Al fine di dare un’interpretazione alle immagini raccolte `e necessario illustrare bre- vemente quali sono i meccanismi alla base dell’interazione tra il fluoroforo da noi utilizzato e la cellula [47]. Oltre al tipo di fluoroforo, questi meccanismi dipendono criticamente anche dalle metodologie con cui `e preparato il campione.
Le cellule vengono colorate prima dell’iniezione e lavate pi`u volte per eliminare le molecole di fluoroforo in eccesso. Al termine di questo processo un alto numero di molecole del fluoroforo rimane intrappolata all’interno della membrana cellulare, in questo modo le cellule iniettate risultano “impregnate” di fluoroforo. In fase di replicazione cellulare le cellule figlie conterranno anch’esse una certa concentrazione di molecole del fluoroforo. Nel caso in cui l’ablazione non abbia successo ci aspettia- mo quindi una diffusione sempre crescente della fluorescenza raccolta, ma con una densit`a dei fluorofori rimanenti minore, e quindi una minore intensit`a di emissione integrata spazialmente.
Ad ablazione avvenuta possono verificarsi due fenomeni differenti:
1. La cellula viene danneggiata in modo tale da indurre l’apoptosi, in questo caso vi `e una fase iniziale (4-16h) in cui la cellula diminuisce la propria dimensione e cambia la propria conformazione, fino alla fase di morte cellulare vera propria e alla rimozione della cellula (18-48h).
2. Il contenuto di calore indotto dall’ablazione `e talmente alto da disgregare le strutture cellulari; in tal caso la scomparsa della fluorescenza `e immediata poich`e il fluoroforo si disperde nell’ambiente circostante. In questa circostanza potrebbe manifestarsi anche una fluorescenza di intensit`a molto meno accen- tuata rispetto alle cellule circostanti, dovuta alle molecole di fluoroforo ancora legate ai frammenti cellulari rimanenti.
Nei due casi appena elencati ci aspettiamo dunque una diminuzione della intensit`a di fluorescenza localizzata nella zona sovrapposta al laser di ablazione, accompa- gnata da una variazione della distribuzione spaziale. Naturalmente tali variazioni sono significative solo se le condizioni di illuminazione sono le stesse, richiesta che `e stata soddisfatta usando le stesse potenze di illuminazione, nei limiti dell’incertezza di misura, cio`e la stessa corrente di alimentazione del LED (vedi cap.3).
In assenza di cellule fluorescenti isolate, per poter riconoscere l’effettiva ablazione nelle zone esposte `e stato necessario posizionare le cavie nella medesima posizione, in modo da avere un riscontro visuale immediato e riconoscere l’eventuale diffusione delle cellule tumorali. Per farlo ci siamo serviti di un anestetico che addormentasse le cavie e della metilcellulosa, un gel idrofilico che funge da addensante e che costrin- ge le cavie a rimanere fissate in una certa posizione anche nelle fasi di spostamento del vetrino.
L’operazione di posizionamento delle cavie sul vetrino `e un po’ laboriosa e delicatada richiedere l’ausilio dell’ago di una siringa. In generale abbiamo deciso di fissare uno standard e posizionare la cavia sempre nella stessa posizione (ad esempio su un lato e con la coda sempre verso il basso o verso l’alto). Esempi di posizionamento della
4.2. LA LETTURA DELLE IMMAGINI E I RISULTATI ATTESI 73
Figura 4.1: In a) e b) immagini di Zebrafish 6. Prima e dopo l’irraggiamento. In c) e d) la posizione in cui `e stato osservato Zebrafish 8 prima e dopo l’irraggiamento. cavia sono mostrate nelle immagini a luce bianca di fig.4.1.
Volendo confrontare l’intensit`a della fluorescenza raccolta tra prima e dopo l’irrag- giamento, i tempi di esposizione, la sensibilit`a della camera e la corrente del LED di illuminazione, devono essere i medesimi, in modo da essere sicuri di osservare la cavia nelle stesse condizioni. Questi valori sono stati opportunamente segnati in fase di irraggiamento, e ricreati all’interno dell’incertezza di misura nell’osservazione successiva. (tabella 4.2). Come ulteriore verifica, `e stato controllato offline che l’in- tensit`a di fluorescenza proveniente da zone del campione non esposte fosse la stessa, entro un’incertezza del ±5%, nelle immagini acquisite prima e dopo l’irraggiamento.
74 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI
Sensibilit`a, tempi di esposizione e illuminazione del LED Zebrafish (ISO) T[ms I[mA]±0.001
Zebrafish1 6400 33.6 30 Zebrafish2 6400 76 30 Zebrafish3 6400 66.6 30 Zebrafish4 6400 66.6 30 Zebrafish5 6400 76 30 Zebrafish6 6400 12.5 30 Zebrafish7 6400 66.6 46 Zebrafish8 6400 200 52
Tabella 4.2: Valori dei tempi di esposizione della fotocamera, e alimentazione del LED per le immagini raccolte.
Preliminarmente all’ablazione sono state acquisite immagini dello spot del laser di ablazione allo scopo di dedurre la posizione della cavia, attraverso sovrapposizione delle immagini relative (eseguito con il software imagej) L’immagine dello spot di ablazione vista al microscopio viene raccolta a tempi di esposizione molto bassi, in modo da tagliare eventuali fenomeni diffrattivi e ridurre la saturazione, succes- sivamente viene trasformata in 8-bit e ne viene cambiato il colore via software in modo da evidenziarne agevolmente lo spot rispetto all’immagine di fluorescenza rossa del campione, infine viene sovrapposta spazialmente all’immagine della fluore- scenza, nelle zone irraggiate. Esempi di due allineamenti possono essere visualizzati in fig.4.2 e fig.4.3, dove si pu`o notare come il primo non sia stato molto accurato, mentre il secondo si, probabilmente a causa dei motivi elencati in precedenza.
4.2. LA LETTURA DELLE IMMAGINI E I RISULTATI ATTESI 75
Figura 4.2: In a) immagine dello spot del laser di ablazione, in b) l’immagine della fluorescenza di Zebrafish1, in c) e d) la sovrapposizione del laser in due zone differenti della cavia. Da notare come l’allineamento non `e risultato completo.
76 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI
Figura 4.3: In a) l’immagine del laser in b)l’immagine della fluorescenza di Zebrafish 8, in c) e d) la sovrapposizione del laser in due zone differenti della cavia, in questo caso l’allineamento `e ottimale, poich`e l’immagine del laser `e ben sovrapposta alla cellula fluorescente.