L’eccitazione delle risonanze plasmoniche `e effettuata usando una sorgente laser a diodo che emette radiazione nel vicino infrarosso a 780nm. La potenza effettiva disponibile `e di circa 5 mW (per una corrente di 100mA). La fig.3.19 mostra l’an- damento della potenza in funzione della corrente di alimentazione.
La radiazione `e guidata e focalizzata sul campione (dove proviene dall’alto) attra- verso una fibra ottica a singolo modo che termina con un focalizzatore. Il sistema impiegato, gi`a disponibile in laboratorio, `e stato realizzato dalla ditta OZ-Optics, presso la quale l’uscita della fibra singolo modo (diametro nominale 5µm)`e stata allineata al focalizzatore, composta da un obbiettivo di lunghezza focale di 7mm e apertura numerica NA=0.20. L’altra estremit`a della fibra `e terminata con un con- nettore FC-APC, che pu`o essere connesso a un lanciatore OZ-Optics. Il piano ottico provvede poi coppie di specchi montati su traslatori micrometrici che consentono di ottimizzare la potenza trasmessa (trasmissione tipica ∼ 50%) Il focalizzatore `e mon- tato su un traslatore micrometrico a tre direzioni con sensibilit`a di 5µm, necessario per traslare il fascio laser all’interno del field of view, mettere a fuoco sul campione, e se necessario defocalizzarlo per ottenere zone di ablazione pi`u ampie. Le caratteri- stiche del fascio sono state studiate con un beam profiler (Data Ray WincamD), cio`e una fotocamera CCD ottimizzata per ricostruire la distribuzione spaziale del fascio: la fig.3.20 mostra la schermata del programma di gestione relativa all’acquisizione del profilo per una distanza della lente frontale di 7.25mm. Il fascio risulta ben descritto da una Gaussiana bidimensionale, la funzione utilizzata `e la seguente:
f (z) = 2w
0e
[1+(Z−Zf ) Z2r 2 ]12(3.3)
Con w0 waist e Zr lunghezza di Rayleigh. Il profilo del fascio `e stato studiato in
funzione della distanza z dalla lente frontale del focalizzatore: la fig.3.21 riporta l’andamento del diametro del fascio 2w0 in funzione di tale distanza.
Eseguendo un best fit dei dati sperimentali secondo l’eq.3.3, si ottiene un waist di w0 = 17.99 ± 0.41µm e una lunghezza di Rayleigh zR = 139.65 ± 3.54µm. Il risultato
mostra che il fuoco si trova distanza zf = 7700 ± 2µm dalla lente di uscita del
focalizzatore.
In condizioni ordinarie di funzionamento, dal focalizzatore esce una potenza di alcuni mW: nel fuoco 1mW di potenza si traduce in un’intensit`a di circa 25W/cm2. Il fascio risulta ben descritto da una funzione gaussiana bidimensionale (in x e y, dimensioni trasversali), con parametro di circolarit`a migliore di 0.9 e numero M2 ' 2.9. Per un
fascio gaussiano, la dipendenza dell’intensit`a lungo la coordinata assiale r `e espressa dalla funzione: I(r) = I0 w0 w(z) 2 e −2r2 w(z)2 (3.4)
3.4. IL LASER INFRAROSSO 67
Figura 3.19: Analisi della potenza emessa del laser in funzione della corrente di alimentazione.
Figura 3.20: Esempio di schermata del programma di gestione del beam profiler WinCamD usato per studiare le caratteristiche del fascio di illuminazione dei na- norods: L’esempio si riferisce a una acquisizione a distanza 7.25 mm dalla lente frontale del focalizzatore
68 CAPITOLO 3. L’APPARATO SPERIMENTALE
Figura 3.21: Analisi del diametro del fascio in funzione della distanza dalla lente frontale del focalizzatore: la linea continua riporta il risultato di un best fit descritto nel testo.
Figura 3.22: Trasmissivit`a dei filtri dicroici nel canale di eccitazione al variare dell’alimentazione della sorgentee di eccitazione.
Infine come ultima misura per la caratterizzazione dell’apparato, abbiamo misurato la potenza nel canale di eccitazione ottenuta in uscita dai filtri dicroici FITC e TRIC. Infatti questi lasciano passare una quantit`a di luce molto differente, in particolare, il filtro FITC (che trasmette luce blu a 485nm) ha una trasmittivit`a molto minore rispetto al filtro TRIC (luce verde a 535nm). La misura `e stata effettuata misurando la potenza in uscita dall’obbiettivo con un power meter, al variare dell’alimentazione del LED su un intervallo che va da 23mA fino a 95mA. Il grafico ottenuto `e il seguente:
La potenza trasmessa dal filtro FITC `e circa quattro volte inferiore rispetto a quella trasmessa dal fitro TRITC.
Capitolo 4
Misure e risultati
In questo capitolo verranno illustrate le misure effettuate e le immagini ottenute nell’esperimento di PPTT vero e proprio. Le cavie utilizzate sono dei piccoli esem- plari di Zebrafish (Danio Nerio), un pesce d’acqua dolce appartenente alla famiglia dei Ciprinidi, gli Zebrafish sono ormai di largo uso per le applicazioni in ambito biomedico, tra i motivi principali possiamo citarne due: il primo `e che il genoma di questo pesce (sequenziato nel 2001) `e molto simile a quello umano, gli zebrafish sono stati quindi utilizzati per lo sviluppo di alcuni modelli transgenici di cancro [45], questi modelli sono trapiantabili e istologicamente molto simili alla malattia umana, in particolare per quanto riguarda le mutazioni su larga scala che porta- no allo sviluppo della malattia. Il secondo motivo `e che ne sono stati sviluppati alcuni esemplari transgenici trasparenti (denominati Casper), questo permette la visualizzazione in tempo reale di alcuni fenomeni di interesse, come la proliferazione cellulare e la circolazione delle cellule.
Le cavie sono state fornite, manipolate e funzionalizzate dal dipartimento di Bio- logia dell’Universit`a di Pisa, si tratta di 8 Zebrafish tumorati con cellule umane di cancro al seno aventi una overespressione della mutazione Her-2 legato al floroforo Alexa Fluor 555 (fig.2.16). I nanorods d’oro impiegati sono di origine commerciale (Nanopartz) e hanno le seguenti caratteristiche: dimensioni tipiche 40×10×10nm, sono funzionalizzati Pegylated e un anticorpo avente un ligando che sfrutta l’overe- spressione Her-2. Si trovano in soluzione colloidale ad una concentrazione nominale di 5·1013N×ml (dove N `e il numero di nanorods), vengono diluiti in acqua alla con-
centrazione di 40N/moli, e viene iniettato nella cavia una quanti`a di composto pari a 40nl. Con queste dimensioni i nanorods esibiscono una risonanza plasmonica cen- trata a 780nm, coincidente con la lunghezza d’onda del laser utilizzato (paragrafo 3.4).
L’esperimento effettuato `e stato pensato come test preliminare di un esperimento pi`u completo che verr`a eseguito in seguito, in questa fase gli obbiettivi dell’esperimento sono:
1. Evidenziare dal punto di vista qualitativo l’effettiva ablazione delle cellule e quindi la corretta funzionalizzazione del materiale.
2. Indagare la densit`a di potenza e i tempi di di irraggiamento a cui avviene l’ablazione.
70 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI 3. Verificare la funzionalit`a e l’utilizzo dell’apparato di imaging descritto in 3.1. Dato l’esiguo numero delle cavie non `e stato possibile indagare statisticamente l’ef- ficacia del trattamento, ma `e stato possibile verificare l’esito dell’ablazione control- lando l’intensit`a della fluorescenza e la sua distribuzione spazial confrontando le immagini di microscopia di fluorescenza di stesse zone acquisite tra prima e dopo l’irraggiamento in alcune delle cavie osservate.
Poich`e non esistono metodi semplici ed affidabili per la misura della temperatura indotta dalla PPTT, le prove effettuate sono state realizzate usando diverse densi`a di potenza e tempi di esposizione riferendoci inizialmente, come ordine di grandezza, a misure gi`a riportate in letteratura.
In letteratura si trovano infatti indicazioni su densit`a di potenza della radiazione di ablazione per l’uso con nanorods simili a quelli da noi impiegati.
Le dimensioni ideali dei nanorods utilizzati per la termoablazione sono il frutto di un compromesso tra facilit`a della funzionalizzazione, il cellular uptake, e lunghezza d’onda a cui irraggiare il campione.
In particolare `e stato dimostrato [46] che i PEGylated-GNRs (dove GNRS sta per “Gold Nanorods”) presentano un cellular uptake che decresce con l’aspect ratio (AR), mentre un AR troppo basso (1 o 2) rende pi`u difficile legare chimicamente il ligando ai nanorods e con un AR =4 si ha il picco corrispondente della LSPR at- torno agli 800nm (780nm nel nostro caso). Al termine del seguente capitolo infine, un paragrafo sar`a dedicato alla misura degli spettri di assorbimento dei nanorods impiegati in questo lavoro, al variare di alcune condizioni sperimentali, come la concentrazioe e la funzionalizzazione.
4.1
Metodologia e densit`a di potenze utilizzate
Le densit`a di potenza utilizzate e i tempi di irraggiamento sono stati scelti in fase preliminare riferendoci all’articolo [48]: I= 2.3 − 2.5 W/cm2 × 15 min, sulla cavia arriva quindi una quantit`a di energia per unit`a di superficie pari a 2250J/cm2. Tenendo conto del fatto che il laser all’uscita della fibra possiede un waist delle dimensioni 17.99 ±0.41 µm(paragrafo3.4) le potenze effettivamente utilizzate nella nostra misura sono elencate in tabella 4.1.
Sono stati effettuati anche esperimenti a potenze minori, e leggermente maggiori; in generale aumentando la densit`a di potenza del laser abbiamo diminuito il tempo di irraggiamento tenendo costante l’energia fornita al sistema.
Le cavie sono state preliminarmente sedate, poste in un vetrino da microscopio (do- tati di pozzetto, progettato in questo lavoro e realizzato con un anello di nylon incollato con cianoacrilato al vetro) e osservate alla ricerca delle zone da irradia- re. Come si vedr`a dalle immagini riportate in seguito, tutte le cavie evidenziano cluster cellulari fluorescenti estesi e centrali (pi`u o meno zona pancia); talvolta so- no presenti anche singoli cluster isolati. In fase di osservazione post trattamento la maggiore fonte di incertezza `e rapprsentata dall’eventuale replicazione cellulare delle cellule vicine, che potrebbe “oscurare” l’avvenuta ablazione della zona di interesse, nei futuri sviluppi dell’esperimento, si intende ottenere cavie che esprimono singole
4.1. METODOLOGIA E DENSIT `A DI POTENZE UTILIZZATE 71
Irraggiamento delle cavie
Zebrafish I[W/cm2±2%] T[s±1] E[J/cm2]
Zebrafish1 6.5 360 2250 Zebrafish2 9 300 2700 Zebrafish3 90 25 2250 Zebrafish4 45 5 225 Zebrafish5 45 20 900 Zebrafish6 45 50 2250 Zebrafish7 18 125 2250 Zebrafish8 18 125 2250
Tabella 4.1: parametri nominali di irraggiamento utilizzati, Nell’esperimento la du- rata dell’esposizione `e stata misurata con un’incertezza stimata di ±1s, mentre per l’incertezza sulla misura di intensit`a, dominata da quella del diametro (waist) del fascio laser, si rimanda al cap.3
cellule magari in zona coda, dove diventa pi`u agevole riconoscere una zona netta di ablazione.
La fase di scelta della regione da irraggiare e il conseguente posizionamento dello spot di ablazione `e un po’ laboriosa a causa di diversi fattori: tra cui la limitata sensibilit`a dei micrometri (±2.5µm) per verificare la posizione iniziale, la necessit`a di irraggiare il campione prima dell’inizio dell’esposizione, la scarsa risoluzione dei riferimenti spaziali nello schermo del computer, dove si osservano le immagini, usati per l’allineamento. Operativamente i passi sono stati i seguenti:
1. Viene messa a fuoco la zona fluorescente del campione da irradiare al centro del quadrato di zoom del software di imaging tenendo tappato il laser di ablazione.
2. La zona fluorescente del campione viene allontanata spostando il campione di qualche millimetro.
3. Viene acceso il laser di ablazione e visualizzato lo spot al centro dello stesso quadrato di zoom, sfruttando le viti micrometriche del porta fibra necessarie anche per mettere a fuoco lo spot, una volta allineato si interrompe il fascio laser di ablazione.
4. Si riallinea nuovamente il campione in corrispondenza del riferimento, si riac- cende il laser cronometrando il tempo di irraggiamento.
5. Avendo acquisito immagini separate della zona fluorescente e dello spot del laser di ablazione, il corretto allineamento del laser viene controllato offline (a posteriori) con appositi programmi che consentono di sovrapporre e manipolare immagini acquisite.
72 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI