METODI ANALITICI DI IDENTIFICAZIONE DELLE PROTEINE! !

diventino garanzia per la tutela del consumatore. !

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Numerose risultano essere le metodiche analitiche attraverso le quali è possibile svelare una frode. Nell’ambito dei prodotti della pesca le principali risultano essere l’esame istologico, utile per discriminare un prodotto fresco da uno congelato (Pezzolato M., 2010) e, per quanto riguarda l’identificazione di specie zoologica, metodiche biomolecolari che possono eleggere come target proteine o il DNA. !

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IV.1 METODI ANALITICI DI IDENTIFICAZIONE DELLE PROTEINE!

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! ! Per quanto concerne le tecniche analitiche che prendono in esame determinate proteine vengono utilizzati metodi immunologici ed elettroforetici. In particolare il metodo immunologico maggiormente utilizzato in passato ma che adesso è stato ormai abbandonato in favore di tecniche più rapide e sensibili, è l’immunodiffusione in gel di agar (AGID). !

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IV.1.1 IMMUNODIFFUSIONE IN GEL DI AGAR

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! ! Questa analisi immunologica è basata su una reazione sierologica antigene- anticorpo tra l'estratto dell'alimento crudo ed una serie di sieri specie-specifici

presenti in commercio. La prova prevede, in seguito alla processazione del

campione, l’allestimento di una piastra di Agar con un pozzetto centrale e dei pozzetti laterali. Nel pozzetto centrale viene distribuito il siero specie specifico acquistato in commercio mentre nei laterali gli estratti dei campioni !

da saggiare. Dall’osservazione della piastra di agar a fine procedimento può essere valutata l’appartenenza o meno di un campione ad una determinata specie, il cui siero viene posizionato nel pozzetto centrale della piastra. La positività di un campione è !

segnalata dalla formazione di una banda di precipitazione localizzata tra il pozzetto contenente il siero ed il pozzetto contenente l’estratto del campione in esame. Il vantaggio di questa prova è rappresentato dalla facilità di esecuzione del

procedimento; tuttavia fattori quali la presenza di un numero limitato di sieri specie- specifici in commercio, la scadenza di tali sieri, l’applicabilità solo a campioni provenienti da prodotti crudi (trattamenti chimici e termici inducono parziale denaturazione delle proteine ed inficiano la possibilità di effettuare tale prova), il tempo di risposta di 48h ed il fatto di essere solo una analisi quantitativa hanno fatto propendere nel tempo all’utilizzo di altre metodiche analitiche più rapide e complete.! In letteratura sono riportati esempi dell’utilizzo di questa metodica immunologica in campo alimentare per svelare la presenza di adulterazioni (Hsieh P., et al., 2007); in particolare per quanto riguarda i prodotti della pesca è presente un contributo che descrive l’utilizzo con successo di questa prova nell’identificazione di surimi di Pollock nei prodotti crudi a base di carne (Dreyfuss, M. S., et al., 1997).!

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IV.1.2 METODICA ELISA!

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! ! Un’altra prova di tipo immunoenzimatico utilizzata per l’identificazione di specie zoologica è rappresentata dal metodo ELISA (Enzime-Lynked Immuno Sorbent Assay).!

Questa prova sfrutta l’affinità e la specificità del legame antigene- anticorpo con la formazione di un immuno-complesso che viene messo in evidenza tramite una reazione enzimatica solitamente colorata. La metodica ELISA utilizzata, nello

specifico, è di tipo diretto non competitivo cosiddetta “a sandwich”. La preparazione prevede la copertura dei pozzetti con un anticorpo di cattura specifico per l’antigene da ricercare. Nei pozzetti viene in seguito aggiunto il campione da saggiare. Viene introdotto poi un altro anticorpo specifico di rilevazione che andrà a legarsi con i complessi antigene- anticorpo di cattura formatisi in precedenza. Questo anticorpo introdotto nei pozzetti secondariamente è coniugato con un enzima che, tipicamente, è rappresentato dalla perossidasi. L’ultimo step !

comporta l’introduzione di un substrato, un cromogeno, che reagendo con l’enzima perossidasi mette in evidenza il risultato positivo della prova.!

La metodica ELISA appena passata in rassegna presenta vantaggi quali la facilità di esecuzione, l’elevata sensibilità, l’elevata specificità ed un tempo di attesa per la risposta di 2 ore circa; tuttavia, anche in questa prova sono presenti dei limiti rappresentati dal costo dei kit, la scadenza di quest’ultimi, il numero limitato di sieri

presenti in commercio e dal fatto di essere una metodica di analisi esclusivamente di tipo qualitativo. Inoltre il metodo ELISA si è dimostrato poco efficace nel distinguere specie molto vicine e richiede, per il suo svolgimento, lo sviluppo di anticorpi specie- specifici contro proteine specie specifiche (Carrera E., et al.,1997).!

In letteratura sono riportati numerosi casi che riportano l’utilizzo di questa metodica nell’identificazione di specie ittiche a partire da prodotti trasformati.!

Hsieh Y.H., et al. (2009) riportano nel loro contributo la messa a punto di una metodica ELISA a sandwich basata sull’utilizzo di specifici anticorpi di cattura e di rilevazione in grado di distinguere in modo rapido ed efficace pesci appartenenti alla Famiglia Pangasidae da altre specie più pregiate.!

In un altro contributo scientifico viene segnalato l’utilizzo di un metodo ELISA indiretto nella discriminazione della Cernia da altre specie di minor qualità (Asensio L., et al., 2003).!

Tuttavia, per quanto riguarda l’identificazione delle specie ittiche, non è ancora stato posto in commercio nessun kit per l’esecuzione di questa tipologia di test

immunologico, probabilmente a causa del largo numero di specie ittiche che potrebbero essere coinvolte. (Mackie et al. 1999)!

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IV.1.3 ISOELETTROFOCALIZZAZIONE!

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! ! Altra metodica mirante ad evidenziare le differenze intraspecifiche su base proteica è rappresentata dall’isoelettrofocalizzazione (IEF) delle proteine

sarcoplasmatiche di pesce (Berrini et al., 2006), prova ufficializzata nel 1995 negli Stati Uniti dalla Food & Drug Amministration (FDA) come metodo d’identificazione delle specie ittiche, ma non !

ufficializzata a livello dell’Unione Europea. Questa tecnica offre infatti ottimi risultati nella individuazione di specie, come riportato in diverse pubblicazioni scientifiche (Terio E., et al., 1985; Rehbein H., 1990; Renon P.. et al 1995; Renon P., et al., 2001,Bernardi C., et al.,2004) e, vista anche la sua rapidità, ha soppiantato l’immunodiffusione in gel di agar. !

L’isoelettrofocalizzazione è una tecnica discriminante e di rapida attuazione che consente di fornire, per le proteine estratte da ogni specie ittica, una vera e propria mappa tipica della specie (Tepedino V., et al., 2000). Questa metodica sfrutta la

differenza di carica elettrica delle proteine sarcoplasmatiche dei pesci dovuta ad una differenziazione della loro struttura primaria. Queste proteine, sottoposte all’azione di un campo elettrico, a seconda della carica che possiedono, migrano su un supporto specifico (carta/acetato di cellulosa o gel di agarosio/poliacrilammide) separandosi ed andando a formare una serie di bande colorate, che risulta essere specifica per ogni specie. La presenza di banche dati costantemente aggiornate contenenti i tracciati delle principali specie ittiche commercializzate permette il confronto e l’identificazione della specie in esame.!

Questa metodica caratterizzata dalla rapidità di esecuzione e dall’alta specificità presenta tuttavia il limite di avere una scarsa utilità nell’identificazione di specie in quei prodotti trasformati che non solo presentano la mancanza di integrità anatomica ma che sono stati anche sottoposti a trattamenti di natura fisica o chimica che hanno portato alla denaturazione delle proteine. Altri limiti nell’applicazione

dell’isoelettrofocalizzazione sono dati dall’omologia delle proteine in specie filogeneticamente correlate e dall’elevato polimorfismo di alcune proteine frequentemente osservato in alcune specie (Rehbein H., 1990).!

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IV.2 METODI ANALITICI DI IDENTIFICAZIONE DEL DNA!

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! ! I limiti evidenziati dall’impiego delle suddette metodiche biomolecolari aventi come target le proteine hanno portato allo sviluppo di metodi basati sull’analisi del DNA. In particolare, le proteine, come precedentemente accennato, vengono denaturate dai trattamenti di calore effettuati (Mackie et al., 1999) e quindi queste metodiche non risultano essere !

attendibili per quei prodotti trasformati la cui preparazione prevede un importante impiego di agenti fisici o chimici. !

L’identificazione di specie basata sull’analisi del DNA ha evidenziato numerosi

vantaggi rispetto ai metodi su base proteica. In particolare, le caratteristica principale del DNA, ovvero quella di essere costituito da una sequenza unica per ogni essere vivente conferisce all’analisi una maggiore specificità e sensibilità. Inoltre la

robustezza e l'affidabilità sono garantite dal fatto che il DNA è maggiormente termostabile rispetto alle proteine ed è quindi in grado di resistere ai trattamenti che avvengono a livello industriale !