Il recupero degli embrioni viene generalmente eseguito 7-8 giorni dopo l’ovulazione della cavalla donatrice; Squires ha riportato che il periodo entro il quale si può procedere alla raccolta degli embrioni è compreso tra il 6° e il 9° post ovulazione (Squires et al., 1999); di fatti il recupero mediante lavaggio uterino non può essere eseguito prima che l’embrione sia disceso dalle tube all’utero, fenomeno che avviene intorno a 5,5 giorni dopo l’ovulazione (Freeman, 1991).
Al giorno 6 la percentuale di recupero degli embrioni è risultata inferiore rispetto ai giorni 7, 8 e 9 e l’unico vantaggio è stato rappresentato dalla maggior vitalità embrionale dopo congelamento (Squires et al., 1999).
L’embrione viene recuperato, ormai da molti anni, con tecnica esclusivamente non chirurgica (Daves, 2000) con piccole varianti in base ai diversi autori (Fig. 4.1).
Squires e Seidel hanno riportato un esempio di tecnica non chirurgica per il recupero degli embrioni: la cavalla viene posta in un travaglio per favorirne il contenimento, dopo di che la coda viene fasciata e legata lateralmente impedendo così di creare fastidio all’operatore durante le procedure; il perineo e la vulva vengono lavati per tre volte con scrub chirurgico utilizzando soluzioni iodate e poi risciacquate con acqua; a questo punto l’operatore, indossando un guanto sterile lungo fino alla spalle, inserisce il catetere attraverso la cervice fino ad entrare in utero, una volta sicuro della posizione del catetere, il pallone alla sua estremità verrà gonfiato con circa 75ml di aria o liquido di lavaggio dopo di che verrà tirato leggermente in dietro così da occludere completamente l’ostio cervicale interno per non permettere la fuoriuscita di liquido durante le operazioni successive (Squires e Seidel, 1995).
Imel e colleghi osservano che il catetere dovrebbe essere inserito per 5 cm all’interno del corpo dell’utero (Imel et al., 1981).
Possono essere utilizzati diversi tipi di catetere; i più frequentemente utilizzati sono: il catetere esofageo umano di Foley modificato (McKinnon e Squires, 1988), il catetere
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urogenitale di Franklin (Volgeslang et al., 1985) e la sonda per il lavaggio uterino delle fattrici (Palmer et al., 1988).
Il lavaggio uterino può essere fatto utilizzando diverse soluzioni: una tra le prime soluzioni usate è stata la Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) contenente l’1% di siero fetale di bovino (circa 1ml di FCS); negli Stati Uniti molti lavaggi uterini sono stati effettuati con 2-3 litri di DPBS (Squires, 1999; Vanderwall, 2000).
Sono stati utilizzati anche altri medium ricchi di tensioattivi switterionici quali Vigro® e EmCare® i quali sembrano avere un’embriotossicità minore rispetto al DPBS, anche se sono più costosi (Squires e Seidel, 1995). Alvarenga e colleghi in uno studio hanno riportato la possibilità di utilizzare il Ringer lattato: gli autori hanno trasferito 36 embrioni di cui 14 erano stati recuperati con DPBS e 22 con Ringer lattato; le percentuali di gravidanza a 60 giorni dopo trasferimento sono state rispettivamente 57% (8/14) e 64% (14/22) (Alvarenga et al.,1993).
Figura 4.1 Procedura di recupero dell’embrione.
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Squires e Seidel hanno osservato che tutti medium di lavaggio dovrebbero essere mantenuti ad una temperatura di 32-35°C prima di essere utilizzati, la quantità da utilizzare dovrebbe variare tra 700ml e i 3 litri totali in relazione alla taglia e all’anamnesi riproduttiva della fattrice (primipara o pluripara) (Squires e Seidel, 1995). Nella tecnica riportata da Squires e Seidel il liquido di lavaggio viene infuso in utero, dopo di che il liquido viene raccolto per gravità in un cilindro graduato previo passaggio attraverso un filtro con pori di diametro di 75 µm (Squires e Seidel, 1995); gli autori hanno consigliato di eseguire un massaggio delle corna e del corpo uterino durate il lavaggio, per facilitare il recupero di tutto il medium infuso.
Diversi autori hanno consigliato di effettuare almeno tre cicli di lavaggio/recupero del medium di lavaggio (Imel et al., 1981; McKinnon e Squires, 1988; Palmer et al., 1988).
La maggior parte del liquido di lavaggio infuso nell’utero della cavalla viene recuperato; a tal proposito in uno studio condotto alla Colorado State University su 224 embryo transfer, il 98,2% del medium di lavaggio è stato recuperato con successo dall’utero delle donatrici (Iuliano, 1983).
È stato riportato che raramente vi è stata la necessità di somministrare 20 U.I i.v. di Ossitocina alla donatrice, per facilitare il recupero del fluido di lavaggio; spesso il mancato recupero completo del medium è dovuto ad un errato posizionamento della sonda (Squires e Seidel, 1995).
Il liquido di lavaggio una volta recuperato dovrebbe essere chiaro, senza detriti cellulari o sangue; Iuliano ha osservato che su 240 medium di lavaggio solo 26 risultavano essere contaminati da sangue (Iuliano, 1983).
Terminata la procedura di lavaggio, la cuffia della sonda viene sgonfiata togliendo l’aria o l’acqua precedentemente inserita, la sonda viene estratta dall’utero della cavalla ed il liquido di lavaggio rimasto al suo interno viene fatto defluire attraverso il filtro. A questo punto si procede alla ricerca dell’embrione rovesciando il contenuto del filtro in una capsula Petri sterile che presenta delle quadrettature sul fondo in modo
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da facilitare la ricerca dell’embrione; il filtro viene lavato usando una siringa contenente circa 60ml di DPBS, il liquido utilizzato per il lavaggio del filtro viene recuperato all’interno della capsula Petri (Squires e Seidel, 1995). La ricerca dell’embrione può essere effettuata anche senza filtro ma la procedura richiede un attesa di 20 minuti per la sedimentazione dell’embrione sul fondo del contenitore (Imel et al, 1981).
Diversi autori hanno riportato l’utilizzo di filtri all’interno dei quali l’embrione può essere cercato direttamente nel fluido residuo di raccolta (Hinrichs et al., 1985; Squires, 1993; Vanderwall, 2000).
La ricerca dell’embrione, di 8 giorni, che normalmente presenta un diametro che oscilla tra 0,5-1 mm, può essere effettuata ad occhio nudo, mentre uno stereo microscopio con un ingrandimento di 10x-50x è necessario per la ricerca di embrioni più giovani che misurano mediamente 400 µm, al 7° giorno e 200 µm al sesto. Di fondamentale importanza, per la previsione dell’esito dell’ET, è la valutazione della qualità dell’embrione basata su parametri morfologici (McKinnon e Squires, 1988) e sulla valutazione dello stadio di sviluppo e del diametro rapportato all’età dell’embrione. A questo riguardo è riportato come il trasferimento di embrioni di qualità scadente o con sviluppo ritardato risulta in una percentuale di gravidanza nelle riceventi significativamente inferiore rispetto al trasferimento di embrioni di buona qualità e ben sviluppati. In alcuni casi è necessario distinguere un embrione da un ovocita non fertilizzato (Stout, 2006).
Eseguite le operazioni precedenti l’embrione viene sottoposto a lavaggi seriali, generalmente 10, trasferendolo da un pozzetto all’altro contenenti medium di coltura che può essere DPBS addizionato con 10% di siero fetale bovino, Vigro® o EmCare®; (Vanderwall, 2000). Al termine di questi passaggi l’embrione è pronto per poter essere trasferito nella ricevente. I fattori che influenzano il recupero embrionale includono il giorno del recupero, il numero delle ovulazioni, l’età della donatrice e la sua storia riproduttiva, lo stallone e il tipo di seme utilizzato per l’inseminazione (Squires e Seidel, 1995;Panzani et al, 2014).
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La percentuale di recupero embrionale varia in base al giorno di recupero ed è maggiore quando maggiori sono le dimensioni dell’embrione (Tab 4.2).
Tabella 4.2. percentuali di recupero embrionale a 6-7-8-9 giorni post ovulazione e inseminazione artificiale con
seme fresco.
Riferimenti
bibliografici Giorno 6 Giorno 7 Giorno 8 Giorno 9
Iuliano et al., 1985 (21/32) 65% (68/90) 75% (50/61) 82% Squires e Seidel, 1995 (86/137) 62% (73/96) 76% (218/293) 74,4% (43/53) 81,1% Fleury e Alverenga, 1999 (106/215) 49,3% (388/669) 58% (18/33) 54,5% Panzani et al., 2014 (16/35) 45,7% (287/546) 52,6% (27/63) 42,9%
Così come la percentuale di recupero, anche le dimensioni dell’embrione variano in concomitanza del giorno di recupero (Tab 4.3).
Tabella 4.3 Effetto del giorno di recupero sul diametro embrionale. (M) taglia media in µm, (r) range diametro
embrionale in µm, (V) percentuale embrioni visti ad occhio nudo.
Riferimenti
bibliografici Giorno 6 Giorno 7 Giorno 8 Giorno 9
Iuliano et al., 1985 M 201 r 132-380 M 488 r 136-1284 M 1368 r 369-3980 Fleury e Alverenga, 1999 M 498 r 120-2000 V 40,4% M 873 r 150-3000 V 72,1% M 1835 r 220-4500 V 94,7% Panzani et al., 2014 M 404,91 ± 306,50 M 660,29 ± 329,33 M 912,39 ± 665,11
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Per quanto concerne il diametro degli embrioni è importante considerare anche il momento dell’inseminazione; in un recente studio di Cuervo Arango e colleghi è stato visto che gli embrioni concepiti tramite inseminazione artificiale post-ovulazione necessitano di un giorno in più per ottenere diametri della vescicola embrionale simili a quelli derivanti da inseminazioni effettuate prima dell’ovulazione (Cuervo Arango et al., 2009).
La percentuale di recupero embrionale può essere influenzata dall’uso di stalloni aventi un seme con una fertilità ridotta o seme congelato di particolari stalloni (Squires e Seidel, 1995); Panzani e colleghi, mediante uno studio retrospettivo su programmi commerciali di ET, in cui hanno analizzato vari fattori che influenzano il recupero embrionale hanno riportato che, il tasso di recupero embrionale utilizzando seme fresco, refrigerato, congelato e refrigerato+congelato, per l’inseminazione delle donatrice, è stato rispettivamente del 60,8%, 51,1%, 43,8%, 61,9% (Panzano et al., 2014).
Squires e colleghi hanno riportato una percentuale di recupero maggiore da fattrici inseminate con seme fresco o spermatozoi diluiti (62 e 78%) con skimmilk extender, rispetto a quelle inseminate con spermatozoi diluiti in lactose-EDTA extender (48%) (Squires et al., 1982).
In tabella 4.4 sono riportate le percentuali di recupero embrionale in cavalle che sono state inseminate con spermatozoi aventi subito diversi trattamenti; si può notare che il seme fresco o refrigerato non è responsabile di differenze nel recupero degli embrioni, le uniche differenze che insorgono sono dovute all’eccessivo periodo di conservazione del seme (Squires e Seidel, 1995).
Diversi autori hanno osservato che uno tra i principali fattori che possono influire sul recupero embrionale è imputato alla storia riproduttiva della donatrice (Carnevale e Ginther, 1995; McKinnon et al., 1988; Squires e Seidel, 1995; Vogelsang, 1989; Panzani et al., 2014).
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Tabella 4.4. Effetto del tempo e della temperatura di conservazione del seme sulla percentuale di recupero
embrionale. (Squires e Seidel, 1995).
Conservazione seme (ore) Temperatura (°C) Numero di Cavalle Recupero Embrionale (%) 0 37 191 65 12 20 32 50 24 20 123 51 24 5 34 59 48 20 16 0 48 5 34 32
Fattrici anziane con un’anamnesi riproduttiva che presenta problematiche possono produrre un minor numero di embrioni; tra le cause responsabili di della ridotta percentuale di recupero embrionale in cavalle anziane vi sono patologie uterine e salpingee ed elevati tassi di perdita embrionale precoce (Ball et al., 1989).
In uno studio è stato riportato che le percentuali di maturazione di oociti ottenuti da cavalle anziane (≥ 15 anni) risultano inferiori a quelle ottenute da oociti prelevati da cavalle giovani (Brinsko et al., 1995).
Carnevale e Ginther hanno dimostrato che oociti ed embrioni derivanti da fattrici anziane hanno una probabilità elevata di degenerare all’interno dell’ovidutto o durante il trasferimento indipendentemente da patologie uterine o salpingee (Carnevale e Ginther, 1995); in questo studio sono stati recuperati oociti da cavalle anziane di 20-26 anni e giovani di 4-6 anni. Gli oociti recuperati sono stati fati maturare in vitro e successivamente trasferiti in giovani riceventi inseminate 12 ore prima e subito dopo il trasferimento. La percentuale di gravidanza a 12 giorni è stata del 92% per le donatrici giovani (11/12) e 31% per le donatrici anziane (8/26).
In fine per quanto riguarda l’influenza di più cicli di embryo transfer durante la stessa stagione riproduttiva sulla percentuale di recupero embrionale, è stato condotto uno studio da Imel che ha confrontato le percentuali di recupero embrionale al primo, secondo, terzo e il quarto ciclo ottenendo una percentuale di recupero simile per tutti i
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tentativi (circa 73%); l’autore ha affermato che ogni tentativo di recupero è indipendente dall’altro salvo che non ci siano patologie dell’apparato riproduttore della fattrice (Imel, 1981).
Squires e Seidel hanno osservato che lavaggi uterini ripetuti per il recupero embrionale, generalmente non presentano controindicazioni nel caso di donatrici con buona storia riproduttiva; al contrario, fattrici con un anamnesi riproduttiva difficoltosa, potrebbero mal tollerare un flushing per ciascun ciclo e quindi sarebbe meglio non utilizzare tutti i cicli estrali (Squires e Seidel, 1995).
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