norods impiegati
Nel seguente paragrafo verranno mostrate le misure degli spettri di assorbimento dei nanorods impiegati in questo lavoro di tesi al variare della concentrazione e della funzionalizzazione (la presenza o meno del fluoroforo coniugato per il FITC). La procedura di questa misura `e molto semplice: i nanorods vengono diluiti in acqua denaturata alle concentrazioni opportune, una goccia di soluzione viene posta su un vetrino e questo viene posizionato nello stage di posizionamento di un microscopio ottico. Illuminando la goccia con una luce avente caratteristiche opportune, cio`e a lungo spettro, e raccogliendo la luce trasmessa dal campione, `e possibile estrarre le informazioni sulla luce assorbita. Per compiere la seguente misura ci siamo quindi serviti principalmente di due strumenti: un microscopio ottico come elemento di raccolta della luce, e di un monocromatore, elemento necessario per l’analisi dell’in- tensit`a della luce raccolta al variare della lunghezza d’onda della luce.
Dato lo spettro di assorbimento nominale dei nanorods e volendo fare indagini spet- toscopiche, la sorgente per la luce di illuminazione deve avere una distribuzione spettrale con una emissione sufficientemente intensa nel vicino infrarosso. In parti- colare la sorgente utilizzata in questa misura `e una lampada alogena al tungsteno, DH-2000-BAL (Ocean Optics), il cui spettro di emissione `e in fig. 4.16. Si pu`o no- tare l’alta intensit`a della luce emessa attorno ai 780nm, che `e la zona dello spettro di nostro interesse. La lampada, ha una potenza nominale di uscita di 650µW. L’apparato sperimentale `e descritto nello in fig. 4.17. La luce emessa della sorgen- te viene lanciata in un fibra ottica multimodo e trasportata a breve distanza del campione (incidendo dal basso). PIl campione `e posizionato sul supporto del mi-
4.4. MISURA DELLO SPETTRO DI ASSORBIMENTO DEI NANORODS IMPIEGATI87
Figura 4.17: Apparato sperimentale per la misura degli spettri di assorbimento dei nanorods.
croscopio: in questa fase non servono ulteriori elementi di focalizzazione della luce poich`e il campione `e illuminato in modo sufficientemente omogeneo.
La luce trasmessa dal campione viene raccolta dall’obbiettivo, `e EC Epiplan-Neofluar 20X, 0.5N.A, IC, (Zeiss) la cui banda di trasmissivit`a `e riportata in fig. 4.18. La luce raccolta, tramite un beam splitter, viene ulteriormente trasportata in una fibra ottica multimodo e inviata ad un monocromatore, e il fascio scomposto nelle sue componenti spettrali, grazie al reticolo di diffrazione, viene infine fatto incidere su una CCD scientifica (Newton Andor 971) interfacciata al pc e al software per l’analisi dello spettro. Il microscopio consente, tramite traslatori micrometrici, il posizionamento dell’oggetto rispetto all’obbiettivo alle distanze di lavoro opportu- ne. In questo caso, non essendo interessati all’immagine vera e propria del campione, abbiamo variato la posizione dell’obbiettivo (in pratica defocalizzando l’immagine) e i tempi di esposizione allo scopo di massimizzare l’intensit`a della luce raccolta dalla CCD e di minimizzare il rumore.
Operativamente la prima misura effettuata riguarda lo spettro diretto della luce raccolta dall’obbiettivo senza la presenza del campione. Lo spettro alle lunghezze d’onda di interesse `e mostrato in fig.4.19, dove si mostra una nascosta discesa verso l’infrarosso dovuta alla risposta spettrale della CCD.
Successivamente si `e passati alla diluizione dei nanorods e alla preparazione del ve- trino. I nanorods inizialmente si trovano in una soluzione colloidale il cui solvente `e acqua deionizzata e ultrafiltrata. Le concentrazioni dei nanorods nella soluzione colloidale sono: 8.2· 1011N×ml per quanto riguarda i nanorods puri dove (N `e il numero di nanoparticelle), e di 5·1013N×ml per quanto riguarda i nanorods funzio-
nalizzati.
88 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI
Figura 4.18: Trasmissivit`a dell’obbiettivo EC Epiplan-Neofluar 20X, 0.5N.A.
Figura 4.19: Spettro della luce diretta di illuminazione.
centrazione di nanorods puri, ovvero diluendo i nanorods per ulteriori 102 volte in acqua denaturata. Il confronto tra lo spettro della luce diretta (senza materiale) e quello dello spettro della luce trasmesso dal campione viene effettuato normalizzan- do all’intensit`a registrata a 720nm, dove non ci si aspetta assorbimento da parte dei nanorods dove. fig. 4.20
4.4. MISURA DELLO SPETTRO DI ASSORBIMENTO DEI NANORODS IMPIEGATI89
Figura 4.20: Confronto tra le intensit`a della luce diretta e la luce trasmessa dal campione, composto da una soluzione di nanorods puri in una diluizione di 10−2 rispetto alle concentrazioni iniziali.
Figura 4.21: Spettro della luce assorbita dal campione composto dai nanorods puri, fittato con una polinomiale di grado 5,che funge da guida per gli occhi.
Dalla sottrazione dei due spettri si ottiene lo spettro della luce assorbita dal cam- pione. Come mostrato in fig. 4.22 sovrapposto allo spettro si trova il risultato di un best fit polinomiale, che aiuta ad individuare la posizione del picco attorno a 780nm come atteso.
La medesima misura `e stata effettuata per i nanorods funzionalizzati, per la stessa concentrazione di nanoparticelle (considerando anche la differenza tra le diluizioni iniziali). Lo spettro ottenuto `e mostrato in fig. 4.22. Dal fit ottenuto la banda risulta pi`u leggermente pi`u stretta e con un massimo piccato a 775.0nm, tuttavia muoven- dosi attorno al massimo su un intevallo che va dai 760 fino ai 790nm (abbastanza ampio per i nostri scopi) l’assorbimento diminuisce del 9%.
Infine `e stata effettuata una misura ad alta diluizione dei nanorods puri, ovvero ad una concentrazione diminuita di 106 volte rispetto a quella iniziale.
Come ci si aspetta, in questo caso la luce assorbita dal campione risulta pressoch`e indistinguibile dal rumore di fondo della misura In definitiva questa misura ci da
90 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI
Figura 4.22: Spettro della luce assorbita dal campione composto dai nanorods funzionalizzati, fittato con una polinomiale di grado 5, il massimo si trova a 775.01±5.4nm.
una conferma sui valori nominali delle lunghezze d’onda di assorbimento, ci fornisce una stima delle concentrazioni minime di nanorods da utilizzare per avere un buon assorbimento della luce incidente sul campione.
Conclusioni
L’obbiettivo principale di questo lavoro di tesi era valutare la terapia fototermica di cellule di tumore del seno (Her2+) inoculate in cavie di Zebrafish. All’interno delle cellule tumorali erano presenti un fluoroforo, necessario per la localizzazione mediante microscopia di fluorescenza, e dei nanorods di oro, con risonanza plasmo- nica piccata attorno a 780 nm, legati alla membrana cellulare tramite un’opportuna procedura di funzionalizzazione. La terapia fototermica prevedeva l’esposizione a un fascio laser a 780 nm, focalizzato e posizionato con precisione micrometrica sulle cellule tumorali.
Dalle misure effettuate si `e potuta valutare la corretta funzionalizzazione del mate- riale e individuare i punti deboli del protocollo utilizzato. Come descritto in capitolo 4, in due delle cavie a disposizione sono stati verificati effetti piuttosto netti dell’abla- zione, con una diminuzione relativa della superficie fluorescente, legata all’estensione del tumore, rispettivamente del 45% e del 60% per i criteri soglia da noi stabiliti. In particolare l’ablazione si `e manifestata con una netta diminuzione di intensit`a della fluorescenza raccolta dalle zone irraggiate con il laser di ablazione osservate 24 ore dopo il trattamento. Tuttavia in alcuni casi `e stato anche osservato un aumento dell’estensione della zona fluorescente (fino a 100 µm di aumento), presumibilmen- te indotta dall’apoptosi di cellule vicino alla zona ablata e al successivo rilascio e distribuzione del fluoroforo per un’estensione spaziale maggiore. Questo risultato `e rilevante per il futuro sviluppo dell’esperimento. Infatti una delle idee alla base del protocollo di fotoablazione era l’uso di radiazione fortemente focalizzata, in modo da poter impiegare potenze relativamente basse, dunque poco invasive per i tessuti sani, ed irraggiamenti brevi, con ovvi vantaggi pratici in termini di realizzazione della terapia. Il risultato dimostra per`o che in queste condizioni la valutazione degli effetti `e difficoltosa, a causa della presenza di cellule tumorali in prossimit`a della regione irraggiata e della possibilit`a che queste modifichino la distribuzione del fluo- roforo nel tempo che intercorre fra trattamento e analisi. Negli sviluppi futuri si prevede quindi di selezionare regioni tumorate di estensione relativamente piccola (decine di micrometri) e di defocalizzare il fascio di ablazione in modo da coprirle interamente.
Bench`e questo non fosse lo scopo principale dell’esperimento a causa dell’esiguo numero di cavie a disposizione e la conseguente impossibilit`a di adottare metodi statistici, la fotoablazione `e stata condotta variando in un intervallo ampio le dosi di energia impiegate, come reso possibile agendo su una combinazione di tempo di esposizione e potenza del laser. I risultati a questo riguardo non sono certamente
92 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI univoci, poich`e gli effetti riscontrati sulle due cavie sono stati ottenuti in condizioni piuttosto differenti tra loro. Ci sono diverse motivazioni per questo risultato, per altro riportato spesso anche in letteratura. La causa principale potrebbe essere il mancato controllo della densit`a spaziale dei nanorods all’interno delle cellule tumo- rali. Infatti, bench`e la procedura di funzionalizzazione preveda una distribuzione uniforme dei nanorods nella membrana cellulare, questa non pu`o essere verificata sperimentalmente. Infatti, anche se le risonanze plasmoniche di cui sono dotate le nanostrutture producono una modifica del coefficiente di estinzione a risonanza, questo non pu`o essere misurato in modo affidabile a causa della presenza di nu- merosi canali di scattering della radiazione, non controllati e dovuti alla struttura del materiale biologico. Alcuni test che confermano questa affermazione sono stati compiuti anche durante questo lavoro di tesi presso IIT, Genova.
Su misure successive a questo lavoro, gi`a in fase di realizzazione, si prevede di mar- care con un fluoroforo anche i nanorods in modo da utilizzare la microscopia di fluo- rescenza a doppia banda (Dual modal imaging PTT [50]) per la co-localizzazione delle cellule tumorali (che, come in questo lavoro, possiedono un fluoroforo che ecci- tato nel verde emette nel rosso) e dei nanorods (dotati di un fluoroforo che, eccitato nel blu, emette nel verde). In effetti questa possibilit`a era prevista fin dall’inizio di questo lavoro di tesi, e infatti l’apparto sperimentale qui progettato e realizza- to consente la possibilit`a del dual mode imaging grazie all’uso di una sorgente a luce bianca e all’integrazione di due diverse tipologie di filtri spettrali (per l’uso con fluorofori FITC e TRITC). Tuttavia problemi nella fase di funzionalizzazione (perdita del fluoroforo dai nanorods in seguito al coating necessario per il legame con l’over-espressione cellulare) hanno impedito di ottenere cavie in-vivo utili per realizzare la tecnica. Misure preliminari, condotte alla fine di questo lavoro di tesi, hanno poi mostrato la tendenza dei nanorods funzionalizzati con fluoroforo a cluste- rizzare, riducendo l’omogeneit`a della loro distribuzione e anche l’efficienza quantica di emissione, presumibilmente a causa di fenomeni di quenching non radiativo. D’altra parte, l’apparato sperimentale progettato, realizzato e caratterizzato in que- sto lavoro di tesi si `e mostrato perfettamente in linea con le aspettative e anche adeguato per gli ulteriori sviluppi della ricerca. Infatti esso consente di ottenere una risoluzione spaziale strumentale (circa 1 µm) sicuramente adatta all’analisi di strutture cellulari, che hanno estensione tipica dell’ordine delle decine o centinaia di micrometri, e di individuare l’emissione di fluorescenza dei fluorofori con sufficiente sensibilit`a, come dimostrato dall’uso di tempi di esposizione relativamente ridotti per l’acquisizione delle immagini. I test di caratterizzazione mostrano che simili performance valgono anche per l’intervallo spettrale di emissione dei fluorofori con cui saranno marcati i nanorods.
Nonostante gli sforzi progettuali e realizzativi, che hanno previsto una simulazione di ray tracing e lo sviluppo di un piano ottico dedicato, risultati meno convincenti sono stati ottenuti per l’illuminazione con laser a 561 nm, sia in termini di omo- geneit`a dell’illuminazione che, soprattutto, per la presenza di frange di interferenza che costituiscono un ostacolo per l’interpretazione delle immagini di fluorescenza. Va comunque osservato come l’uso di un modulatore acusto-ottico per “sporcare” le
4.4. MISURA DELLO SPETTRO DI ASSORBIMENTO DEI NANORODS IMPIEGATI93 propriet`a del fascio laser con una modulazione con un periodo breve rispetto ai tem-
pi di esposizione della fotocamera potrebbe costituire una soluzione praticabile per ridurre i fenomeni di interferenza, a patto, per`o, di ulteriori sforzi di ottimizzazione del sistema. Questi sforzi potrebbero avere significato, ad esempio, nel caso in cui la fluorescenza emessa dal campione fosse dotata di eccitazione su banda molto stretta (e coincidente con la lunghezza d’onda del laser), circostanza che non si verifica nella pratica convenzionale della microscopia di fluorescenza.
Infine, il sistema di fotoablazione, che `e l’elemento principalmente distintivo dell’ap- parato sviluppato in questa tesi, ha dimostrato pienamente la propria funzionalit`a. Esso `e basato su un laser a diodo, dunque una sorgente economica e facilmente reperibile, il cui fascio `e inviato a una fibra a singolo modo terminata con un fo- calizzatore. `E infatti stato possibile focalizzare il fascio e inviarlo, con accuratezza micrometrica, sul campione grazie alla realizzazione di uno specifico supporto mon- tato sul piano del microscopio e dotato di traslatori meccanici. Qualora le esigenze sperimentali lo richiedessero, il sistema potrebbe essere ulteriormente perfezionato con l’uso di viti micrometriche operate con motori elettrici passo-passo, che permet- terebbero un puntamento automatizzato dello spot di ablazione su regioni specifiche della cavia, in modo da aumentare l’affidabilit`a di puntamento.
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