Le metodiche che scolasticamente si possono impiegare per il trasferimento degli embrioni sono essenzialmente due: 1) trasferimento chirurgico; 2) trasferimento non chirurgico, ma attualmente la prima è completamente abbandonata.
I primi lavori di trasferimento chirurgico (mediante laparotomia ventrale mediana) hanno riportato percentuali di gravidanza pari al 15% e 44% dopo trasferimento di embrioni equini rispettivamente nel corno uterino controlaterale e ipsilaterale al corpo luteo (Allen e Rowson, 1975).
Successivamente è stato attuato un nuovo approccio tramite incisione sul fianco con cavalla in stazione (Squires e Seidel, 1995). Questi autori hanno descritto le procedure per effettuare il trasferimento chirurgico mediante approccio dal fianco: la cavalla viene mantenuta in stazione e adeguatamente contenuta in un travaglio, viene eseguita la tricotomia della regione del fianco (indifferentemente fianco destro o sinistro) che si estende dal coxale all’ultima costa e dall’area lombare ventrale fino al fianco, successivamente viene eseguito uno scrub chirurgico e applicato un drappeggio della regione interessata, al fine di rispettare le comuni norme di asepsi. La fattrice viene poi sottoposta a sedazione mediante l’utilizzo di xilazina idrocloride (0,5 mg/Kg), acepromazina (0,04 mg/Kg) e butorfanolo tartrato (0,02 mg/Kg) per via endovenosa; inoltre viene eseguita un anestesia locale tramite infiltrazione di 100 ml di lidocaina al 2% sia sulla cute che sui piani muscolari sulla linea di incisione. A questo punto viene eseguita una linea di incisione sulla cute arrivando ai piani muscolari su cui viene eseguita una dissezione per arrivare al peritoneo che viene perforato usando le dita; viene esteriorizzata una parte del corno uterino, dopodiché viene cercata una porzione avascolarizzata di esso su cui verrà eseguita un incisione per mezzo di un ago, attraverso la quale verrà trasferito l’embrione all’interno dell’utero (in 0,1 ml circa di medium) contenuto in una paillette sterile da 0,25 ml. Eseguito il trasferimento la porzione di corno uterino viene riposizionata in addome e viene eseguita una sintesi dei piani muscolari, sottocute e cute (Squires e Seidel, 1995).
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È stato riportato da Vanderwall, la possibilità di trasferire l’embrione equino all’interno del lume uterino sia nel corno ipsilaterale che controlaterale al corpo luteo, considerata la peculiarità di movimento dello stesso fino al 16° giorno (Vanderwall, 2000).
La tecnica chirurgica, fino a pochi anni fa, veniva preferita da molti autori poiché consentiva percentuali di gravidanza nelle riceventi molto elevate: 75-80% al giorno 12 e 65-70% al giorno 50 (Squires e Seidel, 1995).
Sono stati condotti molti studi al fine di comparare il trasferimento chirurgico e non chirurgico; Imel e colleghi hanno confrontato l’applicazione del trasferimento chirurgico eseguito mediante laparotomia mediana ed il trasferimento non chirurgico, trasferendo 30 embrioni di cui 15 con la prima tecnica e 15 con la seconda; le gravidanze sono risultate essere 4/15 per le riceventi in cui sono stati trasferiti embrioni per via non chirurgica e 8/15 in quelle per via chirurgica (Imel et al., 1981). Anche Iuliano e colleghi hanno comparato i tassi di gravidanza dopo trasferimento di embrioni con tecnica chirurgica e non chirurgica ottenendo 72% di gravidanze dopo trasferimento per via laparotomica del fianco, contro 45% dopo trasferimento per via transvaginale (Iuliano et al., 1985).
I risultati di grandi programmi di embryo transfer condotti in Argentina hanno riportato 353 gravidanze da 580 embrioni trasferita (61%) mediante tecnica non chirurgica (Riera e McDonough, 1993).
Il progresso della tecnica non chirurgica per il trasferimento degli embrioni equini è stato lento (Iuliano et al., 1985); tuttavia, i miglioramenti sostanziali del trasferimento transcervicale hanno reso il trasferimento chirurgico in gran parte obsoleto; il trasferimento transcervicale e più veloce, più economico e maggiormente rispettoso nei confronti del benessere delle riceventi. Infatti, in alcuni paesi Europei il trasferimento chirurgico è vietato (Stout, 2006). Inoltre, operatori esperti possono raggiungere di routine tassi di gravidanza superiori all’80% se hanno a disposizione adeguate riceventi (Losinno et al., 2001; Jasko, 2002).
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Gli embrioni di cavallo possono essere trasferiti nell’utero delle riceventi direttamente nel medium in cui sono stati recuperati. Tuttavia, è più solito trasferire embrioni in “holding medium” a cui l’embrione è stato esposto dopo recupero per l’esecuzione di vari lavaggi seriali; infatti tale medium offre un ambiente migliore per l’embrione nel caso di un ritardo nell’esecuzione del trasferimento, mentre le fasi di lavaggio aiutano a diluire qualsiasi microrganismo introdotto nel medium per il recupero embrionale durante lo svolgimento della procedura, oppure già presenti nell’utero della donatrice (Stout, 2006).
Il trasferimento transcevicale di un embrione è solitamente eseguito utilizzando una pistolette modello Cassou in metallo, dopo aver caricato l’embrione in paillette da 0,25 o 0,5 ml. La scelta delle dimensioni della pistolette e della paillette è in gran parte una questione di preferenza dell’operatore, ma è anche influenzata dalle dimensioni dell’embrione; piccoli embrioni sono più facili da raccogliere in paillette da 0,25 ml, ma embrioni più grandi non possono essere adattati a questo tipo di paillette (Jasko, 2002). In alternativa gli embrioni equini (in particolare quelli più grandi) possono essere trasferiti utilizzando una paillette da inseminazione sterile (Wilsher e Allen, 2004). In ogni caso, la paillette viene caricata con tre colonne di medium separate da due spazi d’aria, l’embrione viene caricato nella colonna centrale assieme al medium; la prima colonna di fluido serve a lubrificare l’uscita della paillette, mentre la terza garantisce che l’embrione venga sospinto fuori e lontano dalla paillette (Stout, 2006). La tecnica esatta per la manipolazione della pistolette di trasferimento, attraverso la cervice e nell’utero, differisce tra i vari operatori; tuttavia gli elementi essenziali per il successo del trasferimento sono: garantire che la pistolette entri correttamente nel lume uterino, evitare il trasporto di contaminanti in utero raccolti durante il passaggio dalla vulva e dalla vagina, evitare traumi al canale cervicale e all’endometrio. La contaminazione viene ridotta al minimo racchiudendo la pistolette in una guaina di plastica sterile (camicia sanitaria) che verrà introdotta nell’ostio cervicale esterno. Una volta nella cervice, la guaina viene tirata lentamente ma con fermezza all’indietro mantenendo la pistolette ferma, una volta rotta la camicia sanitaria viene fatta progredire la pistolette fino all’ostio cervicale interno e nel lume uterino. Oltre a
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rompere la camicia sanitaria al momento giusto, la destrezza necessaria per l’esecuzione della tecnica transcervicale è incentrata sul riuscire a manovrare la pistolette attraverso il canale cervicale in diestro, senza causare un eccessiva dilatazione o traumi; questa manipolazione può essere facilitata afferrando fermamente tra le dita la porzione sporgente della cervice ed eseguire una lieve trazione caudalmente in modo da raddrizzare il suo percorso (Stout, 2006).
In alternativa, è stata sviluppata di recente un'altra tecnica di trasferimento da Wilsher e Allen; essa comporta l’utilizzo di un vaginoscopio di Polansky a becco d’anatra (Kruuse, Marslev, Denmark) per consentire la visualizzazione dell’ostio esterno della cervice (Fig. 4.2a), questo verrà poi afferrato nella sua porzione ventrale mediante una pinza modificata di Velsellum (forcipe Wilsher [Kruuse]), che mediante la sua trazione caudale, determina il raddrizzamento del canale cervicale, del corpo e delle corna uterine consentendo un agevole passaggio della pistolette attraverso la cervice fino all’utero con un movimento fluido (Fig. 4.2b); a questo punto l’embrione contenuto all’interno della paillette viene depositato in utero. La tecnica è molto rapida e semplice da eseguire, in più i tassi di gravidanza raggiunto sono stati molto alti >90% (Wilsher e Allen 2004). Questa tecnica ha il grande vantaggio di aumentare la sterilita durante le fasi di trasferimento in quanto la strumentazione inserita nella vagina della cavalla subisce dei cicli di sterilizzazione prima di ogni utilizzo, inoltre richiede un breve tempo di esperienza per riuscire nella sua applicazione corretta. L’unico inconveniente è costituito dal fatto che richiede almeno due operatori: uno per inserire e tenere premuto il vaginoscopio sul posto, un secondo per raddrizzare la cervice e trasferire l’embrione (Allen, 2005).
Il semplice fatto che il trasferimento transcervicale sia più sensibile alla capacità dell’operatore rispetto al trasferimento chirurgico (Squires et al., 1999; Allen, 2005) dimostra che la corretta esecuzione della tecnica sia un fattore importante per il successo della procedura.
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Figura 4.2: Rappresentazione schematica dell’utilizzo del vaginoscopio di Polansky e delle pinze di Wilsher
per l’esecuzione del trasferimento non chirurgico dell’embrione. a) Dopo l’inserimento e apertura del vaginoscopio, le pinze di Wilsher vengono inserite verso l’orifizio esterno della cervice con l’aiuto di una fonte luminosa. b) Il quadrante ventrale della cervice viene afferrato con le pinze e stirato caudalmente in modo da stirare la cervice così che l’operatore possa inserire facilmente la pistolette e depositare l’embrione in utero. (Allen, 2005).
È ormai chiaro che i due fattori tecnici più importanti che implicano il mancato instaurarsi della gravidanza dopo trasferimento non chirurgico sono la contaminazione batterica dell’utero (Allen, 2005) e disturbi ormonali causati da un’eccessiva dilatazione o manipolazione della cervice che determinano il rilascio di ossitocina (Handler et al., 2003) e PGF2α con conseguente luteolisi (Kask et al., 1997). In risposta
a queste evenienze molti operatori trattano le riceventi con antibiotici sistemici pre e post trasferimento per ridurre il rischi dello sviluppo di una contaminazione batterica (Wilsher e Allen, 2004) e/o con flunixin meglumine e progestinici per 2-3 giorni dopo il trasferimento, per ridurre il rischio di mancata gravidanza a causa del rilascio di PGF2α e conseguente luteolisi. Secondo altri autori, i disturbi della funzione luteale
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et al., 1985; Kask et al., 1997); inoltre la dilatazione cervicale di per se non interrompe il proseguo della gravidanza (Handler et al., 2002). Gli elevati tassi di gravidanza ottenuti da operatori esperti, in assenza di trattamenti di supporto suggeriscono che tali trattamenti non sono necessari (Losinno et al., 2001; Jasko, 2002).
In definitiva questi trattamenti possono risultare utili durante l’acquisizione di esperienza nella tecnica del trasferimento anche se è probabile; che l’eventuale fallimento di tecnici inesperti sia dovuto al mancato deposito dell’embrione in cavità uterina. Questo può avvenire perché la pistolette non viene fatta avanzare correttamente attraverso la cervice, oppure perché l’embrione aderisce alla pistolette durante il trasferimento e viene rimosso con quest’ultima; lavare la punta della pistolette dopo l’esecuzione di un trasferimento evita di incappare in questa problematica (Jasko 2002).
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