I fluorofori

I fluorofori tipicamente sono formati da un certo numero di gruppi aromatici com- binati tra loro, possono essere ciclici o planari e le propriet`a dello spettro di assorbi- mento sono determinate sopratutto dal numero di elettroni di tipo π presenti nella struttura della molecola.

Gli elettroni π per definizione sono quelli coinvolti nella formazione dei legami π, ovvero quei legami formati dalla sovrapposizione di orbitali Py e Pz (dove x `e la

direzione dell’asse del legame) e in cui la densit`a elettronica risulta massima nello spazio situato sopra e sotto il piano in cui risiedono i due nuclei. In particolare i legami π sono tipici dei doppi legami presenti nelle molecole. La fig.2.12 mostra schematicamente l’orientazione spaziale degli orbitali coinvolti [31].

Prendendo ad esempio il doppio legame C = C, la transizione elettronica responsa- bile dell’assorbimento `e una transizione che porta un elettrone da un orbitale π in un orbitale π∗ (detto antibonding). La transizione π → π∗ del doppio legame non coniugato avviene a circa 7 eV e ad una lunghezza d’onda corrispondente di 180 nm (ultravioletto).

Nei fluorofori la determinazione delle energie coinvolte `e pi`u complicata, poich`e en- trano in gioco i legami tra i vari gruppi molecolari e le interazioni con l’ambiente esterno alla molecola. Tuttavia esiste una caratteristica molto suggestiva presente nella maggior parte dei fluorofori, ovvero che essi sono composti da sistemi coniuga- ti, sistemi cio`e in cui si ha una perfetta alternanza di singoli e doppi legami tra gli atomi della molecola: a scopo illustrativo due esempi di configurazione molecolare sono riportati in fig. 2.13.

All’interno di questi sistemi, gli elettroni associati alla funzione d’onda molecolare π possono essere considerati come elettroni delocalizzati lungo l’intera struttura della macromolecola. Il risultato `e che l’energia delle transizioni elettroniche (e quindi anche la lunghezza d’onda di assorbimento e di emissione) dipende criticamente dal- la grandezza e dalla forma della molecola: sistemi coniugati spazialmente pi`u estesi possiedono spettri di assorbimento traslati verso lunghezze d’onde maggiori.

Un modello molto semplice in grado di spiegare qualitativamente come la lunghez- za d’onda sia legata alla dimensione della molecola `e quello in cui l’elettrone viene considerato libero, all’interno di una scatola delle dimensioni della molecola stessa. [33]

2.2. LA MICROSCOPIA DI FLUORESCENZA 43

Figura 2.13: Esempi di sistemi coniugati in fluorofori noti: A)clorofilla, B) β-carotene

compie una transizione tra due livelli energetici quantizzati. La transizione ad ener- gia pi`u bassa (e a lunghezza d’onda pi`u alta) avviene tra i due orbitali di frontiera HOMO (highest occupied molecular orbital) e LUMO (lowest occupied molecular orbital). Chiamando rispettivamente le energie di questi due livelli E1 ed E2 si ha:

hc

λ = E1− E2 (2.26)

Il calcolo di queste energie pu`o essere effettuato considerando il modello dell’elettrone libero in una scatola, facendo l’ipotesi drastica che la molecola sia lineare, composta da N atomi, distribuiti spazialmente tutti alla stessa distanza a.

La lunghezza totale della catena `e quindi (N − 1)a, e questa fissa le condizioni di quantizzazione per il numero d’onda delle oscillazioni ammesse:

K(N − 1)a = nπ (2.27)

In approssimazione di elettrone libero gli autovalori dell’energia sono semplicemente: E = K 2 ~2 2m = n2_π2 ~2 2m(N − 1)2_a2 (2.28)

Per calcolare questi autovalori `e sufficiente contare quanti sono gli elettroni delo- calizzati π all’interno della molecola. C’`e soltanto un elettrone di questo tipo per atomo (per un totale di N elettroni), e ogni stato di energia n-esimo pu`o accomodare due di questi elettroni grazie al principio di Pauli. Quindi se la molecola `e composta da un numero N pari di atomi, il pi`u alto livello occupato `e:

EN/2= ~

2_(N/2)2_π2

2m(N − 1)2_a2 (2.29)

La differenza di energia tra il pi`u basso livello non occupato il pi`u alto livello occupato `e:

∆E = EN/2+1− EN/2 = ~

2_{(N + 1)π}2

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Figura 2.14: Lunghezze d’onda d’assorbimento per molecole lineari calcolati con il modello di particelle libere, e con una spaziatura tra gli atomi pari a 1nm [33] Invertendo la (2.26) si ha infine:

λ = 8mca

2_{(N − 1)}2

(N + 1)h (2.31)

L’equazione (2.31) suggerisce, in un modello che possiamo ritenere qualitativamente valido, come la lunghezza d’onda scali con le dimensioni della molecola. La lun- ghezza d’onda della luce assorbita raggiunge le lunghezze d’onda del visibile per molecole composte da 15 a 25 atomi (fig.2.14) nonostante le drastiche assunzioni fatte i risultati di questo semplice modello sono molto buoni per i sistemi coniugati come quelli in fig. 2.13.

Nel caso in cui si vogliano calcolare le propriet`a spettrali dei fluorofori dal punto di vista quantitativo, bisogna andare pi`u in profondit`a con le tecniche e i principi della meccanica quantistica, tenendo conto esplicitamente delle posizioni dei singoli atomi e delle funzioni d’onda nel calcolo degli orbitali HOMO e LUMO.

Due fluorofori comunemente utilizzati per la microscopia di fluorescenza, sono: ˆ L’isotiocianato di fluoresceina (FITC) (fig.2.15): questo composto possiede

uno spettro di eccitazione centrato nel blu (494nm) e uno di emissione centrato nel verde (520nm);

ˆ il Tetramethylrhodamine (TRITC), che possiede un picco di assorbimeno nel verde (532nm) e un picco di emissione nel rosso (571nm).

Il vasto utilizzo di questi due fluorofori `e dovuto alla presenza del gruppo isotio- cianato (N = C = S) che risulta molto reattivo, e quindi `e facile coniugare questi composti con alcuni tipi di biomolecole, come ad esempio gli anticorpi, o alcuni tipi di proteine.

2.2. LA MICROSCOPIA DI FLUORESCENZA 45

Figura 2.15: Struttura molecolare e lunghezze d’onda dei picchi di assorbimento ed emissione dell’isotocianato di fluoresceina

Figura 2.16: Spettri di emissione ed assorbimento dei due Fluorofori Alexa Fluor 555 e 488

ˆ Un fotobleaching molto veloce, ovvero una degradazione permamente delle propriet`a fotochimiche del fluoroforo indotta dall’irraggiamento, problema che in microscopia pu`o complicare le osservazioni, dato che il fotobleaching pu`o avvenire esponendo il fluoroforo alla luce necessaria per eccitare la fluorescenza. ˆ Una spiccata tossicit`a, aspetto rilevante nel momento in cui si vogliono osser-

vare campioni biologici nel pieno della funzionalit`a.

Per ovviare a questi problemi sono stati sviluppati dei derivati in cui tali caratteristi- che sono meno marcate, e altri derivati sono stati sviluppati anche per modificare le lunghezza d’onda di assorbimento ed emissione [34]. Il fluoroforo Alexa Flour 555 `e un derivato della Tetramethylrhodamina, cos`ı come l’Alexa Flour 488 `e un derivato dell’isotiocianato. Entrambi sono stati utilizzati in questo lavoro di tesi: gli spettri di emissione e assorbimento sono mostrati in fig. 2.16

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