FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
MARTYNA MIKALONYTĖ
PAPRASTŲJŲ KIAULPIENIŲ (TARAXACUM OFFICINALE L.) ŠAKNŲ
IR ŢIEDŲ ETANOLINIŲ IR VANDENINIŲ IŠTRAUKŲ
MODELIAVIMAS IR ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. dr. Saulė Velţienė
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data
PAPRASTŲJŲ KIAULPIENIŲ (TARAXACUM OFFICINALE L.) ŠAKNŲ
IR ŢIEDŲ ETANOLINIŲ IR VANDENINIŲ IŠTRAUKŲ
MODELIAVIMAS IR ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Saulė Velţienė Data
Recenzentas
Lekt. Guoda Kiliuvienė Data Darbą atliko Magistrantė Martyna Mikalonytė Data KAUNAS, 2017
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1.Paprastosios kiaulpienės apibūdinimas, cheminė sudėtis ... 11
1.2. Paprastųjų kiaulpienių biologinis aktyvumas ... 13
1.2.1. Antioksidacinis aktyvumas ... 13
1.2.2. Priešuţdegiminis aktyvumas ... 14
1.2.3. Antimikrobinis aktyvumas ... 14
1.3. Paprastųjų kiaulpienių farmakologiniai efektai ... 14
1.3.1. Antidiabetinis poveikis ... 15
1.3.2 Priešvėţinis poveikis ... 15
1.3.3. Poveikis kepenų ir tulţies funkcijai ... 15
1.3.4. Poveikis virškinimo sistemai ... 16
1.3.5.Diuretinis poveikis ... 17
1.4. Polifenoliniai junginiai ... 17
1.5. Laisvieji radikalai ... 17
1.6. Antioksidantai ... 18
1.7. Bendra ištraukų apţvalga... 18
1.7.1. Tinktūros ... 18
1.7.2.Ekstraktai ... 19
1.8. Ekstrahentų, naudojamų augalinių ištraukų gamyboje, charakteristikos ... 20
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 21
2.1. Naudotos medţiagos ... 21
2.2. Naudota aparatūra ... 21
2.3. Paprastųjų kiaulpienių ţaliavos ištraukų paruošimas ... 21
2.3.1. Reperkoliacijos metodas ... 21
2.3.2. Perkoliacijos metodas ... 22
2.3.3. Klasikinės maceracijos metodas ... 22
2.3.4. Ultragarso metodas ... 22
2.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalinio
sujungimo metodu ... 23
2.6. Paprastųjų kiaulpienių šaknų ir ţiedų analizė ESC metodu ... 24
2.7. Sauso likučio kiekio nustatymas gravimetriniu metodu ... 25
2.8. Gautų duomenų statistinis vertinimas ... 25
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1. Ekstrahento įtaka paprastųjų kiaulpienių ţaliavos ištraukos kokybei ... 26
3.2. Perkoliacijos metodo įtaka paprastųjų kiaulpienių ištraukų kokybei ... 27
3.3. Klasikinės maceracijos metodo įtaka paprastųjų kiaulpienių ištraukų kokybei ... 28
3.4. Reperkoliacijos metodo įtaka paprastųjų kiaulpienės ekstraktų kokybei ... 30
3.5. Ekstrahavimo ultragarsu įtaka paprastųjų kiaulpienių šaknų ištraukų kokybei ... 31
3.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 32
3.7. Paprastosios kiaulpienės augalinių ţaliavų aktyvių junginių analizė ESC metodu ... 37
3.8. Paprastųjų kiaulpienių šaknų ištraukų gamybos metodų palyginamieji tyrimai ... 39
4. IŠVADOS ... 42
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44
PRIEDAI ... 48
SANTRAUKA
Martynos Mikalonytės magistro baigiamasis darbas ,,Paprastųjų kiaulpienių (Taraxacum
officinale L.) šaknų ir ţiedų etanolinių ir vandeninių ištraukų modeliavimas ir analizė“, mokslinė
vadovė doc. dr. Saulė Velţienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra – Kaunas.
Darbo tikslas – parinkti tinkamas sąlygas ir pagaminti etanolines ir vandenines ištraukas iš paprastųjų kiaulpienių (Taraxacum officinale L.) šaknų ir ţiedų bei įvertinti jų kokybę.
Darbo uţdaviniai: Parinkti tinkamą ištraukų gamybos technologiją, nustatant optimalų ekstrakcijos metodą, ekstrahentą; įvertinti ištraukų kokybės rodiklius pagal fenolinių junginių kiekį, antioksidacinį aktyvumą, sausąjį likutį; atlikti stabilumo tyrimus.
Tyrimo objektas: Paprastųjų kiaulpienių šaknų ir ţiedų skystosios etanolinės ir vandeninės ištraukos.
Tyrimo metodai: Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu pagal kavos rūgštį. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai, naudojant DPPH laisvojo radikalo sujungimo metodą. Gravimetriniu metodu įvertintas sausasis ištraukų likutis. Polifenolinių rūgščių kiekis buvo matuojamas naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Gauti rezultatai apdoroti naudojant Microsoft Office Excel 2007 programą.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Nustatyta bendro fenolinių junginių, sauso likučio kiekio bei antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo ţaliavos ekstrahavimo metodo ir ekstrahento. Parinktas tinkamas tirpiklis – etanolis, kurio koncentracija paprastųjų kiaulpienių šaknų ištraukose 50 % (nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį, sausą likutį), o 70 % (nustatant antioksidacinį aktyvumą). Atlikti tyrimai rodo, kad geriausias ekstrahavimo metodas – reperkoliacija, nustatant pagal bendrą fenolinių junginių kiekį (5,68 mg/g) ir antioksidacinį aktyvumą (81,87 %) bei sauso likučio kiekį (24,4±0,06 %). Nustatytas reikšmingas AA ir bendro fenolinių junginių kiekio koreliacijos ryšys (r=0,9962) ištraukose, gamintose perkoliacijos metodu. Vykdant fenolinių junginių analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta, jog chlorogeno rūgšties kiekis (0,56 mg/g, R2=0,999983) paprastųjų kiaulpienių šaknų ištraukoje didesnis nei kavos rūgšties (0,085 mg/g, R2=0,999988). Paprastųjų kiaulpienių ţiedų ištraukoms, parinktas tinkamas ekstrahentas – etanolis, kurio koncentracija 50 %, vertinant pagal bendrą fenolinių junginių kiekį, antioksidacinį aktyvumą bei sausą likutį. ESC metodu nustatytas chlorogeno rūgšties kiekis (0,25 mg/g) yra didesnis nei kavos rūgšties (0,17 mg/g). Atlikus šaknų ir ţiedų ištraukų stabilumo tyrimus, galima teigti, kad laikant ilgalaikėmis sąlygomis (+5-8 °C) temperatūroje, ištraukos išlieka stabilios 12 mėnesių.
SUMMARY
Final Master master's thesis Martyna Mikalonytė „Modelling and analysis of ethanolic and aqueus extracts of common dandelion (Taraxacum officinale L.) roots and blossoms”, scientific supervisor Assoc. Prof. Saulė Velţienė; Medical Technology and Social Pharmacy Department of the Faculty of Pharmacy of the Lithuanian University of Health Sciences – Kaunas.
The aim of the work is to select the appropriate conditions and to produce the extracts from the common dandelion (Taraxacum officinale L.), and to assess their quality.
Tasks of the work: To select a suitable technology for the manufacture of extracts by determining the optimum extraction method, the extraction solvent; to evaluate the extract quality indicators by the quantity of phenolic compounds, antioxidant activity, solid content; and to perform the stability tests.
Object of research: liquid and ethanolic aqueous extracts of common dandelion roots and blossoms.
Method of research: The total content of phenolic compounds was determined by spectrophotometrically according to the caffeic acid. Antioxidant activity was determined spectrophotometrically by using the DPPH free radical scavenging method. Dry extract residue was evaluated with the gravimetric method. The content of polyphenolic acids was measured using the high performance liquid chromatography. The results were processed with Microsoft Office Excel
2007 software.
Results and conclusions of the research: the dependency of the total phenolic compounds, dry content residue and antioxidant activity of the extraction method of raw material, and the extraction solvent was determined. The appropriate solvent was selected – ethanol at a concentration in the common dandelion root extract of 50 % (by determining the total amount of phenolics, dry residue) and 70 % (by determining the antioxidant activity). The research shows that the best extraction method is repercolation, by determining by the total amount of phenolics (5,68 mg/g) and antioxidant activity (81,87 %), and the quantity of dry residue (24,4 ± 0,06 %). There was a significant correlation of AA and total phenolic compounds (r = 0,9962) in the extracts produced by percolation. The phenolic compounds analysis by HPLC showed that the quantity of chlorogenic acid (0,56 mg/g, R2= 0,999983) in the dandelion root extract was greater than in caffeic acid (0,085 mg/g, R2=0,999988). A suitable extractant was selected for the common dandelion blossom extract – ethanol at a concentration of 50 % in terms of total amount of phenolic compounds, antioxidant activity and the dry residue. The content of set chlorogenic acid (0,25 mg/g) determined using the ESC method is higher than in caffeic acid (0,17 mg/g). The stability tests of roots and blossoms suggest that under long-term storage conditions (at the temperature of +5-8 °C) the extracts remain stable for 12 months.
PADĖKA
Uţ suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, materialinę bazę, konsultacijas, pasiūlymus rašant farmacijos magistro darbą norėčiau padėkoti doc. dr. Saulei Velţienei, doc. dr. Giedrei Kasparavičienei, lekt. Mindaugui Marksai ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos bei Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroms.
SANTRUMPOS
AA – antioksidacinis aktyvumasBFJK – bendras fenolinių junginių kiekis CAE – kavos rūgšties ekvivalentas COX-2 – ciklooksigenazė-2
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. High – performance liquid chromatography HPLC) ESCOP – Europos fitoterapijos mokslo kooperatyvas
HSV-1– I tipo Herpes simplex virusas
NADPH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas NOS – azoto oksido sintazė
LR – laisvieji radikalai
Ph.Eur. – Europos farmakopėja VAŢ – vaistinė augalinė ţaliava
ĮVADAS
Paprastąją kiaulpienę vieni giria ir dţiaugiasi geltonais ţiedais, kiti peikia ir vadina ,,darţo priešu“, tačiau šis daugiametis augalas vartojamas liaudies medicinoje kaip turintis gydomųjų savybių. Jo gimtine laikoma Europa, tačiau šis augalas yra plačiai paplitęs ir šiltesnėse Šiaurės pusrutulio klimato zonose, Azijoje, Sibire. Lietuvoje auga beveik visur, retuose lapuočių miškuose, dirvonuose, ganyklose, daţniausiai pievose, laukuose, pakelėse [1,2,3].
Liaudies medicinoje kiaulpienė buvo naudojama kepenų ligoms gydyti, tačiau šiandien yra atlikta daug mokslinių tyrimų, išaugo susidomėjimas tiriant paprastųjų kiaulpienių augalinės ţaliavos naudą organizmui. Paprastųjų kiaulpienių šaknys ir ţiedai naudojami kepenų suriebėjimo ir cirozės prevencijai, tulţies pūslės akmenų ardymui ir tulţies pratekėjimo gerinimui. Taip pat padeda esant gastritams, gerina virškinimą, apetitą, skatina medţiagų apykaitą, aktyvina apsaugines organizmo funkcijas.
Farmakologinį aktyvumą lemia paprastosios kiaulpienės augalinės ţaliavos sudėtyje esantys biologiškai aktyvūs junginiai – fenolinės rūgštys, flavanoidai, karotinoidai, kumarinai, kartumynai. Dėl jų augalas pasiţymi antioksidaciniu, priešuţdegiminiu, virškinimą gerinančiu poveikiu. Taip pat ţinomas tulţies išsiskyrimą, šlapimą varantis, kepenų ir kasos fermentų veiklą skatinantis poveikis. Polifenoliniai junginiai yra labai reikšmingi, antioksidaciniu poveikiu pasiţymintys komponentai, kurių gausu šaknyse ir ţieduose. Šie junginiai kaip antioksidantai saugo organizmo ląsteles nuo ţalingo laisvųjų radikalų poveikio, kuris susidaro oksidacinio streso metu [4,5,6,7].
Randamas gausus mokslinių straipsnių ir tyrimų skaičius, susijęs su farmakologiniu paprastosios kiaulpienės ţaliavų poveikiu ir tai įrodo augalo svarbą medicinoje. Lietuvos vaistinėse galima rasti arbatų mišinių bei kapsulių su paprastosios kiaulpienės šaknimis, todėl magistriniame darbe buvo pasirinkta analizuoti ir pagaminti šaknų ir ţiedų etanolines ir vandenines ištraukas. Norint įvertinti ţaliavos kokybę ir tinkamumą naudoti medicinos tikslams, svarbu atlikti fenolinių junginių kiekybinius tyrimus, nustatyti antioksidacinį aktyvumą, parinkti tinkamą ekstrakcijos metodą, ekstrahentą bei jo koncentraciją.
Baigiamojo darbo tikslas - parinkus tinkamas sąlygas iš paprastųjų kiaulpienių augalinės ţaliavos (šaknų ir ţiedų), pagaminti etanolines ir vandenines ištraukas bei įvertinti, kaip technologiniai parametrai lemia jų kokybę, nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį, antioksidacinį aktyvumą, sausą likutį.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: parinkti tinkamas sąlygas ir pagaminti etanolines ir vandenines ištraukas iš paprastųjų kiaulpienių (Taraxacum officinale L.) šaknų ir ţiedų bei įvertinti jų kokybę.
Darbo uţdaviniai:
1. Parinkti augalinei ţaliavai (paprastųjų kiaulpienių šaknys, ţiedai) tinkamą ekstrahentą. 2. Parinkti augalinės ţaliavos (paprastųjų kiaulpienių šaknų, ţiedų) tinkamą ekstrahavimo
metodą.
3. Įvertinti pagamintų ištraukų kokybę, nustatant antioksidacinį aktyvumą, sausąjį likutį bei fenolinių junginių kiekį spektrofotometriškai ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.
4. Įvertinti ištraukų stabilumą laikymo metu.
Tyrimo objektai: paprastųjų kiaulpienių šaknų ir ţiedų skystosios etanolinės ir vandeninės ištraukos.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1.Paprastosios kiaulpienės apibūdinimas, cheminė sudėtis
Paprastoji kiaulpienė (Taraxacum officinale L.) (Ph.Eur.01/2010:1851) priklauso astrinių (Asteraceae), dar kitaip vadinamų graiţaţiedţių (Compositae) šeimai, kiaulpienių (Taraxacum) genčiai [1,2,3]. Kiaulpienės genties pavadinimas gali būti kilęs iš graikų kalbos: taraxaco–
„sutrikimas“, akos – „vaistas“ [8,9].
Tai daugiametis ţolinis augalas, išaugantis iki 10-25 cm aukščio. Šaknis liemeninė, stora, 1-2 cm skersmens, 20-60 cm ilgio, sultinga, išorinė šaknies pusė geltonai rudos ar rudos, vidinė-baltos spalvos. Lapai – skroteliniai, lancetiški, giliai dantytais pakraščiais, siaurėjantys pagrindo link, švelniai plaukuoti (būdinga jaunam augalui), ţali, sultingi (pav. 1). Balandţio–geguţės mėnesį išauga ţiedstiebiai – tuščiaviduriai, vienas ar keli, 5-30 cm aukščio, be lapelių, šviesiai ţalios, o ties pagrindu rausvai ţalios spalvos. Graiţai – stambūs, 3-5 cm skersmens, apgaubti skraiste [2,3]. Ţiedai lieţuviški, ilgi, siauri, geltonos spalvos, savotiško kvapo. Ţiedai yra jautrūs šviesai ir orui, ryškioje saulės šviesoje, esant sausam orui atsiveria, o tamsiuoju paros metu, lyjant – uţsiveria [10]. Praėjus kelioms savaitėms po ţydėjimo subręsta vaisiai su skristukais. Vaisius yra 3–4 mm ilgio šviesiai rudas lukštavaisis. Vienas augalas uţaugina iki 8000 sėklų, kurias išnešioja vėjas. Šis procesas vadinamas - Anemochorija. Augale gausu pieno sulčių [3,11,12,13].
T. officinale – labai paplitęs augalas. Jo gimtine laikoma Europa, tačiau augalas plačiai
paplitęs ir šiltesnėse Šiaurės pusrutulio klimato zonose, Azijoje, Sibire [1,2,3]. Lietuvoje auga beveik visur, retuose lapuočių miškuose, dirvonuose, ganyklose, daţniausiai pievose, laukuose, pakelėse. Paprastoji kiaulpienė atspari sausrai, tačiau jaunas augalas labai jautrus ir turi maţas galimybes toliau augti tokiame dirvoţemyje [10,11,12,13,14]. Taip pat paprastosios kiaulpienės yra ne viena, o kelios dešimtys giminingų rūšių. Lietuvoje jų įvairovė maţai tyrinėta, bet manoma, jog galėtų būti 150 ar net daugiau rūšių. Paprastųjų kiaulpienių šaknys ir lapai kaupia įvairius metalus: Pb, Se, Zn, Br, Co, Cu, Mn, Hg ir kitus, todėl daţnai yra naudojami kaip bioindikatoriai [3,11,12,13,14].
Vaistinė augalinė ţaliava (VAŢ) – paprastųjų kiaulpienių šaknys su antţemine dalimi (Taraxaci officinalis herba cum radice) (Ph.Eur. 07/2012:1851) [1,4,7]. VAŢ skiriasi tarpusavyje savo fitochemine sudėtimi. Tam įtakos turi klimatas, sezonas, ekologiniai veiksniai [1,15]. Vaistinės augalinės ţaliavos (šaknų) fitocheminė sudėtis pateikiama 1 lentelėje. Šaknys kasamos balandţio – geguţės mėnesį arba rudenį. Ţiedai renkami pavasarį. Iškastas šaknis reikia nuvalyti, nuplauti šaltu vandeniu, supjaustyti ir dţiovinti lauke arba šildomoje, gerai vėdinamoje patalpoje. Išdţiūvusios šaknys yra bekvapės, saldţiai kartaus skonio. Ţaliavą tinka vartoti penkerius metus [12].
1 lentelė. Paprastosios kiaulpienės vaistinės augalinės ţaliavos (šaknų) cheminė sudėtis Seskviterpeniniai laktonai Tetrahidroridentinas B,
taraksakolido-O-gliukopiranozidas, taraksininės rūgšties β-gliukopiranozidas,11β,13-dihidrolaktucinas.
Triterpenai Taraksasterolis, β-taraksasterolis, taraksolis, arnidiolis, faradiolis, α-amirinas, amirinas, β -sitosterolis, β-sitosterolio-β-D-gliukopiranozidas,stigmasterolis. Fenolinės rūgštys Kavos rūgštis, chlorogeno rūgštis, cikoro rūgštis,
p-kumaro rūgštis, vanilino rūgštis, siringo rūgštis, protokatecho rūgštis, ferulinė r.,
p-hidroksibenzenkarboksi rūgštis, p-hidroksifenilacto rūgštis, linolo r., linoleno r., palmitino r., oleino r. ir kt. Kumarinai Umbeliferonas, eskuletinas, skopoletinas, eskulinas,
cikorijinas.
Mineralai ir vitaminai Kalcis, kalis, geleţis, magnis, fosforas ir kt. (Kalio - 2,45% šaknyse).
Cukrus Fruktozė, gliukozė, sukrozė.
Kita Beta karotenas, gleivės, pektininės medţiagos. Inulinas
Paprastosios kiaulpienės vaistinės augalinės ţaliavos (ţiedų) cheminė sudėtis:
Fenolinės rūgštys (kavos rūgštis, chlorogeno rūgštis, cikoro rūgštis);
Flavanoidai (liuteolinas ir jo glikozidai: liuteolinas-7-O-gliukozidas, liuteolinas-7- digliukozidas);
Karotinoidai (iš jų svarbiausias liuteino epoksidas) [1,4].
Polifenoliai yra labai reikšmingi komponentai, pasiţymintys antioksidaciniu poveikiu augalinėje ţaliavoje. Polifenolių antioksidacinis aktyvumas yra daugiausia dėl jų oksidacijos -redukcijos savybių, kurios leidţia jiems veikti kaip redukcinis agentas, vandenilio donoras [6]. Kiaulpienės šaknyse ir ţieduose gausu šių junginių.
1.2. Paprastųjų kiaulpienių biologinis aktyvumas
Paprastosios kiaulpienės pasiţymi šiais biologiniais poveikiais: ţadina apetitą, skatina virškinimo trakto veiklą, jomis gydomi uţdegimai, turi stiprių šlapimo skyrimąsi skatinančių savybių, esant skysčių susilaikymui organizme, sergant inkstų ligomis, celiulitu ir nutukimu [4,5,7]. Be to, jos skatina tulţies išsiskyrimą ir laisvina vidurius dėl ţaliavoje esančių karčiųjų medţiagų. Kiaulpienės preparatais gydomos kepenų (ūminis ir lėtinis virusinis hepatitas, cirozė, kepenų suriebėjimas) ligos. Tradicinėje kinų, indų medicinoje paprastoji kiaulpienė atpaţįstama kaip kepenų tonikas. Be to juo buvo gydomos ir moteriškos ligos, tokios kaip krūtų ir gimdos vėţys, bei tonikas vartojamas skatinti laktaciją. Taip pat paprastosiose kiaulpienėse yra daug kalio junginių [11,13,17,18]. Jos naudojamos apsisaugoti nuo egzemos, furunkulų, pigmentinių dėmių, padeda sergant cukriniu diabetu, tonizuoja ir aktyvina organizmo imuninę sistemą [4,7,12,16].
1.2.1. Antioksidacinis aktyvumas
Paprastųjų kiaulpienių ţiedų ir šaknų ekstraktai antioksidacinį aktyvumą parodė slopindami NADPH, superoksido ir hidroksilo radikalus. Kiaulpienių ţiedai yra potencialus natūralių antioksidantų šaltinis, dėl juose esančio didelio kiekio fenolinių junginių. Ţiedų ekstraktų veiksmingumas, slopinant oksidacinės paţaidos sukeltas reakcijas, buvo priskirtas dėl juose esančių kavos ir chlorogeno rūgščių bei flavonų liuteolino ir liuteolino 7-O-gliukozido [1,19,20,21].
1.2.2. Priešuţdegiminis aktyvumas
Paprastoji kiaulpienė, atliekant tyrimą su ţiurkėmis, buvo įvertinta kaip turinti stiprų priešuţdegiminį apsauginį poveikį prieš cholecistokinino sukeltą ūminį pankreatitą. In vivo atlikto tyrimo metu nustatyta, kad flavanoidų komponentai liuteolinas ir liuteolinas-7-O-gliukozidas inhibuoja azoto oksido sintazę (NOS), ciklooksigenazę-2 (COX-2) ir taip slopina uţdegimo induktorių (prostaglandinų ir leukotrienų) gamybą [18]. Atlikti tyrimai rodo, kad etanoliniai ekstraktai turi anti-angiogeninį, priešuţdegiminį bei anti-nocicepcinį aktyvumą [1,22]. In vitro atliktame tyrime buvo nustatyta, kad kiaulpienių šaknų etanoliniai ekstraktai daro slopinamąjį poveikį ţmogaus trombocitų agregacijai [1,23].
1.2.3. Antimikrobinis aktyvumas
Nustatyta, kad fenoliniai junginiai, esantys paprastosios kiaulpienės šaknyse, pasiţymi antivirusiniu poveikiu. Atliktame in vitro tyrime buvo nustatytas kiaulpienės antivirusinis aktyvumas prieš ţmogaus Herpex Simplex 1 tipo virusą (HSV-1). Chlorogeno ir kavos rūgštis turi poveikį prieš šį virusą [1,24]. In vitro nevalyti ekstraktai taip pat buvo tikrinami dėl jų antioksidacinių bei antimikrobinių savybių. Vandeninis kiaulpienės ţolės ekstraktas, kuriame randama cikoro rūgštis, turi stiprų antivirusinį poveikį prieš ţmogaus imunodeficito (ŢIV-1) virusą [25,26].
1.3. Paprastųjų kiaulpienių farmakologiniai efektai
Kiaulpienė sumaţina riziką aterosklerozės formavimuisi, silpnindama oksiduotus ir uţdegiminius procesus [27]. Taip pat pasiţymi teigiamu poveikiu esant hiperlipidemijai, hipertrigliceridemija, hipercholesterolemija. Atliktame tyrime in vivo, gydant vandeniniais ir etanoliniais kiaulpienių šaknų ir lapų ekstraktais, poveikis pastebėtas po šešių gydymo savaičių. Nustatyta, kad yra ribojama aterosklerozė ir sumaţinamas oksidacinis stresas, bendrojo cholesterolio kiekis serume, trigliceridų kiekis plazmoje ir kepenyse [1,28]. 2008 metais atliktame in vivo ir in vitro tyrime, Korėjos mokslininkai įrodė paprastųjų kiaulpienių inhibuojamąjį poveikį į kasos fermentą lipazę, tai atitiko 90,2% vaisto orlistato poveikio. Šis poveikis priklauso nuo augalinėje ţaliavoje esančių flavanoidų [29].
1.3.1. Antidiabetinis poveikis
Paprastųjų kiaulpienių ekstraktai pasiţymi hipoglikeminiu efektu dėl flavanoidų ir fenolinių rūgščių, skatindami insulino išsiskyrimą iš kasos beta ląstelių ir taip sumaţindami cukraus koncentraciją. Kiaulpienių šaknyse esantis inulinas gali padėti reguliuoti cukraus kiekį kraujyje. Tai gali būti profilaktinė priemonė esant 2 tipo cukriniam diabetui. Lėtindamas skrandţio išsituštinimą bei gliukozės rezorbciją, jis gali padėti išlaikyti pastovų cukraus kiekį kraujyje po valgio. Atliktame tyrime su triušiais, kurie neserga cukriniu diabetu, lyginant paprastosios kiaulpienės šaknų ekstraktus (2 g/kg), buvo nustatytas didelis cukraus kiekio sumaţėjimas, kuris atitiko 65 % efektą, lyginant su (500 mg/kg kūno svorio) sukelto tolbutamido dozės [1,30]. In vitro atliktuose tyrimuose buvo nustatytas paprastųjų kiaulpienių antţeminės dalies slopinantys poveikiai, kurie veikia į kasos fermentus amilazę ir α-gliukozidazę. Šie fermentai yra pagrindiniai, kurie dalyvauja angliavandenių virškinime iki gliukozės molekulių, juos inhibuojant galima padėti sumaţinti hiperglikemiją. Chlorogeno rūgštis ir eskulinas turi didţiausią inhibuojamąjį poveikį į kasos α-amilazę, o liuteolino-7-O-gliukozidas ir apigenino-7-gliukozidas pasiţymi maţesniu slopinančiu poveikiu [1,30,31,32,33].
1.3.2 Priešvėţinis poveikis
Paprastoji kiaulpienė savo sudėtyje kaupia triterpenoidus ir seskviterpenus, dėl kurių augalas pasiţymi antikarcinogeniniu poveikiu. Juo ypač pasiţymi triterpenoidų grupei priklausantys taraksasterolis ir tarakserolis, kurie sukelia ţymų slopinamąjį poveikį [34]. Kiaulpienių vandeniniai ekstraktai buvo naudojami tradicinėje medicinoje Azijos šalyse, Europoje ir Šiaurės Amerikoje gydyti vėţį, įskaitant leukemiją ir krūties vėţį [8]. JAV mokslininkų atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad vandeninis kiaulpienių šaknų ekstraktas slopina MCF-7/AF krūties vėţio ląstelių invaziją ir sukelia kraujo vėţinių ląstelių apoptozę [8,35]. Antikarcinogeninis poveikis dėl ląstelių proliferacijos ir metastazių formavimosi proceso, buvo tiriamas in vitro. Gauti rezultatai parodė, kad šie ekstraktai gali sukelti ţmogaus hepatomos ląstelių apoptozę ir slopinti citotoksinų aktyvumą ţmogaus ţarnyno karcinomos ląstelių linijoje [1,36].
1.3.3. Poveikis kepenų ir tulţies funkcijai
Tradicinėje medicinoje kiaulpienė taip pat vartojama norint pagerinti kepenų funkciją [1,16]. 2010 metais Pietų Korėjoje atliktas tyrimas įrodė kiaulpienių šaknų ekstraktų antioksidacinį pajėgumą
bei gebėjimą sumaţinti lipidų peroksidaciją, taip apsaugant kepenų ląsteles nuo alkoholio poveikio [20]. Taip pat buvo nustatyta, kad seskviterpeninis laktonas pasiţymi stipriu efektu prieš ūmų toksinį poveikį kepenims [37]. Gydymas kiaulpienių šaknų vandens-etanolio ekstraktais skatina kepenų ląstelių nukenksminimą ir stiprina regeneracines savybes [1,38].
Paprastoji kiaulpienė pasiţymi choleretiniu poveikiu, kai tiesiogiai veikiama į kepenis ir kiaulpienė didina tulţies gamybą bei jos srautą į tulţies pūslę, o tiesiogiai veikiant į tulţies pūslę pasireiškia cholagoginis poveikis, kuomet sukeliami tulţies pūslės susitraukimai ir taip skatinamas tulţies išsiskyrimas. Cholagoginis efektas būdingas chlorogeno bei cikoro rūgštims [2,30,39,40]. Buvo atliktas tyrimas šunims su kiaulpienių šaknų ištraukomis ir nustatytas dvigubai didesnis tulţies išsiskyrimas. Tai parodė, kad tulţies išsiskyrimo didinimas, veikiant kiaulpienių šaknų ištraukomis, turi teigiamą poveikį esant tulţies latakų uţdegimui, hepatitui, kepenų perkrovai, tulţies pūslės akmenligei [1,30,40].
1.3.4. Poveikis virškinimo sistemai
Seskviterpeniniai laktonai, išskirti iš kiaulpienės šaknų etanolinio skystojo ekstrakto, pasiţymi virškinimą stimuliuojančiu poveikiu ir esant tokiems sutrikimams Vokietijos komisija ir Europos fitoterapijos mokslo kooperatyvas (ESCOP) rekomenduoja vartoti kiaulpienės ekstraktus [30,41]. Paprastojoje kiaulpienėje esančios karčiosios medţiagos skatina skrandţio sulčių ir seilių sekreciją bei didina tulţies gamybą ir išsiskyrimą. Todėl kiaulpienė pasiţymi virškinimą ir apetitą gerinančiomis savybėmis, švelniu vidurius laisvinančiu poveikiu. Padeda esant vidurių uţkietėjimui, ţarnyno spazmams, viduriavimui, lėtiniam kolitui, skrandţio bei ţarnyno opoms. Atliktame tyrime su pelėmis buvo nustatyta, jog ekstraktai sukelia storosios ţarnos lygiųjų raumenų susitraukimus [42]. Atlikto klinikinio tyrimo metu, pacientams, sergantiems nespecifiniu opiniu kolitu, buvo paskirtas vaistaţolių derinys, tarp kurių buvo ir kiaulpienių šaknys, ir praėjus 15 gydymo dienų dingo vidurių uţkietėjimas [1,30,41,42,43,44]. Taip pat jos skiriamos esant pilvo pūtimui, dispepsijai, pykinimui ir vėmimui. Indėnų tradicinėje medicinoje kiaulpienę naudojo esant skrandţio veiklos sutrikimams bei rėmeniui [43].
Kiaulpienių šaknų nauda sveikatai buvo ištirta ir atsiţvelgiant į didelę dalį inulino (iki 40 %), kuris veikia kaip gleivinę raminantis komponentas, taip pat atlieka ir prebiotiko funkciją ir stipriną imuninę sistemą [8,41,44]. Inulinas yra mitybinė probiotikų medţiaga, padedanti jiems įsitvirtinti ţarnyne. Atliktame in vitro tyrime, buvo nustatyta, kad kiaulpienių šaknų infuzijos skatina probiotikų
Lactobacilli ir Bifidobacteria 14 padermių augimą ir padeda atkurti normalią ţarnyno mikroflorą
1.3.5.Diuretinis poveikis
Kiaulpienė plačiai naudojama kaip diuretinį poveikį turintis augalas, didinantis šlapimo gamybą, skatinant druskų ir vandens išsiskyrimą. Kaip natūralus diuretikas jis intensyviai vartojamas tradicinėje liaudies medicinoje ir modernioje fitoterapijoje Europoje, Azijoje, Amerikoje [1]. Atliktame tyrime in vivo su pelėmis, buvo tiriamas diuretinis poveikis vandeninių ekstraktų, gautų iš kiaulpienių lapų ir šaknų. Buvo nustatyta, jog vandeninis kiaulpienių lapų ekstraktas yra stipresnis uţ šaknų vandeninį ekstraktą ir turi tokį stiprų diuretinį poveikį kaip furozemidas. Kiaulpienė taip pat pasiţymi geresniu diuretiniu efektu negu kiti augalai, tokie kaip dirvinis asiūklis ir paprastasis kadagys [1,30,45]. Paprastoji kiaulpienė kaupia kalį, kuris pakeičia diurezės metu prarandamą kalio kiekį, taip padedama išvengti galimo šalutinio poveikio tokio kaip kraujotakos kolapsas, kuris būdingas sintetiniams diuretikams [3]. Diuretinėmis savybėmis pasiţyminti kiaulpienė vartojama norint išvengti ir gydyti inkstų akmenligę, kitas inkstų ligas, šlapimo takų infekcijas, taip pat gali būti vartojama hipertenzijai, edemoms, kepenų ligoms, vandens susilaikymui organizme gydyti [1,30,45].
1.4. Polifenoliniai junginiai
Polifenoliniai junginiai – tai natūralūs antriniai augalų metabolitai, viena iš gausiausių ir labiausiai paplitusių medţiagų grupių augalų karalystėje. Jų gausu augaliniame maiste, tokiame kaip: vaisiai, darţovės, grūdai, ankštiniai augalai bei augalinės kilmės gėrimai. Pagal struktūrą gausi polifenolinių junginių grupė klasifikuojama į fenolius, fenolines rūgštis, kumarinus, flavanoidus, taninus, stilbenus. Yra ţinoma daugiau nei 8000 skirtingos struktūros fenolinių junginių. Šie junginiai turi polinkį pasiţymėti stipriu antioksidaciniu aktyvumu, antivirusiniu, priešuţdegiminiu, priešvėţiniu poveikiu, maţina oksidacinio streso sukeltus audinių paţeidimus [15,46].
1.5. Laisvieji radikalai
Laisvieji radikalai apibūdinami kaip atomai ar molekulės, kurios turi neporinį elektroną. Nedidelis jų kiekis nuolat susidaro organizme, vykstant normaliems ląstelių procesams, jie dalyvauja kaip antriniai signalo perdavėjai, skatina organizmą kovoti su mikroorganizmais. Tačiau patogeninė būklė ar kiti veiksniai, tokie kaip stresas, vaistai, UV spinduliuotė, cigarečių dūmai, gali paskatinti per didelį laisvųjų radikalų susidarymą ir sukelti ţalingą būklę organizmui – oksidacinį stresą [47].
1.6. Antioksidantai
Antioksidantai – medţiagos, kurios gali apsaugoti organizmo ląsteles nuo laisvųjų radikalų ţalingo poveikio. Neutralizuojant antioksidantus, jie atiduoda savo elektronus ir taip saugo kitas ląsteles. Vaisiai ir darţovės yra antioksidantų šaltinis ir pasiţymi apsauginėmis savybėmis prieš oksidacinio streso sukeliamas ligas. Vitaminai A, C, E, karotenoidai, cinkas, selenas, flavanoidai, fenolinės rūgštys atlieka svarbų vaidmenį neutralizuojant laisvuosius radikalus [47,48].
1.7. Bendra ištraukų apţvalga
1.7.1. Tinktūros
Tai skysti preparatai, gaminami nešildant ir negarinant ekstrahento ir gaunami iš dţiovintų (sausų) augalinės kilmės ţaliavų [49,50]. Būna etanolinės, etanolinės-vandeninės, etanolinės-eterinės ištraukos. Vakarų Europos farmakopėjose tinktūros atsirado XVII amţiuje, ši grupė yra priskiriama prie seniausių pasaulyje galeninių preparatų. Tinktūros yra gaminamos maceracijos, perkoliacijos būdais,naudojant tam tikros koncentracijos etanolį. Taip pat gali būti gaunamos ištirpinant arba praskiedţiant ekstraktus tam tikros koncentracijos etanoliu [17,49]. Tinktūrų gamybai daţniausiai taikomas klasikinis maceracijos metodas. Gaminant šiuo metodu naudojama 1 masės dalis augalinės ţaliavos ir apipilama 5 arba 10 tūrio dalių atitinkamos koncentracijos ekstrakcijos tirpiklio. Esant kambario temperatūrai, uţdarytas indas laikomas 7 paras, vis pamaišant, kad aktyvūs junginiai iš ţaliavos pereitų i tirpiklį ir jame ištirptų. Po to gauta tinktūra filtruojama, augalinė ţaliava dar kartą perplaunama. Gauta ištrauka turi sudaryti 5 arba 10 tūrio dalių, keletą dienų paliekama pastovėti ir filtruojama.
Klasikinis maceracijos metodas netobulas ir turi daug trūkumų: 1) ilgai tęsiasi, nes labai lėtai vyksta difuzijos procesas;
2) susidaro nuostolių ekstrahentui išgaravus; 3) dideli difuzijos proceso nuostoliai;
4) sunku maišyti išbrinkusią ţaliavą: reikalingi mechaniškai stiprūs, specialūs maišikliai, kurie sunaudoja daug energijos [49].
1.7.2.Ekstraktai
Ekstraktai – koncentruotos augalinės ţaliavos ištraukos, kurios skirstomos į kietos, skystos bei tirštos konsistencijos preparatus. Ekstraktai gaunami iš švieţios augalinės, dţiovintos augalinės ir gyvūninės kilmės medţiagos (Ph.Eur. 04/2008:0765). Ekstrahuojama ţaliava, skirta preparatų gamybai, turi būti apdorota - inaktyvinti fermentai, ţaliava susmulkinta ar iš jos pašalinti riebalai. Ekstraktai priskiriami galeniniams preparatams [49,50]. Galeno laikais (129 – 201) buvo ţinomi tik vandeniniai ekstraktai.
Atsiţvelgiant į konsistenciją, pagal tai, kiek drėgmės yra ekstrakte, jie klasifikuojami į 4 grupes:
Skystieji ekstraktai (Extracta fluida);
Tirštieji ekstraktai (Extracta spissa);
Sausieji ekstraktai (Extracta sicca);
Pusiau tirštieji ekstraktai (Extracta tenua s. mollia).
Skystieji ekstraktai yra gaminami ekstrahuojant augalinę ţaliavą tam tikros koncentracijos ekstrahentu (daţniausiai etanoliu). Ekstraktai gaminami santykiu (1:1) taip, kad iš 1 augalinės ţaliavos masės dalies būtų gaunama 1 tūrio dalis skystojo ekstrakto. Gaminant skystuosius ekstraktus parenkami tokie ekstrahavimo metodai, kad iš augalinės ţaliavos būtų išekstrahuota kuo daugiau veikliųjų medţiagų. Skiriami tokie gamybos būdai: perkoliacija, reperkoliacija, maceracija.
Perkoliacijos proceso metu augalinė ţaliava yra brinkinama nedideliu kiekiu pasirinkto ekstrakcijos tirpiklio. Taip paruošta ţaliava paliekama 15 min. ir ilgiau, po to perkeliama į perkoliatorių, uţpilama tirpikliu, perkoliatoriai uţdaromi. Paliekama 24 val ar ilgiau maceruotis. Renkamas gautas ekstraktas, vis prisotinant augalinę ţaliavą ekstrahentu, kad būtų išplaunamos visos išsiekstrahavusios medţiagos [49,51].
Reperkoliacijos metodo esmė – gaunama labiau koncentruota, skysta etanolinė ištrauka. Vaistinė augalinė ţaliava dalijama į kelias dalis. Pirmoji ţaliavos dalis ekstrahuojama grynuoju ekstrahentu, kitos ţaliavos dalys ekstrahuojamos prieš tai surinktos dalies ištrauka, taip pereinama per kelis perkoliatorius ir ekstraktas tampa koncentruotas. Šio ekstrahavimo proceso metu daţniausiai naudojami 3 – 6 perkoliatoriai. Skiriami keturi reperkoliacijos tipai:
Reperkoliacija, turinti baigiamąjį ciklą be garinimo, kai ţaliava dalijama į tris nelygias dalis.
Reperkoliacija, turinti baigiamąjį ciklą be garinimo, kai ţaliava dalijama į tris lygias dalis.
Reperkoliacija, turinti baigiamąjį ciklą ir iš dalies pirminio ekstrakto garinimą.
Pagaminti skystieji ekstraktai laikomi keletą dienų ne aukštesnėje kaip 8 °C temperatūroje, vėliau išvalomi nuo balastinių medţiagų [49].
1.8. Ekstrahentų, naudojamų augalinių ištraukų gamyboje, charakteristikos
Svarbu parinkti tinkamą ekstrahentą, norint pagaminti kokybišką vaistą. Ekstrahentas parenkamas atsiţvelgiant į šias savybes:
1. Selektyvus, tirpina tik tas medţiagas, kurias reikia ekstrahuoti; 2. Chemiškai indiferentiškas ekstrahuojamoms medţiagoms; 3. Stabdo mikrofloros veikimą ekstrakte;
4. Farmakologiškai indiferentiškas; 5. Lakus, išgarinus nepalieka kvapo;
6. Nedegus, nesudaro su oru sprogstamųjų medţiagų; 7. Pigus.
Vanduo pasiţymi daugeliu anksčiau išvardintų savybių ir daţniausiai vartojamas vienas ar mišiniuose su organiniais tirpikliais (pvz. etanoliu). Yra skiriamas kelių švarumo kategorijų vanduo: išgrynintas ir distiliuotas, nemineralizuotas ir geriamasis. Pastarasis turi atitikti higienos normas [49]. Gaminant įvairias vaistų formas,išskyrus injekcinius vaistus, naudojamas išgrynintas arba distiliuotas vanduo. Toks vanduo turi atitikti Europos farmakopėjoje (Ph.Eur. 01/2009:0008) nurodytus reikalavimus [50]. Metodai, kuriais gaminamas išgrynintas vanduo yra distiliacija, jonų mainų osmosas. Vandeninių ekstraktų trūkumas – jie lieka nepatvarūs laikymo metu. Juose atsiranda mikroorganizmų ir ekstraktai greitai sugenda. Nepaisant to, vanduo vis tiek išlieka daţniausiai naudojamu tirpikliu pasaulyje [17,49].
Etanolis – antras pagal populiarumą tirpiklis po vandens, kuris yra daţniausiai pasirenkamas modeliuojant farmacinius preparatus, vartojamus per os [49]. Etanolis turi atitikti Europos farmakopėjoje (01/2008:1317) nurodytus reikalavimus [50]. Šis ekstrahentas turi neigiamų savybių, tokių kaip: farmakologinis neindiferentiškumas, ţema uţsiliepsnojimo temperatūra ir kt., tačiau daţną jo pasirinkimą nulemia atrankumas ir atsparumas mikroorganizmams. Didelį etanolio pritaikymą lemia jo gebėjimas maišytis su vandeniu bei ištirpinti daugelį vandenyje netirpių medţiagų. Daugiausiai farmacijoje, kaip ekstrahentas, naudojami etanolio-vandens mišiniai [49,52].
Taigi, eksperimentinių tyrimų metu, paprastosios kiaulpienės ištraukų gamyboje kaip ekstrahentus planuojama naudoti distiliuotą vandenį bei etanolį.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Naudotos medţiagos
1) 96 proc. etanolis (AB „Vilniaus degtinė“, Lietuva);
2) 2,2-difenil-1- pikrilhidrazilo (DPPH) radikalas (,,Sigma -Aldrich“, Vokietija); 3) Folin–Ciocalteau fenolinis reagentas (,,Merck“, Vokietija);
4) Natrio karbonatas (,,Sigma -Aldrich“, Vokietija);
5) Galo rūgšties monohidratas („Sigma -Aldrich“, Vokietija); 6) Kiaulpienių šaknys (Lietuva);
7) Kiaulpienių ţiedai (Lietuva); 8) Distiliuotas vanduo.
2.2. Naudota aparatūra
Atliekant eksperimentinius tyrimus buvo naudota ši aparatūra ir prietaisai:
Svarstyklės (Kern EMB 200-3, KERN & Sohn GmbH, Vokietija);
UV spektrofotometras (Shimadzu UV-1800 Spectrophotometer, JAV);
Ultragarsinė vonelė (Bandelin Sonorex Digitec, Vokietija);
Chromatografas (Waters Corporation, Milford, USA);
Dţiovinimo spinta (,,Memmert UN55“, Vokietija);
Centrifuga („Sigma 3-18 KS“, Vokietija).
2.3. Paprastųjų kiaulpienių ţaliavos ištraukų paruošimas
2.3.1. Reperkoliacijos metodas
Ekstrahavimo metodu, reperkoliacijos būdu, turinčiu baigiamąjį ciklą, be garinimo, kai ţaliava dalijama į tris lygias dalis, pagaminti paprastųjų kiaulpienių šaknų skystieji ekstraktai. Ţaliavoms ekstrahuoti buvo naudotas ekstrahentas - skirtingų koncentracijų etanolis (40 %, 50 %, 70 %). Šiuo metodu pagamintos 3 serijos ekstraktų. Ekstrahuojama ţaliava dalijama į tris lygias dalis (8,33 g), pakraunama į tris perkoliatorius. Iš pirmo perkoliatoriaus gauta maţiau koncentruota ištrauka, vartojama ţaliavai perkoliuoti antrame perkoliatoriuje. Antroji koncentruota ištrauka, gauta iš antro
perkoliatoriaus, vartojama perkoliuoti trečiame perkoliatoriuje esančiai augalinei ţaliavai. Perkoliacija vyksta tris dienas. Norint visiškai išekstrahuoti ţaliavą, kiekvienas perkoliatorius plaunamas švaraus ekstrahento, tam tikros koncentracijos etanoliu. Iš paskutinio perkoliatoriaus yra surenkama tiek dalių ekstrakto, kiek buvo masės dalių ţaliavos pakrauta į perkoliatorius. Surinktos 25 ml paprastųjų kiaulpienių šaknų ir ţiedų ištraukos.
2.3.2. Perkoliacijos metodas
Perkoliacijos metodu, gaminamos 25 ml ištraukos, santykiu 1:5. Buvo naudojamas trijų skirtingų koncentracijų etanolis – 40 %, 50 %, 70 %. Ekstrahuojama augalinė ţaliava sumaišoma su nedideliu kiekiu ekstrahento (etanoliu), po to pakraunama į perkoliatorių ir uţpilama ekstrahento, kad virš ţaliavos būtų 8-10 mm sluoksnis. Po trijų parų atsukamas perkoliatoriaus čiaupas ir surenkama ištrauka, vis pridedant į perkoliatorių reikiamą kiekį tirpiklio. Tuo metodas ir efektyvus, kad ţaliava nuolat plaunama vis naujomis etanolio porcijomis, taip išplaunamos biologiškai aktyvios medţiagos.
2.3.3. Klasikinės maceracijos metodas
Tinktūros gamintos santykiu 1:5. Gaminimui imta 5 g dţiovintų paprastųjų kiaulpienės šaknų ir uţpilta 5 kartus didesniu tam tikros koncentracijos (40 %, 50%, 70%) ekstrahento (etanolio) kiekiu. Paliekama, esant kambario temperatūrai, 7 paroms, vis pamaišant. Reikalingas tirpiklio kiekis paskaičiuojamas pagal formulę, atsiţvelgiant į sugerties koeficientą: c = V + a*k, kai:
c – bendras etanolio kiekis (ml);
V – norimas pagaminti tinktūros kiekis (ml); a – ţaliavos kiekis (g);
k – šaknų sugerties koeficientas (1,5).
2.3.4. Ultragarso metodas
Paprastųjų kiaulpienių šaknų ekstraktai buvo gaminti ultragarso vonelėje (Bandelin Sonorex Digitec, Vokietija), santykiu 1:5, masės - tūrio metodu. Atsvertas tikslus ţaliavos kiekis, tiek kiek gaminant anksčiau aprašytuose klasikinės maceracijos ir perkoliacijos metoduose. Uţpilama skirtingomis etanolio koncentracijomis – 40 %, 50 %, 70 %. Vykdoma ekstrakcija 10 min, 20 min, 30
min. Vėliau ištraukos centrifuguojamos 5 min, 4700 apsisukimų/min greičiu ir filtruojamos pro sudrėkintą filtro popierių.
2.4. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras fenolinių junginių kiekis paprastųjų kiaulpienių augalinėje ţaliavoje, išreikštas kavos rūgšties ekvivalentais (CAE) gramui sausos ţaliavos (mg/g). Nustatomas naudojant standartinį Folin-Ciocalteu metodą [6,39]. Šio metodo principas pagrįstas kolorimetrine oksidacijos/redukcijos reakcija. Reakcija atliekama mėgintuvėliuose. Imama 2,5 ml Folin-Ciocalteu (1:10) tirpalo, pridedama 0,5 ml tiriamojo tirpalo ir įpilama 2ml 7,5 % natrio karbonato tirpalo. Kiekvienos koncentracijos ţaliavai padaroma po 3 mėginius. Tirpalai paliekami kambario temperatūroje, 30 min, kol spalva pereina į mėlyną. Po to atliekama spektrofotometrinė analizė, esant 765 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas yra naudojamas išgrynintas vanduo. Tirti kiekvieno bandinio trys mėginiai ir išvestas aritmetinis vidurkis.
2.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH)
radikalinio sujungimo metodu
Antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo to, kiek procentų stabilaus DPPH radikalo neutralizuoja tiriamojoje ţaliavoje esantys fenoliniai junginiai. Reakcija atliekama kiuvetėse, į jas įpilama 0,1 ml tiriamojo tirpalo ir sumaišoma su 2,9 ml 0,1 mmol/konc. laisvo radikalo tirpalu. Paliekama tamsioje vietoje, 30 minučių, kambario temperatūroje. Vėliau matuojama mėginių absorbcija su spektrofotometru, esant 515 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas buvo naudojamas 96 % etanolis. Išmatuojama ir DPPH etaloninio tirpalo absorbcija. Kiekvienas bandinys matuotas 3 kartus.
Tirpalų aktyvumas apskaičiuojamas inaktyvinto DPPH kiekio procentais: AA = (A0– At)/A0 × 100 proc.;
AA – antioksidacinis aktyvumas %; A0 – gryno DPPH absorbcija;
2.6. Paprastųjų kiaulpienių šaknų ir ţiedų analizė ESC metodu
Efektyvioji skysčių chromatografija šiuo metu yra vienas iš daţniausiai taikomų metodų augalų cheminei sudėčiai tirti. Šis metodas pagrįstas medţiagų daugkartine sorbcija ir desorbcija, joms judant judriosios fazės sraute per stacionariąją fazę [53,54]. ESC metodui būdingas didelis efektyvumas, atrankumas, skiriamoji geba ir rezultatų atkūrimas [55].
Chlorogeno ir kavos rūgščių kiekiui nustatyti taikytas Europos farmakopėjoje aprašytas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas (Eur. Ph. 01/2011:1054). Analizei atlikti naudotas „Waters2695“chromatografas (Waters Corporation, Milford, USA) su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 996 PDA“ (Waters Corporation, Milford, USA).
Chromatografinis skirstymas atliktas ACE C18 (250x4,6mm, 5μm) kolonėle (Advanced Chromatography Technologies, Scotland). Analizės metu judriąją fazę sudarė acto rūgšties ir vandens mišinys (eliuentas A) ir acetonitrilas (eliuentas B). Fenolinių junginių nustatymas atliekamas esant 320 nm šviesos bangos ilgiui. Tėkmės greitis - 1,0 ml/min; injekcijos tūris – 10 μL; kolonėlės temperatūra –25o
C; analizės trukmė – 67 min. [56]. Chromatografinės analizės duomenims apdoroti naudota programinė įranga: Empower2 (Waters Corporation, Milford, JAV).
Paprastųjų kiaulpienių šaknų ir ţiedų kiekybiniam veikliųjų junginių įvertinimui buvo taikytas kalibracinio grafiko sudarymo metodas. Chlorogeno ir kavos rūgščių standartai buvo ištirpinti etanolyje (96,3 % v/v). Kalibracinės kreivės sudarytos kiekvienam standartui iš 7 taškų. Chlorogeno rūgšties kalibracinio grafiko koncentracijos ribos 0,002–0,134 mg/ml ir kavos rūgšties grafiko koncentracijos ribos 0,002–0,131 mg/ml (2 pav.). Įvertinus tiesiškumą nustatyta, kad kalibraciniai grafikai tenkina validacinius parametrus, nes abiejų junginių tiesiškumas buvo ne maţesnis kaip R2=0,99998. Paprastosiose kiaulpienėse esantys fenoliniai junginiai identifikuoti lyginant jų sulaikymo laikus ir standartų spektrus. Koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal chromatografinių smailių plotus.
2 pav. Kalibracinės kreivės chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties kiekiui nustatyti: žalia spalva -
2.7. Sauso likučio kiekio nustatymas gravimetriniu metodu
Sausas likutis nustatytas naudojant dţiovinimo spintą MEMMERT (Vokietija, 2012m.). Tyrimui imta po 5ml kiekvienos etanolinės ištraukos. Bandymas kartotas 3 kartus.
2.8. Gautų duomenų statistinis vertinimas
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2007 programą. Buvo susisteminti duomenys, apskaičiuoti vidurkiai, pokyčiai, paklaidos, standartiniai nuokrypiai bei Spirmeno koreliacijos koeficientai. Pasirinktas reikšmingumas p = 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrahento įtaka paprastųjų kiaulpienių ţaliavos ištraukos kokybei
Labai svarbu tinkamai parinkti ekstrakcijos sąlygas, norint uţtikrinti maksimalią vaistinės augalinės ţaliavos biologiškai aktyvių junginių išeigą ir farmakologinį aktyvumą [6]. Uţ farmakologinį aktyvumą T.officinale augalinėje ţaliavoje yra atsakingi fenoliniai junginiai [53]. Siekiant uţtikrinti didţiausią biologiškai aktyvių junginių išeigą, atliekama ekstrakcijos tirpiklio parinkimo įtaka bendram fenolinių junginių kiekiui paprastosios kiaulpienės šaknų ištraukose. Optimalaus tirpiklio parinkimas, kuris uţtikrintų didţiausią fenolinių junginių išeigą, buvo atliekamas naudojant įvairios koncentracijos vandens ir etanolio mišinius: 40, 50, 70 %. Tirpiklių pasirinkimą lėmė jų tinkamumas fenolinių rūgščių ekstrahavimui bei saugumas vartojimui. Spektrofotometriškai atlikus fenolinių junginių analizę ir antioksidacinio aktyvumo nustatymą iš paprastųjų kiaulpienių šaknų ištraukų, gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) ir antioksidacinis aktyvumas T.officinale šaknų ekstraktuose, naudojant skirtingos koncentracijos etanolinius tirpalus;
*Rezultatai gauti tiriant 4 mėginius (n=4).
Tirpiklis Vanduo 40 % etanolis 50 % etanolis 70 % etanolis Bendras fenolinių junginių
kiekis pagal CAE (mg/g) 2,12±0,04 3,53±0,02 3,84±0,01 3,78±0,02
Antioksidantinis aktyvumas 8,12 % 69,69 % 77,23 % 79,95 %
Gauti tyrimo rezultatai, lyginant su kitų mokslininkų gautais duomenimis, rodo, kad geriausiai veikliosios medţiagos išekstrahuojamos 50 % etanolio tirpalu [53]. Didţiausia gauta fenolinų junginių išeiga paprastosios kiaulpienės šaknų ekstraktuose (3,84±0,01 mg/g), naudojant 50 % etanolio tirpiklį. Šiek tiek maţesnė išeiga yra gauta 70 % etanolio ektraktuose - (3,78±0,02 mg/g). Statistiškai reikšmingo skirtumo nėra (p>0,05). Maţiausiai fenolinių junginių nustatyta naudojant vandenį kaip ekstrakcijos tirpiklį (2,12±0,04 mg/g). Iš etanolinių ekstraktų maţiausia fenolinių junginių išeiga (3,53±0,02 mg/g) pasiţymėjo ekstraktai, kuriems buvo naudotas 40 % etanolio tirpalas. Antioksidacinio aktyvumo (AA) didţiausia reikšmė pastebima 70 % ekstrahente, tačiau nėra didelio skirtumo lyginant su 50 % etanoliu (p>0,05). Maţiausia AA reikšmė nustatyta vandeniniame ekstrakte. Didţiausia fenolinių junginių išeiga gauta ţiedų ekstraktuose (5,82±0,02 mg/g) nustatyta naudojant 50 % etanolį. Maţiausiai efektyvūs tirpikliai: vanduo ir 40 % etanolis (atitinkamai
2,2±0,03mg/g ir 4,86±0,04 mg/g). Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (80,21 %) pastebimas 50 % ekstrahente. Šiek tiek maţiau – 70 % etanolio ištraukose, tačiau nėra statistiškai reikšmingo skirtumo (p>0,05). Maţiausia AA reikšmė vandeninėje ištraukoje ir 40 % ekstrahente. Rezultatai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) ir antioksidacinis aktyvumas T.officinale ţiedų ekstraktuose, naudojant skirtingos koncentracijos etanolinius tirpalus;
*Rezultatai gauti tiriant 4 mėginius (n=4).
Tirpiklis Vanduo 40 % etanolis 50 % etanolis 70 % etanolis Bendras fenolinių junginių
kiekis pagal CAE (mg/g) 2,2±0,03 4,86±0,04 5,82±0,02 5,35±0,03
Antioksidantinis aktyvumas 26,45 % 77,51 % 80,21 % 79,72 %
Pagal literatūros duomenis, didţiausią dalį paprastųjų kiaulpienių šaknyse ir ţieduose esančių fenolinių junginių sudaro fenolinės rūgštys, todėl tyrimo metu buvo nustatyta, kad 50 % etanolio tirpiklis yra pagrįstai tinkamas biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai. Taip pat Korėjos mokslininkų Hye-Jin Jeon, Hyun-Jung Kang, Young-Sook Kang atliktame tyrime su pelėmis buvo įrodytas etanolinių ekstraktų veiksmingumas, turintis įtakos priešuţdegiminiam, antiangiogeniniam poveikiui [18]. Kadangi didţiausia fenolinių junginių išeiga paprastosios kiaulpienės šaknų ir ţiedų ištraukose nustatyta naudojant 50 % etanolį, tolesniuose etapuose, vertinant optimalų ekstraktų gamybos metodą, antioksidacinį aktyvumą, bendrą fenolinių junginių kiekį, kaip tirpiklis yra pasirinktas 50 % vandens ir etanolio mišinys.
3.2. Perkoliacijos metodo įtaka paprastųjų kiaulpienių ištraukų kokybei
Eksperimentinio tyrimo metu buvo tiriamas perkoliacijos metodas ištraukų gamybai, siekiant nustatyti šio metodo efektyvumą. Metodo efektyvumui nustatyti buvo tiriami šie standartiniai rodikliai: bendras polifenolinių junginių kiekis pagal kavos rūgštį bei sausas likutis. Rezultatai pateikiami 3pav.
3 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis pagal kavos rūgštį, taikant perkoliacijos metodą.
Įvertinus rezultatus, gautus tiriant bendrąjį polifenolinių junginių kiekį pagal kavos rūgštį, didţiausias polifenolinių junginių kiekis (4,34 mg/g) randamas, kai ekstrahentas etanolis yra 70 %. Kai ekstrahentas 50 % etanolis (3,86 mg/g), tarp gautų rezultatų statistiško skirtumo nepastebėta. Naudojant kaip ekstrahentą 40 % etanolį yra pastebimas statistiškai reikšmingas maţesnis polifenolinių junginių kiekis (3,69 mg/g).
Nustačius sausą likutį perkoliacijos būdu pagamintose ištraukose (4 lentelė), buvo pastebėta jog tinkamiausias ekstrahentas yra 50 % etanolis. Naudojant 70 % etanolį statistiškai reikšmingo skirtumo nepastebėta. Įvertinus 40 % ir 50 % ištraukų sausus likučius, pastebėtas statistiškai reikšmingas maţesnis skirtumas (p<0,05).
4 lentelė. Tyrimo duomenys sauso likučio kiekio nustatymui paprastųjų kiaulpienių ištraukose, pagamintose perkoliacijos metodu.
Sausas likutis (%)
Paprastųjų kiaulpienių ištraukos, gautos perkoliacijos metodu
40 % 50 % 70 %
23,26±0,09 24,07±0,06 23,89±0,08
3.3. Klasikinės maceracijos metodo įtaka paprastųjų kiaulpienių ištraukų kokybei
Toliau buvo vertinamas pasirinktas maceracijos metodas. Efektyvumo nustatymui buvo pasirinkti tie patys standartiniai rodikliai: bendras polifenolinių junginių kiekis pagal kavos rūgštis bei
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 40% 50% 70% B endras fenol inių jun gi nių kie kis pagal C A E , m g/ g Etanolio koncentracija
sausas likutis. 4 paveiksle pateikti tyrimo rezultatai gauti tiriant bendrąjį polifenolinių junginių kiekį pagal kavos rūgštį.
4pav.Bendras fenolinių junginių kiekis pagal kavos rūgštį, taikant klasikinį maceracijos metodą.
Kaip matyti iš pateiktų rezultatų, didţiausias kiekis polifenolinių junginių (2,60 mg/g) yra nustatomas naudojant 70 % ekstrahentą – etanolį. Gautas bendras polifenolinių junginių kiekis maţesnis nei Korėjos mokslininkų atliktame tyrime, kai paprastųjų kiaulpienių šaknų etanolinėje ištraukoje buvo gautas 7,15 mg/g fenolinių junginių kiekis [57]. Statistiškai reikšmingas skirtumas pastebėtas kai ekstrahentas yra 50 % etanolis (2,18 mg/g), lyginant su 70 % etanoline ištrauka. Tarp 50 % ir 40 % ištraukų statistiškai reikšmingo skirtumo nėra (p>0,05).
Maţiausias sauso likučio kiekis ištraukose, gautose maceracijos metodu yra, kai ekstrahentu naudojamas 50 % etanolis. Tinkamiausias ekstrahentas pagal gautus sauso likučio rezultatus (22,03±0,05 %) yra 40 % etanolis. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp 50 % ir 70 % ekstrahento nėra (p>0,05) (5 lentelė).
5 lentelė. Tyrimo duomenys sauso likučio kiekio nustatymui paprastųjų kiaulpienių ištraukose, pagamintose maceracijos metodu.
Sausas likutis (%)
Paprastųjų kiaulpienių ištraukos, gautos maceracijos metodu
40 % 50 % 70 % 22,03±0,05 20,75±0,1 20,92±0,06 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 40% 50% 70% Etanolio koncentracija B endras fenol inių jun gi nių kie kis pagal C A E , m g/ g
3.4. Reperkoliacijos metodo įtaka paprastųjų kiaulpienės ekstraktų kokybei
Eksperimento metu buvo įvertintas bendras fenolinių junginių kiekis pagal kavos rūgštį bei sausą likutį, taikant reperkoliacijos metodą, kuris vertinamas kaip efektyviausias metodas ištraukų gamyboje. Rezultatai pateikti 5 pav.
5pav. Bendras fenolinių junginių kiekis pagal kavos rūgštį, taikant reperkoliacijos metodą
Gauti rezultatai parodė visai kitokius duomenis nei ankstesni taikyti metodai ištraukų gamyboje. Nustatyta, kad didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis (5,68 mg/g) randamas, kai ekstrahentu yra parinktas 50 % etanolis. Įvertinus visas tris ekstrahento koncentracijas, maţiausias kiekis yra randamas 40 % – 4,98 mg/g. Pagal gautus rezultatus statistiškai reikšmingas skirtumas yra pastebimas tarp ekstrahento 40 % ir 50 % etanolio, p<0,05.
6 lentelėje pateikiami sauso likučio kiekio, gauto ištraukose, pagamintose reperkoliacijos metodu, rezultatai. Kaip ir nagrinėjant perkoliacijos metodu pagamintų ištraukų sausą likutį, taip ir šiuo atveju tinkamiausias ekstrahentas yra 50 % etanolis (24,4±0,06 %). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp 40 ir 50 % ekstrahento (p<0,05). O lyginant 40 % ir 70 % – reikšmingo skirtumo nėra (p>0,05). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 40% 50% 70% Etanolio koncentracija B endras fenol inių jun gi nių kie kis pagal C A E , m g/ g
6 lentelė. Tyrimo duomenys sauso likučio kiekio nustatymui paprastųjų kiaulpienių ištraukose, pagamintose reperkoliacijos metodu.
Sausas likutis (%)
Paprastųjų kiaulpienių ištraukos, gautos reperkoliacijos metodu
40 % 50 % 70 %
23,36±0,08 24,51±0,06 22,94±0,09
3.5. Ekstrahavimo ultragarsu įtaka paprastųjų kiaulpienių šaknų ištraukų kokybei
Eksperimentiniame tyrime buvo pritaikytas ultragarsinis metodas paprastųjų kiaulpienių šaknų ištraukų gamybai. Ultragarsinėje aplinkoje uţpilta VAŢ laikoma 10, 20, 30 minučių. Metodo efektyvumas analizuojamas pagal rodiklius: bendrą polifenolinių junginių kiekį pagal kavos rūgštį bei sausąjį likutį. Gauti tyrimo rezultatai pateikti 6 pav.
6 pav. Bendras polifenolinių junginių kiekis pagal kavos rūgštį, naudojant ultragarsinį metodą.
Vertinant gautus rezultatus taikant ultragarso metodą, matoma, kad didţiausias bendras polifenolinių junginių kiekis (3,64 mg/g), gautas naudojant 50 % etanolį kaip ekstrahentą. Naudojant ekstrahentą etanolį 70 % yra gaunamas maţiausias kiekis polifenolinių junginių (2,77 mg/g). Fenolinių junginių išeiga neţymiai, bet didėja veikiant ultragarsu iki 20 min (p<0,05). Ilgiau trunkanti ekstrakcija ultragarso metodu, dėl galimo biologiškai aktyvių junginių skilimo, polifenolinių junginių kiekį ištraukose maţina (p<0,05). Ekstrahavimo ultragarsu reikšmingas laikas paprastųjų kiaulpienių šaknų
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 10 20 30 40% etanolis 50% etanolis 70% etanolis Laikas, min B endras fenol inių jun gi nių kie kis pagal C A E , m g/ g
ţaliavai yra 20 minučių. Tiek laiko trukusios ekstrakcijos metu nustatytas aktyvių junginių kiekis ţaliavų ištraukose. Po 30 minučių ultragarsinės ekstrakcijos gauti maţiausi polifenolinių junginių kiekiai: naudojant ekstrahentą 40 % etanolį – 3,17 mg/g, 50 % – 3,43 mg/g, 70 % – 2,77mg/g. Kaip matome pagal gautus rezultatus, nustatyta, kad nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp 10 minučių ir 30 minučių ultragarsinės ekstrakcijos (p>0,05).
Vertinant ultragarso būdu gautų ištraukų sausą likutį pastebima, kad maţiausias kiekis yra 50 % ekstrahente (20,58±0,03 %). Rezultatai pateikti 7 lentelėje. Kai ekstrahentu parenkamas 40 % etanolis yra gaunama didţiausia sauso likučio reikšmė. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp 50 % ir 70 % ekstrahento nepastebėta (p>0,05).
7 lentelė. Tyrimo duomenys sauso likučio kiekio nustatymui paprastųjų kiaulpienių ištraukose, pagamintose ultragarso būdu.
Sausas likutis (%) Paprastųjų kiaulpienių ištraukos,
gautos ultragarso būdu
40 % 50 % 70 %
21,83±0,07 20,58±0,03 20,92±0,09
3.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Tyrimo metu buvo nustatytas antioksidacinio aktyvumo įvairavimas priklausomai nuo ištraukų gamybos metodo. 7 paveiksle pateikti perkoliacijos metodu pagamintų ištraukų iš paprastosios kiaulpienės šaknų AA .
7 pav. DPPH radikalų surišimo geba paprastosios kiaulpienės šaknų ištraukose, pagamintose perkoliacijos metodu. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 40% 50% 70% Etanolio koncentracija D P P H radi kalų suri ši m o geba
Didţiausias AA aktyvumas (79,98 %) pasireiškia ištraukose, kuriose kaip ekstrahentas naudojamas 70 % etanolis. Rezultatai rodo, kad maţiausia laisvųjų radikalų surišimo geba (70,86 %) yra 40 % etanolio ištraukose. Tarp 40 ir 70 % etanolio koncentracijų yra pastebimas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05).
Eksperimentinio tyrimo metu, nustatyta priklausomybė tarp AA ir bendro fenolinių junginių kiekio (BFJK), chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties paprastosios kiaulpienės šaknų ištraukose, gamintose perkoliacijos metodu. Atliktas statistinis įvertinimas, rezultatai pateikti 8 lentelėje.
8 lentelė. Spirmeno koreliacijos ryšys tarp antioksidacinio aktyvumo, bendro fenolinių junginių kiekio, chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties.
Antioksidacinis aktyvumas (AA), % Bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g Chlorogeno rūgšties kiekis, mg/g Kavos rūgšties kiekis, mg/g Antioksidacinis aktyvumas (AA), % 1,000 0,9962 0,9689 -0,7922
*Tirta tarp perkoliacijos metodu pagamintų tinktūrų, n=4
Tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo gautas didelio stiprumo koreliacijos ryšys: Spirmeno koreliacijos koeficientas 0,9962. Šis ryšys yra statistiškai reikšmingas, nes p reikšmė yra maţesnė uţ 0,01. Taip pat stiprus ryšys tarp AA ir chlorogeno rūgšties (0,9689), o su kavos rūgštimi yra atvirkštinė priklausomybė. Tokiu atveju AA yra didesnis, kai kavos rūgšties kiekis yra maţesnis (-0,7922).
Atliktame eksperimente, kaip matoma 8 paveiksle, buvo tirta, kokį poveikį antioksidaciniam aktyvumui turi klasikinės maceracijos metodas.
8 pav. DPPH radikalų surišimo geba paprastosios kiaulpienės šaknų ištraukose, pagamintose klasikinės maceracijos metodu.
Gauti rezultatai rodo, kad maţiausiu AA aktyvumu (75,46 %) pasiţymi 40 % etanolio ištraukos. Pagal turimus rezultatus nėra nustatyto, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp naudojamų skirtingų koncentracijų etanolio ekstrahentų (p>0,05). Tačiau reikėtų atkreipti dėmesį, kad didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu (78,36 %) pasiţymi 70 % etanolio ekstrahentas.
Nustatytas koreliacijos koeficiento ryšys (pavaizduota 9 lentelėje) tarp bendro fenolinių junginių kiekio, antioksidacinio aktyvumo, kavos rūgšties ir chlorogeno rūgšties, gautų iš maceracijos būdu gamintų ištraukų.
9 lentelė. Spirmeno koreliacijos ryšys tarp AA, bendro fenolinių junginių kiekio, chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties.
Antioksidacinis aktyvumas (AA), % Bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g Chlorogeno rūgšties kiekis, mg/g Kavos rūgšties kiekis, mg/g Antioksidacinis aktyvumas (AA), % 1,000 0,8464 0,8731 -0,9971
*Tirta tarp maceracijos metodu pagamintų tinktūrų, n=4
Tarp DPPH radikalų surišimo gebos ir BFJK gautas Spirmeno koreliacijos koeficientas 0,8464. Rezultatas statistiškai patikimas, jo reikšmė maţesnė uţ 0,01. Įvertinant antioksidacinio aktyvumo su chlorogeno rūgštimi koreliacijos ryšį, galima pastebėti, kad nėra toks stiprus kaip prieš tai
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 40% 50% 70% Etanolio koncentracija D P P H radi kalų suri ši m o geba
aprašyto metodo ištraukų. Atvirkštinė priklausomybė pasireiškusi tarp AA ir kavos rūgšties (-0,9971) yra stiprus statistiškai priklausomas ryšys.
Norint ištirti laisvųjų radikalų surišimo gebą, buvo taikomas reperkoliacijos metodas. Šio metodo rezultatai pateikti 9 paveiksle.
9pav. DPPH radikalų surišimo geba paprastosios kiaulpienės šaknų ištraukose, pagamintose reperkoliacijos metodu.
Įvertinus gautus šio metodo rezultatus ir palyginus su ankščiau aprašytais, AA yra didţiausias – 70 % etanolio ištraukose (81,87 %). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp naudojamo 50 % ir 70 % etanolinio ekstrahento nėra (p>0,05). Maţiausia radikalų surišimo geba (73,35 %) vyrauja naudojamame 40 % etanolio ekstrahente.
Nustatytas AA ryšys tarp bendro fenolinių junginių kiekio, chlorogeno ir kavos rūgščių, gautų ekstraktų reperkoliacijos metodu. Atlikto statistinio įvertinimo rezultatai pateikiami 10 lentelėje.
10 lentelė. Spirmeno koreliacijos ryšys tarp AA, bendro fenolinių junginių kiekio, chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties.
Antioksidacinis aktyvumas (AA), % Bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g Chlorogeno rūgšties kiekis, mg/g Kavos rūgšties kiekis, mg/g Antioksidacinis aktyvumas (AA), % 1,000 0,7316 0,9755 -0,9859
*Tirta tarp reperkoliacijos metodu pagamintų ekstraktų, n=4
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 40% 50% 70% Etanolio koncentracija DP P H rad ik alų su riši m o ge b a
Atlikus koreliacijos statistinį įvertinimą nustatyta, kad tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo yra statistiškai patikima priklausomybė r=0,7316. Nustatytas stipriausias statistiškai priklausomas ryšys tarp AA ir chlorogeno rūgšties yra 0,9755. Antioksidacinis aktyvumas didesnis, kai kavos rūgšties kiekis maţesnis (-0,9859). Šiuo atveju pasireiškia stipri atvirkštinė priklausomybė.
Pateikti tyrimo rezultatai (10 pav.) vertinant antioksidacinio aktyvumo ir ultragarsinio metodo tarpusavio ryšį.
10pav. DPPH radikalų surišimo geba paprastosios kiaulpienės šaknų ištraukose, pagamintose ultragarso metodu.
Atlikus tyrimą nustatyta, kad stipriausiomis antioksidacinėmis savybėmis (79,57 %) pasiţymi naudojamas 70 % etanolio ekstrahentas. Palyginus visus ištraukų gamybos metodus ir jų įtaką AA aktyvumui, pagal gautus tyrimų rezultatus pastebėta, kad didţiausiu AA aktyvumu pasiţymi naudojamas ekstrahentas - 70 % etanolis. Rezultatai rodo, kad silpniausiu antioksidaciniu aktyvumu (59,08 %) ištraukose, gamintose ultragarso metodu, pasiţymi 40 % etanolio ištraukos. Dar maţesnis antioksidacinio aktyvumo rezultatas (51,2 %) gautas Bulgarijos mokslininkų atliktame tyrime, kai ekstrahentas buvo naudotas - 95 % etanolis [58]. Būtent pagal rezultatų duomenis tarp stipriausiomis ir silpniausiomis AA savybėmis pasiţyminčių ištraukų yra pastebimas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05).
Eksperimento metu nustatytas Spirmeno koreliacijos ryšys tarp ultragarso metodu gautų tinktūrų antioksidacinio aktyvumo, bendro fenolinių junginių kiekio, chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties. Rezultatai pateikti 11 lentelėje.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 40% 50% 70% Etanolio koncentracija DP P H rad ik alų su riši m o ge b a
11 lentelė. Spirmeno koreliacijos ryšys tarp AA, bendro fenolinių junginių kiekio, chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties.
Antioksidacinis aktyvumas (AA), % Bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g Chlorogeno rūgšties kiekis, mg/g Kavos rūgšties kiekis, mg/g Antioksidacinis aktyvumas (AA), % 1,000 -0,3417 -0,6474 -0,6790
*Tirta tarp ultragarso metodu pagamintų tinktūrų, n=4
Vertinant Spirmeno koreliacijos ryšį šiuo atveju matoma, kad vyrauja atvirkštinė priklausomybė tarp bendro fenolinių junginių kiekio, chlorogeno rūgšties, kavos rūgšties ir antioksidacinio aktyvumo. Tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir jų AA nustatytas silpnas priklausomas ryšys (-0,3417). Panaši priklausomybė vyrauja tarp chlorogeno r., kavos r. su AA, atitinkamai (-0,6474 ir -0,6790).
3.7. Paprastosios kiaulpienės augalinių ţaliavų aktyvių junginių analizė ESC
metodu
Paprastosios kiaulpienės augalinių ţaliavų fenolinių junginių analizei buvo taikytas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas. Šios analizės metodika pateikta 2.6. skyriuje. Pagrindiniai ištraukų mėginiuose nustatyti veiklieji junginiai – chlorogeno rūgštis ir kavos rūgštis, kai parinktas ištraukų ekstrakcijos tirpiklis buvo vandens ir etanolio mišinys [53]. Rezultatai apskaičiuoti naudojantis kalibracine šių junginių kreive (2 pav.). Gauti rezultatai pateikti 12 lentelėje.
