caratterizzazione dell’illuminazione
Nelle fasi preliminari di questo lavoro, abbiamo acquisito una serie di immagini al fine di caratterizzare i sistemi di illuminazione e di riveazione della luce del nostro sistema. In questa fase abbiamo fatto uso di diversi campioni di test, tra cui film polimerici contenenti un colorante (R-perylene) che assorbe nel verde e riemette nel rosso.
Per quanto riguarda l’illuminazione, abbiamo valutato l’omogeneit`a della luce con cui viene illuminato il campione, e l’ampiezza su cui viene distribuita la luce sul cam- po di vista, cercando di minimizzare eventuali effetti di vignettatura imposti dalle superfici degli elementi ottici all’interno del microscopio. Un confronto immediato tra le due sorgenti di illuminazione, `e stato effettuato illuminando il campione poli- merico. A parit`a di tempi di esposizione e di guadagno della telecamera il risultato viene mostrato in fig. 3.14, dove in a) l’illuminazione del campione `e stata effettuata utilizzando il laser verde nelle migliori condizioni di allargamento del fascio, in b) l’illuminazione tramite il LED. Si nota come illuminando con il laser non si riesce a illuminare completamente il campo di vista del sensore della fotocamera Canon, ma soltanto una porzione del diametro di circa 600µm, questo a causa dell’effetto di vignettatura descritto nel paragrafo precedente. Viceversa con l’illuminazione tramite LED `e possibile illuminare tutto il campo di vista, anche se si notano delle lievi diminuizioni di intensit`a sui bordi dell’immagine.
Riducendo il field of view, come realizzato con il sensore CMOS della IDS, quanto si ottiene `e mostrato nell’immagine in fig.3.15, in questo caso, come si vede, `e possibile illuminare tutto il campo di vista del sensore.
3.3. LE IMMAGINI OTTENUTE NEI TEST PRELIMINARI E CARATTERIZZAZIONE DELL’ILLUMINAZIONE63
Figura 3.15: Illuminazione di un campioncino di prova, in a) l’illuminazione con il laser verde, in b) l’illuminazione con la lampada LED. L’immagine `e acquisita tramite il sensore CMOS della IDS
A questo punto `e necessario fare alcune considerazioni riguardo l’omogeneit`a delle immagini ottenute. Escludendo gli effetti dovuti alla vignettatura, nell’immagine prodotta illuminando con il laser, fig.3.15 a), si pu`o constatare, in primo luogo, co- me vi sia la presenza di una lieve e disomogenea presenza di luce verde. Il fenomeno `e dovuto alla non perfetta efficienza del filtro utilizzato (descritto precedentemen- te), che lascia passare una certa quantit`a di luce riflessa all’indietro nel canale di trasmissione. In secondo luogo e in modo altrettanto visibile, si nota la presenza di frange di interferenza, distribuite lungo tutto il field of view.
La comparsa di frange di interferenza ampliando in illuminazione con un laser `e tipi- ca in microscopia, e costituisce il motivo fondamentale per cui, in genere, si preferisce l’illuminazione da sorgenti a banda larga. L’interferenza `e legata alle caratteristiche di coerenza spaziale del laser e della presenza di numerosi elementi riflettenti nel cammino ottico, in particolare nel nostro caso, il beam splitter cubico.
Allo scopo di ridurre la rilevanza delle frange di interferenza, abbiamo pensato di modulare spazialmente la diversione del fascio usando un modulatore acusto ot- tico. Infatti, poich`e le immagini vengono sempre acquisite integrando nel tempo (per la durata dell’esposizione, che `e sempre di almeno alcuni millisecondi), questa modulazione pu`o portare a un aumento dell’omogeneit`a di illuminazione. In questo modo si riesce a modulare l’ordine 1 in uscita dal modulatore, inducendo oscillazioni di frequenza e una piccola deflessione modulata alla frequenza dell’ordine di 100Mhz. Abbiamo dunque inserito un modulatore acusto ottico (Crystal Technology-98-215Mhz) sul cammino del laser.
Le prove sono state condotte in modo empirico, variando la frequenza di modulazione e l’allineamento del sistema. Un esempio dei risultati `e mostrato in 3.16. Bench`e essi possono essere considerati incorraggianti, e probabilmente meritevoli di essere ulteriormente raffinati, si `e ritenuto opportuno, per gli scopi dell’esperimento, di impiegare l’illuminazione con luce bianca opportunamente filtrata
64 CAPITOLO 3. L’APPARATO SPERIMENTALE
Figura 3.16: Immagini che mostrano l’eliminazione delle frange indotte dal modulatore acusto ottico (tempo di integrazione 250ms)
In una ulteriore sessione di misura, `e stata verificata la sensibilit`a e la funzionalit`a del sistema, nell’acquisizione di immagini di cellule di cavie identiche a quelle che utilizzeremo nelle misure vere e proprie.
Alcune immagini ottenute per questo genere di osservazioni sono in fig.3.17: in 3 zone differenti della cavia: coda, pancia e dorso, `e visibile la fluorescenza delle cellule funzionalizzate con il fluoroforo. La prima considerazione da fare `e che il sistema `e in grado di riconoscere la fluorescenza prodotta anche da singoli cluster cellulari: immagine a) in fig.3.17.
Nell’immagine b) la luce in azzurro `e lo spot del laser infrarosso di ablazione (di cui parleremo nel prossimo paragrafo), riuscire a visualizzarlo in tempo nelle stesse con- dizioni di illuminazione della cavia `e di fondamentale importanza per l’allineamento con le zone di interesse nelle fasi di misura. Riguardo le condizioni di illuminazione risulta di fondamentale importanza avere un controllo sull’intensit`a della luce di il- luminazione, agevolmente ottenuta agendo sulla corrente di alimentazione del LED. Riguardo le condizioni di rilevazione della luce, per la fluorescenza i tempi di espo- sizione possono variare su un intervallo molto ampio (da circa 10s. fino a qualche centinaia di millisecondo) al variare dell’ampiezza dei cluster cellulari presenti nel- le zone di interesse. Tuttavia nella maggioranza dei casi non si scende al di sotto dei 200ms. Il guadagno della fotocamera, espresso convenzionalmente in unit`a ISO. All’aumentare del guadagno il rumore elettronico di lettura tende ad aumentare. Tuttavia in molti casi `e stato necessario spingersi ad alti guadagni (ISO 3200 o ISO 6400), data la scarsa emissione di cluster fluorescenti. Infine, abbiamo dimostrato che anche con l’illuminazione tramite il laser, nonostante le limitazioni del sistema, risulta possibile visualizzare la fluorescenza delle cellule. In questa sessione di misu- re, le immagini ottenute sono mostrate in fig.(3.18), la fluorescenza viene spostata verso il rosa, aspetto dovuto al tipo di filtro dicroico utilizzato.
3.3. LE IMMAGINI OTTENUTE NEI TEST PRELIMINARI E CARATTERIZZAZIONE DELL’ILLUMINAZIONE65
Figura 3.17: Immagini di fluorescenza utilizzando luce bianca e filtro TRITC, in tre zone differenti di 3 Zebrafish differenzi.
Figura 3.18: Immagini di zone fluorescenti per la cavia utilizzando come luce di illuminazione il laser verde.
66 CAPITOLO 3. L’APPARATO SPERIMENTALE