Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica - Università degli Studi di Padova
Introduzione
È noto come i legni duri, quali la quercia e il castagno (latifoglie), siano più pericolosi rispetto ai cosiddetti le-gni teneri come l’abete, il pino ed il larice (conifere). Al-cuni studi hanno dimostrato la presenza di tannini, poli-fenoli complessi, negli estratti acquosi di tutte le polveri d’origine vegetale (1); per alcuni di questi polifenoli è stata dimostrata la cancerogenicità negli animali da espe-rimento (2).
Scopo del nostro studio è stato quello di dosare la con-centrazione totale di queste sostanze negli estratti di una serie di legni sia duri che teneri, al fine di evidenziare una possibile differenza in contenuto. Inoltre, sulla base della maggiore concentrazione di alcuni tannini in specifici le-gni, è stato messo a punto un metodo in HPLC per il do-saggio dell’acido gallico (GA), un polifenolo ben noto, presente in elevata concentrazione negli estratti della quer-cia. Lo scopo è quello di proporre tale sostanza come marker chimico delle polveri di quercia (3), classificate dall’American Conference of Governmental Hygienists (ACGIH) come carcinogene riconosciute per l’uomo (ca-tegoria A1) (1, 4).
Materiali e Metodi
Nel corso di alcune indagini presso aziende operanti nel settore del mobile e del parquet sono stati acquisiti dei campioni di 35 diverse specie di legno correntemente uti-lizzate. I vari pezzi di legno sono stati ridotti in polvere e, per ciascuna tipologia, sono stati preparati dei campioni del peso di 20 ± 1 mg. È stata quindi eseguita un’estrazio-ne delle polveri con soluzioun’estrazio-ne fisiologica. Gli estratti sono stati suddivisi in due aliquote e su ognuna di queste è sta-to determinasta-to il contenusta-to di tannini utilizzando due me-todiche spettrofotometriche (SPF) differenti: la prima pre-vedeva l’uso della soluzione di Folin-Chocalteu (2N) con lettura finale SPF a 750 nm (5); la seconda una lettura di-retta dell’estratto a 280 nm. Per semplicità di trattamento, il contenuto di tannini totali è stato espresso in equivalen-ti di GA per grammo di legno.
Alcuni ricercatori (6-7) hanno riportato che il GA è pre-sente in concentrazioni relativamente elevate nelle polveri RIASSUNTO
Utilizzando due diversi metodi spettrofotometrici, è stata determinata la concentrazione totale di tannini in 35 specie di legni, ridotti in polvere, appartenenti sia alle latifoglie che alle conifere. Tale concentrazione variava da 2,485 mg/g per il pino svedese (softwood) a 35,843 mg/g per la quercia (rovere, hardwood) usando il metodo a lettura diretta (280 nm). I dati ottenuti con il secondo metodo (Folin-Chocalteau) sono ben correlati con i precedenti (y = 0,9885x + 4,3373; r = 0,84; n = 35). Le concentrazioni ottenute sono generalmente più elevate per la maggior parte dei legni duri (latifoglie) rispetto a quelle relative alle conifere. È stato inoltre messo a punto un semplice metodo HPLC-DAD per la determinazione dell’acido gallico (GA), proposto di recente come marker delle polveri di rovere. Parole chiave: polveri di legno, indicatori di esposizione, tannini, acido gallico.
ABSTRACT
[Tannin and gallic acid as marker of exposure to hardwood] The total tannin concentration was determined, using two different SPF methods, in 35 dust powdered wood species, both hard and softwood. Using direct reading-method (280 nm) the concentration varied from 2,485 mg/g for Swedish pine to 35,843 mg/g for European oak (quercus robur, hardwood). The data obtained with the second method (Folin-Chocalteau) were well correlated (y = 0,9885x +4,3373; r = 0,84; n = 35) with the data obtained with the first method. The measured concentrations are usually higher in hardwood than softwood tested. Finally, a simple HPLC-DAD method was tested for gallic acid (GA), recently proposed as a marker for oak dust.
Key words: softwood, hardwood, marker of exposure, tannin, gallic acid.
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del legno di quercia europea (quercus robur, rovere) ed è sta-to anche rintracciasta-to nel liquido di lavaggio nasale di lavo-ratori esposti durante le lavorazioni alla polvere di rovere. Abbiamo quindi ottimizzato un metodo per la quantificazio-ne del GA quantificazio-negli estratti di tale legno. Il protocollo prevede il trattamento della polvere del rovere con miscela acqua e metanolo e successiva estrazione dell’analita con etile ace-tato (2 aliquote da 4 ml); l’estratto organico è porace-tato a sec-co, ripreso con 200 µl di fase mobile (acqua/acido acetico 99:1; flusso 1 ml/min) ed analizzato
in un sistema HPLC-DAD (Diode Array Detector) a 270 nm, (Linea Perkin Elmer Serie 200). La colonna cromatografica era una C18 Chrom-Sep SS 150x4,6 mm (Varian). In queste condizioni il GA ha un tempo di ritenzione di 5.6 minuti.
Risultati e Discussione
I due metodi SPF si sono dimo-strati ben correlati fra loro (y = 0,9885x + 4,3373; r = 0,84; n = 35) e possono essere considerati sostan-zialmente equivalenti. Il metodo con il reattivo di Folin-Chocalteu è lineare in un range di concentrazio-ne più ampio (5-100 mg/l) rispetto al metodo a lettura diretta (1-40 mg/l). Nelle Figure 1 e 2, rispettiva-mente, sono riportati i dati riguar-danti le 10 specie di legno più note e più usate industrialmente fra quel-le esaminate. Si nota facilmente la netta differenza, un ordine di gran-dezza, di contenuto in tannini tra le-gni appartenenti alla famiglia delle latifoglie, come rovere e castagno, e legni appartenenti alla famiglia del-le conifere, quali il pino svedese e l’abete canadese. In particolare, in base ai risultati ottenuti usando il metodo a lettura diretta (280 nm), la concentrazione di tannini totali espressa in equivalenti di GA varia-va da 2,485 mg/g per il pino svede-se (softwood) a 35,843 mg/g per la quercia (rovere, hardwood).
I metodi di analisi proposti po-trebbero essere utilizzati come si-stemi di screening per valutare la pericolosità (legata alla tossicità dei tannini) delle polveri di legno in ambiente di lavoro. Purtroppo que-sti metodi non sono sufficientemen-te specifici per caratsufficientemen-terizzare ed identificare i diversi tipi di polveri di legno che possono essere presen-ti in ambiente di lavoro.
A differenza delle analisi precedentemente proposte, quella del GA ha i requisiti di specificità: ed infatti questa molecola era stata precedentemente identificata per mezzo di un’accurata analisi dei tannini presenti nel legno di quer-cia (6). Abbiamo quindi ottimizzato una metodica in HPLC che si è dimostrata sufficientemente sensibile, riproducibi-le e lineare nel range 0,05-50 mg/l. Il limite di ririproducibi-levabilità è risultato essere 0,025 mg/L (rapporto segnale rumore 3:1). Il CV% è risultato variabile fra 1 e 7% nell’intervallo
ana-Figura 1. Concentrazioni di tannini determinate con il metodo spettrofotometrico a let-tura diretta (280 nm)
Figura 2. Concentrazioni di tannini totali determinate con il metodo spettrofotome-trico di Folin-Chocalteu (750 nm)
334 G Ital Med Lav Erg 2005; 27:3 www.gimle.fsm.it vere. Il metodo da noi messo a punto ci consentirebbe, in-fatti, di avere un limite di quantificazione della concentra-zione di tali polveri aerodisperse pari a 0,1 mg/m3, per un campionamento personale di 4 ore con preselettore IOM.
Conclusioni
In base ai risultati ottenuti si può concludere che tra i due metodi di screening testati per la determinazione rapi-da dei tannini nelle polveri di legno, è preferibile quello a lettura diretta, più veloce e sostanzialmente sovrapponibi-le a quello con il reattivo di Folin-Chocalteu. In ogni caso queste metodiche non sono sufficientemente specifiche per poter caratterizzare ed identificare i diversi tipi di polvere di legno in ambiente di lavoro.
Di contro, la metodica in HPLC per il dosaggio del GA è risultata sufficientemente sensibile per l’uso di tale sostanza come marker per il rovere sui campioni di polvere raccolti in ambiente di lavoro. Per far comprendere meglio l’importanza di questa determinazione, ricordiamo che fino allo scorso anno l’ACGIH aveva fissato un valore limite per le polveri di quercia (TLV-TWA) di 1 mg/m3 con indicazione A1. Il metodo descritto potrebbe essere adeguato anche in caso di abbassamento del valore limite Europeo.
Figura 4. Curva di taratura dell’Acido Gallico nel range 0 - 50 mg/L
Richiesta estratti:Gori Giampaolo, Dipartimento di Medicina Ambientale e Sanità Pubblica, Sede di Medicina del Lavoro, Università degli Studi di Padova, Via Giustiniani 2, 35127, Padova, fax 049 8212542, e-mail [email protected]
Figura 3. Tracciato in HPLC-DAD di uno standard di acido gallico da 10 mg/L
litico della curva di taratura; l’accuratezza, sempre nello stesso intervallo, è risultata variabile fra il 95 ed il 108%. Nella Figura 3 possiamo vedere il tracciato HPLC di una soluzione standard di GA (concentrazione 10 mg/L). Nella Figura 4 è riportata la curva di taratura (area di risposta del rivelatore contro concentrazione) nel range 0,05 - 50 mg/L.
Con tale metodo è stato determinato il contenuto medio di GA in 9 campioni di polvere di rovere, che è risultato pari a circa 400 µg per grammo di polvere di legno. Que-sta concentrazione è sufficiente per poter considerare il GA come un buon marker dell’esposizione a polveri di
ro-Bibliografia
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