La valutazione degli embrioni deve essere eseguita in laboratorio mediante l’ausilio di uno stereomicroscopio, mediante il quale viene assegnato un punteggio in base alla qualità dell’embrione (Tab. 4.5). Le caratteristiche morfologiche che vengono valutate sono: la compattezza dei blastomeri, blastomeri estrusi o danneggiati, colore dell’embrione, forma, la dimensione dello spazio perivitellino, danni alla zona pellucida e lo stadio di sviluppo in cui si presenta l’embrione (Squires e Seidel, 1995). In uno studio condotto da McKinnon è stato osservato che le percentuali di gravidanza dopo trasferimento di embrioni classificati come qualità 1 o 2, risultavano significativamente maggiori rispetto al trasferimento di embrioni classificati con qualità ≥ 3; in questo studio le percentuali di gravidanza dopo trasferimento di embrioni di qualità 1 o 2 furono 73% al giorno 15, 73% al giorno 35 e del 70% al giorno 50; mentre per gli embrioni con qualità ≥3 sono risultate 17% a 15, 35 e 50 giorni (McKinnon et al., 1988).
Tabella 4.5 Sistema di classificazione della qualità degli embrioni equini. (Adattato da Slade, 1984)
Grado Descrizione
1 Eccellente: Un embrione ideale, sferico, con cellule uniformi in taglia, colore e struttura.
2 Buono: Presenza di alcune imperfezioni come blastomeri estrusi, forma irregolare o separazione trofoblastica.
3 Medio: presenza di imperfezioni non gravi, presenza di blastomeri estrusi, cellule degenerate o blastocele collassato.
4 Scarso: gravi problemi, blastocele collassato, numerosi blastomeri estrusi, cellule degenerate ma con una massa embrionale ancora evidentemente vitale.
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. Selezione e gestione delle riceventi
Uno tra i più importanti fattori che condizionano il successo di un programma di embryo transfer è costituito dalla selezione, valutazione e gestione delle cavalle impiegate come riceventi per gli embrioni delle donatrici (McKinnon et al., 1988; Squires e Seidel, 1995).
Prima di essere arruolata in un programma di ET, le potenziali riceventi devono essere sottoposte a un esame clinico completo e scrupoloso (Squires et al., 1999; Vanderwall, 2000; Squires, 2006). Tale esame deve cominciare con un esame obbiettivo generale dello sviluppo scheletrico e muscolare, stato di nutrizione e tonicità muscolare, stato del sensorio, atteggiamenti e segni particolari, cute, annessi cutanei e connettivo sottocutaneo, mucose apparenti e linfonodi esplorabili, temperatura corporea, polso (frequenza cardiaca), respiro (frequenza respiratoria) e grandi funzioni organiche, perché è evidente che un problema di salute generale esclude la possibilità di impiegare l’animale come ricevente di un embrione che potenzialmente può avere un grande valore economico.
Bisognatenere in considerazione che anche patologie ortopediche quali laminiti, teniti, navicoliti possono essere responsabili di una diminuita efficienza riproduttiva; inoltre la presenza di patologie respiratorie ed in particolare patologie ostruttive (esempio: broncopolmonite cronica ostruttiva o COPD) secondariamente a sforzo respiratorio per tosse e dispnea espiratoria possono predisporre la cavalla a pneomovagina e ad infezioni uterine (Easley, 1993). Le riceventi devono essere in buone condizioni generali ed avere un adeguato body condition score essere relativamente giovani (3-12 anni), dal momento che l’età è un importante fattore predisponente alla degenerazione dell’endometrio che comporta a sua volta l’incapacità di mantenere la gravidanza (Ricketts e Alonso, 1991; Morris e Allen, 2002); infatti le riceventi di età >10 anni sembrano essere a maggior rischio di perdere una gravidanza derivante da ET (Carnevale et al. 2000).
Fondamentale poi è l’esame obiettivo particolare con ispezione e palpazione dell’apparato riproduttoredella ricevente ed eventuali esami collaterali.
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Come e più di quanto ricordato per la donatrice, anche nella ricevente è importante osservare la conformazione del perineo associata all’inclinazione e lunghezza della vulva.; Pascoe nel 1979 ha attribuito un indice alla conformazione vulvare chiamandolo indice di Caslick. Tale indice è dato dal prodotto tra la distanza espressa in centimetri che va dalla commessura dorsale della vulva all’osso pubico e il valore dell’angolo di inclinazione della vulva; cavalle che presentano un indice superiore a 150 presentano generalmente problemi riproduttivi maggiori tra cui pneomovagina, flogosi uterina e urovagina, rispetto a quelle con un indice inferiore a 50 (Caslick, 1937; Pascoe, 1979). Come già precedentemente riportato per le donatrici, tutte quelle riceventi che presentano un indice di Caslick > 150 devono essere sottoposte ad un intervento di Caslick o di “Caslick modificato” (McKinnon, 1993).
L’esame delle riceventi prosegue con una minuziosa indagineecografica dell’apparato riproduttore. Ogni minima deviazione dall’aspetto normale, quale, ad esempio, raccolte di fluido o di aria in utero cisti uterine, tumori ovarici o altre anomalie ovariche indirizzano inequivocabilmente il clinico a non arruolare la cavalla come ricevente.
Squires e Seidel hanno riportato una percentuale di fattrici scartate al momento della scelta delle riceventi variabile dal 15 al 20%; i due Autori anno anche affermato che, tutte quelle cavalle che tramite biopsia uterina sono state classificate come 1A o 1B e non presentano fenomeni acuti o cronici di endometrite, possono essere accettate come riceventi di embrioni (Squires e Seidel, 1995).
Le riceventi debbono essere vaccinate per influenza, tetano e rinopolminite e tenute in quarantena per un periodo non inferiore a trenta giorni prima di essere immesse nel branco; inoltre devo essere garantiti i regolari piani di sverminazione.
Il fattore che maggiormente influenza la probabilità di gravidanza dopo un ET è la sincronia tra ricevente e donatrice (Stout, 2006). Sebbene la grande variabilità di lunghezza dell’estro tra le varie fattrici complichi la procedura di sincronizzazione, questo viene in qualche maniera controbilanciato dal fatto che la sincronia richiesta
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nelle cavalle è considerevolmente meno precisa rispetto ad altre specie di animali da allevamento (Allen, 2005).
In numerosi studi è stato dimostrato che le riceventi che hanno ovulato da un giorno prima (+1) fino a tre giorni dopo (-3) l’ovulazione della donatrice, hanno la stessa probabilità di rimanere gravide dopo il trasferimento di un embrione (Allen e Rowson, 1975; Squires e Siedel, 1995); al di fuori di questo periodo accettabile di sincronia, i tassi di gravidanza subiscono una marcata diminuzione.
Wilsher e colleghi hanno condotto uno studio nel tentativo di poter valutare l’ampliamento dell’intervallo di sincronizzazione tra ricevente e donatrice; è stato somministrato un inibitore della sintesi delle prostaglandine, l’acido meclofenamico, in cavalle riceventi di embrioni che avevano ovulato da 1 a 5 giorni prima delle donatrici, a partire dal 9° giorno dell’ovulazione fino al 7° giorno dopo il trasferimento. Sono stati raggiunti alti tassi di gravidanza nelle riceventi trattate che avevano ovulato 2-3 giorni prima delle donatrici, mentre le gravidanze che si sono stabilite in caso di un più lungo periodo di asincronia (4-5 giorni) sono state quasi sempre perse in seguito (Wilsher et al., 2006).
Carnevale e colleghi hanno riportato che la perdita di una gravidanza derivante da ET risulta più probabile se le riceventi presentano ovulazioni 7 giorni dopo quelle delle donatrici, questo è probabilmente imputato al fatto che l’embrione non ha il tempo necessario per determinare un adeguamento dell’utero alla produzione di sostanze nutritive essenziali per l’embrione stesso (Carnevale et al., 2000), o di inviare il messaggio per il riconoscimento materno di gravidanza impedendo la sovra regolazione dei recettori endometriali per l’ossitocina, un processo che inizia 8-10 giorni dopo l’ovulazione (Stout et al. 1999).
In genere la maggior parte degli operatori preferisce trasferire embrioni di 7-8 giorni, in riceventi che hanno ovulato da 0 a 2 giorni dopo la donatrice; tale sincronia si ottiene in maniera abbastanza agevole se si ha a disposizione un gruppo “centralizzato” di riceventi, in modo da poter disporre di due o tre riceventi per ciascuna donatrice, in modo si da poter scegliere la migliore sia da non avere problemi
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nel caso in cui si recuperino più embrioni da una singola donatrice (Squires e Seidel, 1995).
In casi particolari, è possibile utilizzare come riceventi cavalle ovariectomizzate o fattrici in anestro trattate con progestinici subito dopo l’ovulazione della donatrice (Hinrichs et al. 1987); tale approccio può risultare utile all’inizio della stagione di monta quando relativamente poche riceventi cicliche sono disponibili. Sebbene non siano segnalati numerosi trasferimenti in cavalle acicliche e trattate con progestinici, i tassi di gravidanza e le perdite embrionali non sembrano discostarsi significativamente da quelli ottenuti in cavalle cicliche e ben sincronizzate (Carnevale et al., 2000; Pessôa et al., 2005), a patto che una dose adeguata di progestinico venga somministrata fino a quando non vi sia un sufficiente produzione endogena (McKinnon et al. 1988).
Sebbene la sincronia con la donatrice sia la componente più importante per determinare l’idoneità o meno di una ricevente, ci sono anche una serie di altri fattori, tra i quali la qualità della ricevente in quel determinato ciclo, che influiscono sulla possibilità di ottenere e mantenere la gravidanza.
Per questo motivo Squires e Seidel hanno consigliato di effettuare un esame palpatorio ed ecografico dell’apparato riproduttore delle riceventi prima, in genere il 5° giorno dopo l’ovulazione, del trasferimento dell’embrione (Squires e Seidel, 1995).
Il tono uterino, sia delle corna che del corpo, al momento del trasferimento sono utili indicatori di idoneità della ricevente; uno scarso tono uterino è associato ad un tasso di gravidanza più basso e una maggiore probabilità di perdita di gravidanza (Carnevale et al., 2000).
Un aspetto di gran lunga trascurato nella scelta delle riceventi è quello di scegliere cavalle con le dimensioni corporee simili a quelle della donatrice e dello stallone, una ricevente è in genere scelta sulla base dei costi e della sincronia, ponendo poca attenzione a quest’ultimo aspetto. Studi condotti in Newmarket sul trasferimento di embrioni di Purosangue in Pony e viceversa, hanno dimostrato chiaramente che gli squilibri tra la “dimensione genetica” degli embrioni e le dimensioni delle riceventi, influiscono su molti aspetti sia intrauterini che sullo sviluppo post-natale del soggetto.
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Una dimensione materna inappropriata determinerà, a seconda delle diverse dimensioni, una riduzione o un aumento della crescita del feto alla nascita (Allen et al., 2002), che nonostante un certo grado di compensazione durante la vita post-natale, viene mantenuto durante la maturità (Allen et al. 2004). Inoltre, la ritardata crescita intrauterina dei feti di Purosangue, condotta all’interno degli uteri del Pony, ha evidenziato chiari segni di un’immaturità sia fisica che comportamentale alla nascita; come ad esempio un ritardo in quelli che sono i tempi semeiologici naturali e una ridotta capacità di rilasciare cortisolo in risposta alla stimolazione da parte dell’ACTH (Ousey et al., 2004).
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