LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
GIEDRĖ TAUTKEVIČIENĖ
IZATINO STRUKTŪRĄ TURINČIŲ JUNGINIŲ SINTEZĖ, ANALIZĖ IR JŲ METABOLITŲ POKYČIOVEIKIANTS. AUREUSTYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
prof. dr. Hiliaras Rodovičius
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 PADĖKA ... 6 SANTRUMPOS ... 7 SĄVOKOS ... 9 ĮVADAS ... 10DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
1.1. Staphylococcus aureus rezistensiškumas Europoje ... 12
1.2. S. aureus purinų biosintezė ... 14
1.3. Purinų biosintezės fermentai ... 15
1.4. N5-CAIR sintetazės taikinys ... 16
1.5. Izatino junginių biologinis aktyvumas ... 16
1.6. Metabolominio pokyčio tyrimas ... 19
1.7. Skysčių chromatografija ir masių spektrometrija (SC/MS)... 20
1.8. Tandeminė masių spektrometrija (MS/MS) ... 21
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 22
2.1. Sintezės metodikos ... 22 2.2. Analizės metodai ... 26 2.2.1. IR spektroskopija ... 26 2.2.2. UV spektroskopija ... 26 2.2.3. SC-MS spektrometrija ... 26 2.2.4. Lydymosi temperatūra ... 28
2.3. Metabolitų pokyčio nustatymas ... 28
2.3.1. Mėginių koncentracija ... 28
2.3.2. Bakterijų kultūros paruošimas ... 29
2.3.3. Tiriamųjų junginių paruošimas metabolominiui tyrimui ... 29
2.3.4. Metabolitų pokyčio tyrimo vertinimas SC-MS ... 29
2.4.1. Baltymo struktūros parinkimas ir paruošimas darbui ... 31
2.4.2. Ligandų modeliavimas ir paruošimas darbui ... 31
2.4.3. Numanomo aktyvumo nustatymas ... 31
3. Rezultatai ir jų aptarimas ... 32
3.1. Junginių sintezės rezultatai... 32
3.2 Junginių analizės rezultatai ... 32
3.2.1.IR spektroskopijos rezultatai ... 32
3.2.2. UV spektroskopijos rezultatai ... 37
3.2.3. SC-MS rezultatai ... 38
3.3. Metabolitų pokyčio tyrimo rezultatai ... 40
3.4. In silico tyrimo rezultatai ... 50
4. IŠVADOS ... 53
5. REKOMENDACIJOS ... 54
6. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 55 PRIEDAI ... Error! Bookmark not defined.
SANTRAUKA
G. Tautkevičienės magistro baigiamojo darbo tema„Izatino struktūrą turinčių junginių sintezė, analizė ir jų metabolitų pokyčio veikiant S. aureus tyrimas“. Mokslinis vadovas prof. dr. H. Rodovičius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas:atlikti izatino struktūrą turinčių junginių metabolitų pokyčio tyrimus veikiant S. aureus.
Tyrimo uţdaviniai:
1. Atlikti pasirinktų izatino darinių sintezę.
2. Nustatyti gautų junginių tapatybę ir fiziko-chemines savybes.
3. Atlikti sintetintų junginių metabolitų pokyčio tyrimąveikiantS. aureus. 4. Atlikti gautų junginių in silicotyrimą.
Tyrimo metodai:.junginių sintezė atlikta vykdant modifikacijas izatino žiedo 1-oje, 3-oje ir
5-oje padėtyse. Sintetintų junginių struktūra įrodyta ultravioletinės (UV)infraraudonosios (IR)spinduliuotės ir masių spektrometrijos metodais. Grynumas nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija (ESC-MS)metodu. Lydymosi temperatūra nustatyta Koflerio prietaisu.In silico tyrimai atlikti panaudojant Schrodinger programinį paketą.
Tyrimo rezultatai:Susintetintų junginių grynumas yra 90-95 %. Ištirtas sintetintų junginių
metabolitų pokytis veikiantS. aureus. Nustatytas, kad 94 % junginių mažino guanino kiekį lyginant su kontrole. Metiladenino kiekį sumažina 88 % junginių lyginant su kontrole. 55 % junginių padidina dTDP kiekį lyginant su kontrole. Atlikus in silico tyrimą nustatyta, potencialus slopinimo mechanizmas. Sintetinti junginiai sąveikauja su baltymo aktyviojo centro Tyr, Arg, Lys aminorūgštimis.
Tyrimo išvados:Atlikta 16 izatino ir 1 indazolo junginių sintezė. Nustatyta, kad veikiant 1 ir I-12 junginiais ženkliai (10,6 karto) sumažėjo guanino kiekis lyginat su kontrole. Veikiant I-14 junginiu
nustatytas ženklus metiladenino kiekio sumažinimas lyginant su kontrole. Nustatyta, kad junginiai I-8 ir
I-18ženkliai padidina dTDP kiekį lyginant su kontrole. Atlikus in silico tyrimą stipriausia sąveika
nustatyta tarp baltymo ir junginių I-5 ir I-9.
Tyrimo rekomendacijos: atlikti detalesnius metabolitų pokyčių tyrimus, identifikuojant visų
SUMMARY
Master thesis of Giedrė Tautkevičienė „Synthesis, analysis and change of metabolomics profile analysis against S. aureusof isatin derivatives“. Tutor: Hiliaras Rodovičius, professor, Ph.D. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug chemistry.
Aim of study: to perform synthesis of 1st, 3rd and 5th substituted isatin compounds and identify it metabolomic profileagainstS. aureus.
Study objectives:
1. To synthesize selected isatin derivatives.
2. To determine compounds structure and physico-chemical properties. 3. Identify synthesize compounds metabolomic profile against S. aureus. 4.Render compounds in silico screening.
Study methods:synthesis of compounds was done by modifying 1st,3rd and 5th positions of isatin ring. The identity of compounds was confirmed by means of UV, IR and MS spectral data. Purity analysis was performed LC-MS method. Melting points were determined by using Kofler bench.In silicostudies was done using Schrodinger program.
Study results:purity of the synthesized compounds is 90-95%. The metabolitic change of the
synthesized compounds to S. aureus was analized. It was found that 94% of the compounds reduced the amount of guanine compared to the control. Metiladenin reduces 88% quantity of the compound compared to the control. 55 % of the compounds increases the amount of dTDP compered to the control. The in silico study provides a potential mechanism of inhibition. Synthetic compounds interact with the active center of the protein Tyr, Arg , Lys amino acids
Conclusions:Successfully performed the synthesis of 16 isatin and 1 indazole compounds. It was
found that in compounds I -1 and I-12 the reduction of guanine was significant (10,6 times) compared to the control. I-14 compounds reduction of guanine was significant compared to the control. I -8 and I-18 compounds significant dTDP quantity increase compared to the control. After in silico test the strongest interaction between the protein and the compound was in I- 5 and I -9.
Recomendations: do more in depth metabolomic change research, identifying all metabolits
PADĖKA
Dėkoju savo darbo vadovui prof. dr. Hiliarui Rodovičiui už galimybę atlikti magistro baigiamąjį darbą vaistų chemijos katedroje.
Dėkoju LSMU FF Vaistų chemijos katedros asistentui: Liudui Šlepikui už pagalbą ir patarimus vykdant eksperimentinę dalį bei rašant magistro baigiamąjį darbą.
Dėkoju LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto prof. Alvydui
Povilioniui už suteiktą pagalbą atlikti tyrimus su S. aureus bei konsultaciją mikrobiologiniais klausimais.
Dėkoju LSMU FF Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskuiir doktorantuiMindaugui Marksaiuž pagalbąbei konsultaciją analitiniais klausimais.
SANTRUMPOS
AIR – aminoimidazolo ribonukleotidas
AMP- adenozinmono fosfatas
Arg – arginino aminorūgštis
ATP - Adenozin 5' trifosfatas
BMR – branduolių magnetinis rezonansas
CAIR – 4-karboksi-5-amino imidazolo nukleotidas
Da - daltonai
DMF - dimetilformamidas
DMSO – dimetilformamidas
dTDP - deoksitimidindifosfatas
ESI – elektro purkštuvinė jonizacija
FAB – greitas atomų bombordavimas
FGAM - N-formilglicinamidino ribonukleotidas
FGAR – N-formilglicinamido ribonukleotidas
GAR – glicinamido ribonuleotidas
GTP – guanozin-5'-trifosfatas
HTS – aukšto našumo tyrimas
IMP – inozitolmonofosfatas
IR – infraraudonoji spinduliuotė
Lys – lizino aminorūgštis
MRSA – meticilinui atsparus S. aureus
m/z – masės-krūvio santykis
PRA – 5-fosfo-D-ribosilaminas
PRPP - fosforiboziltransferazės pirofosfatas
PurB – SAICAIR liazė
PurC – N-sukcinilo 5-aminoimidazolil-4-karboksamido ribonukleotido sintetazė
PurD – glicinamido ribonukleotido (GAR) sintetazė
PurE - aminoimidazolo ribonukleotido (AIR) karboksilazė (II klasė)
PurF – amidofosforiboziltransferazė
PurH – 5-aminoimidazolo-4-karboksamido ribonukleotido (AICAIR) transformilazė
PurJ – inozino monofosfato (IMP) ciklohidrolazė
PurL - formilglicinamido ribonukleotido (FGAR) sintetazė
PurM – aminoimidazolo ribonukleotido (AIR) sintetazė
PurN - glicinamido ribonukleotido (GAR) transformilazė
PurO - inozino monofosfato (IMP) ciklohidrolazė (prokariotų)
PurP –flavino 5-aminoimidazolo-4-karboksamido ribonukleotido (AICAIR) sintetazė (prokariotų)
PurT – formilglicinamido ribonukleotido (FGAR) sintetazė (prokariotų)
SAICAIR – sukcino 5-aminoimidazolo-4-karboksamido ribonukleotidas
SC – skysčių chromatografija
SC-MS – skysčių chromatografija – masių spektrometrija
Tyr – tirozino aminorūgštis
THF – tetrahidrofuranas
UATR (Single Reflection Diamond) – vienvietis reflekcijos deimantas.
SĄVOKOS
Aktyvusis centras – nedidelis regionas baltymo struktūroje, ties kuria gali prisijungti substrato molekulė (ligandas) ir sukelia specifinį poveikį.
„De novo“ purino nukleotidų sintezė – purino bazės sintezė iš mažos molekulinės masės pirmtakų – sacharidų ir baltymų apykaitos produktų: glicino, aspartato, glutamino, formiltetrahidrofolio rūgšties (formil-THFR) ir CO2.
Elektronų akceptorinė grupė –atomų grupė, prisijungianti elektronus ir sudaranti cheminę jungtį, tam panaudodama laisvą orbitalę ir donoro laisvą elektronų porą.
Koflerio prietaisas – prietaisas, skirtas junginių lydymosi temperatūrai nustatyti.
Ligandas – molekulė ar jonas, susijungęs su baltymo molekule.
Metabolitas – medžiagų apykaitos produktas.
Nukleofilinė substitucija –cheminių reakcijų klasė, kuomet neigiamą ar dalinai neigiamą krūvį turinti molekulė atakuoja teigiamą ar dalinai teigiamą krūvį turinčią molekulę.
ĮVADAS
Atsižvelgiant į 2007 – 2010 m. Europos ligų prevencijos ir kontrolės centro (European Centre for Disease Prevention and Control) duomenis Staphylococcus aureus (S.aureus) atsparumas meticilinui (MRSA) aštuoniose valstybėse iš dvidešimt aštuonių Europos valstybių viršija 25 %[1]. S. aureus atsparumas apsunkina gydymą ir padidina mirtingumą dėl padidėjusio toksiškumo ir nepakankamai efektyvaus alternatyvaus gydymo būdo[2]. Tai yra opi visuomenės sveikatos problema.
Viena iš strategijų ieškant biologiškai aktyvių junginių pasižyminčiu priešmikrobiniu aktyvumu yra baltymo taikinio paieška. Atlikus tyrimus su N5-CAIR sintetaze nustatyta, kad šis fermentas yra svarbus bakterijų, grybelių ir mielių organizmams. Šis fermentas dalyvaujanti purinų sintezėje [3–5]. Pašalinus N5-CAIR sintetazės geną bakterijos tampa nevirulentiškos ir negali daugintis žmonių ar pelių kraujo serume[6–9]. N5-CAIR sintetazės gali būti potencialus taikinys, kuriant naujus antibiotikų prieš MRSA.
Viena iš biologiškai aktyvių junginių klasių – indolo. Izatinas turi indolo struktūrą ir taip pat pasižymi plačiu biologiniu poveikis (priešgrybeliniu, antivirusiniu, antibakteriniu, antituberkulioziniu, antimaliariniu, antihelmitiniu ir antiepileptiniu poveikiu bei veikia prieš pirmuonis) [10–14].
Šio tyrimo metu buvo pasirinkta izatino struktūra dėl literatūroje minimo jo galimo poveikio N5-CAIR sintetazę[15]. Susintetinti junginiai turėtų blokuoti purinų sintezę ir slopinti S.aureus dauginimąsi. Junginių sintezė buvo atliekama vykdant izatino žiedo modifikacijas 1-oje, 3-oje ir 5-oje padėtyse. Modifikacijos vykdomos taikant nukleofilinės substitucijos sintezės metodą. Junginiai gryninami kristalizacijos metodu. Susintetintų junginių struktūra nustatoma IR ir UV spektroskopijos metodais, o grynumas buvo nustatomas atlikus SC-MS tyrimą. Junginių metabolitų pokytis,veikiantS. aureus buvo tiriamas atlikus SC-MS tyrimą.
Šio tyrimo tikslas yra atlikti izatino struktūrą turinčių junginių metabolitų pokyčio tyrimus veikiantS. aureus.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas:atlikti izatino struktūrą turinčių junginių metabolitų pokyčio tyrimus veikiantS. aureus.
Darbo uţdaviniai:
1. Atlikti pasirinktų izatino darinių sintezę.
2. Nustatyti gautų junginių tapatybę ir fiziko-chemines savybes.
3. Atlikti sintetintų junginių metabolitų pokyčio tyrimusveikiantS. aureus. 4. Atlikti gautų junginių in silicotyrimą.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Staphylococcus aureus rezistensiškumas Europoje
Infekcijos, kurias sukelia daugeliui vaistų atsparios gramteigiamos bakterijos sudaro didžiąją visuomenės sveikatos problemą, ne tik kalbant apie sergamumą ir mirštamumą, bet taip pat ir padidėjusias gydymo bei prevencijos išlaidas[1,16].Daugiausiai problemų sukeliančios gramteigiamos bakterijos yra
Staphylococcus, Clostridium, Bacillus, Listeria[1].
Staphylococcus aureus (S. aureus) yra svarbus oportunistinis patogenas atsakingas už įvairias
ligas, pradedant nuo nedidelių odos iki gyvybei pavojingų sisteminių infekcijų, įskaitant endokarditą ir sepsį. Lietuvoje 2013 m. iš nustatytų visų hospitalinių infekcijų (27,7 %) dažniausias sukėlėjas buvo S.
aureus (14,4 %)[17]. Ši bakterija dažniausiai sukelia pusę visų odos ir jungiamojo audinio infekcijų, ir
taip pat yra viena pagrindinių priežasčių, dėl kurios atsiranda operacinių žaizdų infekcijos[18].
Meticilinui atsparus S. aureus (MRSA) yra viena svarbiausių priežasčių dėl antibiotikams atsparių infekcijų paplitimo visame pasaulyje. Infekcijos su MRSA pasunkina gydymą ir padidina mirtingumą, dėl padidėjusio toksiškumo ir nepakankamai efektyvaus alternatyvaus gydymo. Nustatyta, kad MRSA yra dažniausiai nustatomas antibiotikams atsparus patogenas daugelio pasaulio šalių ligoninėse, įskaitant Europą, Ameriką, Šiaurės Afriką ir Tolimuosius Rytus [2] (1 pav).
1 pav. . Meticilinui atsparių Staphylococcus aureus paplitimas 2010 m.[2]
Ţalia spalva paţymėtos valstybės, kuriose atsparumas meticilinui yra maţesnis nei 1 %, geltona –atsparumas svyruoja tarp 5 – 10 %, oranţine – atsparumas svyruoja tarp 10 – 25 %, raudona – atsparumas svyruoja tarp 25 –
50%, tamsiai raudona spalva – atsparumas didesnis nei 50 %. Pilka spalva paţymėtos valstybės, apie kurias nėra gauta duomenų, balta spalva – valstybės, kurios buvo neįtrauktos į tyrimą.
Pagal Europos ligų prevencijos ir kontrolės centro (European Centre for Disease Prevention and Control) 2010 m. duomenis S. aureus, iš kurių yra meticilinui atsparių Staphylococcus aureus proporcija nebeauga ar mažėja daugelyje Europos šalių per keturis metus (2007-210 m.) (2 pav.). Septyniose šalyse pastebėtos MRSA mažėjimo tendencijos, tačiau keturiose pastebėtas padidėjimas. Šalyse, kuriose sumažėjo MRSA yra Austrija, Kipras, Estija, Prancūzija, Airija, Latvija ir Jungtinė Karalystė. Nors pastebimi teigiami pokyčiai, tačiau MRSA išlieka visuomenės prioritetas, nes MRSA vis dar viršija 25 % aštuoniose iš dvidešimt aštuonių šalių, daugiausiai pietų ir rytų Europos regionuose[2].
2 pav. Staphylococcus aureus rezistensiškumo meticilinui pokytis Europoje 2007 – 2010 m.[2]
Šviesiai pilka spalva paţymėtos S. aureus atsparumas meticilinui valstybėse 2007 m., pilka spalva – 2008 m., tamsiai pilka – 2009m., ţalia – 2010 m.
1.2. S. aureus purinų biosintezė
Adenilatas ir guanilatas (purinai) dalyvauja daugelyje pagrindinių biologinių procesų, jie įeina į DNR ir RNR sudėtį, ląstelės energiniųjunginių ATP ir GTP biomolekulių (pvz NADH, kofermento A, ir t.t.)sudėtį [19,20]. Yra žinomi du šių nukleotidų sintezės keliai. Pirmasis yra de novo, purino biosintezės kelias.Šis kelias buvo atrastas, 1950 m. Buchanan„o ir jo kolegų, kurie parodė, kad fosforiboziltransferazės pirofosfatas (PRPP) paverčiamas inozinmonofosfatu (IMP) fermentinio 10 etapų proceso metu aukštesniųjų eukariotų organizmuose (3 pav.) [19,21,22]. IMP yra sintetinamas iš mažų molekulių tokių kaip: glicinas, glutaminas, aspartato, anglies dioksidas, N10-formil-tetrahidrofolatas, ir ribozės-5-fosfatas, kurios sudaro purino heterociklus su cukraus molekulėmis. Kai IMP yra suformuotas, IMP gali būti paverčiamas į adenozino monofosfatą (AMP) arba guanozino monofosfatą (GMP), priklausomai nuo ląstelės poreikio[19,22].
Antrasis purinų sintezės būdas: yra vadinamas gelbėjimosi keliu, kuris sintetina purino bazes susidariusias iš nukleotidų skilimo produktų. Tačiau, šiuo biosintezės keliu gaminama tik 1% arba mažiau visų pagaminamų nukleotidų DNR sintezei [23]. Todėl, de novo purino biosintezės kelias yra pagrindinis, skirtas sintetinti purino bazes, reikalingas replikacijai.
Kiekvienas nurodytas fermentas atspindi jį veikiantį geną.
Buchannan„o pateiktas purinų biosintezės kelias iš esmės liko nepakitęs iki 1990 m. atliktų tyrimų, kurių metų paaiškėjo, kad aukštesniųjų eukariotų (pvz: žmonių) purinų sintezė skiriasi nuo bakterijų, mielių ir grybelių. Tyrėjai pastebėjo, kad PurF, PurD, PurL, PurM ir PurB fermentai buvo visuose organizmuose, o PurN ar PurT, PurK / PurE (I klasė) arba PurE (II klasė), PurH arba PurP ir PurJ arba PurO ne visuose (žr. sutrumpinimų sąraše puslapyje IXI) [22].
1.3. Purinų biosintezės fermentai
Šeštoji de novo purino biosintezės pakopa yra jungties formavimosi reakcija tarp dviejų anglies atomų. PurE yra fermentas, kuris katalizuoja šį unikalų cheminį procesą ir pakeičia aminoimidazolo ribonukleotidą (AIR) 4-karboksi-5-aminoimidazolo ribonukleotidu (CAIR). Apie 30 metų buvo manoma, kad PurE fermentas yra toks pats visuose organizmuose ir buvo vadinamas AIR karboksilaze. Tačiau 1990 m. mokslininkai įrodė, kad bakterijoms, grybams ir mielėms reikia dviejų fermentų, kad konvertuotų AIR į CAIR (4 pav.).Šie mokslininkai atrado, kad PurE galėjo konvertuoti AIR į CAIR, tačiau, tik tuo atveju, jei hidrokarbonato koncentracijamažesnė nei fiziologinė. Be to PurK ir ATP paspartino CAIR gamybą esant mažesnei hidrokarbonato koncentracijai. Šie tyrimai parodė, kad PurK veikia kaip CO2 PurE gamybos sistema. Papildomi tyrimai parodė, kad PurK geba susintetinti trumpalaikius tarpinius produktus, N5-CAIR iš AIR, o PurE konvertuoti N5-CAIR į CAIR. Taigi, PurK buvo pavadintas N5-CAIR sintetaze, o PurE (I klasė) buvo pervadintas N5-CAIR mutaze. N5-CAIR sintetazės tyrimai nurodė, kad reakcija įvyko dėl suformuotos karboksifosfato tarpinės medžiagos, iš kurios atskiria anglies dioksido (CO2) molekulės. Vėliau CO2 prisijungia AIR, kad pagamintų N5-CAIR (5 pav.) [3].
Paveikslėlyje ţalia rodyklė vaizduoja kaip vyksta purinų sintezė 6-oje pakopoje bakterijų, grybelių ir mielių organizmuose. Geltona rodyklė vaizduoja purinų sintezę ţmogaus organizme.
5 pav. PurK katalizės mechanizmas [24]
Paveikslėlyje pavaizduota kaip susidaro N5-CAIR bakterijų, mielių ir grybelių organizmuose veikiant PurK fermentui.
1.4. N
5-CAIR sintetazės taikinys
N5-CAIR sintetazės yra unikalus fermentas esantis bakterijose, mielėse ir grybeliuose, bet jo nėra žmogaus organizme [3,4]. Šis fermentas vaidina svarbų vaidmenį mikrobų augime ir ligos progresavime [5]. Pašalinus N5-CAIR sintetazės genąbakterijos tampa nepatogeniškos ir negali daugintis žmogaus arba pelės serume[6–9]. Šie rezultatai patvirtina neseniai Lan ir kitų mokslininku atliktą darbą, kuris parodė, kad 6-tioguaninas gali slopinti de novo purino biosintezę ir, todėl, slopinti S. aureus virulentiškumą [25]. Tai patvirtina, kad N5-CAIR sintetazė yra potencialustaikinys, siekiant slopinti bakterijų de novo purino sintezę. Naujų,biologiškai aktyvių junginių veikiančių į baltymus, kurie yra būdingi tik prokariotams kūrimas, yra viena iš strategijų kovojant su bakterijų rezistensiškumu[26].
1.5. Izatino junginių biologinis aktyvumas
Izatinas (1H-indole-2,3-dione) (6 pav.), oksiduotas indolo darinys pirmą kartą buvo atrastas Erdmann„o ir Laurent 1840 m., kaip indigo oksidacijos produktas, naudojant azoto ir chromo rūgštį. Vėliau izatinas buvo rastas augale Isatinis genus, medžio gvianinio sviedmio (Couroupita
guianensisAubl.)vaisiuose ir Bufo varlės seilėse. Įvairūs izatino dariniai taip pat buvo identifikuoti kituose
augaluose, grybuose, simbiotinėse bakterijose ir jūrų moliuskuose[27].
Izatinasyra heterociklinės sistemos junginys, pasižymintis plačiu biologiniu aktyvumu: priešgrybeliniu, antivirusiniu, antibakteriniu, antituberkulioziniu, antimaliariniu, antihelmitiniu ir antiepileptiniu poveikiu bei veikia prieš pirmuonis[10–13,28]. Dėl savo plataus biologinio aktyvumo gali dalyvauti daugybėje sintezės reakcijų, todėl plačiai naudojamas kaip pagrindas vaistų chemijoje[11,28,29]. Dėl esančių reaktyvių centrų molekulėje, izatinasgali dalyvauti daugelyje reakcijų. Dėl keto grupių esančių 2 ir 3 pozicijose galimos prijungimo per C-O ryšį ir kondensacijos reakcijos. Taip pat dėl pirminės amino-grupės junginiai gali dalyvauti N-alikilinimo ir N-acilinimo reakcijose, ir Mannich ir Michael tipo reakcijose[29].
6 pav. Izatino struktūra
Nustatyta, kad elektronų akceptorinės grupės įvedimas į 5,6,7 padėtis indolo žiede padidina izatino antimikrobines savybes [30]. Įterpus pakaitą į 3-ią padėtį, taip pat padidėja antimikrobinis aktyvumas [14,30].
Kaip Šifo bazių junginiai reaguoja su bakterijomis, priklauso nuo molekulių struktūrų, dažniausiai junginių antibakterinis aktyvumas didėja įvedus halogeną [31]. Palyginus izatino junginių 5 padėtyje turinčių chloro, bromo ar fluoro aktyvumą su izatinu nustatyta, kad junginiai turintys halogenų pakaitus, pasižymi didesniu antimokrobiniu aktyvumu [32]. Elektronų akceptoriaus pakaitas ir nitro grupė kartu gali sustiprinti antimikrobinį poveikį. Lyginant1 ir 2junginių (7 pav.) elektronų akceptorines grupes,3-oje padėtyje esantį fenilo žiedą ir 5-oje padėtyje nitro-grupę, galima numanyti, kad padidės 2 junginio lipofilinės savybės, dėl to padidės ląstelės perėjimas per mikroorganizmų ląstelių membraną ir tai padidins antimikrobinį aktyvumą [30].
7 pav. Antibakterinių junginių struktūros [29]
Šiuo metu rinkoje yra izatino struktūra turintis antinavikinis vaistas „SU-11248“ (Sunitinib) (8 pav.). Vaistas skiriamas virškinimo trakto stromos ir kasos neuroendokrininių navikų bei metastazavusių inkstų ląstelių karcinomos gydymui. Sunitinibopasižymi tirozino kinazes slopinančiu poveikiu bei antiangiogeninėmis savybėmis[10,29].
8 pav. Sunitinibo strutūra [29]
Mičigano universitete cheminės genomikos centre (Centre of Chemical Genomics (CCG)) buvo atliktas HTS (HTS = aukšto našumo) tyrimas, kurio metu nustatė potencialius vaistus - N5-CAIR sintetazės slopiklius. Iš 14 slopiklių (HIT norma: 0,03%) su IC50 reikšmėmis mažesnėmis kaip 70 µM, 6 turėjo izatino struktūrą. Izatino klasės slopikliai pasižymi stipriu poveikiu į bakterijų N5-CAIR sintetazę (IC50 (HTS) svyruoja nuo 2,3 iki 69 µM) [15].
N5-CAIR sintetazės yra struktūriškai susijusi su fermentu acetil-KoA karboksilaze. 1990 m. buvo nustatytas nekonkurencinis vieno domeno – biotino karboksilazės slopiklis, sorafenas A (9 pav.)[33]. Vėliau Kolumbijos universiteto mokslininkai nustatė, kad kristalinė sorafeno A struktūra suriša mielių biotino karboksilazės domenus[34]. Tiriant sorafeno A struktūrą nustatyta, kad jis gali sujungti karboksilazės dimerų paviršius irmažina fermento aktyvumą slopindamas domeno oligomerizaciją. N5 -CAIR sintetazės tai pat yra dimeras. Izatino junginiai taip pat gali panašiai slopinti N5--CAIR sintetazę
kaip sorafenas A biotino karboksilazę [35]. Atlikti tyrimai rodo, kad izatino struktūrą turintys junginiai slopina N5-CAIR sintetazės veikimą, tačiau po kol kas veikimo mechanizmas dar pilnai nėra žinomas.
9 pav. Sorafeno A struktūra [35]
1.6. Metabolominio pokyčio tyrimas
Metabolizmas yra cheminių reakcijų rinkinys, kuris vyksta biologiniame organizme. Jo metu vienas metabolitas nuosekliai virsta kitu metabolitu. Šis procesas yra svarbus, kad organizmas galėtų normaliai funkcionuoti: galėtų auti, daugintis, išlaikyti savo struktūrą ir prisitaikyti prie besikeičiančios aplinkos[36].
Metabolinė analizė, biologinio organizmo metabolitų sudėtis ir jų kiekybė buvo nustatoma dar senovės Kinijoje, kur gydytojai naudodami skruzdėles nustatydavo aukštą gliukozės kiekį žmogaus šlapime ir taip pacientui diagnozuodavo cukrinį diabetą[37]. 1940 m. Roger Williams iškėlė teiginį, kad žmonės gali turėti „medžiagų apykaitos profilį“, kuris atspindi jų biologinių skysčių sudėtį. Jis naudodamas popieriaus chromatografiją, nustatydavo būdingus medžiagų apykaitos produktus šlapime ir seilėse, iš kurių buvo nustatomos tokios ligos kaip šizofrenija[38]. Tačiau toks metabolitų nustatymo būdas yra labiau kokybinis ir jo metu galima nustatyti tik kelis metabolitus.
Metabolomika yra metabolitų identifikavimas ir kiekybiškas jų įvertinimas biologinėje sistemoje. Analizuodami tūkstančius metabolitų, galima identifikuoti įvykusi metabolominį pokytį biologinėje sistemoje. Šiuo metu metabolominiai tyrimai atliekami įvairiose mokslo srityse įskaitant ir naujų biologinių žymenųir vaistų paiešką. Terminąmetabolomika sugalvojo Nicholson, siekdamas nustatyti metabolitų pokyčius kaip atsaką į patofiziologinius dirgiklius ar genetinius pokyčius[39]. Ši analizė dažniausiai atliekama naudojant branduolių magnetinį rezonansą (BMR) arba masių spektrometriją (MS).
1.7. Skysčių chromatografija ir masių spektrometrija (SC/MS)
Masių spektrometrija yra dažnai naudojama su skysčių chromatogafija tiriant metabolitų pokyčius. Kai mėginys yra injekuojamas į SC-MS prietaisą, pirmiausiai vyksta skysčių chromatografinis išskirstymas. Mėginiai yra nešami tirpalo nešėjo ir veikiami aukšto slėgio patenka į kolonėlę, kuri yra užpildyta nejudrią faze. Junginio sulaikymo laikas priklauso nuo tiriamo junginio sąveikos su nejudria fazeir nuo pasirinktų tyrimo sąlygų, todėl skirtingi cheminiai junginiai iš kolonėlės išplaunami skirtingu laiku. Po junginių išplovimo, jie yra įpurškiami į masių spektrometrą.Priklausomai nuo veikimo principo yra naudojami skirtingų tipų masių spektrometrai. Tačiau, jie visi susideda iš trijų pagrindinių komponentų: jonų šaltinio, masių analizatorius irdetektorius. Jonų šaltinis neutralų junginį paverčia krūvį turinčia molekule, jonu. Šis jonizacijos procesas gali būti atliekama skirtingais metodais, naudojant elektropurkštuvinę jonizaciją (ESI),atmosferos slėgio cheminę jonizaciją, atmosferos slėgio fotojonizaciją, greitą atomų bombardavimą (FAB), ir t.t. Dėl savo paprastumo ir plataus jonizacijos pritaikymo ESI yra viena iš populiariausių jonizacijos būdų. Jis gali jonizuoti skirtingus metabolitus su įvairiomis molekulinėmis masėmis ir skirtingais junginių poliškumais nepažeidžiant molekulių jonų identifikuojant metabolitus. Dėl skirtingų metabolitų cheminių savybių, dažnai junginius reikia analizuoti ir teigiamu ir neigiamu jonizacijos metodu, kad maksimaliai padidinti metabolizmo apimtį[37,40].
Nors SC-MS priemonė galėtų tiksliai nustatyti m/z santykį, pvz: aptiktų jonų masės tikslumas gali svyruotinuo 50 ppm iki mažiau nei 1 ppm, tačiau yra sunku susieti stebimą joną su konkrečiu metabolitu. Metabolitai turintys skirtingas elementų formules gali turėti labai panašias mases. Bet su didesne problema susiduriama, kai metabolitai turi tas pačias elementines formulės, tačiau skirtingas struktūras pvz: (10 pav.) 1-Metilguaninas, 6-O-Metilguaninas ir 7-Metilguaninas visų jų elementinė formulė yra C6H7N5O. Visi trys metabolitai sveria 165,07 Da. Tačiau, jų struktūros yra skirtingos. Naudojant tikSC-MS analizębūtųlabai sudėtinga juo identifikuoti, todėl naudojama tandeminė masių spektrometrija[40].
10 pav. Metabolitų skirtingos struktūrinės,bet vienodos molekulinės formulės
Paveikslo kairėje pusėje pateikta metilguanino molekulinė formulė, dešinėje – metilguanino galimų izomerų struktūrinės formulės.
1.8. Tandeminė masių spektrometrija (MS/MS)
Tandeminė masių spektrometrija (MS / MS) atlieka MS junginių analizę keliais etapais naudodama QTOF, QqQ ar Orbitrap technologijas. SC/MS tyrime kvadrupolinis analizatorius nukreipia jonus į masių detektorių nepriklausomai nuo jų masių, o naudojant QTOFkvadrupolinis analizatorius veikia kaip masių filtras, praleidžianti tik pasirinkto m/z santykio jonus.FragmentuotasMS/MS spektras yra ypač svarbus, leidžiantis identifikuoti metabolitus net ir turinčius tokią pačią elementinę sudėtį[40].
11 pav. Tandeminės masių spektrometrijos analizės schema.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Sintezės metodikos
Buvo susintezuoti 17 izatino junginių, prijungiant radikalus į1-ąją, 3-ąją ir 5-ąją padėtis. 18 junginys paimtas iš laboratorijoje turimų reagentų. Junginių sintezė įterpiant 1-ąją padėtį buvo vykdomas pagal O.Radul, G.Zhungietu, M. Rekhter et al. sintezės metodiką [41]. Sintezės schema pateikta 12 pav. Siekiant padidinti reakcijos išeigą, reakcijų mišiniai buvo šildomi iki 40 °C temperatūros. Perkristalinami minimaliame etilo alkoholio kiekyje. I-2 – dėl labilios nitrilo grupės, kad būtų išlaikyta pH ≈ 7 buvo įdėta 50 ml DMF, reakcijos mišinys nebuvo šildomas. Produktas perkristalinamas naudojant izopropanolio:metanolio:acetono mišinį (1:1:3). I-4 – kalio karbonato kiekis buvo naudotas dvigubai didesnis (0,06 mol), chloro jonams surišti.
X= Cl, I-1 - R= -CH2-CH=CH2; I-2 - R= -CH2CN; I-3 - R= - CH2C6H6; I-4 - R= -CH2CH2Cl;
I-5 - R= -CH2COOH.
12 pav. Junginių sintezė įvedant pakaitus į 1 padėtį Pagal nurodyta reakcijos schemą buvo gauti junginiai:
I-1 1-(PROP-2-EN-1-IL)-1H-INDOL-2,3-DIONAS. Raudonos spalvos kristalai, išeiga 60 %,
lydymosi temperatūra 86-88 °C.
I-2 (2,3-DIOKSO-2,3-DIHIDRO-1H-INDOL-1-IL)ACETONITRILAS. Geltonos spalvos
milteliai, išeiga 41 %, lydymosi temperatūra 252-255 °C.
I-3 1-FENIL-1H-INDOL-2,3-DIONAS. Oranžinės spalvos kristalai, išeiga 76 %, lydymosi
temperatūra 137-138 °C.
I-4 1-(2-CHLORETIL)-1H-INDOL-2,3-DIONAS. Raudonai-oranžinės spalvos kristalai, išeiga
72%, lydymosi temperatūra 115-117 °C.
I-5 (2,3-DIOKSO-2,3-DIHIDRO-1H-INDOL-1-IL)ACTORŪGŠTIS. Geltonai-žalios spalvos
Junginių sintezė įterpiant radikalus į 3–ąją padėtį, buvo vykdoma pagal modifikuotas Katherashala, Swarnalatha Bollam, Balakrishna [42] ir Patel A-, Bari S-, Talele G-, et al. [32] sintezuojant I-6, Haribabu J, Jeyalakshmi K, Arun Y-et al sintezuojant I-7 junginį [43], Kearney T., Philip A. Haris, Arthur Jackson[44] sintezuojant I-8 junginį, Harada H, Morie T, Hirokawa Y, Terauchi H, et al.[45] sintezuojant I-9, junginį metodikas.Sintezių schemos pateiktos13 pav. 6 ir I-7),14 pav. (I-8),15 pav. (I-9).
I-6 R= - NNH2; I-7 R= -NNHCSNH2.
13 pav. Junginių sintezė įvedant pakaitus į 3 padėtį
Pagal viršuje pateiktą schema gauti junginiai:
I-6(3Z)-3-HIDRAZINILIDEN-1,3-DIHIDRO-2H-INDOL-2-ONAS. Geltonos spalvos milteliai,
išeiga 75%, lydymosi temperatūra 168-170 °C.
I-7
(2Z)-2-(2-OXO-1,2-DIHIDRO-3H-INDOL-3-ILIDEN)HIDRAZIN-1-KARBOTIOAMIDAS. Geltonos spalvos kristalai, išeiga 85 %, 245-249 °C.
14 pav. Junginio turinčio izatino fragmentą sintezė
Pagal aukščiau nurodytą schemą gautas junginys:
I-8 (3E)-3-(HIDROKSIMINO)-1,3-DIHIDRO-2H-INDOL-2-ONAS. Geltonos spalvos kristalai,
15 pav. Junginio turinčio izatino fragmentą sintezė atidarant ir ciklizuojant penkianarį žiedą
Pagal nurodytą schemą aukščiau gautas junginys:
I-9 3H-INDAZOL-3-KARBOKSIRŪGŠTIS. Gelsvai-rudos spalvos milteliai, išeiga 54 %,
lydymosi temperatūra 288-293 °C.
Junginių sintezė įterpiant radikalus į 3–ąją padėtį buvo vykdoma pagal modifikuotas Lee D, Long S. ir kt.[46]sintezuojant I-11 – I-14 junginius,Hosseinzadeh R, Sarrafi Y, Khaledi H[47]sintezuojant I-15 junginį, Daisley RW, Shah V-K[48]ir Vine K-L, Locke JM, Ranson M et al.[49]sintezuojant I-16 junginį, Bellamy F.D, Ou K[50]I-17 junginį, metodikas. Sintezių schemos pateiktos 16 pav.(I-11 – I-14) ir 17 pav. (I-15 – I-17).
I-11 R= -NH2; I-12 R= - NNN; I-13R= -NHNH2; I-14 R= -NHC6H6
16 pav. Junginio sintezė, įvedant pakaitus į 5 padėtį
Pagal aukščiau nurodytą reakcijos schemą gauti junginiai:
I-10 2,3-DIOKSO-2,3-DIHIDRO-1H-INDOL-5-SULFONILCHLORIDAS. Rudai-geltoni
I-11 2,3-DIOKSO-2,3-DIHIDRO-1H-INDOL-5-SULFONAMIDAS. Tamsiai raudonai-violetinės
spalvos kristalai, išeiga80 %, 180-183 °C .
I-12 5-(2ƛ5-TRIAZ-1-EN-2-INE-1-SULFONYL)-1H-INDOL-2,3-DIONAS. Rudai-raudonos spalvos milteliai, išeiga 20%, lydymosi temperatūra 196-199 °C.
I-13 2,3-DIOKSO-2,3-DIHIDRO-1H-INDOL-5-SULFONOHYDRAZIDAS. Rudai-oranžinės
spalvos kristalai, išeiga 55%, lydymosi temperatūra 148-151 °C.
I-14 2,3-DIOKSO-N-FENIL-2,3-DIHIDRO-1H-INDOL-5-SULFONAMIDAS. Kreminės
spalvos milteliai, išeiga 25 %, lydymosi temperatūra 220-222 °C.
17 pav. Junginio sintezė, įvedant pakaitus į 5 padėtį
Pagal aukščiau nurodytą reakcijos schemą gauti junginiai:
I-155-BROM-1H-INDOL-2,3-DIONAS.Tamsiai oranžinės spalvos milteliai, išeiga 80%,
lydymosi temperatūra 247-252 °C.
I-16 5-NITRO-1H-INDOL-2,3-DIONASGeltonos spalvos kristalai, išeiga 76%, lydymosi
temperatūra 255-258 °C.
I-17 5-AMINO-1H-INDOL-2,3-DIONASJuodai-violetinės spalvos kristalai, išeiga 15%,
2.2. Analizės metodai
2.2.1. IR spektroskopija
Sintetintų junginių IR spektrai užrašyti PerkinElmer Two spektrometru naudojant UATR. Junginys buvo užnešamas ant deimanto kristalo ir užrašomas IR spektras 450-4000cm-1 bangos ilgyje.
2.2.2. UV spektroskopija
Tiriamųjų junginių spektrai buvo užrašyti naudojantis Agilent Technologies Cary 8454 UV-VIS. Tiriamųjų junginių 1 mg buvo tirpinamas 1 ml metilo alkoholyje (I-1, I-3, I-4, I-9, I-11, I-14, I-16), acetonitrile (I-2, I-5, I-6, I-7,I-8, I-10, I-15) ar dimetilsulfokside (DMSO) (I-12, I-13, I-17). Iš tirpalo buvo paimama 10 µl ir praskiedžiama iki 1 ml ir matuojama UV absorbcija esant bangos ilgiui 200-600 nm.
2.2.3. SC-MS spektrometrija
Susintetinti junginiai buvo analizuojami naudojantAgilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF SC/MS prietaisą, identifikuojant junginius (parametrai nurodyti 1 ir 2 lentelėse). Mėginiai buvo paruošiami pagal tą pačią metodiką aprašytą prie UV spektrofotometrijos. Pagaminti mėginių tirpalai buvo filtruojami ir tiriami.
1 lentelė.Optimizuotos junginių gryninimo tyrimo sąlygos naudojant SC
Parametrai Agilent 1260 Infinity SC sistema
Chromatografinė kolonėlė
Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 2.1 ×
100 mm, 1.8-µm, (p/n 959757-902) Kolonėlės
temperatūra
40oC junginių grynumo tyrimams
Injekavimo tūris 10 µL junginių grynumo tyrimui su Agilent 6530 Q–TOF Injekavimo greitis 200 µL/min
Mobili faze (+ jonizacija)
Junginių grynumo tyrimai:
A: Vanduo, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%) B: Metanolis, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%) Tekmės greitis 0.40 mL/min junginių grynumo tyrimams
Gradienas (+ jonizacija)
Junginio grynumo tyrimai
0 min 1 min 11 min 13 min 15 min 20 min
A: 100 A: 100 A: 0 A: 0 A: 100 A: 100
B: 0 B: 0 B: 0 B: 0 B: 0 B: 0
Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio diapazonas 200–550 nm, po 2 nm,
smailės plotis <0.0031 min (atsako laikas 0.031 s), (80 Hz)
A: 254/4 nm B: 474/4 nm C: 550/4 nm D: 215/4 nm
E: 360/4 nm F: 200/4 nm G: 310/4 nm H: 410/4 nm
Analizės trukmė (stop time)
20 minučių sintezuotų junginių grynumo tyrimams
Post-analizės trukmė 15 minučių
2 lentelė.Optimizuotos junginių gryninimo tyrimo sąlygos naudojant Q-TOF MS
Parametrai Agilent 6530 Q–TOF MS sistema
Jonizacija Teigiama (+)
Jonizacijos šaltinis Agilent Dual Jet Stream elektropurkštuvinis jonizatorius (ESI)
Kapiliarinė įtampa 4250 V (+)
Purkštuvo įtampa 250 V
Džiovinimo dujų temperatūra 350 °C
Džiovinimo dujų tėkmė 13 1/min
Purkštuvo slėgis 40 psg
Apgaubiančių dujų temperatūra 280 °C
Apgaubiančių dujų tėkmė 12 1/min
MS ribos 100 – 1700 m/z
Kolizijos energija 2,5 V
MS registravimo dažnis 2 spektrais
MS/MS: 100 – 1700 m/z MS/MS registravimo dažnis MS: spektrais
MS/MS: 3 spektrais, Auto MS/MS
Izoliavimo plotis Siauras (~1.3 m/z)
Kolizijos energija 0 – 20 V
Etaloninė masė (+): 121.050873 ir 922.009798
Instrumento režimas Didelės raiškos režimas (4 GHz)
2.2.4. Lydymosi temperatūra
Junginių lydymosi temperatūros nustatytos Koflerio prietaisu. Gautos lydymosi temperatūros yra nekoreguotos.
2.3. Metabolitų pokyčio nustatymas
2.3.1. Mėginių koncentracija
Buvo paruošti mėginiai 10 mM koncentracijos tirpinti DMSO ir praskiesti iki 10 μM koncentracijos. Kontrolinis tirpalas buvo fiziologinis tirpalas su S.aureus 1,0 x 109 kolonijas sudarančių vienetų (CFU) ml-1
2.3.2. Bakterijų kultūros paruošimas
S. aureus(ATCC 25923) buvo auginama Mueller Hinton (MH) terpėje ir inkubuojamos 24 val. 37
°C aerobinėmis sąlygomis. Gauta kultūra buvo praskiesta fiziologiniu tirpalu iki 1,0 x 109
kolonijas sudarančių vienetų (CFU) ml-1
naudojant DEN-1 Mc-Farland densitometrą. 1,0 ml bakterinės suspensijos buvo sumaišytos su 10 μMkoncentracijos 1μl tiriamųjų junginių tirpalais. Mišiniai buvo aerobiškai kultivuojami 37 °C 20-24 val. [51,52].
2.3.3. Tiriamųjų junginių paruošimas metabolominiui tyrimui
Po 20-24 val. junginiai buvo praskiedžiami 1 ml -20 °C metilo alkoholiu. Mėginiai buvo supurtomi ir 20 min. veikiami ultragarsu. Po to 1 val. buvo šaldomi ir 30 min. nusodinami centrifuguojant (600 rpm). Gauti mėginiai buvo filtruojami ir analizuojami SC-MS[51,52].
2.3.4.Metabolitų pokyčio tyrimo vertinimas SC-MS
3 lentelė. Optimizuotos metabolinio profiliavimo tyrimo sąlygos naudojant SC
Parametrai Agilent 1260 Infinity SC sistema
Chromatografinė kolonėlė
Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 2.1 ×
100 mm, 1.8-µm, (p/n 959757-902) Kolonėlės
temperatūra
50oC metabolitų profiliavimo tyrimams
Injekavimo tūris 1 µL metabolinio profiliavimo tyrimui su Agilent 6530 Q–TOF Injekavimo greitis 200 µL/min
Mobili faze (+ jonizacija)
Metabolinio profiliavimo tyrimai:
A: Vanduo, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%) B: Metanolis, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%) Tekmės greitis 0,35 mL/min metabolinio profiliavimo tyrimams
Gradienas (+ Metabolinio profiliavimo tyrimams
jonizacija) A: 90 A: 90 A: 10 A: 10 A: 90 A: 90
B: 10 B: 10 B: 90 B: 90 B: 10 B: 10
Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio diapazonas 200–550 nm, po 2 nm,
smailės plotis <0.0031 min (atsako laikas 0.031 s), (80 Hz)
A: 254/4 nm B: 474/4 nm C: 550/4 nm D: 215/4 nm
E: 360/4 nm F: 200/4 nm G: 310/4 nm H: 410/4 nm
Analizės trukmė (stop time)
40 minučių metabolinio profiliavimo tyrimams
Post-analizės trukmė 15 minučių
Optimizuotos junginių metabolinio profiliavimo sąlygos naudojant Q-TOF MS tokios pačios kaip junginių grynumo tyrimo.
Programinė įranga naudota duomenų analizei: Agilent MassHunter Qualitative Analysis (Qual) B.07.00; Agilent MassHunter Profinder B.06.00, sp. 1; Agilent Mass Profiler (MP) B.07.01; Agilent MassHunter Molecular Structure Correlator (MSC) B.07.00.
18 paveiksle pateikta SC-MS metabolinio tyrimo eiga. Didelės raiškos Q – TOF SC – MS metabolitų pokyčio tyrimui buvo pasirinktos S. aureus rūšies bakterijos, esančios ankstyvoje stacionarioje fazėje.
18 pav. SC-MS metabolinio tyrimo eiga 1.MS duomenų surinkimas metabolinio profiliavimo tyrimui (TOF) 2. Junginio savybių nustatymas (Profinder) 3. Diferencinė analizė (MP) 4. MS/MS duomenų surinkimas identifikavimui (Q–TOF) 5. Identifikacija (Qual ir MSC)
2.4. In silicotyrimas
2.4.1. Baltymo struktūros parinkimas ir paruošimas darbui
S. aureusDnrG baltymo trimatės struktūros modelis atsisiųstas iš RCSB baltymų duomenų bazės
(PDB kodas: 4EDG). Ši trimatė struktūra buvo pasirinkta dėl aukštos rentgeno spindulių difrakcijos rezoliucijos: 2.0 Å ir aiškiai matomo aktyviojo fermento centro. Baltymo struktūra paruoštapapildant trūkstamus vandenilių atomus, pašalinant vandens molekules ir atkuriamos pažeistos baltymo struktūros dalys: šoninės grandinės ir kilpos. Baltymo energijos minimizavimas atliktas panaudojant OPLS3 jėgos lauką, esant RMSD 0,30 reikšmei.
2.4.2. Ligandų modeliavimas ir paruošimas darbui
Virtualios bibliotekos kūrimas atliekamas ReagentPreparation moduliu. Junginių modeliavimas atliekamas 2D sketcher moduliu. Panaudojus modeliavimui skirtą CombiGlide modulį sukurti izatinojunginiai, turintys skirtingus pakaitus 1-oje, 3-oje ir 5-oje padėtyse. Naudojantis LigPrep moduliu sukurtos trimatės ligandų struktūros ir jų energijos minimizacija atlikta pagal OPLS3 jėgos lauką. Ligandų jonizacijos būsenos generuotos Epic moduliu, jonizuojant visas galimas konformacijas, esant pH 6.8-7.4 intervalui.
2.4.3. Numanomo aktyvumo nustatymas
Spėjamam aktyvumui nustatyti naudojamas GlideDocking modulis. Trimatėje struktūroje nustatoma baltymo aktyvioji sritis ir vykdomas jos nuskaitymas. Po to erdvėje modeliuojami sudaryti ligandų modeliai. Jie išdėstomi skirtingomis pozomis, kaskart įvertinant galimas sąveikas tarp ligando ir baltymo. Modeliuotų ligandų energijos kiekis užrašomas „GScore“ rezultato lange.
3. Rezultatai ir jų aptarimas
3.1. Junginių sintezės rezultatai
Susintetinta 17 junginių. Reakcijų išeiga svyravo nuo 15 -95 %. Mažiausia išeiga buvo I-17 vykdant redukciją dėl netinkamo tirpiklio ekstrakcijai parinkimo.
3.2 Junginių analizės rezultatai
3.2.1.IR spektroskopijos rezultatai
Junginių struktūros patvirtinimui buvo užrašyti IR spektrai. Spektrai buvo analizuojami pagal žemiau pateiktą pavyzdį, rezultatai pateikti 4 lentelėje, o spektrai pateikti 1 priede.
19 pav. I-1 ir izatino junginių IR spektrų palyginimas
Paveikslėlyje A pavaizduotas izatino (raudona spalva) ir I-1 junginio (ţalai spalva) IR perdengti spektrai. B ir C paveiksluose išryškinti smailių pokyčiai.
Aukščiau pateiktame paveikslėlyje pateikti izatino ir I-1 junginio spektrai. B paveikslėlyje matyti, kad I-1 junginyje ties 3189,56 cm-1 išnyko smailė. 3200-3180 cm-1 šiame regione būdinga N-H grupių turinčių smailės, kadangi smailė išnyko, vadinasi prie aminogrupės prisijungė 1-propenas. C paveikslėlyje matyti, kad ties 928,24 cm-1
atsiranda nauja smailė, kurios nebuvo izatine. 950-900 cm-1 regione matyti -CH=CH2 alifatinė grupė, todėl tai patvirtina, kad susidarė I-1 junginys.
20 pav. I-10 ir izatino junginių IR spektrų palyginimas
Paveikslėlyje A pavaizduotas izatino (raudona spalva) ir I-10 junginio (ţalai spalva) IR perdengti spektrai. B paveiksle išryškinti smailių pokytis.
Paveikslėlyje pateikti izatino ir I-10 junginio spektrai. Atliekant junginio sintezę literatūroje buvo nurodyta, kad gali susidaryti 2,3-diokso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonylchloridas (I-10) junginys arba 3,3-dichloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonylchloridas (21 pav.)[46]. B paveiksle matyti, kad atsiranda smailė ties 1370 cm-1
, 1390-1360 cm-1 regione būdinga S=O grupė, todėl galima teigti, jog junginys susidarė. Bet nematoma nauja smailė 850-550 cm-1
regione, kuris būdingas C-Cl grupei, todėl galima teigti, jog susidarė I-10 junginys.
4 lentelė. Junginių IR spektrų pikai ir juos atitinkančios funkcinės grupės
Junginio šifras
Funkcinė grupė Spektro pikas (cm-1)
I-1
C=O 1721,64
CH=CH2 (alifatinėje grandinėje) 928,24
CH=CH (aromatiniame žiede) 1597,34
I-2 -CH2 (šalia N atomo) 2850,83
I-3 C=O 1727,8 C=C (aromatiniame žiede) 1608,25; 1494,11 C-N 1468,53 I-4 C=O 1731,05 C=C (aromatiniame žiede) 1604,10 C-C 1361,89 C-Cl 756,25 I-5 O-H (karboksi gr.) 2916,1 C-C 2848,3 C=O (keto gr.) 1723,72 C=O (karboksi gr.) 1680,18 C=C( aromatiniame žiede) 1592,47 I-7 NH2 3450,51 N-H 3333,25 C=O 1726,37 C=S 1106,75 I-8 O-H 2918.43 C=O 1674.43 C=N 1624,66 I-9 N-H 2893,99 C=O (karboksi gr.) 1678,70 I-10 C=O (keto gr.) 1769,72; 1731,60 C=C (cikle) 1616,92 S=O 1376,08
S-Cl < 570 I-11 N-H 3120,35 NH2 3035,00 C=O 1670,99 S=O 1148,47 I-12 NH 3285,85 N=N=N 2142,50 C=O 1749,66 S=O 1358,36 I-13 NH2 ir N-H 3283,51-3103,76 C=O 1742,71 S=O 1294,59 I-14 NH (aromatinė) 2597,06 C6H6 1495,46 S=O 1078,91 C-S 604,49 I-15 N-H 3177,19 C=O 1746,76; 1708,54 C-Br 681,60 I-16 N-H 3319,59 C=O 1698,39; 1673,97 NO2 1346,34 I-17 N-H 3162,12 NH2 3403,30 C=O 1719.79; C=C 1668,54 C6H6 (monosubstituotas žiedas) 787,64
3.2.2. UV spektroskopijos rezultatai
Sintetintų junginių spektrai pateiki 2 priede.
5 lentelė. Junginių UV spektrų pikai
Junginys UV spektro pikai Junginys UV spektro pikai
I-1 210; 245; 299 I-10 222; 282 I-2 224; 264; 399 I-11 207; 223; 251 I-3 206; 245; 298 I-12 262 I-4 205; 245; 298 I-13 268 I-5 219; 226; 252 I-14 218; 284 I-6 214; 247; 268 I-15 249; 293 I-7 214; 245; 272; 368 I-16 229; 341 I-8 220; 269; 326 I-17 264 I-9 204; 292 I-18 220
3.2.3. SC-MS rezultatai
Junginių tapatumui nustatyti buvo tiriamos sintetintų junginių masės ir lyginamos su jų teorinėmis masėmis. Junginių analizės pavyzdys pateiktas žemiau. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.
22 pav. I-1 junginio SC-MS analizė.
.A paveiksle pateikta I-1 junginio SC chromatograma (ţalia spalva).B paveiksle pateikta I-1 junginio ir jo fragmento MS spektras MS spektre matyti junginio I-1 jono tiksli masė ir intensyvumas.
Pagal junginio masių spektrą matyti, kad susidarė I-1 junginys, jo teorinė masė (M+H )+ 188,0706, o gauta masė (M+H )+ 188.0665. Tačiau taip pat matyti kitas junginys, kuris yra I-1 junginio fragmentacijos produktas, dėl labilios alilo (1-propeno) grupės.
23 pav. I-10 junginio SC-MS analizė.
Paveiksle pateikta I-10 MS spektras. A paveiksle pateikta I-10 junginio SC chromatograma (ţalia spalva). B paveiksle MS spektre matyti junginio I-10 ir 3,3-dichloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonylchloridojonų tiksli masė ir
intensyvumas
Pagal junginio masių spektrą matyti, kad susidarė I-10 junginys, jo teorinė masė (M-H )- 243,9477, o gauta masė (M-H)- 243,9484. Taip pat matyti, kad susidarė 3,3-dichloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonylchloridas (M-H)- 321,9709, tačiau jo yra tris kartus mažiau nei I-10 junginio. Tai dar kartą patvirtina, kad tikrai susidarė I-10 junginys.
6 lentelė.Junginių MS Junginio
šifras Apskaičiuota teorinė masė Gauta junginio masė
I-1 (M+H )+ 188,0706 (M+H )+ 188.0665
I-2 (M+Na)+209,0321 (M+Na)+209,0320
I-3 (M+H)+ 238,0863
(M+Na)+ 260,0682
(M+H)+ 238,0826 (M+Na)+ 260,0656
(M+Na)+ 232,0136 (M+Na)+ 232,0121
I-5 (M+Na)+ 228,0267 (M+Na)+ 228,0274
I-6 (M+Na)+ 184,0481 (M+Na)+ 184,0467
I-7 (M+Na)+ 243,0311 (M+Na)+ 243,0304
I-9 (M+Na)+ 185,0321 (M+Na)+ 185,0314
I-10 (M-H)- 243,9477 (M-H)- 243,9484
I-11 (M+CH3COO)+ 241,0278 (M+CH3COO)+ 241,0328
I-12 (M-H)-250,9880 (M-H)- 250.9883
I-13 (M+H)+ 242,0230 (M+H)+ 242,0232
I-15 (M-H)- 223,9353 (M-H)- 223,9338
I-16 (M-H)- 191,0083 (M-H)- 191,0098
I-18 (M-H)- 400,1190 (M-H)- 400,1155
3.3. Metabolitų pokyčio tyrimo rezultatai
Atlikus mėginių analizę gauti rezultatai pateikti 24 pav. Jame pavaizduoti mėginių su S.
aureuspaveiktų susintetintų junginių spektrai. Iš spektrų matyti, kad daugeliomėginių metabolitai sutampa
24 pav. Sintetintų junginių chromatogramos
Paveikslėlyje pateikti tirtų junginių I-1–I-18 metabolitinio profilio MS/MS perdengti spektrai. Kiekviena smailė atitinka skirtingą metabolitą. Smailių intensyvumas atitinka specifinius metabolitą(us).
Atlikus detalesnių junginių analizę, pastebėta bendra tendencija, kad 17 iš 18mėginių sumažėjo guanino (25 pav.) ir 15 iš 18 mėginių sumažėjo metiladenino metabolitų kiekis (26 pav.) ir 10 iš 18 mėginių padidėjodeokstimidindifosfato (dTDP)metabolito (27 pav).
25 pav. Guanino kiekio sumžėjimas
Paveiksle pavaizduotas guanino sumaţėjimas lyginant su kontrole. Junginiai, kurie ţenkliausiai sumaţino S. aureus metabolito guanino kiekį pavaizduoti formulėmis.
26 pav. Metiladenino kiekio sumžęjimas.
Paveiksle pavaizduotas metiladenino sumaţėjimas lyginant su kontrole. Junginys, kurie ţenkliausiai sumaţino S. aureus metabolito metiladenino kiekį pavaizduoti formulėmis.
27 pav. dTDP kiekio padidėjimas
Paveiksle pavaizduotas dTDP sumaţėjimas lyginant su kontrole. Junginiai, kurie ţenkliausiai sumaţino S. aureus metabolito dTDP kiekį pavaizduoti formulėmis.
Atlikus nustatytų metabolitų paiešką Kioto genų ir genomų enciklopedijoje (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (http://www.genome.jp/kegg/)) nustatyta, kad gauti pokyčiai susiję su purinų ir pirimidinų sintezę, kurie svarbūs DNR replikacijos metu. Guaninas ir metiladeninas dalyvauja purinų
28 pav. Purinų metabolizmas[53]
29 pav. Purimidinų metabolizmas[54]
Metabolitų pokyčiai buvo analizuojami lyginant S.aureusmėginį paveikus susintetintais junginiais. Metabolitų analizės pavyzdys pateiktas žemiau.Atliekant I-1 mėginio analizę buvo nustatyti 4262 metabolitų kiekio pokyčiai lyginant su kontrole (30 pav.). Nustatyti trijų metabolitų pokyčiai (guanino, metiladenino ir dTDP).
30 pav. I-1 metabolitų pokyčiai
A paveiksle pavaizduoti visi metabolitų pokyčiai paveikus S.aureus mėginį su I-1 junginiu. B paveiksle guanino pokytis, C- metiladenino, D- dTDP.
31 pav. I-1 mėginio metabolitų pokytis lyginant su kontrole
Paveikslėlyje pateikti tirto junginio I-1(violetinė spalva) ir kontrolės (ţalia spalva) metabolitų pokyčio MS/MS perdengti spektrai. Paveikslo kairėje pusėje tiksli guanino jono masė ir struktūrinė formulė, dešinėje – 6-metiladenino jono
masė ir struktūrinė formulė.
Viršuje pateiktame paveiksle matyti metabolitų pokyčiai. Guanino sulaikymo laikas 0,5 min. Iš spektro matyti ženklus metobolito sumažėjimas (10,6 karto) lyginant su kontrole.Kairėje pusėje pateikta tiksli guanino jono masė(([C5H5N5O]+H) 152,0568 ir ([C5H5N5O]+Na ) 174,0389 ). 6-metiladenino sulaikymo laikas yra 16,7 min. Šio metabolito sumažėjimas yra 2,3 karto lyginant su kontrole. Dešinėje pateiktatiksli 6-metiladenino jonomasė ((3[C6H7N5]+CH3CN)+ 489,2142 ir 3[C6 H7N5]+CH3CNH)+ 490,2469). Metabolitų kiekisnuo 1-13 min ir 24-35 min. ženkliai kito.
Atliekant I-12 mėginio analizę buvo nustatyti 4404 metabolitų kiekio pokyčiai lyginant su kontrole (32 pav.). Identifikuoti dviejų metabolitų pokyčiai (guanino, metiladenino).
32 pav. I-1 metabolitų pokyčiai
A paveiksle pavaizduoti visi metabolitų pokyčiai paveikus S.aureus mėginį su I-12 junginiu. B paveiksle guanino pokytis, C- metiladenino.
33 pav. I-12 mėginio metabolitų pokytis lyginant su kontrole
Paveikslėlyje pateikti tirto junginio I-12(violetinė spalva) ir kontrolės (ţalia spalva) metabolitų pokyčio MS/MS perdengti spektrai. Paveikslo kairėje pusėje tiksli guanino jono masė ir struktūrinė formulė, dešinėje – 7-metiladenino jono masė ir struktūrinė formulė.
Viršuje pateiktame paveiksle matyti guanino ir 7-metiladenino pokyčiai. Guanino sulaikymo laikas 0,5 min. Šio metabolito kiekis sumažėjo 10,6, karto lyginant su kontrole. Paveikslėlio kairėje pusėje pateikta tiksli guanino jono masė (([C5H5N5O]+H ) 152,0568 ir ([C5H5N5O]+Na ) 174,0385 ). 7-metiladenino sulaikymo laikas yra 16,7 min. Metabolito sumažėjo 2 kartais lyginant su kontrole. Paveikslėlio dešinėje pateikta tiksli 7-metiladenino jono masė ((3[C6 H7 N5]+CH3CN)+ 489,2447 ir 3[C6 H7 N5]+CH3CNH)+ 490,2458). Metabolitų kiekis nuo 1-13 min ir 24-35 min. ženkliai kito.
Guanino ir metiladenino sumažėjimo rodo, jog junginiai potencialiai gali veikti į purinų metabolizmą. dTDP padidėjimasgali būti kompensacinis mechanizmas į guanino ir adenino sumažėjimą arba rodyti, kad junginiai nėra selektyvus, ir potencialiai gali veikti ne tik į purinų bet ir pirimidinų sintezę. Norint išsiaiškinti tikslesnį veikimo mechanizmą reikia atlikti detalesnius tyrimus.
3.4. In silico tyrimo rezultatai
Atlikus pirminius junginių metabolitų pokyčio tyrimus, nustatyta, kad jie potencialiai gali veikti į purinų ir pirimidinųbiosintezės kaskadą . Siekiant išsiaiškinti junginių potencialų veikimo mechanizmą buvo pasirinkta atlikti in silico tyrimą. Atlikus S. aureus baltymų, atsakingų už DNR sintezę, paiešką PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) duomenų bazėje buvo rasta DnrG baltymo kristalografinė struktūra. DnrG baltymas S. aureusyra atsakingas už primerų sintezę DNR replikacijos metu. Slopinant DNR replikaciją slopinamas S.aureus dauginimasis[55]. Atlikus tyrimą nustatyta, kad14 iš 18 juginiųsąveika su pasirinktu baltymu buvo panaši (Δ E ~ 5 kcal/mol) (34 pav.).Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo I-5 ir I-9 junginiai (35 pav. ir 36 pav.).
34 pav. Prognozuojamos junginių sąveikos su baltymu
Paveiksle stipriausia sąveika pasiţymintys junginiai pavaizduoti formulėmis.
I-5 junginys pasižymi stipria sąveika su baltymu (ΔE= -7,546 kcal/mol). Ši sąveika pasireiškiadėl esančios karboksigrupės. Ši grupė su aktyviuoju centru sudaro vandenilinius ryšius su Tyr, Arg aminorūgštimis, aromatinis žiedas sudaro π-π sąveiką su Lys aminorūgštimi.
35 pav. I-5 junginio sąveika su baltymo aktyviuoju centru, jo trimatis (kairėje)ir trimatis (dešinėje) vaizdas
Kairėje pavaizduotame baltyme vandenilinės jungtys paţymėtos geltona spalva, o π-π sąveika – ţalia spalva.
Stipriausia sąveika su baltymu (ΔE= -8,019 kcal/mol) pasižymi I-9 junginys. Ši sąveika pasireiškia dėl indazolo žiede esančio tretinio amino-ir karboksigrupės su aktyviojo centro aminorūgštimis. Junginyssudarė vandenilinius ryšius su Tyr, Arg, Lys aminorūgštimis.
36 pav. I-9 junginio sąveika su baltymo aktyviuoju centru, jo trimatis (kairėje) ir dvimatis (dešinėje) vaizdas.
4. IŠVADOS
1. Atlikta 16-kos izatino ir 1 indazolo darinių, turinčių pakaitus 1-oje, 3-oje ir 5-oje žiedo padėtyse sintezė,atliekant nitrinimo, brominimo, redukcijos, pavadavimo reakcijas.Sintetintų junginių išeiga svyravo nuo: I-1 –I-5 - 40-76 %; I-6– I-8 – 40 – 85 %; I-9 54% ; I-10 – I-17 - 15 – 95 %.
2. Sintetintų junginių struktūra patvirtinta UV, IR, masių spektrinais duomenimis, o grynumas – efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Junginių grynumas siekė 90 - 95%.
3. Ištirtas sintetintų junginių metabolitų pokytis veikiantS. aureus. Nustatytas, kad junginiaiI-1 ir I-12 10,6 karto mažino guanino kiekį, lyginant su kontrole. Junginys I-14 5,4 karto sumažino metiladenino kiekį, lyginant su kontrole. Junginiai I-8 ir I-18 padidino dTDP kiekį 9,3 ir 7,6 karto,lyginant su kontrole.
4. Atlikus in silico tyrimą nustatyta, potencialus slopinimo mechanizmas. DnrG baltymas sudaro stipriausią sąveiką su I-5 ir I-9 junginiais, ΔE= -7,546 kcal/mol ir ΔE= -8,019 kcal/mol atitinkamai. I-5 junginys sąveikauja su baltymu aktyviuoju centru, susidarant vandeniliams ryšiams tarp junginio karboksigrupėsir Tyr, Arg, Lys aminorūgščių, o aromatinis žiedas sudaro π-π sąveiką su Phe aminorūgštimi. I-9 junginys sąveikauja su baltymo aktyviuoju centru sudarant vandeniliams ryšiams tarp junginio karboksigrupės, tretinio azoto ir Tyr, Arg, Lys aminorūgščių.
5. REKOMENDACIJOS
Šiame darbe atliktas pirminis junginių patikrinimas siekiant sužinoti jų preliminarų veikimą. Norintišsiaiškintiį kurią purinų biosintezės vietą veikia mūsų junginiai ir tikslų jų veikimo mechanizmą, reikia atlikti tolimesnius tyrimus. Reikėtų atlikti junginių antibakterinį tyrimą, nustatyti junginių IC50 reikšmes, kad sužinoti minimalią junginio koncentraciją slopinančią bakterijų augimą. Tikimasi, kad šis,dalinai ištirtas veikimo mechanizmas, bus naujų antibiotikų paieškos pradžia, kovojant su meticilinui atspariu S. aureus.
6. LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Woodford N, Livermore DM. Infections caused by Gram-positive bacteria: a review of the global challenge. J Infect [Internet]. 2009 Sep [cited 2016 Apr 19];59 Suppl 1:S4–16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19766888
2. Ole Heuer, Anna-Pelagia Magiorakos, Marianne Gunell A, Economopoulou, Paula Bianca
Blomquist, Derek Brown CW, Monnet NP and D. Antimicrobial resistance surveillance in Europe [Internet]. 2010 [cited 2016 May 6]. Available from:
http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/1111_SUR_AMR_data.pdf.pdf 3. Mueller EJ, Meyer E, Rudolph J, Davisson VJ, Stubbe J. N5-carboxyaminoimidazole
ribonucleotide: evidence for a new intermediate and two new enzymatic activities in the de novo purine biosynthetic pathway of Escherichia coli. Biochemistry [Internet]. 1994 Mar 1 [cited 2016 May 9];33(8):2269–78. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8117684
4. Mathews II, Kappock TJ, Stubbe J, Ealick SE. Crystal structure of Escherichia coli PurE, an unusual mutase in the purine biosynthetic pathway. Structure [Internet]. 1999 Nov 15 [cited 2016 May 9];7(11):1395–406. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10574791
5. Brugarolas P, Duguid EM, Zhang W, Poor CB, He C. Structural and biochemical characterization of N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthetase and N5-carboxyaminoimidazole
ribonucleotide mutase from Staphylococcus aureus. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [Internet]. 2011 Aug [cited 2016 May 9];67(Pt 8):707–15. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3144853&tool=pmcentrez&rendertype =abstract
6. Mahan MJ, Slauch JM, Mekalanos JJ. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science [Internet]. 1993 Jan 29 [cited 2016 May 9];259(5095):686–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8430319
7. Kirsch DR, Whitney RR. Pathogenicity of Candida albicans auxotrophic mutants in experimental infections. Infect Immun [Internet]. 1991 Sep 1 [cited 2016 May 9];59(9):3297–300. Available from: http://iai.asm.org/content/59/9/3297
8. Samant S, Lee H, Ghassemi M, Chen J, Cook JL, Mankin AS, et al. Nucleotide biosynthesis is critical for growth of bacteria in human blood. PLoS Pathog [Internet]. 2008 Feb 8 [cited 2016 May 9];4(2):e37. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2242838&tool=pmcentrez&rendertype =abstract
9. Ivánovics G, Marjai E, Dobozy A. The growth of purine mutants of Bacillus anthracis in the body of the mouse. J Gen Microbiol [Internet]. Microbiology Society; 1968 Sep 1 [cited 2016 May 9];53(2):147–62. Available from:
http://mic.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/00221287-53-2-147
10. Hatem A. Abdel-Aziz, Hazem A. Ghabbour, Wagdy M. Eldehna, Maha M. Qabeel A, Fun H-K. Synthesis, Crystal Structure, and Biological Activity of cis/trans Amide Rotomers of (Z)-N‟-(2-Oxoindolin-3-ylidene)formohydrazide. [Internet]. Journal of Chemistry. 2014 [cited 2016 Apr 28].
Available from:
http://web.a.ebscohost.com/abstract?direct=true&profile=ehost&scope=site&authtype=crawler&jrn l=20909063&AN=100503621&h=1BUq92708PjKQ7iTbaIiXOLHY2LDTcs5nsBYIjgzbWmB3ArJ Xnne6J2DNwdQZhZdPgji64rLejT+j7nlF0Xbyw==&crl=c&resultNs=AdminWebAuth&resultLoca l=E
11. Souza RD, Chattree A. Design, Synthesis and Biological Activities of Isatin Derivatives. Chem Sci Trans [Internet]. 2015;4(1):208–12. Available from:
http://www.e-journals.in/abstract.asp?Totarticle=928
12. Info HA, Activity A, New S, Derivatives I, Pdf S. Synthesis and Antimicrobial Activity of Some New Isatin Derivatives. 2016;(V):2–6.
13. Mohammed M, Al-mudhafar J. SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND PRELIMINARY
ANTIMICROBIAL EVALUATION OF NEW SCHIFF BASES OF AMPICILLIN AND
AMOXICILLIN DERIVED FROM ISATIN DERIVATIVES [Internet]. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2016 [cited 2016 May 9]. p. 113–6. Available from: http://innovareacademics.in/journals/index.php/ijpps/article/view/10825
14. Pandeya SN, Sriram D, Nath G, De Clercq E. Synthesis, antibacterial, antifungal and anti-HIV evaluation of Schiff and Mannich bases of isatin derivatives with 3-amino-2-methylmercapto quinazolin-4(3H)-one. Pharm Acta Helv [Internet]. 1999 Dec [cited 2016 May 9];74(1):11–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10748620
15. Firestine SM, Paritala H, McDonnell JE, Thoden JB, Holden HM. Identification of inhibitors of N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthetase by high-throughput screening. Bioorg Med Chem [Internet]. 2009 May 1 [cited 2016 May 9];17(9):3317–23. Available from:
http://europepmc.org/articles/PMC2696058
16. Hamed K, Gonzalez-Ruiz A, Seaton A. Daptomycin: an evidence-based review of its role in the treatment of Gram-positive infections. Infect Drug Resist [Internet]. 2016 Apr [cited 2016 Apr 27];9:47. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27143941
17. A. Belskij, I. Čaplinskienė, R. Liausėdienė, D. Razmuvienė, J. Tamkevičiūtė GZ. Sergamumo užkrečiamosiomis ligomis Lietuvoje 2013 m. apžvalga [Internet]. 2014 [cited 2016 May 7]. Available from: http://www.ulac.lt/uploads/downloads/leidiniai/sergamumas_2013
18. Revazishvili T, Bakanidze L, Gomelauri T, Zhgenti E, Chanturia G, Kekelidze M, et al. Genetic background and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus strains isolated in the Republic of Georgia. J Clin Microbiol [Internet]. 2006 Oct 1 [cited 2016 May 7];44(10):3477–83. Available from: http://jcm.asm.org/content/44/10/3477.full
19. Fox PM, Climo MW, Archer GL. Lack of relationship between purine biosynthesis and
vancomycin resistance in Staphylococcus aureus: a cautionary tale for microarray interpretation. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2007 Apr 1 [cited 2016 May 7];51(4):1274–80. Available from: http://aac.asm.org/content/51/4/1274.full
20. BUCHANAN JM, WILSON DW. Biosynthesis of purines and pyrimidines. Fed Proc [Internet]. 1953 Jun [cited 2016 May 9];12(2):646–50. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13060368
21. Tranchimand S, Starks CM, Mathews II, Hockings SC, Kappock TJ. Treponema denticola PurE Is a bacterial AIR carboxylase. Biochemistry [Internet]. 2011 May 31 [cited 2016 May
