Le riceventi sono state sottoposte a diagnosi di gravidanza tramite ecografia transrettale 7 giorni dopo il trasferimento, corrispondente al 14° giorni di età dell’embrione. L’esame veniva ripetuto dopo due giorni e, in caso di riscontro positivo,ogni 48 ore fino al 26° giorno, successivamente una volta a settimana fino al termine.
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3. Risultati
Dai 24 cicli sono stati recuperati 14 embrioni (58,3%); dei 14 embrione recuperati, 12 risultavano di grado 1, uno di grado 2 e uno di grado 3, ottenendo un grado medio di 1,2; il diametro medio degli embrioni è risultato essere 422,04 µm (Tab. 1).
Dei 14 embrioni recuperati 13 sono stati sottoposti a vitrificazione; durante la fase di scongelamento gli embrioni n.3, n.5 e n.12 sono andati perduti durante lo svolgimento della procedura. Dieci embrioni sono stati trasferiti in altrettante riceventi (Tab. 1).
Dei 10 embrioni trasferiti, solamente uno (n.11) ha dato origine ad una gravidanza a 14 giorni, che è stata portata avanti correttamente e senza problemi, culminata in un parto eutocico al 304° giorno di gestazione con la nascita di una puledra sana e vitale nonostante la precocità della data del parto (Tab. 1). La percentuale di successo calcolata sugli embrioni trasferiti è stata quindi del 10% (1/10) e sugli embrioni recuperati del 13% (1/13)
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Tabella 1: Quadro riassuntivo dei risultati della tesi: embrioni recuperati, diametro, diagnisi di gravidanza e
esito. Embrione Diametro (µm) Grado Diagnosi gravidanza 14 gg Esito Note 1 561 1 Negativa 2 258 3 Negativa 3 619.2 1 Perso nello scongelamento 4 361.2 1 Negativa 5 541.8 1 Perso nello scongelamento 6 361.2 1 Negativa 7 412.8 1 Negativa 8 438.6 1 Negativa 9 335.4 2 Negativa 10 361.2 1 Negativa 11 361.2 1 Positiva Parto eutocico 12 516 1 Perso nello scongelamento 13 232 1 Negativa 14 594 1 Escluso dal protocollo
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4. Discussione
Gli embrioni equini, destinati ad essere immediatamente trasferiti o refrigerati, vengono comunemente recuperati 7-8 giorni dopo l’ovulazione della donatrice; in letteratura sono stati riportati tassi di recupero a 7 giorni pari al 76% (Squires e Seidel, 1995), 49,3% (Fleury e Alverenga, 1999), 61% (Jacob et al., 2012), 45,7% (Panzani et al., 2014). I tassi di recupero di embrioni per ciclo ottenuti in questo studio 7 giorni post ovulazione (58,4%) rientrano perfettamente nella percentuali riportate in bibliografia da altri autori.
Il diametro medio degli embrioni recuperati in questa tesi è stato di 422,04 µm; 7/14 embrioni sono risultati < 400 µm, gli altri 7 presentavano un diametro > a 400 µm. Anche questo risultato rientra tra quelli riportati in letteratura da altri autori: 575.0 ± 82.0 µm (Eldridge-Panuska et al., 2005), 498 µm (Flury e Alverenga, 1999), 404,91 ± 306,50 µm (Panzani et al., 2014), per embrioni di 7 giorni.
Nell’ambito delle tecnologie applicabili alla riproduzione animale, la crioconservazione degli embrioni, grazie alla possibilità di differirne nel tempo il trasferimento nelle riceventi e alla facilità di trasporto, se paragonato a quello degli animali vivi, offre numerosi vantaggi, tra i quali la riduzione dei rischi sanitari connessi allo spostamento di animali, la possibilità di gestire al meglio le donatrici nel proprio allevamento di origine, la conservazione per un tempo pressoché indefinito del germoplasma animale, la possibilità di accelerare il miglioramento genetico mediante l’utilizzo di individui “superiori”, quella di potenziare il commercio internazionale di genotipi animali e quella di ridurre i costi delle procedure di embryo transfer riducendo il numero di riceventi da mantenere. Nonostante questa serie di indubbi vantaggi, la crioconservazione degli embrioni equini non è ancora entrata nella pratica quotidiana a causa dei bassi tassi di gravidanza ottenuti in riceventi dopo trasferimento di embrioni congelati e scongelati.
Dall’esame della letteratura, appare ormai chiaro che il punto critico sono le dimensioni degli embrioni che si intende crioconservare. Riguardo alla tecnica tradizionale, congelamento lento, esistono numerosi studi che dimostrano che
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embrioni di dimensioni superiori ai 300 µm subiscono danni irreversibili durante il congelamento con la conseguenza di percentuali di gravidanza nelle riceventi molto basse. Ad esempio17% (Slade et al., 1985), 0 % (Meira et al., 1993).
Al contrario, il trasferimento di embrioni < 300 µm, sottoposti a congelamento lento, è risultato in percentuali di gravidanza nelle riceventi accettabili. Ad esempio 80% (Slade et al., 1985), 40% (Meira et al., 1993), circa 50% (Squires e Seidel, 1995). Il problema sembrerebbe facilmente risolvibile recuperando embrioni piccoli, di diametro < 300 µm. Morule o giovani blastocisti di queste dimensioni possono essere recuperate esclusivamente al 6° giorno dopo l’ovulazione. Sfortunatamente i tassi di recupero a quest’epoca sono significativamente più bassi rispetto a quelli riscontrabili al giorno 7 o 8 (Panzani et al., 2014; Squires e Seidel, 1995; Fleury e Alverenga, 1999), soprattutto operando in cavalle non più giovani, rendendo anche questo approccio inapplicabile nella pratica.
La tecnica della vitrificazione, introdotta nel 1985 (Rall e Fahy, 1985) e studiata nel cavallo a partire dal 1994 (Hochi et al., 1994), rispetto al congelamento tradizionale presenta il vantaggio di semplificare le procedure di esecuzione e di ridurne i costi e, soprattutto, di ovviare alla necessità di disporre di attrezzature costose come il congelatore programmabile, con la conseguenza di essere più facilmente alla portata dei veterinari pratici. Sfortunatamente anche la tecnica della vitrificazione, con le procedure fino ad oggi riportate in letteratura (Eldridge-Panuska et al., 2005;Lagneaux e Palmer, 1991; Slade et al., 1985), non ha risolto il problema della scarsa conservabilità degli embrioni di diametro >300 µm.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare se l’applicazione nel cavallo di un sistema di vitrificazione ultra-rapido chiuso, Rapid-I vitrification sistem, in uso nella specie umana, consentisse di ottenere percentuali di gravidanza accettabili nelle riceventi dopo trasferimento di embrioni recuperati 7 giorni dopo l’ovulazione, quindi di dimensioni >300 µm.
I risultati ottenuti in questo protocollo, 10% di riceventi gravide, rientrano nel range di quelli riportati in bibliografia, che oscillano da percentuali dello 0% (Eldridge-Panuska
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et al., 2005), al 29% (Takeda et al., 1984). Campos-Chillon e colleghi ottennero percentuali di sviluppo embrionale al 16° giorno, dopo vitrificazione di embrioni > 300 µm, del 35% (6/17), tuttavia il 55% degli embrioni con diametro compreso tra 300 e 400 µm si svilupparono, mentre nessun embrione con diametro >400 µm continuò la crescita (Campos-Chillon et al., 2006)
Attualmente le cause precise della difficoltà della crioconservazione degli embrioni equini di grandi dimensioni non sono completamente chiarite, anche se potrebbero essere ricercate nella probabile riduzione della permeabilità ai crioprotettori, indotta dalla presenza della capsula glicoproteica la quale comincia a formarsi circa 6 giorni dopo la fecondazione, continuando a svilupparsi in spessore durante i giorni successivi (Squires e Seidel, 1995). Lo sviluppo della capsula durante l’espansione della blastocisti equina potrebbe essere responsabile di una limitata permeabilità alle soluzioni crioprotettive (Hochi, 1995).
E’ stato anche ipotizzato che i maggiori tassi di sopravvivenza degli embrioni di piccole dimensioni ≤ 300 µm, possano essere una conseguenza di rapporti diversi tra volume e superficie degli stessi; gli embrioni piccoli avrebbero, infatti, un rapporto maggiore superficie/volume permettendo così un equilibratura con i crioprotettori più veloce, soprattutto durante la rimozione degli stessi in fase di scongelamento, rispetto ad embrioni con dimensioni più grandi (Ptaff, 1994). In questi ultimi, il ridotto tasso di sopravvivenza dopo crioconservazione potrebbe anche essere causato dalla formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari che portano alla disintegrazione degli organelli intracellulari, principalmente il citoscheletro (Dobrinsky, 1996).
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5. Conclusioni
La crioconservazione dei gameti e degli embrioni animali assume un’importanza sempre maggiore non soltanto da un punto di vista economico, ma anche della salvaguardia delle specie e dei genotipi a rischio di estinzione. La crioconservazione degli embrioni di cavallo presenta ancora notevoli difficoltà, ricollegate alla biologia della specie equina. Gli ostacoli più grandi ancora da superare sono la mancanza di efficaci protocolli di superovulazione che, da un punto di vista scientifico, determinano la difficoltà di avere a disposizione un numero sufficiente di embrioni per la ricerca, e da un punto di vista pratico, rende antieconomico l’investimento in costosi macchinari per il congelamento di un numero esiguo di embrioni; in aggiunta a tali problematiche, permane la difficoltà nel congelamento di embrioni > 300 µm, cioè di più del 90% degli embrioni che vengono recuperati nella pratica clinica.
Nelle condizioni di questo studio, il ricorso ad un protocollo impiegato per la vitrificazione di embrioni ed oociti nella specie umana, per la vitrificazione di embrioni di cavallo di diametro > 300 µm, non ha consentito percentuali di gravidanza accettabili dopo trasferimento degli embrioni nelle riceventi.
Ulteriori studi sono necessari prima che la crioconservazione degli embrioni equini possa essere attuata al difuori dei laboratori di ricerca, nella pratica clinica veterinaria.
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