1Seconda Università degli Studi di Napoli, Dipartimento di Medicina Sperimentale - Sezione di Medicina del Lavoro, Igiene e Tossicologia Industriale, Napoli
2Università degli Studi di Napoli “Federico II”, Dipartimento di Medicina Pubblica e della Sicurezza Sociale, Napoli
3Seconda Università degli Studi di Napoli, Dipartimento di Scienze della Vita, Caserta
4Università degli Studi di Napoli Federico II, Dipartimento di Ingegneria Chimica, Napoli
Introduzione
La combustione di carburanti ricchi di idrocarburi dà luogo ad un’ampia varietà di particelle carboniose che dif-feriscono in natura e dimensioni; in particolare, nanoparti-celle di carbonio organico (NOC) e fuliggine sono state ri-levate nei gas di scarico di motori diesel e a benzina, sug-gerendone una presenza ubiquitaria, soprattutto in aree ur-bane, a seguito del traffico autoveicolare. L’esposizione professionale a tali particelle riguarda principalmente il set-tore dei trasporti e, in linea generale, tutte le attività che comportino esposizione ad emissioni autoveicolari. Studi epidemiologici hanno mostrato una relazione causale dose-effetto a seguito di esposizione a particolato; tuttavia, al va-riare delle caratteristiche chimico-fisiche tipiche di ciascu-na classe di particelle variano i meccanismi di diffusione nell’aria, di penetrazione, assorbimento e distribuzione al-l’interno dell’organismo: ad esempio, particelle con diame-tro inferiore ai 20 nm diffondono attraverso l’organismo agli organi extra-polmonari, mentre particelle a dimensioni maggiori si depositano prevalentemente lungo il tratto re-spiratorio (1-11). Risulta quindi indispensabile indagare il potenziale rischio per la salute rispetto a ciascuna singola classe di particelle. In questo contesto, l’attenzione è stata focalizzata sulla valutazione della mutagenicità dei NOC, particelle caratterizzate da un diametro inferiore ai quattro nanometri -i cui effetti tossicologici non sono stati, finora, investigati- e sullo studio della loro capacità di interagire con molecole biologiche, quali proteine e peptidi.
La mutagenicità di nanoparticelle presenti nei gas di scarico è stata verificata mediante Test di Ames condotti utilizzando due ceppi di Salmonella typhimurium, TA98 e TA100, recanti ognuno un diverso tipo di mutazione nel-l’operone che codifica per la biosintesi dell’istidina, per cui i batteri sono incapaci di sintetizzare tale amminoaci-do. L’utilizzo di due ceppi differenti di Salmonella typhi-murium permette di evidenziare diversi tipi di danni gene-tici a livello di una o poche coppie di basi nel DNA (mu-tazioni puntiformi); in particolare il ceppo TA98 rileva mutazioni per inserzione o delezione di basi, mentre il cep-po TA100 rileva mutazioni per sostituzione di basi (12).
Per distinguere le sostanze che per esercitare la loro azione mutagena devono essere metabolizzate (promuta-RIASSUNTO
Nanoparticelle di carbonio organico con diametro inferiore ai 4 nm (NOC) derivano dalla combustione di carburanti ricchi di idrocarburi e si ritrovano soprattutto in aree urbane ad alto traffico autoveicolare. Vista la relazione causale dose-effetto connessa con l’esposizione a particolato, dimostrata attraverso diversi studi epidemiologici, il potenziale rischio per la salute dovuto alla presenza dei NOC nell’aria ambiente è stato investigato studiandone mutagenicità e reattività. Sono stati condotti test di Ames su ceppi di Salmonella TA98 e TA100 incubati con campioni provenienti da esausti di motori diesel e a benzina, con e senza attivazione metabolica; mentre l’eventuale presenza di sostanze elettrofile in grado di interagire con le macromolecole biologiche dell’organismo (DNA e proteine) è stata indagata semplificando la complessità della matrice biologica, mediante l’utilizzo di peptidi modello. Tali peptidi, incubati col materiale particellare, sono stati analizzati adoperando tecniche di cromatografia liquida/spettrometria di massa. I risultati ottenuti hanno evidenziato il discreto potere mutageno e l’elevata reattività delle particelle esaminate, mettendo in luce la necessità di individuare un adeguato biomarcatore in grado di rilevare l’esposizione ad emissioni autoveicolari.
Parole chiave: NOC, combustione, test di Ames, addotti.
ABSTRACT
[Combustion generated nanoparticles: mutagenicity and chemical reactivity]
Nanoparticles of organic carbon (NOC) are formed in combustion of hydrocarbon-rich fuels and have been detected in vehicle exhausts, suggesting their presence in urban atmospheres. Epidemiological studies showed that some causal relationships exist between particle concentration in the air and a wide range of health effects, but no toxicological studies are reported on the potential health risk of particles smaller than 4 nm. The present study investigated the mutagenicity and the reactivity of NOC collected in water samples from the exhausts of diesel and gasoline engines. Mutagenicity was tested following the Ames Test, with and without metabolic activation. Reactivity was investigated by using a new approach aimed to identify electrophilic agents present in the sample material, which if introduced into the organism, could interact with nucleophilic sites of biological macromolecules (DNA and proteins), forming adducts. Given the large number of nucleophilc sites within biological
macromolecules, the complexity of NOC, and the inexact knowledge of its chemical structure, this approach was simplified by examining in vitro interactions between NOC particles and model peptides through LC/MS analyses of incubation mixtures. The results indicate a high reactivity and, in several cases, the mutagenicity of NOCs, thus calling for suitable biomarkers to assess NOC exposure associated with vehicle emissions. Key words: NOC, combustion, Ames test, adducts.
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geni) da quelle che possono agire sul DNA direttamente (mutageni diretti), i test sono stati condotti con e senza at-tivazione metabolica esogena, adoperando la frazione mi-crosomiale epatica “S9”, ottenuta mediante stimolazione dell’attività degli enzimi epatici del ratto.
La reattività delle particelle è stata investigata utiliz-zando un approccio teso ad identificare agenti elettrofili presenti nel materiale campionato, il quale, se introdotto nell’organismo, può interagire con i siti nucleofili di ma-cromolecole biologiche (DNA e proteine), formando ad-dotti. Gli addotti possono fungere da indicatori della geno-tossicità e/o da biomarker di esposizione agli xenobiotici in esame. Dato l’elevato numero di siti nucleofili presenti nelle macromolecole biologiche e data la complessità dei NOC, assieme alle scarse conoscenze circa la loro esatta composizione e struttura chimica, l’approccio preliminare della ricerca ha previsto l’identificazione di eventuali com-ponenti elettrofili contenuti nei NOC, usando, come matri-ci proteiche, dei peptidi modello che contenessero residui amminoacidici con siti nucleofili specifici ed altamente reattivi (13, 14). Tali peptidi, incubati con il materiale par-ticellare, sono stati analizzati adoperando tecniche di cro-matografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) le qua-li consentono di misurare l’incremento del peso molecola-re della frazione proteica dovuto ad una eventuale intera-zione con uno xenobiotico.
Materiali e Metodi
Il materiale nanoparticellare è stato raccolto collegan-do ad un apposito sistema di campionamento i gas di sca-rico di veicoli alimentati a gasolio e a benzina collocati su un telaio dinamometrico a carico costante (50-75 km/hr). Il sistema di campionamento è costituito da tubi a lun-ghezza e diametro variabili raffreddati ad acqua, che con-sentono: a) condensazione e raccolta dei prodotti di com-bustione in ambiente acquoso; b) diluizione (1:10, con aria purificata mediante filtri HEPA) dell’esausto gassoso e mi-surazione in situ dello spettro UV-visibile. La concentra-zione del carbonio organico totale (TOC) dei campioni ac-quosi è stata misurata mediante un TOC Analyzer (Shi-madzu TOC-5000 A).
Per lo studio della mutagenicità sono stati utilizzati campioni acquosi a concentrazione di 600 ppm, diesel e 400 ppm, benzina, progressivamente diluiti 1:2, ottenendo per ciascun esausto, cinque concentrazioni decrescenti. I test di Ames sono stati condotti effettuando tre repliche in-dipendenti su ciascun campione, utilizzando ceppi di Sal-monella typhimurium TA98 e TA100, con e senza S9. I re-vertenti sono stati contati dopo 48h di incubazione delle piastre in termostato a 37°C. Per ciascun test sono stati ef-fettuati controlli negativi. Lo studio della reattività dei campioni provenienti da combustione ha previsto incuba-zioni in vitro (18 h, 37°C) di quattro peptidi (Angiotensina I, Coxsackie B3 Virus Epitope, Alloferon 1 e un Peptide sintetico con Cisteina N-terminale) con campioni acquosi contenenti NOC a concentrazione di 850 ppm (diesel) e 550 ppm (benzina). Le miscele di incubazione sono state analizzate mediante LC/MS (LCQTM
DECA, Thermo).
Sepa-razione cromatografica: colonna C18(250 mm x 2.0 mm, 5
µm, 300 Å); flusso 0.2 ml/min; tamponi: 0.1% acido for-mico (A) e 0.1% acido forfor-mico in metanolo (B); gradiente lineare: 5-70% (95 min). Gli spettri di massa sono stati ac-quisiti nell’intervallo 50-2000 m/z.
Risultati Test di Ames
La mutagenicità del campione è stata stimata applican-do il criterio del radapplican-doppio: una sostanza viene considera-ta muconsidera-tagena quando il rapporto tra i revertenti indotti ed il numero dei revertenti spontanei dati dal campione di con-trollo negativo risulta maggiore di due (15).
L’andamento della crescita dei revertenti in funzione della dose ha permesso di costruire curve dose/risposta, ri-portando i µg di campione incorporati in piastra in funzio-ne del numero dei revertenti per piastra. La mutagenicità del composto è stata valutata considerando il tratto lineare delle curve, al fine di eliminare interferenze dovute all’e-ventuale presenza di effetti tossici.
Per i ceppi di Salmonella TA98, i campioni da motori a benzina risultano positivi sia in presenza sia in assenza di S9; i campioni da diesel sono mutageni solo in presenza di attivazione metabolica, con una risposta di circa 4 volte ri-spetto ai controlli negativi. Al contrario, i test condotti per il diesel con il ceppo TA100 mostrano anch’essi andamen-ti lineari dose-risposta, ma le risposte nel range esaminato (3.75-280 e 2.5-145 µg/piastra, per i NOC da diesel e da benzina, rispettivamente) sono meno del doppio rispetto al controllo.
Reattività chimica
I campioni di NOC da motori diesel e benzina sono sta-ti analizzasta-ti in LC/MS prima e dopo incubazione con quat-tro differenti peptidi modello. I profili cromatografici dei campioni di NOC mostrano numerosi picchi caratterizzati da un incremento di massa di 44Da. In molti casi, dopo l’addizione dei peptidi, le analisi LC/MS evidenziano la scomparsa dei segnali relativi ai peptidi e alle particelle dei NOC e la contemporanea comparsa di un numero di picchi coeluenti e non ben risolti ad alti tempi di ritenzione. Tali segnali, caratterizzati da elevati pesi molecolari, non corri-spondono ad un’interazione covalente NOC-peptide, per-tanto la loro natura non è stata ancora identificata. Ciono-nostante, la scomparsa dei segnali corrispondenti ai pepti-di pepti-dimostra l’elevata reattività delle particelle in esame. Non avendo registrato la formazione di un classico addot-to covalente, ulteriori indagini sono necessarie al fine di stabilire se l’interazione NOC-peptide sia dovuta a legami di natura chimica e/o fisica.
Conclusioni
Gli esperimenti condotti hanno evidenziato che i gas di scarico di motori alimentati a gasolio o a benzina conten-gono una frazione particellare con diametro inferiore ai 4 nm che mostra, in diversi casi, mutagenicità ed elevata
reat-328 G Ital Med Lav Erg 2005; 27:3 www.gimle.fsm.it tività delle particelle. I risultati ottenuti evidenziano quindi
la necessità di condurre ulteriori indagini in questa direzio-ne al fidirezio-ne di stabilire l’esatta composiziodirezio-ne del materiale or-ganico e di individuare un adeguato biomarcatore in grado di rilevare l’esposizione ad emissioni autoveicolari.
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