temperatūrai [35].

1.5 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas

Laisvieji radikalai atstovauja reaktyvias chemines formas, turinčias nesuporuotą elektroną išorinėje orbitoje. Svarbiausia endogeninė laisvųjų radikalų gamybos vieta yra mitochondrijos [12]. ROS laisvieji radikalai yra superoksido anijonas (O2-), peroksilo radikalas (HOO•), hidroksilo radikalas (•OH), azoto oksido radikalas (NO•) ir vandenilio peroksido (H2O2) radikalas. RNS laisvasis radikalas yra peroksinitritas (ONOO-), kuris susidaro O2- reaguojant su azoto oksidu (NO) [8,12].

Laisvieji radikalai yra gaminami aerobinių procesų, tokių kaip ląstelinis kvėpavimas, mikrobinės infekcijos, kai aktyvuojami fagocitai, bei didelių fizinių krūvių metu, patiriant UV radiaciją, esant teršalų/toksinų poveikiui (rūkymas, alkoholis, pesticidai ir kt.). Nedideliais kiekiais ROS atlieka signalo perdavimo molekulių, kurios dalyvauja ląstelių proliferacijoje, apoptozėje bei

(17)

genų ekspresijoje, vaidmenį. Reaktyvios deguonies formos moduliuoja visų biomolekulių rūšių veiklą ir paveikia beveik visus ląstelės substratus [8].

Oksidacinis stresas yra apibrėžiamas kaip perteklinė reaktyvių deguonies formų (ROS) ir reaktyvių azoto formų (RNS) gamyba ar buvimas, kurios negali neutralizuoti antioksidantai. Žinomi šie pagrindiniai endogeniniai (vidiniai) ROS susidarymo būdai: vienelektroninė redukcija mitochondrijų kvėpavimo grandinėje; nefermentinės Fentono bei Haberio ir Weiso reakcijos dalyvaujant geležies ir vario jonams, kai susidaro ypač toksiškas hidroksilo radikalas; sąveikaujant su ksenobiotikais endoplazminiame tinkle aktyvinamas citochromas P450; oksidacinis pliūpsnis fagocitinėse ląstelėse. Oksidaciniu pliūpsniu vadinamas staigus ROS susidarymas imuninėse ląstelėse (makrofaguose ir neutrofiluose), joms sąveikaujant su mikroorganizmais. Šiame procese dėl sąveikos su patogenu aktyvinamas fermentas NADPH oksidazė, kuris didina superoksido anijono gamybą, o tai lemia kitų ROS susidarymą [30]. Laisvieji radikalai gali būti gaminami nefermentinių reakcijų metu, kai jungiasi deguonis su organiniais junginiais, arba inicijuotos jonizuojančios radiacijos [22]. Oksidacinis stresas kyla dėl padidėjusios ROS/RNS gamybos arba dėl sumažėjusių antioksidantų gynybinių galimybių [12]. Dėl to gali įvykti oksidaciniai DNR, baltymų bei lipidų pažeidimai, kurie galiausiai priveda prie lėtinių ligų. [21] Buvo nustatyta, jog oksidacinis stresas yra susijęs su daugiau negu 100 ligų, kaip to priežastis ar pasekmė. Tarp jų yra ir širdies ir kraujagyslių (aterosklerozė, insultas), uždegiminės, neurodegeneracinės ligos (Parkinsonas, Alzhaimeris), vėžys, kepenų funkcijos sutrikimai, plaučių ligos (astma, plaučių vėžys), akių ligos (katarakta), reprodukcinės sistemos ligos, odos ligos, cukrinis diabetas bei senėjimas [8, 13].

Minėtų ligų vystymąsi lemia tai, kad ląstelių DNR, baltymai ir lipidai yra jautrūs laisviesiems radikalams, kurie, sąveikaudami su šiomis makromolekulėmis ląstelėse, keičia jų cheminę struktūrą bei funkcijas. Baltymų oksidacija gali lemti baltymų inaktyvinimą, fragmentaciją, agregaciją, sąsiuvų (angl. cross-linking) formavimąsi. Mitochondrijų membranų lipidų peroksidacija keičia membranų laidumą. Ypač jautrus peroksidacijai išorinės mitochondrijų membranos lipidas kardiolipinas. Dėl jo peroksidacijos nuo išorinės mitochondrijų membranos disocijuoja citochromas c, dėl to aktyvinama kaspazių kaskada ir apoptozė, taigi mažėja ATP susidarymas mitochondrijose. Be to, lipidų peroksidacijos produktai gali sąveikauti su baltymais ir DNR, pažeisdami šias struktūras. Dėl DNR pažaidų koduojamuose baltymuose atsiranda pokyčių, o tai gali lemti sutrikusią baltymų funkciją arba visišką jų inaktyvinimą [30].

1.6 Antioksidacinis aktyvumas

Laisvųjų radikalų poveikis organizmams privertė išsivystyti eilę gynybinių mechanizmų. Biologiniai antioksidantai bendrai aiškinami kaip bet koks junginys, kuris padeda atitolinti arba visai

(18)

išvengti substrato oksidacijos [14]. Kai antioksidantas sunaikina laisvąjį radikalą, jis tampa oksiduotas. Dėl to antioksidantų atsargos turi būti nuolat atnaujinamos. Nors vienoje sistemoje antioksidantas yra veiksmingas prieš laisvuosius radikalus, kitoje tas pats antioksidantas gali būti neefektyvus [22]. Antioksidantų funkcijos yra susijusios su oksidacinio streso, DNR mutacijų, piktybinių transformacijų, bei ląstelių pažeidimų mažinimo. Antioksidantų funkcija yra sulaikyti ROS/RNS atsiradimą bei užblokuoti laisvųjų radikalų susiformavimą. Kita svarbi funkcija yra ląstelių taisymas/atkūrimas, kurios metu pažeista biomolekulė yra pašalinama prieš atsirandant ląstelės metabolizmo pokyčių [14]. Antioksidantai yra skirstomi į dvi grupes: endogeninius ir egzogeninius [21].

Endogeniniai antioksidantai yra pagaminami organizme, metabolizmo metu [22]. Jie būna nefermentiniai (gliutationas, bilirubinas, tioliai, albuminai ir kiti.) bei fermentiniai (katalazė, superoksido dismutazė (SOD), glutationo peroksidazė) [15]. SOD katalizuoja greitą superoksido radikalų vertimą vandenilio peroksidu citozolyje ir mitochondrijose. Tiek katalazės, tiek glutationo peroksidazės fermentinės sistemos susidariusį vandenilio peroksidą nukenksmina paversdamos vandeniu. Svarbu paminėti, kad mikroelementas selenas (Se) yra svarbus biologinis antioksidantas, apsaugantis nuo oksidacinio streso sukeliamų pažaidų. Se gali padidinti viduląstelinį antioksidacinės sistemos pajėgumą, kadangi yra antioksidacinio fermento glutationo peroksidazės kofaktorius. Kai trūksta Se, silpnėja antioksidacinė organizmo sistema, daugėja ROS. Nepaisant to, kad mažos Se koncentracijos pasižymi apsauginėmis savybėmis, didelės Se koncentracijos veikia genotoksiškai ir kancerogeniškai [30].

Egzogeniniai antioksidantai yra junginiai, kurių pats organizmas negali pasigaminti ir yra gaunami su maistu arba papildais [22]. Šių antioksidantų yra vaisiuose, daržovėse bei kituose augaliniuose produktuose ir jie prisideda prie endogeninių antioksidantų veikimo. Yra teigiama, kad valgant maistą, kuriame yra daug antioksidantų, sveikatos būklę yra gerinama. Dėl šio teiginio yra labai domimasi natūralių produktų antioksidacine galia. Vitaminas C, vitaminas E, karotenoidai bei fenoliniai junginiai yra pagrindiniai egzogeniniai antioksidantai. Su maistu gaunami antioksidantai gali sumažinti padidėjusį oksidacinį stresą, kurio inaktyvavimui neužtenka endogeninių šaltinių [8]. Natūralūs antioksidantai (ir endogeniniai ir egzogeniniai) skirstomi į dvi klases – fermentinius bei nefermentinius [8]. Normaliomis sąlygomis yra balansas tarp endogeninių antioksidantų bei egzogeninių. Šis balansas yra svarbus išlaikant sveiką organizmą [14].

1.7 Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Rausvažiedė ežiuolė (Echinacea purpurea L.) yra populiarus tyrimų objektas dėl savo gausios naudos žmogaus sveikatai bei kaupiamų fenolinių junginių. Jų ekstrakcija ultragarsu, lyginant su tradiciniais ekstrakcijos metodais, palengvina procesą dėl įrangos paprastumo, sumažina ekstrakcijos

(19)

trukmę, pagerina išeigą bei sumažina reikalingo tirpiklio kiekį. Fenoliniai junginiai yra vieni gausiausiai paplitusių junginių augalų karalystėje ir pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Jos yra svarbios norint sumažinti bei panaikinti oksidacinį stresą. Dėl jo gali kilti daug sveikatos problemų, įskaitant vėžį, cukrinį diabetą, aterosklerozę, kataraktą, astma, reprodukcinės sistemos ligas bei tokias neurodegeneracines ligas kaip Alzhaimeris, Parkinsonas. Antioksidantai yra svarbūs norint išvengti ar palengvinti šių ligų eigą.

(20)

2. TYRIMO METODIKA

2.1 Tiriamasis objektas

Tyrimo objektas – sausa rausvažiedžių ežiuolių (Echinacea purpurea L.) žolė ir dinaminės maceracijos, naudojant ultragarsą, būdu pagamintos ištraukos. Žaliavos gamintojas A. Karvelio terapijos-fitoterapijos įmonė, Lietuva. Analizuojamieji ekstraktai pagaminti iš papildomai nesmulkintos žaliavos, kurios dalelių dydis didesnis negu 1,12mm bei iš dalelių iki 1,12mm dydžio.

2.2 Naudota aparatūra

Tyrimo eigoje buvo naudota šie prietaisai bei aparatūra:  Sietai „Retsch As 200 basic, Vokietija“,

 Analitinės svarstyklės „Axis AD510 , Lenkija“,

 Ultragarso vonelė „Ultrasonic bandelin electronic DT 156 BH, Vokietija“,  Centrifuga „Sigma 3-18 KS, Vokietija“,

 UV Spektrofotometras „UV-1800, Shimadzu, Vokietija“,  Automatinės pipetės „Pipetman gilson, Prancūzija“,  Automatinės pipetės ,,Winlab, Vokietija”,

 Automatinės pipetės ,,Eppendorf Research, Vokietija”.

2.3 Naudoti reagentai

1. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalas. Chromatografinio grynumo > 99 proc. (Sigma- Aldrich, Vokietija),

2. Etanolis 96 proc. V/V (AB “Vilniaus degtinė”, Lietuva), 3. Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Darmstadt, Vokietija),

4. Natrio karbonatas, grynumas > 99,5 proc. (Sigma-Aldrich, Vokietija),

5. Geležies chlorido heksahidratas (FeCl3×6H2O) (UAB “Eurochemicals”, Slovakija), 6. Koncentruota druskos rūgštis (37 proc.) (konc. HCl) (Sigma – Aldrich, Vokietija), 7. 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) (Sigma – Aldrich, Vokietija),

8. Natrio acetatas (Carl Roth, Vokietija) 9. Troloksas 97 proc. (Acros Organics, JAV). 10. Išgrynintasis vanduo (LSMU laboratorija).

(21)

2.4 Augalinės žaliavos dalelių dydžio nustatymas

Norint nustatyti rausvažiedės ežiuolės dalelių dydį buvo atlikta sietų analizė. 100g vaistinės augalinės žaliavos buvo persijota per sietų rinkinį su 2,0 mm, 1,6 mm, 1,12 mm, 0,71 mm, 0,450 mm angelėmis. Sijojimo laikas 15 min, amplitudė – 60 svyravimų/min. Persijojus žaliavą, nuo kiekvieno sieto nuimta neprabirusi frakcija buvo pasverta ir apskaičiuotas procentinis kiekis.

2.5 Tiriamųjų ekstraktų technologija

Rausvažiedės ežiuolės žolės ekstraktai buvo išgaunami ultragarsinės ekstrakcijos metodu, santykiu 1:10, 1:20, 1:30. Atsveriamas tikslus vaistinės augalinės žaliavos (VAŽ) kiekis – 1g, 0,5g, 0,33g ir užpilama 10ml ekstrakcijos tirpiklio. Naudoti tirpikliai – išgrynintas vanduo bei 40% (V/V) etanolis. Tokios koncentracijos etanolis pasirinktas, išanalizavus kitų mokslininkų straipsnius, kuriuose teigiama, kad 40% etanoliu išekstrahuojama daugiausia fenolinių junginių [40, 41].

Ekstrakcija atliekama skirtingomis temperatūromis: 20-25ºC, 30-35ºC arba 35-40ºC, kurios nustatomos ultragarso vonelės valdyme. Ekstrahuojama 5min., 10min. 15min. ir 30min. Ultragarso vonelės dažnis 35kHz.

Gautas ekstraktas centrifuguojamas 10min., 4700 aps/min greičiu ir perfiltruojamas per filtro popierių į tamsaus stiklo buteliuką. Jie buvo laikomi tamsioje, vėsioje vietoje.

Atliekant tyrimą buvo daroma po 2 etaloninius ekstraktus, kiekvienam VAŽ santykiui.

2.6 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometriškai, Folin-Ciocalteu metodu. Reagentas susideda iš mišinio sudaryto iš natrio molibdato, natrio volframato ir kitų reagentų. Jam sureagavus su fenoliniais junginiais, susidaro mėlyna spalva, kuri absorbuojama 765 nm bangos ilgyje [25]. Jis yra pasiūlytas kaip standartizuotas metodas maisto bei maisto papildų kokybės kontrolei ir antioksidacinės galios matavime [24].

Pagaminami darbiniai tirpalai: 7,5% vandeninis natrio karbonato tirpalas bei Fiolin-Ciocalteu reagento tirpalas su išgrynintu vandeniu santykiu 1:10.

Reakcija atlikta mėgintuvėliuose. Imama 2,5 ml Folin-Ciocalteu darbinio tirpalo, pridedama 0,5 ml tiriamojo tirpalo ir 2ml darbinio natrio karbonato tirpalo. Tirpalai laikomi 30 min, kol spalva pasikeičia iš žalsvos į mėlyną.

(22)

Spektrofotometru matuojama absorbcija 765 nm bangos ilgyje. Palyginamajame tirpale vietoje tiriamojo tirpalo pilama ekstrahento. Bendras fenolinių junginių kiekis paskaičiuotas pagal kavos rūgšties kalibracinį grafiką (R=0,9931). Koncentracija išreiškiama kavos rūgšties ekvivalentais (KRE) mg/g sausos medžiagos. Kiekvienas ekstraktas buvo analizuojamas po 3 kartus ir apskaičiuojamas vidurkis ir standartinė paklaida.

2.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu

Antioksidacinis aktyvumas (AA) yra nustatomas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) metodu. Šis metodas buvo išrastas siekiant suvienodinti antioksidacinio aktyvumo nustatymą [26]. Standartizuotas tyrimas yra labai svarbus, norint palyginti rezultatus, gautus skirtinguose laboratorijose, bei patvirtinti išvadas [27]. Nelyginis azoto atomo elektronas, esantis DPPH, yra redukuojamas, gaunant vandenilio atomą iš antioksidantų. To pasekoje yra prarandama violetinė spalva [26].

Visu pirma, ruošiama etaloninis 0,1 mM koncentracijos DPPH tirpalas. Atsveriama 0,01g DPPH radikalo ir ištirpinama 96 % (V/V) etanolyje, 250 ml matavimo kolboje. Pagamintas tirpalas paliekamas 24 h tamsioje, vėsioje vietoje. DPPH tirpalo absorbcija turi būti 1 ± 0,2.

Tiesiai į kiuvetes įpilama po 2,9 ml etaloninio DPPH tirpalo. Tada įpalama 0,1 ml tiriamojo tirpalo ir paliekama 30 min. tamsioje vietoje. Palyginamasis tirpalas daromas taip pat, tik vietoje tiriamojo tirpalo pilama tirpiklio. Antioksidacinis aktyvumas išreikštas trolokso ekvivalentu ir paskaičiuotas pagal kalibracinį grafiką (R=0,9985). Koncentracija išreiškiama trolokso ekvivalentais (TE) µg/ml. Kiekvienas ekstraktas buvo analizuojamas po 3 kartus ir apskaičiuojamas vidurkis ir standartinė paklaida.

2.8 Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu

Šiam tyrimui reikalingi standartiniai tirpalai:

1. 300 mmol/l acetatinis buferis, kurio pH 3,6 ; atsveriama 3,1g natrio acetato trihidrato, užpilama 16 ml koncentruotos acto rūgšties ir supilame į distiliuotą vandenį (iki 1 litro).

2. Atsveriami 2,4,6-tripyridyl-s-triazino (TPTZ) milteliai ir ištirpiname 40 mmol/l druskos rūgšties tirpale. Gaunamas 10 mmol/l TPTZ tirpalas

3. Ištirpinamas geležies (III) chlorido heksahidrato kiekis išgrynintame vandenyje. Gaunamas 20 mmol/l tirpalas.

(23)

FRAP darbinis reagentas ruošiamas iš 10 dalių acetatinio buferio, 1 dalies TPTZ tirpalo ir 1 dalies geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo. Šis reagentas ruošiamas naujai kiekvieną tyrimo dieną.

Tiesiai į kiuvetes įpilama po 3 ml darbinio FRAP tirpalo ir 20 μl tiriamojo tirpalo. Mišinys paliekamas tamsoje 30 min. Palyginamasis tirpalas daromas taip pat, tik vietoje tiriamojo tirpalo pilama tirpiklio. Praėjus šiam laikui, spektrofotometru matuojama mėginių absorbcija 593 nm bangos ilgyje.

Antioksidacinis aktyvumas išreikštas trolokso ekvivalentu ir paskaičiuotas pagal kalibracinį grafiką (R=0,9881). Koncentracija išreiškiama atitikmeniu trolokso koncentracijai mmol/ml. Kiekvienas ekstraktas buvo analizuojamas po 3 kartus ir apskaičiuojamas vidurkis ir standartinė paklaida.

2.9 Duomenų statistinis įvertinimas

Gauti tyrimų duomenys buvo statistiškai apdoroti, naudojant Microsoft Excel 2010 (Microsoft, JAV) programą. Apskaičiuotas rezultatų vidurkis, standartinė paklaida ir koreliacijos koefcientas. Rezultatai laikomi statistiškai patikimais, kai p<0,05.

(24)

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Augalinės žaliavos kokybės vertinimas

Analizė atlikta pagal 2.4 skyriuje nurodytą metodiką. Rausvažiedės ežiuolės žolės dalelių dydis buvo nustatomas atliekant sietų analizės testą. Gauti rezultatai pateikiami 1 lentelėje.

1 lentelė. Rausvažiedės ežiuolės žolės sietų analizės rezultatai

Atlikus tyrimą, buvo nustatyta, jog dalelių iki 1mm yra 33,55%, o dalelių didesnių negu 1mm yra 66,45%. Siekiant įvertinti dalelių dydžio įtaką išekstrahuojamam fenolinių junginių kiekiui, žaliavą padalinome iki 1,12 mm ir didesnes.

3.2 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm (1 pav.). Nustatyta, jog

didžiausi FJK kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 (p>0,05) ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo likusiomis sąlygomis ekstrahuotų mėginių (p<0,05). Mažiausi kiekiai nustatyti po 5, 10 ir 15 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

Sieto angelių dydis Svoris gramais Masės dalis (%)

2 mm 34,07 34,07 1.6 mm 14,42 14,42 1.12 mm 17,96 17,96 710 µm 15,43 15,43 450 µm 10,19 10,19 Smulkesnė už 450 µm 7,93 7,93 Iš viso 100,00

(25)

1 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12 mm

didžiausi FJK kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 (p>0,05) ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo likusiomis sąlygomis ekstrahuotų mėginių (p<0,05). Mažiausias kiekis – po 5 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p<0,05).

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(26)

didžiausi FJK kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 bei 15 min santykiu 1:20 (p>0,05). Mažiausi kiekiai – po 5 ir 10 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p>0,05).

Padidinus vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių didesnių negu 1,12 mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC bendras FJK sumažėjo 4,85 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC, gautas 8,89 proc. didesnis bendras FJK.

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm (4 pav.). Nustatyta, jog didžiausias FJK

kiekis išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 (p<0,05). Mažiausi kiekiai – ekstrahuojant 5, 10 min. santykiu 1:10 (p>0,05). 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(27)

4 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12 mm

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose 30-35ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm (5 pav.). Nustatyta, jog didžiausi FJK

kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 bei 15min santykiu 1:20 (p>0,05). Mažiausi kiekiai – po 5, 10 ir 15 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p>0,05).

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės vandeniniuose ekstraktuose pagamintuose 35-40ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12 mm (6 pav.). Nustatyta, jog didžiausi FJK

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(28)

kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 bei 15min santykiu 1:30 (p>0,05). Mažiausi kiekiai – po 5 ir 10 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p>0,05).

Padidinus vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12 mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC bendras FJK sumažėjo 0,69 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC, bendras FJK sumažėjo 6,57 proc.

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12 mm (7 pav.). Nustatyta, jog

didžiausi FJK kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 (p>0,05) ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo likusiomis sąlygomis ekstrahuotų mėginių (p<0,05). Mažiausias kiekis – po 5 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p<0,05).

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(29)

7 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12 mm

didžiausi FJK kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 15, 30 min. santykiu 1:30 (p>0,05). Mažiausi kiekiai – po 5, 10 ir 15 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p>0,05).

8 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 30-35ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12 mm

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(30)

didžiausi FJK kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 5, 15 min. santykiu 1:30 bei 30min. santykiu 1:20 (p>0,05). Mažiausi kiekiai – po 5 ir 10 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p>0,05).

9 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 35-40ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm

Padidinus etanolinių ekstraktų, pagamintų iš dalelių didesnių negu 1,12mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC bendras FJK padidėjo 3,11 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC bendras FJK padidėjo 9,47 proc.

Fenolinių junginių kiekio svyravimai galėjo kilti dėl nevienodo dalelių dydžio bei dėl to, jog skirtingose augalo dalyse kaupiamas nevienodas kiekis fenolinių junginių ir sverimo metu gali pakliūti daugiau stiebo dalių, negu lapų ir t.t.

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm (10 pav.). Nustatyta, jog didžiausi FJK

kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 (p>0,05). Mažiausi kiekiai – ekstrahuojant 5 ir 10 min. santykiu 1:10 (p>0,05). 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(31)

10 pav. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 20-25ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 30-35ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm (11 pav.). Nustatyta, jog didžiausi FJK

kiekiai išsiskiria ekstrahuojant 15, 30 min. santykiu 1:30 (p>0,05) ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo likusiomis sąlygomis ekstrahuotų mėginių (p<0,05). Mažiausias kiekis – po 5 min. ekstrakcijos santykiu 1:10 (p<0,05).

Fenolinių junginių kiekio įvairavimas rausvažiedės ežiuolės etanoliniuose ekstraktuose pagamintuose 35-40ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm (12 pav.). Nustatyta, jog didžiausias

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(32)

FJK kiekis išsiskiria ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 (p<0,05). Mažiausi kiekiai – ekstrahuojant 5, 10 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

Padidinus etanolinių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC bendras FJK padidėjo 23,40 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC bendras FJK sumažėjo 8,52 proc. Kaip minima Ma ir kt. (2008) tyrime, temperatūros didinimas, iki tam tikros ribos, pagerina ekstrakto išeigą. Tačiau didelės temperatūros nėra naudingos ultragarsiniai ekstrakcijai, nes išgaruoja tirpiklis [38].

Didžiausias FJK – 2,189 ± 0,121 mg/g KRE buvo nustatytas etanoliniame ekstrakte, ekstahuotame 30 min., 30-35º C temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm, VAŽ ir tirpiklio santykiu 1:30. Mažiausias FJK – 0,544 ± 0,041 mg/g KRE buvo nustatytas etanoliniame ekstrakte, pagamintame 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm, VAŽ ir tirpiklio santykiu 1:10.

Dalelių dydis turėjo nežymų poveikį bendram FJK – etanoliniuose ekstraktuose su dalelėmis iki 1,12 mm vidutiniškai buvo 2,31 % daugiau fenolinių junginių, o vandeniniuose ekstraktuose su dalelėmis iki 1,12 mm buvo 3,25 % mažiau fenolinių junginių. Kaip buvo minima Muhammad Kamran Khan ir kt. (2010) mažesnių dalelių dydis galėjo turėti šiek tiek mažesnę išeigą dėl to, kad dalelės galėjo likti tirpiklio viršuje ir dėl to būtų ribojamas ultragarso poveikis joms [32].

Bendram fenolinių junginių kiekiui didelės įtakos turėjo tirpiklis – etanoliniuose ekstraktuose buvo 13,65% daugiau FJ. Didesnė išeiga ekstrahuojant etanoliu taip pat buvo pastebėti Leandro Galvan d’Alessandro ir kt. (2012). Jų tyrimo metu buvo nustatyta, kad didesnė FJ išeiga gauta su 50% etanoliu, negu su grynu vandeniu [33].

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 1:10 1:20 1:30 K o n c. (m g/ g KRE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(33)

Didžiausias FJK vidurkis buvo gautas esant mažesniam (1:30) VAŽ ir tirpiklio santykiui. Pakeitus santykį iš 1:10 į 1:20 FJK vidurkis išaugo 32,42 proc. Dar pakeitus santykį iš 1:20 į 1:30 FJK vidurkis dar padidėjo 7,88 proc. Panašūs rezultatai buvo gauti ir Leandro Galvan d’Alessandro ir kt. (2012) tyrimo metu. Jie pastebėjo, jog geriausia išeiga gauta esant tirpiklio ir VAŽ santykiui tarp 1:20 ir 1:40 [33].

Didinant ekstrakcijos laiką, didėja ir bendras FJK. Padidinus ekstrakcijos laiką nuo 5min iki 10min FJK padidėjo 9,51 proc. Dar 5 min. padidinus ekstrakcijos trukmę, iki 15 min. FJK padidėjo 8,48 proc. Pailginus ekstrakciją nuo 15min. iki 30min. FJK padidėjo 13,06 proc. Panašūs rezultatai buvo gauti ir Yang ir kt. (2008) tyrimo metu. Jie pastebėjo, jog esant nedidelei ultragarso galiai, ekstrakcijos laiko didinimas padidina gautą išeigą [37].

3.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu

Rausvažiedės ežiuolės vandeninių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu (13 pav.). Nustatyta, jog

didžiausią antioksidacinį aktyvumą (AA) turi ekstraktas gautas ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 - 347,071 ± 31,370 µg/ml TE (p<0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 10 min. santykiu 1:10 – 131,378 ± 6,212 µg/ml TE (p<0,05).

13 pav. Rausvažiedės ežiuolės vandeninių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu

Rausvažiedės ežiuolės vandeninių ekstraktų pagamintų 30-35ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu (14 pav.). Nustatyta, jog

0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(34)

didžiausią AA turi ekstraktas gautas ekstrahuojant 15 min. santykiu 1:20 bei 30 min. santykiu 1:20 ir 1:30 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5 ir 10 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

Rausvažiedės ežiuolės vandeninių ekstraktų pagamintų 35-40º C temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu (15 pav.). Nustatyta, jog

didžiausią AA turi ekstraktas gautas ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:20 - 250,717 ± 12,624 µg/ml TE (p<0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5 min. santykiu 1:10 – 87,776 ± 5,145 µg/ml TE (p<0,05). 0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(35)

Padidinus vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių didesnių negu 1,12mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC AA sumažėjo 34,17 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC AA padidėjo 0,65 proc.

Nustatyta vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių didesnių negu 1,12mm, AA priklausomybė nuo BFJK. Koreliacijos koeficientas yra 0,79 – stipri priklausomybė.

Rausvažiedės ežiuolės vandeninių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu (16 pav.). Nustatyta, jog didžiausią AA turi

ekstraktas gautas ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 - 117,226 ± 17,324 µg/ml TE (p<0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5 min. santykiu 1:10 – 40,868 ± 1,419 µg/ml TE (p<0,05).

16 pav. Rausvažiedės ežiuolės vandeninių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu

ekstraktas gautas ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 ir 1:20 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5 ir 10 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000 140.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(36)

ekstraktas gautas ekstrahuojant 15, 30 min. santykiu 1:20 ir 1:30 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5 min. santykiu 1:10 – 56,335 ± 2,388 µg/ml TE (p<0,05).

0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000 140.000 160.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000 140.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(37)

Padidinus vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC AA padidėjo 13,49 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC AA padidėjo 4,57 proc.

Nustatyta vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12mm, AA priklausomybė nuo BFJK. Koreliacijos koeficientas yra 0,78 – stipri priklausomybė.

Rausvažiedės ežiuolės etanolinių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu (19 pav.). Nustatyta, jog

didžiausią AA turi ekstraktas gautas ekstrahuojant 30 min. santykiu 1:30 - 378,258 ± 53,841 µg/ml TE (p<0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5, 10 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

19 pav. Rausvažiedės ežiuolės etanolinių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu

didžiausią AA turi ekstraktas gautas ekstrahuojant 5 min santykiu 1:20 bei 5, 10, 30 min. santykiu 1:30 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5, 10, 15 ir 30 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 450.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(38)

didžiausią AA turi ekstraktas gautas ekstrahuojant 15, 30 min. santykiu 1:30 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5 ir 10 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 450.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(39)

Padidinus etanolinių ekstraktų, pagamintų iš dalelių didesnių negu 1,12mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC AA padidėjo 33,65 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC AA sumažėjo 21,02 proc.

Nustatyta etanolinių ekstraktų, pagamintų iš dalelių didesnių negu 1,12mm, AA priklausomybė nuo BFJK. Koreliacijos koeficientas yra 0,76 – stipri priklausomybė.

Rausvažiedės ežiuolės etanolinių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu (22 pav.). Nustatyta, jog didžiausią AA turi

ekstraktas gautas ekstrahuojant 15, 30 min. santykiu 1:20 ir 1:30 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5 ir 10 min. santykiu 1:10 ir 10 min. santykiu 1:30 (p>0,05).

22 pav. Rausvažiedės ežiuolės etanolinių ekstraktų pagamintų 20-25º C temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu

ekstraktas gautas ekstrahuojant 15, 30 min. santykiu 1:30 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5, 10 ir 15 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(40)

23pav. Rausvažiedės ežiuolės etanolinių ekstraktų pagamintų 30-35ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu

ekstraktas gautas ekstrahuojant 15, 30 min. santykiu 1:30 (p>0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5, 10 ir 15 min. santykiu 1:10 (p>0,05).

24 pav. Rausvažiedės ežiuolės etanolinių ekstraktų pagamintų 35-40ºC temperatūroje iš dalelių iki 1,12mm antioksidacinis aktyvumas DPPH metodu

0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 450.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min 0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 450.000 1:10 1:20 1:30 K o n c. (µ g/ m l TE ) Santykis 5min 10min 15min 30min

(41)

Padidinus etanolinių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12mm, temperatūrą penkiais laipsniais nuo 20-25ºC iki 30-35ºC AA padidėjo 6,35 proc. Dar padidinus temperatūrą iki 35-40ºC AA padidėjo 2,56 proc.

Nustatyta etanolinių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12mm, AA priklausomybė nuo BFJK. Koreliacijos koeficientas yra 0,73 – stipri priklausomybė.

Didžiausias nustatytas AA ekstrakte yra 394,556 ± 15,352 µg/ml TE. Jis buvo ekstrahuotas etanoliu, 10 min., 30-35ºC temperatūroje, iš dalelių didesnių negu 1,12mm bei žaliavos ir tirpiklio santykiu 1:30. Mažiausias nustatytas AA ekstrakte yra 40,868 ± 1,419 µg/ml TE. Jis buvo ekstrahuotas vandeniu, 5min., 20-25ºC temperatūroje, iš dalelių iki 1,12mm bei žaliavos ir tirpiklio santykiu 1:10.

Didinant ekstrakcijos laiką, didėja ir antioksidacinis aktyvumas. Padidinus ekstrakcijos laiką nuo 5min iki 10min AA padidėjo 9,62 proc. Dar 5min. pailginus ekstrakciją iki 15min. AA padidėjo 8,00 proc. Padidinus ekstrakcijos trukmę nuo 15 min. iki 30 min. AA padidėjo 13,23 proc.

Didžiausias AA vidurkis buvo gautas esant mažesniam (1:30) VAŽ ir tirpiklio santykiui. Pakeitus santykį iš 1:10 į 1:20 AA vidurkis išaugo 37,65 proc. Dar pakeitus santykį iš 1:20 į 1:30 AA vidurkis dar padidėjo 9,61 proc.

Vandeninių ištraukų, pagamintų iš dalelių didesnių negu 1,12mm, antioksidacinis aktyvumas (AA) yra 27,24 proc. mažesnis nei etanolinių. Vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12mm, AA yra 65,87 proc. mažesnis nei etanolinių.

Etanolinių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12mm, AA yra 5,69 proc. didesnis, negu pagamintų iš didesnių dalelių. Vandeninių ekstraktų, pagamintų iš dalelių iki 1,12mm, AA yra 50,26 proc. mažesnis, negu pagamintų iš didesnių dalelių.

3.4 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu

Rausvažiedės ežiuolės vandeninių ekstraktų pagamintų 20-25ºC temperatūroje iš dalelių didesnių negu 1,12mm antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu (25 pav.). Nustatyta, jog

didžiausią AA turi ekstraktas gautas ekstrahuojant 10 min. santykiu 1:30 - 50,367 ± 3,767 mmol/ml TE (p<0,05). Mažiausias aktyvumas – ekstrahuojant 5, 10, 15 min. santykiu 1:10 (p>0,05).