Uno dei principali cambiamenti, nel campo dell’embryo transfer equino, nel corso degli ultimi anni, è stata la possibilità di conservare gli embrioni a 5°C (Squires et al., 2003). La refrigerazione e la conservazione degli embrioni equini a 5°C ha determinato la possibilità di trasportare gli embrioni a stazioni di monta centralizzate per il trasferimento in cavalle riceventi; circa il 70% degli embrioni trasferiti alla Colorado States University sono stati trasportati in Colorado da Veterinari e allevatori di varie parti degli USA (Squires e Seidel; 1995).
I primi studi condotti sulla refrigerazione degli embrioni equini hanno dato scarse percentuali di gravidanza; in uno studio condotto alla Colorado State University, 15 embrioni equini sono stati conservati in DPBS + 20% di siero, per 3 e 24 hore a 37°C; successivamente sono stati trasferiti tramite laparotomia ventrale mediana; gli embrioni coltivati per 24 h hanno dato un numero minore di gravidanze dopo trasferimento (3/15) rispetto a quelli che sono stati trasferiti subito dopo il flushing uterino (8/17) (Squires et al., 1982).
Douglas ha riportato che il mantenimento di embrioni equini in vitro, per più di 6 ore, utilizzando DPBS è responsabile della riduzione in percentuali di gravidanza; sono state ottenute 14/28 gravidanze dopo trasferimento chirurgico di embrioni conservati per meno di 3 ore, contro 0/7 gravidanze dopo trasferimento di embrioni conservati 6 ore nello stesso medium (Douglas, 1982).
Clark e colleghi hanno dimostrato che lo sviluppo di embrioni i vitro, per un periodo superiore a 24 ore in Ham’s F10 è stato maggiore rispetto a quelli mantenuti in “Minimum Essential Medium” (MEM) a 24°C o a 5°C (Clark et al., 1985); nello stesso studio gli autori hanno osservato che gli embrioni conservati in Ham’s F10 + 10% di FCS in atmosfera composta da 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 a 5°C, 24°C e 37°C sono stati considerati vitali ed hanno continuato a svilupparsi dopo coltura a 37°C.
Le procedure per il raffreddamento e il trasporto degli embrioni equini sono state descritte anche da Carnevale e colleghi, che hanno valutato la vitalità degli embrioni
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dopo 24 ore di conservazione in Ham’s F10 a 5°C in atmosfera modificata con 5% di CO2, 5% O2, e il 90% N2 (Carnevale et al., 1987); in questo studio, quaranta embrioni equini recuperati 7 giorni dopo l’ovulazione, sono stati conservati a 5°C per 24 h in uno dei due terreni di coltura (n = 20 / gruppo): 1) Ham’s F10 + FCS tamponato da gassificazione con il 5% di CO2, 5% O2 e 90% N2; 2) Ham’s F10 + FCS + soluzione tampone Hepes. Gli embrioni coltivati in Ham’s F10 + CO2 hanno mantenuto una qualità migliore ed hanno avuto un maggiore incremento medio diametro (34,8 micron) degli embrioni conservati in Ham’s F10 tamponato con Hepes (-10,2 micron). Gli embrioni sono stati trasferiti chirurgicamente in cavalle riceventi che avevano ovulato -3 o +1 giorni, in relazione alla donatrice. Venti embrioni coltivati in DPBS + 10% FCS e trasferiti meno di 1 ora dopo la raccolta, sono stati utilizzati come controlli. I tassi di gravidanza erano più alti per gli embrioni conservati in Ham’ F10 + CO2 (70%, 55%) che per gli embrioni conservati in Ham’s F10 + Hepes (20%, 15%) a 14 e 35 giorni, rispettivamente; per il gruppo di controllo i tassi di gravidanza sono risultati 90% e 80% a 14 e 35 giorni, rispettivamente (Carnevale et al., 1987).
Qualche anno più tardi, Carney e colleghi hanno riportato che non vi sono grandi differenze nelle percentuali di gravidanza ottenute da embrioni trasferiti subito dopo il recupero ed embrioni sottoposti ha refrigerazione; lo studio ha interessato 104 embrioni trasferiti freschi e 136 embrioni trasferiti dopo stoccaggio in Ham’s F10 + 10% FCS, 5% di CO2, 5% O2 e 90% N2 il tutto confezionato all’interno di una unità di
raffreddamento passivo (Equitainer); le percentuali di gravidanza a 12, 35 e 50 giorni sono risultate simili sia per i freschi (74, 64, 61%) sia per i refrigerati (80, 67, 66%) (Carney et al., 1991).
Squires ha riportato un lavoro scientifico nel quale le percentuali di gravidanza a 50 giorni dopo trasferimento chirurgico di embrioni freschi e refrigerati sono risultate simili: 66% per gli embrioni freschi contro 68% per gli embrioni refrigerati (Squires, 1992).
Generalmente, gli embrioni che vengono sottoposti a refrigerazione, sono raccolti nelle aziende dove è ubicata la donatrice, per poi essere spediti a stazioni centralizzate dove sono presenti le cavalle riceventi; il confezionamento avviene all’interno di contenitori
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a raffreddamento passivo (Equitainer; Hamilton Thorne Biosciences, Beverly, MA) ad una temperatura di circa 5°C e la spedizione mediante aereo o corriere su gomma. L’intervallo tra la raccolta e il trasferimento degli embrioni così conservati oscilla generalmente tra le 12-30 h. Purtroppo, se un embrione non viene recuperato da una donatrice e il terreno di coltura, Ham’s F10 + gas, era stato preparato in precedenza questo non può essere conservato e riutilizzato una seconda volta. Pertanto, molti ricercatori hanno tentato di individuare un terreno di coltura diverso per il trasporto di embrioni equini, che non richiede gas (Squires et al., 2003).
A tal proposito Fleri e colleghi, hanno condotto uno studio mantenendo embrioni equini in Ham’s F10 tamponato con Hepes + 0,4% BSA ad una temperatura di 15- 18°C per diversi periodi di tempo prima del trasferimento; gli embrioni sono stati suddivisi in cinque gruppi in base al tempo di conservazione: Gruppo 1: <1 h, Gruppo 2: 1-4 h, Gruppo 3: 4-8 h, Gruppo 4: 8-12 h, e Gruppo 5: 12 -18 h. Ciascun gruppo di trattamento è stato suddiviso in due categorie: embrioni di misura o <1000 o> 1000 micron. Non ci sono state differenze nei tassi di gravidanza tra i diversi periodi di raffreddamento e diametri embrioni. Gli autori hanno concluso che gli embrioni possono essere conservati in Ham’s F10 fino a 18 ore a 15-18 °C, senza alcun effetto negativo sui tassi di gravidanza (Fleury et al., 2002).
McCue e colleghi hanno comparato le percentuali di gravidanza di embrioni refrigerati per 24 ore in Ham’s F10 e in “Emcare holding solution” (EmCare™; ICP, Auckland, New Zealand) ed hanno osservato che le percentuali di gravidanza non erano diverse tra i due trattamenti (McCue et al., 2000). Moussa e colleghi hanno valutato diversi media, disponibili in commercio, per la conservazione degli embrioni equini. Nel primo esperimento hanno confrontato la vitalità degli embrioni conservati per 0, 6, o 24 ore utilizzando Ham’s F10, “Emcare holding solution” e “ViGro holding Plus” (A- B Technology, Pullman, WA). Dopo lo stoccaggio in Equitainer per la giusta quantità di tempo, è stata valutata la vitalità degli embrioni mediante tecnica “DAPI-staining” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) che evidenzia i nuclei delle cellule morte. Il numero di cellule morte a 0 e 6 era significativamente inferiore di quello a 24 ore; tuttavia, non vi è stata nessuna differenza significativa nel numero di cellule morte tra
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i diversi terreni di coltura. Nello stesso studio, gli autori, hanno confrontato i tassi di gravidanza derivanti dal trasferimento di embrioni conservati per 24 h in Ham’s F10 o EmCare™; anche se i numeri erano molto bassi non vi sono state differenze nei tassi di sopravvivenza degli embrioni (45% per Ham’s F10 e il 40% per EmCare™). Moussa e colleghi hanno affermato che EmCare™ e “ViGro holding Plus” offrono una buona alternativa al terreno di coltura Ham’s F10 per la refrigerazione (a 4°C) degli embrioni equini (Moussa et al., 2000).
Per quanto concerne le alterazioni morfologiche associate alla refrigerazione degli embrioni equini per periodi di tempo compresi tra 12 e 24 ore, Squires e Seidel hanno descritto alcune anormalità: collasso del blastocele (totale o parziale) con separazione cellulare dalla zona pellucida o dalla capsula, blastomeri estrusi, cellule scure e aumento della superficie granulare con aspetto di un apparente separazione delle cellule (Squires e Seidel, 1995). Carnevale ha osservato che il collasso del blastocele è comunemente associato ad embrioni piccoli (< 300 µm) (Carnevale et al., 1987). Clark ha descritto un aumento del disegno della superficie granulare con apparente delineazione tra singole cellule morte o cellule scure indicative di morte cellulare, come uno dei principali difetti associati alla refrigerazione di embrioni equini (Clark et al., 1987), sebbene Carnevale avesse affermato che un aumento della granulosità non è stato correlato ad una diminuzione della vitalità degli stessi (Carnevale et al., 1987).
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