LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

GINETA ŠATIKAITĖ

3,5-DIFENILIZOKSAZOLO DARINIŲ, TURINČIŲ FLUORO ATOMĄ, SINTEZĖ

[3+2] CIKLOADICIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius

KAUNAS 2017

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, ____________ Data 2017 __ __

3,5-DIFENILIZOKSAZOLO DARINIŲ, TURINČIŲ FLUORO ATOMĄ,

SINTEZĖ [3+2] CIKLOADICIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius, ___________ Data 2017 __ __

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė _______________________ Gineta Šatikaitė, ____________

Data 2017 __ __ Data 2017 __ __

KAUNAS, 2017

TURINYS

1. Izoksazolų sintezės metodai ... 10

1.1. [3+2] ciklizacijos reakcijos ... 10

1.1.1. Metalų katalizuojama [3+2] ciklizacija ... 11

1.1.2. Organokatalitinė [3+2] ciklizacija ... 14

1.2. Izoksazolų sintezė vykdant cikloizomerizacijos reakcijas ... 15

2. Izoksazolų biologinis aktyvumas ... 16

METODIKA ... 18

1. Naudotos medţiagos ir tirpikliai ... 18

2. Junginių sintezės metodikos... 18

3. Junginių analizės metodai ... 19

3.1. FT–IR spektroskopija ... 19

3.2. Plonasluoksnė chromatografija ... 19

3.3. UV spektrofotometrija ... 20

REZULTATAI ... 23

1. 3,5-difenilizoksazolų junginių sintezė ... 23

Junginių analizės rezultatai ... 25

2.1. Plonasluoksnė chromatografija ... 25

2.2. FT-IR spektroskopijos rezultatai ... 26

2.3. UV spektroskopijos analizės rezultatai ... 28

2.4. ESC–MS analizės rezultatai ... 29

IŠVADOS ... 37

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38

SANTRAUKA

Magistro baigiamąjį darbą, tema „3,5-difenilizoksazolo darinių, turinčių fluoro atomą, sintezė [3+2] cikloadicijos metodu―, atliko Gineta Šatikaitė. Darbo vadovas – prof. dr. Hiliaras Rodovičius. Darbo atlikimo vieta – Lietuvos Sveikatos Mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Vaistų chemijos katedra, Kaunas.

Darbo tikslas – atlikti 3,5-difenilizoksazolo darinių, turinčių fluoro atomą, sintezę [3+2] cikloadicijos metodu.

Darbo uţdaviniai:

1. Atlikti pasirinktų izoksazolo darinių sintezę.

2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę ir fiziko-chemines savybes.

3. Atlikti sintezės reakcijos sąlygų optimizavimą.

Tyrimo metodika: vykdant Klaizeno (angl. Claisen) benzaldehidų ir acetofenonų kondensacijos reakciją, ir gavus tarpinius junginius – chalkonus – buvo atliekama galutinių junginių – izoksazolų – sintezė [3+2] cikloadicijos metodu. Atliktos dvipakopės ir vienpakopės (be tarpinių junginių gryninimo) sintezės. Vienpakopė sintezė buvo vykdoma, siekiant optimizuoti reakcijos sąlygas. Atliekamų sintezės reakcijų greičiui monitoruoti ir pirminiam grynumui nustatyti buvo naudojami plonasluoksnės bei efektyviosisos skysčių chromatografijos masių spektrometrijos metodai. Sintezuotų tarpinių ir galutinių junginių struktūros buvo patvirtintos FT-IR, UV ir MS spektrais, o grynumas chromatografiškai.

Tyrimo rezultatai: dvipakopės sintezės metodu gauti keturi galutiniai junginiai – difenilizoksazolo dariniai, kurių išeigos 29-64%. Vienpakopės sintezės metodu gauti taip pat keturi 3,5-difenilizoksazolo dariniai, kurių išeigos 7-54%. Taip pat atlikus sintezę be tarpinių junginių gryninimo, galutinis izoksazolas buvo uţterštas šalutiniais reakcijos produktais. Sintezės metu susidaro identišką masę turintys, kaip manoma, 3,5-difenilizoksazolų struktūriniai regioizomerai. Sintezuotų junginių grynumas - 87-94%.

Tyrimo išvados: atlikta 3,5-difenilizoksazolo darinių sintezė vyksta neregioselektyviai. Reakcijos metu galimai susidaro izoksazolo (1,2-oksazolo) struktūrinis analogas – oksazolas (1,3-oksazolas). Vykdant vienpakopę 3,5-difenil-pakeistų izoksazolų sintezę be tarpinių junginių gryninimo, reakcijos išeiga yra 15-75% maţesnė nei atliekant dvipakopę junginių sintezę su tarpinių junginių gryninimu.

SUMMARY

Master thesis of Gineta Šatikaitė ―Synthesis of fluorinated 3,5-diphenylisoxazole derivatives by [3+2] cycloaddition‖. Tutor Hiliaras Rodovičius, professor, Ph.D. Lithuanian University of Health Sciences, faculty of Pharmacy, department of Drug Chemistry.

Aim of study: to perform synthesis and reaction optimization of fluorinated 3th and 5th substituted diphenylisoxazole compounds with potential biological activity.

Study objectives:

1. To synthesize selected 3,5-diphenylisoxazole derivatives.

2. To determine structure and physic-chemical properties of synthesized compounds. 3. To perform synthesis and reaction optimisation.

Study methods: synthesis of compounds was done, firstly, by L. Claisen condensation of benzaldehydes and acetophenones. 3,5-diphenylisoxazole derivatives were synthesized from purified intermediate compounds – chalcones – by [3+2] cycloaddition reaction. One-pot synthesis of 3,5-diphenylisoxazole derivatives was performed by analogy, in order to optimize reaction conditions. Initial purity of compounds and reaction time was monitored by TLC. Structures of intermediate and terminal compounds was confirmed by using FT-IR, UV and ELC-MS analitic methods.

Study results: 3,5-diphenylisoxazole derivatives synthesized with chalcone purification were obtained in higher yields (29-64%) than using one-pot synthesis method (7-54%). Also it was harder to crystallyze final product, from one-pot reaction mixture. In both cases, MS spectra analysis showed, two compounds with identical mass, and structural isomers formation is predicted. Purity of obtained compounds is 87-94%.

Conclusions: the synthesis of 3,5-diphenylisoxazole was achieved in good yields, but shows poor regioselectivity. It is assumed, that reaction products are isoxazoles (1,2-oxazoles) and it‘s congener oxazole (1,3-oxazole). One-pot 3,5-diphenylisoxazole synthesis reaction gives 15-75% lower yields, than two step synthesis with an intermediate purification.

SANTRUMPOS

DFT (angl. Density Functional Theory) – tankio funkcionalo teorija. GASR – gama-aminosviesto rūgštis.

NMDA – N-metil-D-asparto rūgštis.

trans-ACDP – trans-1-aminociklopentano-1,3-dikarboksilinė rūgštis. PABA – para-aminobenzoinė rūgštis.

FT-IR – Furje transformuota infraraudonųjų spindulių spektrometrija. BMR – branduolio magnetinis rezonansas.

PC – plonasluoksnė chromatografija. NHC – N-heterociklinis karbenas.

SĄVOKOS

Aduktas (angl. adduct) – molekulinis kompleksas arba junginys, susidarantis susijungiant kelioms molekulėms, tačiau neprarandant jokių jose buvusių atomų (pavyzdţiui, furano ir maleino rūgšties anhidrido aduktas – dieninės sintezės rezultatas). Aduktas gali susidaryti nebūtinai santykiu 1:1 (galimas pavyzdţiui, bis-aduktas – 2:1).

Batochrominis poslinkis (angl. batochromic shift) – sugerties poslinkis į ilgesnių bangų pusę. Izomerizacija (angl. isomerisation) – cheminė reakcija, kurios metu susidaręs junginys yra pradinio junginio izomeras.

Regioizomerai (angl. regioisomers) – izomerai, susidarantys, kai reagentas gali atakuoti kelis molekulėje esančius reaktingus centrus.

Regioselektyvumas (angl. regioselectivity) – vieno iš kelių galimų vienodos prigimties reakcijos centrų molekulėje dalyvavimas reakcijoje.

ĮVADAS

Heterocikliniai junginiai, turintys azoto ir deguonies atomus savo struktūroje, yra laikomi svarbia junginių klase medicinoje. Izoksazolų (1,2-oksazolų) dariniai pasiţymi molekulių diversiškumu bei plačiu biologiniu poveikiu, tokiu kaip antioksidacinis, analgezinis, priešmikrobinis, priešgrybelinis, prieštuberkuliozinis, priešvėţinis antikoaguliacinis, o kai kurie junginiai veikia ir prieš ŢIV virusą. Yra įvairiausių sintezės būdų, tokių kaip ciklizacija katalizuojant metalams ar elektrofilinė ciklizacija, kondensacija, cikloizomerizacija ir kt., todėl ieškoma paprasčiausio ir efektyviausio metodo norimiems junginiams gauti.

Vaistų sintezėje yra svarbus vaisto molekulės stabilumas ir lipofiliškumas, siekiant uţtikrinti vaisto saugumą ir efektyvumą galutiniam vartotojui. Lipofiliškumas svarbus uţtikrinant molekulės praeinamumą pro biologines membranas, kas yra aktualu sintetinant vaistus, slopinančius nervų sistemos veiklą, ar tokius vaistus, kurių poveikiui pasiekti reikalingas didelis vaistinės medţiagos pasiskirstymas organizme.

Renkantis 3,5-difenilizoksazolų darinius būsimai sintezei, buvo atsiţvelgiama į literatūroje pateikiamus junginių kriterijus ir modifikacijas, kuriomis pasiţymi biologiškai aktyvūs izoksazolo dariniai. Pats izoksazolo ţiedo struktūrinis fragmentas buvo pasirinktas dėl jo unikalių savybių, tokių kaip peptidinės jungties mėgdţiojimas [1–5] bei didesnis struktūrinis junginio stabilumas, lyginant su etino klasės junginiais, turinčiais trigubą jungtį [6]. Taip pat buvo pasirinkta įvesti fluoro atomą į aromatinio ţiedo (esančio 5-oje izoksazolo ţiedo padėtyje) 4-tą padėtį. Fluoro atomo įvedimas į šią padėtį padidina molekulės metabolinį stabilumą prieš citochromo CYP450 fermentinę sistemą [7–9]. 3-oje izoksazolo ţiedo padėtyje būsiančiame fenilo aromatiniame ţiede buvo pasirinkta įvesti nitrogrupę, dėl lengvos jos redukcijos iki aminogrupės, kas gali būti panaudota tolimesnei fluorintų 3,5-difenilizoksazolų bibliotekos sintezei.

Darbo tikslas – atlikti potencialiai biologiškai aktyvių 3,5-difenilizoksazolo darinių, turinčių fluoro atomą, sintezę ir optimizuoti jos sąlygas.

Darbo uţdaviniai:

1. Atlikti pasirinktų izoksazolo darinių sintezę.

2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę ir fiziko-chemines savybes. 3. Atlikti sintezės reakcijos sąlygų optimizavimą.

LITERATŪROS APŢVALGA

1. Izoksazolų sintezės metodai

Izoksazolas (a) yra penkianaris heterociklinis junginys, turintis deguonies ir azoto atomus 1-oje ir 2-1-oje padėtyje. Jo dalinai nesotūs analogai yra vadinami izoksazolinais (b-d), o visiškai sotūs analogai – izoksazolidinais (e) (Pav. 1).

O N O N O NH O NH O NH a b c d e

Pav. 1. Izoksazolas (a) ir jo analogai.

Dalinai nesotūs – izoksazolinai (b-d) ir sotūs izoksazolidinai (e)

Izoksazolai pasiţymi plačiu biologinio aktyvumo spektru ir unikaliomis fizikocheminėmis savybėmis, kurių dėka jie plačiai naudojami medicinoje [10–12] ţemdirbystėje [13] ir technologijos srityje [14]. Taip pat šie junginiai naudojami organinėje sintezėje, kaip naujų sintetinamų junginių molekulių pagrindas. Taip yra pirmiausiai dėl to, jog izoksazolai, būdami stabilūs aromatiniai heterocikliniai junginiai, turi silpną deguonies – azoto (O–N) ryšį. Šie struktūriniai izoksazolų ypatumai leidţia atlikti įvairias jų chemines modifikacijas, neišardant penkianario heterociklo ţiedo [15].

1888 metais, Liudvikas Klaisenas (angl. Ludwig Claisen) pirmasis atpaţino 3-metil-5-fenilizoksazolo ciklinę struktūrą bei parodė jo chemines savybes, tipiškas aromatinei sistemai, esant tam tikroms reakcijos sąlygoms, pavyzdţiui, labai didelį šio junginio labilumą šarminėje terpėje. Pirmieji, susintetinę izoksazolo ţiedą buvo Dunstanas ir Dimondas (angl. Dunstan and Dymond). Jiems pavyko gauti 3,4,5- trimetilizoksazolą, kaitinant nitroetaną su vandeniniais šarmų tirpalais [16]. Reikšmingas įnašas izoksazolų chemijos vystymuisi buvo padarytas iš Kviliko (angl. Quilico) tirtos izoksazolo ţiedo sistemos sintezės, naudojant nitrilo oksidus ir nesočius junginius, 1930-1946 metais [17].

1.1. [3+2] ciklizacijos reakcijos

1930 metais Quilico pateikė pirmuosius [3+2] dipolinės ciklizacijos tarp nitrilo oksidų ir alkinų pavyzdţius, sintetinant izoksazolus [17]. Dabar tai vienas iš svarbiausių izoksazolų sintezės metodų. Ciklizacija gali būti vykdoma keliais būdais.

1.1.1. Metalų katalizuojama [3+2] ciklizacija

Pirmuosius metalų katalizuojamos izoksazolų sintezės [3+2] ciklizacijos metodo pavyzdţius publikavo Fokinas (ang. Fokin) ir bendraautoriai, 2005 metais [18]. Jie parodė, jog Heisgeno (vok.

Huisgen) 1,3 – dipolinės ciklizacijos reakcija [19, 20] gali būti katalizuojama vienvalenčio vario (Cu (I)).

Reakcijos metu selektyviai susidaro 3-oje ir 5-oje padėtyse pakaitus turintys izoksazolai (Pav. 2). Aktyvus Cu (I) katalizatorius yra gaunamas redukuojant dvivalentes vario druskas (pavyzdţiui, CuSO4) su natrio

askorbatu. Ši metalų katalizuojama ciklizacijos reakcija gali būti vykdoma kambario temperatūroje, reakcijos laikas yra trumpas, o ciklizacijos selektyvumas >95:5. Reakcijos išeiga yra pakankamai didelė – 74-98%. Kita vertus, palyginimui nekatalizuojamoms reakcijoms daţniausiai reikalinga aukšta temperatūra, o reakcijos metu susidaręs produktas yra 3,5– ir 3,4–regioizomerų mišinys.

R₁ Cl

N OH

+

CuSO4 x 5H2O (2 mol%)

Natrio askorbatas (10 mol%) KHCO3 (4.3 ekv.) H2O/t-BuOH (1:1), r.t., 1-4 h N O R₁ R₂ H R₂

Pav. 2. Fokino (angl. Fokin) ir bendraautorių, Vario (Cu (I)) katalizuojama [3+2] cikloadicijos reakcija. [18]

Fokin‗as su bedraautoriais analizavo tikėtiną šios reakcijos mechanizmą [18]. Jie pritaikė kvantinės mechanikos skaičiavimus (tankio funkcialo teoriją (DFT)) bei parodė, kad reakcija gali vykti sekančiu būdu (Pav. 3):

1. koordinacinių ryšių formavimasis tarp alkino ir Cu (I); 2. vario (I) acetilido susidarymas;

3. vieno iš vario ligandų pakeitimas nitrilo oksidų ir naujo C–Cu ryšio susidarymas;

4. šešianario metalociklo susidarymas, kai įvyksta acetilido C2 ir deguonies atomų sąveika;

5. ţiedo kontrakcija;

CuL_n-2 N O+ R2 R1 O N R2 R1 CuL_n-2 [CuL_n]+ R2 H R2 CuL_n-1 O H N+ R1 R2 _CuLn-2 N+ O R1 O _N R2 R1 H

Pav. 3. Fokino ir bendraautorių (angl. Fokin) pateiktas galimas variu (Cu(I)) katalizuojamos [3+2] izoksazolų ciklizacijos reakcijos mechanizmas [18]

Tais pačiais 2005 metais Fokino grupė publikavo straipsnį [21], kuriame pateikė vienpakopės (ang.

one–pot) Cu (I) katalizuojamos dipolinės ciklizacijos 3,5-izoksazolų sintezės metodiką (Pav. 4).

Atitinkamai in situ iš įvairių aldehidų buvo gauti nitrilų oksidai, kurie ciklizuojami su alkinais. Reakcijos išeiga yra šiek tiek maţesnė nei prieš tai aprašytos reakcijos – 57-76%, tačiau paţymėtinai svarbu tai, kad reakcijos eigoje galima įvesti įvairias funkcines grupes – arilbromidus, benzileterius, neapsaugotas karbonilines bei karboksilines grupes, alilinius alkoholius. Taip pat visais atvejais buvo stebimas puikus reakcijų regioselektyvumas (>95:5) N _O R₁ R₂ O R₁ H

+

1. H2NOH*HCl, NaOH (1.05 ekv.)

2. TsN(Cl)Na*3H2O (1.05 ekv.)

3. Cu/CuSO4*5H2O (3 mol%)

H2O/t-BuOH (1:1), r.t., 6 val. H

R₂

Pav. 4. Fokino mokslininkų grupės pateikta vienpakopė (be tarpinių produktų gryninimo), Vario (Cu (I)) katalizuojama [3+2] 3,5-izoksazolų ciklizacijos reakcija [21]

Pateikiama keletas susidariusių junginių pavyzdţių su jų išeigomis (Pav. 5). N O Br 72% N O OH F 64% 5 N O O OH O C H₃ 61% N O CH₃ OH 76% N O O O CH₃ O 68%

Pav. 5. Keletas Fokino mokslininkų grupės gautų junginių su išeigomis. Vienpakopė variu (Cu(I)) katalizuojama [3+2] 3,5-izoksazolų ciklizacija

2007 metais, Viskonsino universiteto profesorius Richardas P. Hsung su kolegomis parodė, jog Cu (I) katalizuojama [3+2] cikloadicijos reakcija gali vykti tarp nitrilo oksidų bei inamidų [22–24] (Pav. 6)

N R₁ Cl OH

+

Natrio askorbatas (20 mol%) K2CO3 (2.0 ekv.) H2O/t-BuOH (1:1), r.t., 12 val. _N O R₁ N R₂ R₃

Pav. 6. R. P. Hsung ir kolegų pateikta variu (Cu (I)) katalizuojama [3+2] cikloadicijos reakcija tarp nitrilo oksidų ir inamidų

Šiuo metodu galima gauti įvairius 5-amino-izoksazolus, kurių išeigos svyruoja nuo 22% iki 86%, o reakcija yra regioselektyvi (>95:5). Mokslininkų optimizuota metodika tarp inamidų ir nitrilo oksidų turi plačias pritaikymo galimybes. Viena jų yra farmacijos pramonei gaunami vertingi enantiomeriškai praturtinti izoksazolai, kurie egzistuoja kaip pavieniai regioizomerai (angl. single regioisomers). Ţemiau pateiktas vienas jų pavyzdţių (Pav. 7).

N _O N N H O CH₃

Pav. 7. R. H. Hsung parodytas, regioselektyvus enantiomeriškai grynas 3,5 – pakeistas izoksazolas, kuris gautas 1,3 – dipolinės cikloadicijos reakcijos metu iš inamidų [22].

Po metų, Fokin‗as ir bendraautoriai publikavo ruteniu (Ru) (II) katalizuojamos [3+2] ciklizacijos su alkinais ir azoto oksidais sintezės metodą, kuriuo gaunami 3-oje ir 4-oje padėtyse pakaitus turintys izoksazolai [25]. Reakcija vyksta švelniomis sąlygomis, kambario temperatūroje, galimas funkcinių grupių diversiškumas (pavyzdţiui, halogenidų, alkoholių, ketonų, aminų, esterių, nitrilų), tačiau didţiausias šios reakcijos privalumas yra 3,4-izoksazolų susiformavimas, kuris sunkiai regioselektyviai vykdomas, esant aukštai temperatūrai [26–29].

1.1.2. Organokatalitinė [3+2] ciklizacija

Šioms reakcijoms atlikti buvo naudojamos kelios organinių katalizatorių klasės. 2011 metais, Vadde‗as ir Vasam‗as pateikė 1,3-dipolinės ciklizacijos su nitrilo oksidais ir alkinais sintezę, kurioje katalizatoriumi naudojamas NHC (N-heterociklinis karbenas) (Pav. 8) [30].

R₁ N+ O -R₃ R2 + NHC prekursorius (5 mol%) Et3N (5 mol%) CH2Cl2, 0-5 o C O N R₁ R₂ R₃

Pav. 8. Vadde‘o ir Vasam‘o pateikta [3+2] ciklizacija su nutrilo oksidais ir alkinais, katalizuojant NHC [30]

Reakcija vyksta švelniomis sąlygomis, esant 0-5˚C temperatūrai, pasiţymi funkcinių grupių diversiškumu ir selektyvia ciklizacija. Reakcijos išeiga 85-96%, buvo gauta 15 junginių.

2010 metais, Hall‗as publikavo boro rūgštimi katalizuojamą [3+2] ciklizacijos su nitrilo oksidais ir 2-alkilinėmis rūgštimis (Pav. 9) [31].

R1 N+ O -R2 O OH

+

Pav. 9. Halo (angl. Hall) publikuota [3+2] ciklizacijos reakcija su nitrilo oksidais ir 2-alkilinėmis rūgštimis, katalizuojama boro rūgštimi [31]

Šios reakcijos metu susidaro papildomi izoksazolo ţiedo regioizomerai – vienas 5-oje, o kitas 4-oje padėtyje turintys karboksilo grupę. Reakcija vykdoma kambario temperatūroje, abiejų regioizomerų selektyvumas yra >98:2, o gautų izoksazolų išeiga svyruoja tarp 71-87%. Buvo gauti penki izoksazolų pavyzdţiai.

1.2. Izoksazolų sintezė vykdant cikloizomerizacijos reakcijas

Cikloizomerizacijos reakcijos gali būti vykdomos katalizuojant įvairiais metalais (auksu, paladţiu, sidabru) ar organinėmis medţiagomis bei vykstant elektrofilinei ciklizacijai. Pastaruoju metu, vykdant izoksazolų sintezę, nereikalingos sudėtingos reakcijos sąlygos, siekiant įvesti heteroatomus į izoksazolo ţiedą. Taip pat, šiai sintezei naudojamos jau paruoštos (pramoninės gamybos) pradinės medţiagos, todėl nereikia papildomai atlikti šių medţiagų sintezės [32–34]. 2005 metais, Larock‗as ir jo kolegos publikavo elektrofilinės ciklizacijos izoksazolų sintezę iš O-metiloksimų veikiant juos halogenidais (ICl, I2, Br2)

(Pav. 10) [35]. N R₁ R₂ O CH_{3 A, CH} 2Cl2, r.t. [A = ICl, I₂, Br₂, PhSeBr] N O R₁ A R₂

Pav. 10. Larock‘o 4-halo-3,5-izoksazolų sintezė iš O-metiloksimų elektrofilinės ciklizacijos metodu. [35]

Reakcija vyksta kambario temperatūroje, buvo gauta 15 junginių, kurių išeiga svyravo tarp 55-100%.

2. Izoksazolų biologinis aktyvumas

Izoksazolo fragmentą turinčių biologiškai aktyvių junginių esama tiek natūraliuose produktuose, tiek medicinoje vartojamuose sintetiniuose preparatuose. Gamtoje randamos biologiškai aktyvios medţiagos, savo struktūroje turinčios izoksazolo ţiedo fragmentą, tokios kaip muscimolis ir iboteninė rūgštis, randami Paprastojoje musmirėje (lot. Amanita muscaria) (Pav. 11) [36, 37].

N O O H NH₂ N O O H NH₂ O O H

Muscimolis Iboteninė rūgštis

Pav. 11. Paprastojoje musmirėje (lot. Amanita muscaria) aptinkami biologiškai aktyvūs junginiai, turintys izoksazolo žiedą

Muscimolis, dar kitaip vadinamas agarinu arba panterinu, yra GASR-A receptorių agonistas, pasiţymintis sedaciniu-hipnotiniu poveikiu. Iboteninė rūgštis yra gliutamato receptorių agonistas, selektyviai NMDA ir trans-ACDP receptorių centrinėje nervų sistemoje [36, 38, 39].

Daugumoje farmacinių preparatų izoksazolo ţiedas integruojamas kaip farmakoforas, nulemiantis junginio biologinį aktyvumą. Izoksazolo ţiedą savo struktūroje turi tokie preparatai, kaip selektyvūs COX-2 inhibitoriai parekoksibas ir valdekoksibas, PABA antagonistas sulfametoksazolas, β-laktaminis antibiotikas oksacilinas, antireumatinis vaistas leflunomidas, antipsichozinis vaistas risperidonas ir kt. (Pav. 12).

Valdekoksibas yra sulfonamidų darinys ir nesteroidinis vaistas nuo uţdegimo (NVNU), pasiţymintis priešuţdegiminiu, analgeziniu ir antipiretiniu poveikiais. Šis vaistas selektyviai jungiasi ir inhibuoja COX-2 receptorius, taip uţkirsdamas kelią prostaglandinų, kurie atsakingi uţ uţdegiminius procesus, skausmą ir karščiavimą, sintezei iš arachidono rūgšties. 2005 metais valdekoksibas buvo atšauktas iš Kanados, JAV ir Europos Sąjungos rinkos dėl galimai padidėjusios miokardo infarkto ir insulto rizikos [40].

Parekoksibas taip pat priklauso NVNU grupei. Jis yra selektyvus COX-2 inhibitorius, valdekoksibo provaistas, tačiau tebenaudojamas medicinoje, nes kol kas nėra pastebėta reikšmingų nepageidaujamų poveikių [41].

Leflunomidas yra izoksazolo darinys, pasiţymintis imunosupresiniu ir priešuţdegiminiu poveikiais. Jis yra teriflunomido provaistas. Pastarasis blokuoja fermentą dihidroorotato dehidrogenazę (esminį fermentą de novo pirimidino sintezei), ko pasekoje išvengiama aktyvuotų T limfocitų ekspansijos. Teriflunomidas taip pat blokuoja įvairias baltymų tirozino kinazes C, taip slopindamas ląstelių proliferaciją [42].

Risperidonas yra benzizoksazolo darinys, pasiţymintis antipsichoziniu veikimu. Jis selektyviai antagonistiškai veikia ţievinius 5-HT2 receptorius ir neţymiai konkuruoja su dopamino D2 receptoriais, taip sumaţindamas haliucinacijų [43].

Oksacilinas yra beta-laktaminis penicilinų klasės antibiotikas. Jis yra atsparus penicilinazėms ir stabilus rūgščioje terpėje. Daţniausiai skiriamas gram-teigiamų bakterijų sukeltoms infekcijoms gydyti, tačiau in vitro tyrimais nustatyta, jog yra efektyvus tiek prieš gram-teigiamas, tiek prieš gram-neigiamas bakterijas [44–46]. N O CH₃ S O O NH COC₂H₅ N O N F N N C H3 O O N CH₃ NH N O O S CH₃ CH₃ CO₂H N O CH3 NH CF₃ O Parekoksibas Oksacilinas Risperidonas Leflunomidas N O CH₃ SO2NH2 Valdekoksibas

METODIKA

1. Naudotos medţiagos ir tirpikliai

Benzaldehidas, o-nitrobenzaldehidas, m-nitrobenzaldehidas, p-nitrobenzaldehidas, acetofenonas, 4-fluoracetofenonas, hidroksilamino hidrochloridas, bevandenis natrio acetatas, acto rūgštis, metanolis, kalio hidroksidas. Naudoti reagentai yra analitinio grynumo.

2. Junginių sintezės metodikos

3,5-substituoti izoksazolai buvo gauti dvipakopės sintezės metu (Pav. 13). Pirmiausiai, susintetinamas atitinkamas chalkonas: imama 0,01 mol benzaldehido, 0,01 mol acetofenono ir ištirpinama apie 15 ml metanolio, prijungiama prie aparato su magnetine maišykle, atsargiai pridedama 0,02 mol KOH ir maišoma apie valandą. Susidarę kristalai filtruojami su vakuumu, praplaunami šaltu išgrynintu vandeniu, po to šaltu metanoliu ir dţiovinami 50˚C temperatūroje dţiovinimo spintoje. Gautas produktas rekristalizuojamas iš metanolio.

Antroje sintezės pakopoje vykdoma chalkono ciklizacija susidarant 3,5-substituotiems izoksazolams. 0,01 mol I-oje sintezės pakopoje gauto chalkono ištirpinama apie 25 ml metanolio, kadangi tirpsta lėtai, panaudojamas ultragarso prietaisas. Imamas bevandenio natrio acetato ir hidroksilamino hidrochlorido perteklius (dvigubas kiekis – po 0,02 mol). 0,02 mol bevandenio natrio acetato ištirpinama minimaliame karštos acto rūgšties kiekyje, 0,02 mol hidroksilamino hidrochlorido ištirpinama apie 15 ml metanolio. Bevandenio natrio acetato tirpalas pridedamas į hidroksilamino hidrochlorido tirpalą, susidaro natrio chlorido nuosėdos. Šis tirpalas filtruojamas pro stiklinį filtrą su vakuumu (kad būtų kuo maţiau priemaišų galutiniame produkte) tiesiai į metanolinį chalkono tirpalą. Reakcijos mišinys refliuksinamas su grįţtamuoju šaldytuvu apie 12 valandų. Po to reakcijos mišinys atvėsinamas iki kambario temperatūros ir koncentruojamas sumaţinto atmosferos slėgio aplinkoje roto vakuuminiu būdu. Susidarę kristalai filtruojami ir praplaunami nedideliu kiekiu šalto metanolio. Gauti kristalai dţiovinami dţiovinimo spintoje, esant 50˚C temperatūrai, ir rekristalizuojami iš metanolio.

O H + H3C O X Y KOH, CH3OH O X Y NH2OH*HCl, CH3COONa CH3OH, CH3COOH N O Y X Benzaldehidas Acetofenonas Chalkonas 3,5-izoksazolas

3. Junginių analizės metodai

Siekiant įvertinti reakcijos greitį ir pirminį grynumą buvo naudojami plonasluoksnės chromatografijos ir FT-IR spektroskopijos metodai, taip pat buvo nustatyta lydymosi temperatūra. Gautų junginių struktūrinė ir priemaišų analizės buvo atliekamos FT-IR spektroskopu, UV spektroskopu bei ESC-MS/MS spektrometru.

3.1. FT–IR spektroskopija

Gautų GŠ junginių FT-IR spektrai buvo nuskenuoti PerkinElmer UATR Two spektrometru. Tiriant medţiagas šiuo metodu, dydis, apibūdinantis medţiagų IR spindulių sugertį, yra bangos skaičius n (cm-1

).

PerkinElmer UATR Two spektrometro bangos skaičius apima 450-4000 cm-1 intervalą. Susintetintų GŠ medţiagų kristaliniai milteliai plonu sluoksniu uţnešami ant prietaiso deimanto, interferavusi IR spinduliuotė nukreipiama į konkretų medţiagos mėginį ir yra uţrašomas jos FT-IR spektras. Gautame spektre matomos smailės atspindi tiriamos molekulės vibracinius pokyčius, dėl kurių gali būti identifikuojamos GŠ medţiagos funkcinės grupės bei pirštų antspaudų (angl. fingerprint) regionas, kurie vėliau yra palyginami su pradinių sintezės medţiagų FT-IR spektrų smailėmis. Lyginant spektrus, juose atsiradusios/pranykusios smailės leidţia daryti prielaidą apie po sintezės atsiradusią/pranykusią funkcinę grupę ar papildomą ryšį tarp atomų, kas leidţia įsitikinti, jog gautas reikiamas junginys ir sintezė įvyko sėkmingai. Po spektro uţrašymo atliekamos smailių ATR korekcijos, kurias rekomenduoja prietaiso gamintojai.

3.2. Plonasluoksnė chromatografija

Atliekant GŠ junginių sintezę, pirminiam tapatumo nustatymui ir reakcijos greičio monitoravimui buvo naudojamas paprastas ir greitas medţiagų tyrimo metodas – plonasluoksnė chromatografija. Šiam metodui naudojama silikageliu padengta aliumininė plokštelė ir pasirenkama tirpiklių sistema, geriausiai atskirianti junginius ir jų priemaišas. Tinkamiausia tirpiklių sistema nustatoma eksperimentiškai, tačiau daţniausiai naudojama ir laikoma universalia yra etilacetato/heksano sistema. Silikagelio plokštelėje atţymima starto linija ir mikrokapiliarų pagalba uţlašinami keli μl tiriamojo GŠ junginio ir pradinių medţiagų, kurios eikvojasi sintezės metu. Kiekvienąkart uţlašinus tiriamosios medţiagos laukiama, kol dėmė išdţius, ir tik tada dedamas sekantis lašas. Chromatografinė kamera uţpildoma pasirinkta tirpiklių sistema (judančiąja faze) ir į ją atsargiai patalpinama plokštelė su tiriamaisiais junginiais. Kiekvienas tiriamojo junginio komponentas judančiąja faze per sorbento sluoksnį juda skirtingu greičiu. Tirpiklių sistemos keliui pasibaigus, silikagelio plokštelė išimama iš chromatografinės kameros, atţymima finišo linija ir laukiama, kol plokštelė išdţius. Tiriamosios dėmės identifikuojamos jas apšviečiant UV

spinduliuote. Junginio tapatumas nustatomas apskaičiuojant Rf reikšmes ir jas palyginant su

standartinėmis Rf reikšmėmis. Rf apskaičiuojamas pagal formulę: , kur a – nueitas tiriamosios

medţiagos kelias, o h – tirpiklių sistemos nueitas kelias.

3.3. UV spektrofotometrija

Tiriamųjų GŠ junginių spektrai buvo nuskenuoti naudojant Agilent Technologies Cary 8454

UV-VIS spektrofotometrą. Šiame prietaise UV absorbcija matuojama esant 200-600 nm bangos ilgiams.

Atsvertas 1 mg GŠ junginio buvo tirpinamas 1 ml metanolio. Gautas tirpalas yra koncentruotas, todėl papildomai praskiedţiamas, paimant 10 µl tirpalo ir skiedţiant jį 1 ml metanolio. Gaunamas 10 µl/ml tirpalas. Į kiuvetę įpilama metanolio, ši dedama į spektrofotometrą, kuriame uţrašomas metanolio sugerties spektras, kuris yra atimamas. Po to analogiškai uţrašomas tiriamojo GŠ junginio tirpalo UV sugerties spektras.

3.4. ESC-MS spektrometrija

1 lentelė. Skysčių chromatografijos junginių išskirstymo parametrai junginių grynumo tyrimams

Parametrai Agilent 1260 Infinity ESC sistema

Chromatografinė kolonėlė

Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 2,1×50 mm, 1,8-µm,

(p/n 959757-902) Kolonėlės temperatūra 25o

C Injekavimo tūris 2,5 µl Injekavimo greitis 500 µl/min

Mobili fazė Junginių grynumo tyrimai:

A: 0,1% TFA vandeninis tirpalas

B: Metanolis, turintis 0,1% TFA (analitinio švarumo >99,5%)

Tėkmės greitis 340 µl/min

Gradientas

Junginio grynumo tyrimai

Laikas A: B:

0,05 min 90,0 % 10,0 %

Parametrai Agilent 1260 Infinity ESC sistema 2,75 min 15,0 % 85,0 % 6,00 min 10,0 % 90,0 % 9,25 min 10,0 % 90,0 % 9,50 min 90,0 % 10,0 % 10,00 min 90,0 % 10,0 %

Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio intervalas 190–640 nm, diapazono plotis po 1 nm,

<0,0031 min (atsako laikas 0,031 s), (80 Hz)

A: 254/1 nm Ref. 550/100 nm B: 230/1 nm Ref. 550/100 nm C: 410/1nm Ref. 550/100 nm D: 215/1 nm Ref. 550/100 nm E: 360/1nm Ref. 550/100 nm F: 200/1nm Ref. 550/100 nm G: 310/1 nm Ref. 550/100 nm H: 280/1 nm Ref. 550/100 nm

Analizės trukmė 10 minučių sintezuotų junginių grynumo tyrimams Post-analizės trukmė 7,5 minutės

Susintetinti GŠ junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530

Accurate-Mass Q-TOF SC/MS prietaisą (parametrai nurodyti 1 ir 2 lentelėse). Mėginiai buvo paruošiami pagal tą

pačią metodiką, kaip ir atliekant UV spektrofotometrijos analizę. Pagaminti GŠ mėginių tirpalai buvo filtruojami ir injekuojami į efektyvųjį skysčių chromatografą Agilent Technologies Infinity 1260 chromatografinei ir masių spektrometrinei analizei.

2 lentelė. Optimizuoti masių spektometrijos parametrai

Programinė įranga duomenų analizei:

• Agilent MassHunter Qualitative Analysis (Qual) B.07.00; • Agilent MassHunter Profinder B.06.00, sp. 1;

Parametrai Agilent 6530 Q–TOF MS sistema

Jonizacija Teigiama (+)

Jonizacijos šaltinis Agilent Dual Jet Stream elektropurkštuvinis jonizatorius (ESI)

Kapiliarinė įtampa 3250 V (+)

Purkštuvo įtampa 250 V

Fragmentatoriaus įtampa 150 V

Dţiovinimo dujų temperatūra 350oC

Dţiovinimo dujų tėkmė 10 l/min

Purkštuvo slėgis 45 psig

Apgaubiančių dujų temperatūra 380oC

Apgaubiančių dujų tėkmė 8 l/min

MS ribos 80 – 450 m/z

Kolizijos energija 0 – 40 V

MS registravimo daţnis 2 spektrai/s

MS/MS ribos MS: 100 – 1700 m/z

MS/MS: 100 – 1700 m/z

MS/MS registravimo daţnis MS: 2 spektrai/s

MS/MS: 3 spektrai/s, Auto MS/MS

Izoliavimo plotis Siauras (~1,3 m/z)

Kolizijos energija 0 – 40 V

Etaloninė masė (+): 121,050873 ir 922,009798

REZULTATAI

1. 3,5-difenilizoksazolų junginių sintezė

3,5-difenilizoksazolų struktūra buvo pasirinkta dėl literatūros apţvalgoje minėto plataus šių junginių biologinio aktyvumo spektro. Be to, izoksazolo ţiedas pasiţymi unikaliomis struktūrinėmis ypatybėmis, tokiomis kaip, peptidinės jungties mėgdţiojimas [1–5] bei yra stabilesnis būdamas plokščios (planarinės) penkianarės struktūros nei etino klasės junginiai, turintys trigubą jungtį [6]. Fluoro atomo įvedimas, ypatingai į para- padėtį aromatiniame ţiede, suteikia molekulėms metabolinio stabilumo prieš citochromo CYP450 fermentinę sistemą. Dėl šių prieţasčių šiame darbe stengtasi sintezuoti izoksazolo darinius, turinčius fluoro atomą(us), tikintis, jog pastarieji junginiai bus metaboliškai stabilesni. Nitrogrupė pasirinkta dėl lengvos redukcijos iki aminogrupės, kas gali būti panaudota tolimesnei 3,5-difenilizoksazolų bibliotekos, turinčių fluoro atomą, sintezei.

Atliekant 3,5-difenilizoksazolų, turinčių fluoro atomą, sintezę, pirmiausia buvo gauti 4 tarpiniai junginiai – chalkonai. Šie tarpiniai junginiai buvo sintezuoti atliekant Klaizeno (angl. Claisen) kondensaciją iš pasirinktų orto-, meta- ir para- nitrobenzaldehidų bei acetofenono ir fluoracetofenono. Gautų chalkonų išeiga svyravo nuo 78% iki 89%, kurie toliau buvo naudoti 3,5-difenilizoksazolų sintezei.

Pirmiausiai buvo sintezuoti izoksazolai, turintys m-nitrofenil- pakaitą 3-oje padėtyje ir 4-fluorfenil- pakaitą 5-oje padėtyje bei p-nitrofenil- pakaitą 3-oje ir 4-fluorfenil- pakaitą 5-oje padėtyje. Atlikus ESC-MS analizę, buvo rasti du identišką masę turintys junginiai. Tai leido iškelti hipotezę, jog tai izoksazolų regioizomerai. Siekiant patvirtinti šią hipotezę, buvo atlikti du eksperimentai – MS/MS fragmentacijos eksperimentas ir vykdoma 3,5-difenilizoksazolų sintezė. Turint omenyje, jog šis izoksazolo darinys turi du vienodus pakaitus, izomerizacija vykti neturėtų. Po eksperimentų, izoksazolų regioizomerizacijos hipotezė buvo atmesta, nes:

1. Po MS/MS fragmentacijos buvo gautos labai panašios fragmentuotų junginių masės, todėl nebuvo įmanoma identifikuoti hipotetinių regioizomerų.

2. 3,5-difenilizoksazolo ESC-MS chromatogramoje matomi du identišką masę turintys junginiai. Buvo iškelta nauja hipotezė – izoksazolo-oksazolo ciklo persigrupavimo reakcija, kuomet vykstant reakcijai, susidaro izoksazolas ir jo analogas – oksazolas .

Vėliau buvo atliekama izoksazolų sintezės optimizacija, kurios metu chalkonų kondensacijos ir vėlesnė, su šiais tarpiniais junginiais atliekama, izoksazolų ciklizacijos reakcijos, buvo vykdomos viename reaktoriuje, negryninant tarpinių junginių (chalkonų).

Dvipakopės sintezės metu gautų galutinių junginių – izoksazolų – išeigos 29–64%. Tarpinių ir galutinių junginių IUPAC ir kodiniai pavadinimai bei tikslios išeigos pateiktos ţemiau (3 lentelė).

3 lentelė. Sintezuotų tarpinių junginių (GŠT01-04) ir galutinių junginių (GŠI01-04) išeigos

Susintetinto

junginio kodas IUPAC pavadinimas Išeiga, %

GŠT–01 (2E)–1,3–difenilprop–2–en–1–onas 89 GŠT–02 (2E)–3–(4–fluorofenil)–1–(3–nitrofenil)prop–2–en–1–onas 82 GŠT–03 (2E)–3–(4–fluorofenil)–1–(4–nitrofenil)prop–2–en–1–onas 78 GŠT-04 (2E)–3–(4–fluorifenil)–1–(2–nitrofenil)prop–2–en–1–onas 75 GŠI–01 3,5–difenilizoksazolas 53 GŠI–02 5–(4–fluorofenil)–3–(3–nitrofenil)izoksazolas 64 GŠI–03 5–(4–fluorofenil)–3–(4–nitrofenil)izoksazolas 62 GŠI-04 3–(4–fluorofenil)–1–(2–nitrofenil)izoksazolas 29

Ţemiau pateikiamos sintezuotų galutinių junginių (3,5-difenilzoksazolo darinių) struktūrinės formulės (Pav. 14). N O N O N+ O -O F N O N+ O -O F N O N+ O -O F 3,5-difenil-izoksazolas 5-(4-fluorofenil)-3-(4-nitrofenil)-izoksazolas 5-(4-fluorofenil)-3-(2-nitrofenil)-izoksazolas 5-(4-fluorofenil)-3-(3-nitrofenil)-izoksazolas

Junginių analizės rezultatai 2.1. Plonasluoksnė chromatografija

Sintezuotų junginių reakcijos greičiui monitoruoti ir pirminiam grynumui nustatyti buvo taikyta plonasluoksnė chromatografija (PC). Eksperimentiškai parinktos šios tirpiklių sistemos (Lentelė 4). Naudojant šiuos eliuentus, pilnai yra išskirstomi pradiniai, tarpiniai ir galutiniai junginiai. Taip pat yra stebimos neţinomos kilmės chromatografinės dėmės, kurios gali būti traktuojamos, kaip šalutinės priemaišos.

4 lentelė. Sintezės reakcijos greičio monitoravimas ir pirminio grynumo tyrimas plonasluoksnės chromatografijos būdu. Eksperimentiškai parinkos tirpiklių sistemos bei gautos Rf reikšmės

Susintetinto junginio kodas Tirpiklių sistema ir jų santykis Rf reikšmės

GŠT–01 3 etilacetetas : 7 heksanas 0,398

GŠT–02 3 etilacetatas : 7 heksanas 0,381

GŠT–03 3 etilacetatas : 7 heksanas 0,352

GŠT-04 3 etilacetatas : 7 heksanas 0,374

GŠI–01 1 etilacetatas : 9 heksanas 0,476

GŠI–02 1 etilacetatas : 9 heksanas 0,423

GŠI–03 1 etilacetatas : 9 heksanas 0,459

GŠI-04 1 etilacetatas : 9 heksanas 0,486

Ţemiau pateikiamas fizinis plonasluoksnės chromatogramos pavyzdys, kuriame A raide ţymimas tarpinis (GŠT–02), o B raide – galutinis (GŠI–02) junginys (Pav. 15). Taip pat šiame paveiksle yra pavaizduota densitometriškai įvertinta GŠT–02 ir GŠI–02 junginių PC chromatograma.

Pav. 15. Izoksazolų sintezės stebėjimas, plonasluoksnės chromatografijos metodu. A – (2E)–3–(4–fluorofenil)–1–(3–nitrofenil)prop–2–en–1–ono chromatografinė dėmė;

Pagal pateiktus chromatografinius rezultatus, galima daryti prielaidą, jog didţioji dalis chalkono yra sureagavusi ir izoksazolo ciklizacija įvyko.

2.2. FT-IR spektroskopijos rezultatai

Siekiant preliminariai patvirtinti sintezuotų junginių struktūrą, buvo uţrašyti tarpinių ir galutinių junginių FT-IR spektrai. Spektrai buvo analizuojami pagal ţemiau pateiktą pavyzdį.

Pav. 16. GŠT-02 FT-IR spektras.

X ašis – bangos ilgis, cm-1_{; Y ašis – pralaidumas (%)}

16 paveiksle yra pateiktas (2E)–3–(4–fluorofenil)–1–(3–nitrofenil)chalkono (GŠT–02) FT-IR spektras. Siekiant identifikuoti, jog tai būtent šis junginys, spektre ieškomos smailės, kurios būtų būdingos C–F, C–HAlk, C–HAr jungtims bei C=O ir NO2 funkcinėms grupėms.

Pav. 17. GŠI-02 FT-IR spektras.

X ašis – bangos ilgis, cm-1_{; Y ašis – pralaidumas (%)}

Antrame paveiksle (Pav. 17) pavaizduotas 5–(4–fluorofenil)–3–(3–nitrofenil)izoksazolo (GŠI–02) FT-IR spektras. Jame nustatytos šios struktūriškai reikšmingos funkcinės grupės ir jungtys: N=C, C=C, C-F, C-HAr bei NO2. GŠI–02 spektre yra matoma, jog išnyko karbonilo funkcinės grupės smailė (C=O),

tačiau galima pastebėti, kad atsirado izoksazolo ţiedui būdinga N=C jungtis. Remiantis šiais duomenimis, galima daryti prielaidą, jog (2E)–3–(4-fluorofenil)–1–(3-nitrofenil)chalkono ciklizacija įvyko ir buvo gautas 5–(4–fluorofenil)–3–(3–nitrofenil)izoksazolas. Sintezuotų tarpinių ir galutinių GŠ junginių charakteringi FT–IR spektrinės analizės duomenys yra pateikti 5-oje lentelėje.

5 lentelė. Gautų tarpinių (chalkonų) ir galutinių (izoksazolų) junginių FT-IR spektrinės analizės duomenys

Junginio kodas Funkcinė grupė/jungtis Spektro pikas (cm-1)

GŠT–01 C=O (alkilinė) 1673 C-H (alkilinė) 3102 C-H (aromatiniame žiede) 2957 GŠT–02 C-F (aromatiniame žiede) 1117 C=O (alkilinė) 1684 C-H (alkilinė) 3087 C-H (aromatiniame žiede) 2988 NO2 (aromatiniame žiede) 1591 GŠT–03 C-F (aromatiniame žiede) 1105 C=O (alkilinė) 1657 C-H (alkilinė) 3076 C-H (aromatiniame žiede) 2961 NO2 (aromatiniame žiede) 1579 GŠT–04 C-F (aromatiniame žiede) 1134

C=O (alkilinė) 1668 C-H (alkilinė) 3095 C-H (aromatiniame žiede) 3009 NO2 (aromatiniame žiede) 1582 GŠI–01 C=C 1515 N=C 1612 C-H (aromatiniame žiede) 2997 GŠI–02 C=C 1524 N=C 1606 C-F 1157 C-H (aromatiniame žiede) 3091 NO2 1578 GŠI–03 C=C 1516 N=C 1624 C-F 1119 C-H (aromatiniame žiede) 3012 NO2 1594 GŠI–04 C=C 1517 N=C 1627 C-F 1156 C-H (aromatiniame žiede) 3037 NO2 1586

2.3. UV spektroskopijos analizės rezultatai

Nustatyti tarpinių ir galutinių junginių absorbcijos maksimumai (λ1, λ2), kurie pateikti 6-oje

lentelėje. Remiantis šiais duomenimis patvirtinama sintezuotų junginių struktūrinė ypatybė – stiprios aromatinės savybės.

6 lentelė. Tarpinių GŠT01-04 ir galutinių GŠI01-04 junginių absorbcijos maksimumai

Susintetinto junginio kodas λ1, nm λ2, nm

GŠT–01 225 287 GŠT–02 228 293 GŠT–03 220 299 GŠT-04 223 302 GŠI–01 245 - GŠI–02 242 - GŠI–03 260 - GŠI-04 273 -

2.4. ESC–MS analizės rezultatai

Gauti tarpiniai ir galutiniai GŠ junginiai – chalkonai ir izoksazolai – buvo tiriami Efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos metodu, naudojant Agilent 1260 Infinity ESC-MS sistemą.

Atlikus galutinių GŠI-02 ir GŠI-03 junginių – izoksazolų – sintezę ir gryninimą, buvo atlikta ESC-MS analizė. UV-Vis chromatograma buvo uţrašoma visame bangos ilgio intervale (angl. Total Wave

Chromatography) (Pav. 18).

Pav. 18. GŠI-02 junginio UV-Vis chromatograma, užrašyta visame bangos ilgyje. X ašis – laikas (min), Y ašis – absorbcija (AU)

Gautoje chromatogramoje matomos dvi smailės, tačiau pagal literatūros šaltiniuose publikuojamą izoksazolų sintezės reakcijos mechanizmą, turėtų būti stebima viena chromatografinė smailė, kuri atspindėtų vieną reakcijos produktą. Norint įsitikinti, ar tai priemaiša, buvo analizuojamas masių spektras (Pav. 19).

Pav. 19. GŠI-02 junginio masių spektras. X ašis – m/z reikšmė, Y ašis – jonų intensyvumas

Pateiktame masių spektre stebimos identiškos chromatogramoje uţrašytų smailių masės. Tai leidţia daryti prielaidą, jog galimai gauti izoksazolo regioizomerai ir reakcija vyksta neregioselektyviai. Atlikus paiešką literatūros šaltiniuose, buvo rastas galimas izoksazolų regioizomerizacijos mechanizmas [47] (Pav. 20). F N+ O -O O F N+ O -O N OH F N+ O -O O NH O H

+

Pav. 20. Galimas izoksazolų regioizomerizacijos mechanizmas

Remiantis publikacijoje pateiktu reakcijos mechanizmu, izoksazolų sintezė vyksta dvejopai: vienu atveju pakeisti benzaldehido ir acetofenono pakaitai atitinkamai yra nukreipiami į trečiąją ir penktąją izoksazolo ţiedo padėtis, o kitu – į penktąją ir trečiąją.

Norint patvirtinti izoksazolų regioizomerizacijos hipotezę, buvo atliekamas junginių MS/MS fragmentacijos eksperimentas. Junginiai teoriškai turėtų skilti į skirtingos masės fragmentus, kuriuos analizuojant, būtų galima identifikuoti skirtingus regioizomerus.

Pav. 21. Izoksazolų MS/MS fragmentacijos eksperimento masių spektrai, esant 20 eV kolizijos energijai.

X ašis – m/z reikšmė, Y ašis – jonų intensyvumas

Atlikus MS/MS fragmentacijos eksperimentą, kaip ir tikėtasi, esant didesnėms kolizijos energijoms, buvo gauti fragmentuoti junginio spektrai. Eksperimentas buvo atliekamas esant skirtingoms kolizijos energijoms – 20 eV ir 40 eV. Esant 20 eV kolizijos energijai dar stebima santykinai daug pradinio junginio, kurio m/z reikšmė 285 arba 307 (Pav. 21). Tai atitinka molekulinį aduktą su vandenilio [M+H]+ arba natrio atomu [M+Na]+. Molekulė fragmentuojasi neţymiai, todėl bandymas pakartotas esant 40 eV kolizijos energijai (Pav. 22).

Pav. 22. Izoksazolo MS/MS fragmentacijos eksperimento masių spektrai, esant 40 eV kolizijos energijai.

X ašis – m/z reikšmė, Y ašis – jonų intensyvumas

Gautame MS/MS spektre, kai kolizijos energija lygi 40 eV, nebelieka pradinio junginio, kurio m/z reikšmė yra 285. Lyginant po fragmentacijos gautas m/z reikšmes, sunku atskirti specifinius struktūrinius fragmentus. Stebimi identiškos arba tik per vienetą besiskiriančios m/z reikšmės. Pavyzdţiui, abiejuose masių spektruose yra matomos šios vienodos m/z reikšmės: 76, 95, 183, 190, 210 ir 238. Taip pat yra nustatytos šios, tik per vienetą besiskiriančios m/z reikšmės: 103 ir 104, 109 ir 110, 122 ir 123, 134 ir 135, 149 ir 150. Bandymas sudėti junginį iš jo skilimo fragmentų nebuvo sėkmingas, todėl šio eksperimento rezultatai neleido identifikuoti galimai susidariusių regioizomerų.

Toliau bandant patvirtinti susidariusių izoksazolo regioizomerų hipotezę, analogišku metodu buvo atliekama 3,5-difenilizoksazolo sintezė. Šis eksperimentas pasirinktas dėl to, kad šis junginys, turėdamas vienodus pakaitus 3-oje ir 5-oje padėtyse, negali turėti regioizomerų. Hipotezės patvirtinimui, atliktoje ESC-MS chromatogramoje, teoriškai turėtų būti stebima viena spektrinė smailė, kuri turėtų m/z reikšmę, lygią 222.

Vis dėlto hipotezė buvo klaidinga, nes uţrašytoje chromatogramoje matomos ne viena, o dvi spektrinės smailės, kurių m/z reišmės lygios 222 (Pav. 23).

Pav. 23. 3,5-difenilizoksazolo UV-Vis (viršuje) ir MS (apačioje) chromatogramos. UV-Vis: X ašis – laikas (min), Y ašis – absorbcija (AU)

MS: X ašis – laikas (min), Y ašis – jonų intensyvumas

Šį dviejų smailių atsiradimą būtų galima paaiškinti izoksazolo ciklo persigrupavimo reakcija iki jo struktūrinio analogo – oksazolo. Vienas iš kriterijų, leidţiančių daryti šią prielaidą, yra skirtingas junginių sulaikymo laikas. Vienas jų, eliuento iš kolonėlės yra išplaunamas 7,065 min, o kitas – 8,08 min. Kitas kriterijus yra UV spektriniai duomenys (Pav. 24). Antrojo junginio spektras (esant 267 nm absorbcijos maksimumui), pirmojo atţvilgiu (esant 245 nm absorbcijos maksimumui), yra pasislinkęs į dešinę spektro pusę (raudonasis poslinkis), kitaip vadinamas batochrominiu poslinkiu. Be to, išanalizavus abiejų junginių masių spektrinius duomenis, yra matoma, jog jų elementinė sudėtis yra identiška. Pirmojo junginio tiksli m/z reikšmė – 222,1632, o antrojo – 222,1633. Apskaičiuota šių junginių tarpusavio m/z

reikšmių paklaida (Δm/z) milijoninėmis dalimis (ppm) buvo lygi 0,1 ppm. 25-ame paveiksle pateikiami šių junginių masių spektrai.

Pav. 24. 3,5-difenilizoksazolo UV spektras, atliktas reakcijos monitoravimo metu. X ašis – bangos ilgis (nm), Y ašis – absorbcija (AU)

Atlikus eksperimentus ir nustačius, jog gauti junginiai nėra izoksazolo (1,2-oksazolo) regioizomerai, iškelta nauja hipotezė, jog tai yra izoksazolo ir oksazolo (1,3-oksazolo) darinių mišinys. Šiai hipotezei patvirtinti yra reikalingi papildomi instrumentinės analizės eksperimentai, pavyzdţiui, BMR tyrimai.

Pav. 25. 3,5-difenilizoksazolo pirmojo ir antrojo junginio masių spektrai. X ašis –m/z reikšmės

Y ašis – jonų intensyvumas

3. Reakcijos sąlygų optimizavimas

Buvo bandoma parinkti optimalias izoksazolų sintezės sąlygas. Siekiant išvengti tarpinių junginių gryninimo ir sutrumpinti sintezės laiką, ji buvo vykdoma viename reaktoriuje (η1). Pirmiausiai buvo

atliekama Klaizeno kondensacija, po kurios sekė [3+2] cikloadicijos reakcija. Po 8 valandų kaitinimo iki refliuksinimosi, reakcijos mišinys buvo koncentruojamas distiliuojant su roto vakuumu. Gauta tiršta klampi, tamsiai rudos spalvos masė. Ţinant, jog izoksazolai maţai tirpūs vandenyje, buvo bandoma juos išgryninti su karštu vandeniu. Dėl sudėtingos ir ilgos gryninimo procedūros, junginių išeigos buvo maţesnės nei vykdant dvipakopę sintezę (η2) bei atliekant tarpinių junginių gryninimą. Palyginamosios

reakcijų išeigos pateikiamos 7-oje lentelėje.

7 lentelė. Junginių, gautų dvipakopės (η2) ir vienpakopės(η1) sintezės metu reakcijos išeigų palyginimas

Junginio kodas Reakcijos išeiga, % η1 Reakcijos išeiga, % η2 GŠI-01 42 53 GŠI-02 54 64 GŠI-03 43 62 GŠI-04 7 29

Bandant ciklizuoti (2E)–3–(4–fluorifenil)–1–(2–nitrofenil)prop–2–en–1–oną, negryninant reakcijos tarpinių produktų, GŠI-04 junginys gautas labai maţa išeiga. To prieţastimi galėtų būti vykstantys erdviniai trukdymai (angl. steric hindrance), kuriuos lemia sąlyginai didelė nitrogrupė, esanti orto- padėtyje. Pastaroji prieţastis apsunkina izoksazolų ciklizaciją. Galimas erdvinių trukdymų mechanizmas pateiktas 26-ame paveiksle [48, 49].

IŠVADOS

1. Sintezuoti keturi 3,5-pakesti izoksazolo dariniai, turintys fluoro atomus, fenilo ţiedo para- padėtyje. Sintezuotų junginių išeiga buvo 29-64%. Sintezuoti keturi tarpinai junginiai (chalkonai), kurie buvo panaudoti 3,5-pakestų izoksazolo darinių ciklizacijai [3+2] cikloadicijos metodu. 2. Sintezuotų junginių struktūra patvirtinta spektriniais, o grynumas chromatografiniais analizės

metodais. Gautų junginių grynumas buvo 87-94%. Nustatyta, kad sintezuoti izoksazolo dariniai [3+2] cikloadicijos metu sudaro struktūrinius izomerus, kurių m/z reikšmė skiriasi 0,1 milijonine dalimi (ppm).

3. Optimizuojant 3,5-difenil-pakeistų izoksazolų sintezės sąlygas, nustatyta, kad vienpakopės reakcijos išeiga yra 15-75% maţesnė, lyginant su daugiapakope sinteze ir reikalauja sudėtingesnės gryninimo procedūros, kadangi susidaro daug pašalinių reakcijos produktų.

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Magistro baigiamajame darbe nustatyta, jog 3,5-difenilizoksazolo darinių [3+2] ciklizacijos reakcija vyksta neregioselektyviai. Tikslinga būtų pakeisti 3,5-difenilizoksazolo darinių gryninimo procedūrą efektyvesniais metodais, pvz., preparatyvine chromatografija, kas leistų išskirstyti stuktūrinius regioizomerus. Be to, rekomenduojama praplėsti cheminės struktūros tapatybės patvirtinimo tyrimus, protonų ir anglies BMR metodais.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. El-Dahshan, Adeeb, Samina Nazir, Ahsanullah, Farzana Latif Ansari, and Jörg Rademann. 2011. Peptide-heterocycle chimera: New classes of more drug-like peptidomimetics by ligations of peptide-bis(electrophiles) with various bis(nucleophiles). European Journal of Organic Chemistry: 730–739. doi:10.1002/ejoc.201001206.

2. Niu, Teng-fei, Mei-fang Lv, Liang Wang, Wen-bin Yi, and Chun Cai. 2013. Chemoselective preparation of 1,2,3-triazole–isoxazole bisfunctional derivatives and their application in

peptidomimetic synthesis. Organic & Biomolecular Chemistry 11: 1040. doi:10.1039/c2ob26990b.

3. Chalyk, Bohdan A., Inna Y. Kandaurova, Kateryna V. Hrebeniuk, Olga V. Manoilenko, Irene B. Kulik, Rustam T. Iminov, Vladimir Kubyshkin, Anton V. Tverdokhlebov, Osman K. Ablialimov, and Pavel K. Mykhailiuk. 2016. A base promoted multigram synthesis of aminoisoxazoles: valuable building blocks for drug discovery and peptidomimetics. RSC Adv. 6: 25713–25723. doi:10.1039/C6RA02365G.

4. Jones, Raymond C F, Laura E. Seager, and Mark R J Elsegood. 2011. 3-(1-Aminoalkyl)Pyrazole- and 4,5-Dihydropyrazole-5-Carboxylic Acids As Peptide Bond Replacements. Synlett: 211–214. doi:10.1055/s-0030-1259303.

5. Jones, Raymond C F, Stephen J Hollis, and James N Iley. 2000. 3-(1-Aminoalkyl)isoxazole-4-carboxylic acids as peptide bond replacements. Tetrahedron: Asymmetry 11: 3273–3276. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0957-4166(00)00318-9.

6. Liu, Jianhua, Li Fang Yu, J. Brek Eaton, Barbara Caldarone, Katie Cavino, Christina Ruiz, Matthew Terry, et al. 2011. Discovery of isoxazole analogues of sazetidine-A as selective α4β2-nicotinic acetylcholine receptor partial agonists for the treatment of depression. Journal of

Medicinal Chemistry 54: 7280–7288. doi:10.1021/jm200855b.

7. Böhm, Hans-Joachim, David Banner, Stefanie Bendels, Manfred Kansy, Bernd Kuhn, Klaus Müller, Ulrike Obst-Sander, and Martin Stahl. 2004. Fluorine in medicinal chemistry.

Chembiochem : a European journal of chemical biology 5: 637–43. doi:10.1002/cbic.200301023.

8. Shah, Poonam, and Andrew D Westwell. 2007. The role of fluorine in medicinal chemistry.

Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 22: 527–540.

9. Earl, Richard A., Robert Zaczek, Christopher A. Teleha, Barbara N. Fisher, Carla M. Maciag, Maria E. Marynowski, Andrew R. Logue, et al. 1998. 2-Fluoro-4-pyridinylmethyl analogues of linopirdine as orally active acetylcholine release-enhancing agents with good efficacy and duration of action. Journal of Medicinal Chemistry 41: 4615–4622. doi:10.1021/jm9803424.

10. Grnanger, Paolo, and Paola Vita-Finzi. 1999. Chemistry of Heterocyclic Compounds. Edited by Paolo Grnanger and Paola Vita-Finzi. Vol. 49. Chemistry of Heterocyclic Compounds: A Series Of Monographs. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc. doi:10.1002/9780470187357.

11. D. Giomi, F.M. Cordero, F. Machetti. 2008. Isoxazoles. In Comprehensive Heterocyclic Chemistry

III, 367–485. Elsevier. doi:http://dx.doi.org/10.1016/B978-008044992-0.00403-X.

12. David Greenwood. Antimicrobial Drugs: Chronicle of a Twentieth Century Medical Triumph. 1 st. ed. Oxford University Press.

13. Upadhyay, Archana, Madhuban Gopal, Chitra Srivastava, and N. D. Pandey. 2010. Isoxazole derivatives as a potential insecticide for managing Callosobruchus chinensis. Journal of Pesticide

Science 35: 464–469. doi:10.1584/jpestics.G10-40.

14. Jin, Ruifa, Weidong Sun, and Shanshan Tang. 2012. A DFT study of pyrrole-isoxazole derivatives as chemosensors for fluoride anion. International Journal of Molecular Sciences 13: 10986–10999. doi:10.3390/ijms130910986.

15. Galenko, A V, A F Khlebnikov, M S Novikov, V V Pakalnis, and N V Rostovskii. 2015. Recent advances in isoxazole chemistry. Russian Chemical Reviews 84: 335–377. doi:10.1070/RCR4503.

16. Dunstan, Wyndham R., and T. S. Dymond. 1891. XLV.—Contributions from the Research Laboratory of the Pharmaceutical Society of Great Britain. The action of alkalis on the nitro-compounds of the paraffin series. Formation of isoxazoles. J. Chem. Soc., Trans. 59: 410–433. doi:10.1039/CT8915900410.

17. Quilico, A., G. Stagno D‘alcontres, and P. Grünager. 1950. A New Reaction of Ethylenic Double Bonds. Nature 166: 226–227. doi:10.1038/166226a0.

18. Himo, Fahmi, Timothy Lovell, Robert Hilgraf, Vsevolod V. Rostovtsev, Louis Noodleman, K. Barry Sharpless, and Valery V. Fokin. 2005. Copper(I)-catalyzed synthesis of azoles. DFT study predicts unprecedented reactivity and intermediates. Journal of the American Chemical Society 127: 210–216. doi:10.1021/ja0471525.

19. Rostovtsev, Vsevolod V., Luke G. Green, Valery V. Fokin, and K. Barry Sharpless. 2002. A

stepwise huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective ―ligation‖ of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie - International Edition 41: 2596–2599. doi:10.1002/1521-3773(20020715)41:14<2596::AID-ANIE2596>3.0.CO;2-4.

20. Meldal, Morten, and Christian Wenzel Tomøe. 2008. Cu-catalyzed azide - Alkyne cycloaddition.

Chemical Reviews 108: 2952–3015. doi:10.1021/cr0783479.

21. Hansen, Trond V, Peng Wu, and Valery V Fokin. 2005. One-Pot Copper(I)-Catalyzed Synthesis of 3,5-Disubstituted Isoxazoles. The Journal of Organic Chemistry 70: 7761–7764.

doi:10.1021/jo050163b.

22. Evano, Gwilherm, Alexis Coste, and Kévin Jouvin. 2010. Ynamides: Versatile tools in organic synthesis. Angewandte Chemie - International Edition 49: 2840–2859.

doi:10.1002/anie.200905817.

23. DeKorver, Kyle a, Hongyan Li, Andrew G Lohse, Ryuji Hayashi, Zhenjie Lu, Yu Zhang, and Richard P Hsung. 2010. Ynamides: A Modern Functional Group for the New Millennium. Chem.

Rev. 110: 5064–5106. doi:10.1021/cr100003s.

24. P. Hsung, Richard, Hongyan Li, Lingfeng You, Xuejun Zhang, Whitney L. Johnson, and Ruth Figueroa. 2007. Synthesis of Amide-Substituted Isoxazoles and Pyrazoles via Regioselective [3+2] Cycloadditions of Terminally Unsubstituted Ynamides. Heterocycles 74: 553. doi:10.3987/COM-07-S(W)34.

25. Grecian, Scott, and Valery V. Fokin. 2008. Ruthenium-catalyzed cycloaddition of nitrile oxides and alkynes: Practical synthesis of isoxazoles. Angewandte Chemie - International Edition 47: 8285–8287. doi:10.1002/anie.200801920.

26. Liu, Tao, and Hua Fu. 2012. Copper-catalyzed synthesis of N-heterocyclic compounds. Synthesis

(Germany) 44: 2805–2824. doi:10.1055/s-0032-1316763.

27. Dudnik, Alexander S., and Vladimir Gevorgyan. 2010. Transition Metal-Catalyzed Synthesis of Monocyclic Five-Membered Aromatic Heterocycles. Catalyzed Carbon-Heteroatom Bond

Formation: 227–316. doi:10.1002/9783527633388.ch8.

28. Hamama, Wafaa S., Mona E. Ibrahim, and Hanafi H. Zoorob. 2013. Advances in the Chemistry of Aminoisoxazole. Synthetic Communications 43: 2393–2440. doi:10.1080/00397911.2012.729281.

29. Pinho e Melo, Teresa. 2005. Recent Advances on the Synthesis and Reactivity of Isoxazoles.

Current Organic Chemistry 9: 925–958. doi:10.2174/1385272054368420.

30. Kankala, Shravankumar, Ravinder Vadde, and Chandra Sekhar Vasam. 2011. N-Heterocyclic carbene-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition reactions: a facile synthesis of 3,5-di- and 3,4,5-trisubstituted isoxazoles. Organic & Biomolecular Chemistry 9: 7869. doi:10.1039/c1ob06072d.

31. Zheng, Hongchao, Robert McDonald, and Dennis G. Hall. 2010. Boronic acid catalysis for mild and selective [3+2] dipolar cycloadditions to unsaturated carboxylic acids. Chemistry - A European

Journal 16: 5454–5460. doi:10.1002/chem.200903484.

32. Michelet, Véronique, Patrick Y. Toullec, and Jean Pierre Genêt. 2008. Cycloisomerization of 1,n-enynes: Challenging metal-catalyzed rearrangements and mechanistic insights. Angewandte

Chemie - International Edition 47: 4268–4315. doi:10.1002/anie.200701589.

33. Watson, Iain D. G., and F. Dean Toste. 2012. Catalytic enantioselective carbon-carbon bond formation using cycloisomerization reactions. Chemical Science 3: 2899. doi:10.1039/c2sc20542d.

34. Aubert, Corinne, Louis Fensterbank, Pierre Garcia, Max Malacria, and Antoine Simonneau. 2011. Transition metal catalyzed cycloisomerizations of 1, n-allenynes and-allenenes. Chemical Reviews 111: 1954–1993. doi:10.1021/cr100376w.

35. Waldo, Jesse P., and Richard C. Larock. 2005. Synthesis of isoxazoles via electrophilic cyclization.

Organic Letters 7: 5203–5205. doi:10.1021/ol052027z.

36. Ginterová, Pavlína, Barbora Sokolová, Peter Ondra, Joanna Znaleziona, Jan Petr, Juraj Ševčík, and Vítězslav Maier. 2014. Determination of mushroom toxins ibotenic acid, muscimol and muscarine by capillary electrophoresis coupled with electrospray tandem mass spectrometry. Talanta 125: 242–247. doi:10.1016/j.talanta.2014.03.019.

37. Kupka, Teobald, and Piotr P. Wieczorek. 2016. Theoretical and experimental NMR studies on muscimol from fly agaric mushroom (Amanita muscaria). Spectrochimica Acta - Part A:

Molecular and Biomolecular Spectroscopy 153. Elsevier B.V.: 216–225.

doi:10.1016/j.saa.2015.08.026.

38. Larsen, Povl Krogsgaard, Lotte Brehm, and Kjeld Schaumburg. 1981. Muscimol, a Psychoactive Constituent of Amanita Muscaria, as a Medicinak Chemical Model Strucure. Acta Chemica

39. Petersen, Jette G., Rikke Bergmann, Povl Krogsgaard-Larsen, Thomas Balle, and Bente Frløund. 2014. Probing the orthosteric binding site of GABAa receptors with heterocyclic GABA carboxylic acid bioisosteres. Neurochemical Research 39: 1005–1015. doi:10.1007/s11064-013-1226-6.

40. Chen, Li-Chia, and Darren M Ashcroft. 2007. Risk of myocardial infarction associated with selective COX-2 inhibitors: Meta-analysis of randomised controlled trials. Pharmacoepidemiology

and Drug Safety 16: 762–772. doi:10.1002/pds.1409.

41. Liu, Meina, Qiuyang Yu, Ping Li, Meng Zhu, Mingming Fang, Bingjun Sun, Mengchi Sun, et al. 2016. Simultaneous determination of parecoxib sodium and its active metabolite valdecoxib in rat plasma by UPLC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study after intravenous and intramuscular administration. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the

Biomedical and Life Sciences 1022. Elsevier B.V.: 220–229. doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.009.

42. Sharma, Poornima, Debraj Gangopadhyay, Phool Chand Mishra, Hirdyesh Mishra, and Ranjan K. Singh. 2016. Detection of in Vitro Metabolite Formation of Leflunomide: A Fluorescence

Dynamics and Electronic Structure Study. Journal of Medicinal Chemistry 59: 3418–3426. doi:10.1021/acs.jmedchem.6b00088.

43. Zanatta, Geancarlo, Gustavo Della Flora Nunes, Eveline M. Bezerra, Roner F. Da Costa, Alice Martins, Ewerton W S Caetano, Valder N. Freire, and Carmem Gottfried. 2016. Two Binding Geometries for Risperidone in Dopamine D3 Receptors: Insights on the Fast-Off Mechanism through Docking, Quantum Biochemistry, and Molecular Dynamics Simulations. ACS Chemical

Neuroscience 7: 1331–1347. doi:10.1021/acschemneuro.6b00074.

44. Negi, Beena, Deepak Kumar, Widuranga Kumbukgolla, Sampath Jayaweera, Prija Ponnan, Ramandeep Singh, Sakshi Agarwal, and Diwan S. Rawat. 2016. Anti-methicillin resistant Staphylococcus aureus activity, synergism with oxacillin and molecular docking studies of metronidazole-triazole hybrids. European Journal of Medicinal Chemistry 115: 426–437. doi:10.1016/j.ejmech.2016.03.041.

45. Ling, Losee L, Tanja Schneider, Aaron J Peoples, Amy L Spoering, Ina Engels, Brian P Conlon, Anna Mueller, et al. 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 517: 455–459. doi:10.1038/nature14098.

46. Dong, Kui-yong, Hai-tao Qin, Xing-xing Bao, Feng Liu, and Chen Zhu. 2014. Oxime-Mediated Facile Access to 5-Methylisoxazoles and Applications in the Synthesis of Valdecoxib and Oxacillin. Organic Letters 16: 5266–5268. doi:10.1021/ol502246t.

47. Johnson, Leland, James Powers, Fupeng Ma, Keith Jendza, Bing Wang, Erik Meredith, and Nello Mainolfi. 2013. A reliable synthesis of 3-amino-5-alkyl and 5-amino-3-alkyl isoxazoles. Synthesis

(Germany) 45: 171–173. doi:10.1055/s-0032-1317935.

48. Hughes, E D. 1948. Steric hindrance. Q. Rev. Chem. Soc. 2. The Royal Society of Chemistry: 107– 131. doi:10.1039/QR9480200107.

49. P. Kadziauskas. 1999. Stereochemijos sąvokos. Edited by VU. Vilnius: Viniaus universiteto leidykla.