4.3 I risultati
4.3.1 Zebrafish 6
Il campione su cui si sono ottenuti risultati a nostro avviso pi`u convincenti `e Zebra- fish6. La cavia `e stata irragiata con una densit`a di potenza di 45W/cm2×50s.
La fluorescenza appare come in fig.4.4. Le due immagini a) e b) evidenziano le due zone differenti della cavia a cui `e stato sovrapposto il laser di ablazione. Le immagini al centro del field of wiev in a) e b) in figura 4.4 tengono quindi conto di una lieve correzione della messa al fuoco al variare della posizione da cui si raccoglie l’immagine, dovuto allo spessore della cavia, si vedr`a comunque che, in questo caso, il fenomeno `e irrilevante poich`e i profili di intensit`a estratti dalle due immagini sono praticamente sovrapponbili.
In fig.4.5 `e presentata l’immagine acquisita 24 ore dopo l’esposizione al laser. Da un primo immediato confronto con fig.4.4, si nota come la forma e la dimensione della zona fluorescente `e variata in modo sostanziale, anche ad occhio nudo si pu`o notare come: nella zona 1) cerchiata in figura appare quasi del tutto sparito un cluster di cellule fluorescenti (anche variando la messa a fuoco), mentre in zona 2) si intravede una brusca discontinuit`a della massa fluorescente centrale.
L’analisi dei risultati `e stata effettuata estraendo i profili di intensit`a lungo un seg- mento di pari lunghezza (in questo caso 550µm) e della larghezza di 20 µm (ovvero paragonabile alla dimensione dello spot del laser), che attraversa le zone di interesse, fig.4.6. L’incertezza di posizionamento `e dovuta alla selezione manuale dei segmenti lungo le direzioni scelte per il confronto delle immagini, essa pu`o essere stimata in qualche micron. Il software di imaging utilizzato effettua una media delle intensit`a pixel×pixel lungo lo spessore del segmento e registra le intensit`a cos`ı ottenute. I profili infine sono stati normalizzati utilizzando un picco di intensit`a massima re- gistrata in una zona non irraggiatiata, in questo caso distante circa 100µm dalla zona esposta pi`u vicina, e che presenta quindi la stessa intensit`a sia prima che do- po l’irraggiamento, nei limiti dell’incertezza di misura, che in questo caso `e dovuta sopratutto alle condizioni di illuminazione.
In fig.4.7, viene presentato il grafico acquisito dall’immagine di Zebrafish6 prima dell’ablazione. Si notano dei picchi di intensit`a iniziali (1 e 2) che fanno da riferi- mento e che corrispondono a singoli cluster cellulari isolati.
4.3. I RISULTATI 79
Figura 4.5: Immagine della fluorescenza di Zebrafish6 24 ore dopo l’ablazione, in zona 1 e 2 si notano cambiamenti evidenti rispetto alle immagini in figura 4.4.
Figura 4.6: Segmenti di estrazione dei profili di intensit`a in una direzione che comprenda entrambe le zone di ablazione (~x).
80 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI
Figura 4.7: Profilo di intensit`a estratto dall’immagine di fluorescenza di Zebrafish6 prima dell’ablazione.
. In fig. 4.8 vengono presentati i due grafici acquisiti corrispondenti a fig. 4.4, ovvero durante dell’ablazione e per due zone diverse del campione. In figura `e pre- sente anche lo spot del laser, riconoscibile dalla figura diffrattiva e da una banda praticamente piatta (saturazione). Infatti, nonostante la presenza del filtro dicoico, intensit`a del laser `e cos`ı alta che una frazione viene registrata dalla camera, che ricordiamo, ha un tempo di esposizione lungo per permettere una adeguata raccolta del segnale di fluorescneza. In questo modo `e possibile individuare in modo preciso quali siano le zone esposte: in particolare il secondo picco da sinistra (corrispondente alla zona 1), e parte dei massimi della seconda banda (pi`u larga) attorno ai 400µm. Infine si nota il massimo con cui `e stata effettuata la normalizzazione, distante circa 100µm dal laser di ablazione.
In figura 4.9, si ha il profilo di intensit`a della fluorescenza corrispondente a fig.4.5. Si nota facilmente l’assenza dei picchi 1 e 2 in corrispondenza della prima zona, a meno di una fluorescenza residua (un picco molto stretto) di forma molto diversa dai precedenti, e che potrebbe essere associato a frammenti di materiale biologico e fluorescente, non pi`u riconoscibile ad occhio nudo. Ma sopratutto in zona 2 (la seconda zona in cui `e stato sovrapposto il laser), si nota una netta ed accentuata diminuzione di intensit`a, non associabile a effetti di defocalizzazione (perch`e troppo netta rispetto alla fluorescenza nell’intorno immediatamente circostante), e delle dimensioni di circa 20µm quindi paragonabile alla grandezza dello spot del laser di ablazione.
4.3. I RISULTATI 81
Figura 4.8: Profili di intensit`a estratti da a) e b) di figura 4.4: i picchi 1 e 2 cor- rispondono a singoli cluster cellulari isolati osservabili ad occhio nudo in figura.4.4, si nota anche la figura diffrattiva indotta dal laser che indica in che zona `e stato allineato.
82 CAPITOLO 4. MISURE E RISULTATI
Figura 4.9: Profilo di intensit`a corrispondente alla figura 4.5, si nota la scomparsa dei picchi di intensit`a in zona 1 e una diminuzione di intensit`a molto accentuata in zona due, l’intensit`a massima risulta invariata rispetto ai grafici precedenti.
La seconda analisi che `e stata compiuta `e una misura della superficie ablata. Per fare questa misura `e necessario riconoscere profili superficiali ben definiti, e quindi il pi`u possibile scevri dal rumore di fondo nell’immagine, e dall’effetto di de-focalizzazione (gi`a descritto in precedenza) ai bordi dei profili nelle immagini. L’operazione neces- saria `e tipica delle analisi finalizzate alla identificazione e misura di particelle isolate. In sostana `e stato stabilito in modo arbitrario una soglia di intensit`a oltre la qua- le la radiazione viene considerata fluorescente. In questo modo sono state perse le infromazioni locali della emissione, minimizzando l’effetto della defocalizzazione ricordato in precedenza. La fig. 4.10 mostra le immagini acquisite prima e dopo l’ablazione ottenute in questo modo: la soglia `e qui posta allo stesso valore, pari al 20% del massimo. Questa scelta `e risultata “stabile”, nel senso che piccole variazioni attorno a quel valore non hanno prodotto variazioni significative nei risultati. Ottenute le figure, sono state selezionate tutte le zone di interesse, e misurate le superfici di ognuna di essa tramite il software da noi utilizzato. La superficie totale delle figure ottenute prima dell’irraggiamento `e pari a 22800±2000µm2, mentre dopo
l’ablazione di 12400±1200µm2, che risulta in una diminuzione relativa del 45% della superficie fluorescente definita secondo il nostro metodo.
4.3. I RISULTATI 83
Figura 4.10: Immagini trattate tra prima e dopo l’ablazione, secondo quanto descritto nel testo.
Figura 4.11: In a) immagine della fluorescenza acquisita prima dell’ablazione e la sovrapposizione con il laser di ablazione (in blu), in b) l’immagine della fluorescenza dopo l’ablazione, in zona 1 si nota una netta diminuzione di intensit`a.