Sommario
Riassunto ... 4
PARTE GENERALE ... 5
1. FISIOLOGIA ED ENDOCRINOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE NELLA CAGNA ... 7
1.1 INTRODUZIONE ... 8
1.2 CICLO ESTRALE NELLA CAGNA ... 9
1.3 COME VALUTARE LE FASI DEL CICLO ESTRALE E DETERMINARE IL PERIODO FERTILE.. 27
1.4 GRAVIDANZA NELLA CAGNA ... 48
1.5 IL PARTO ... 68
2. INFERTILITA’ NELLA CAGNA E PATOLOGIE DELLA RIPRODUZIONE ... 85
2.1 INTRODUZIONE ... 86
2.2 INFERTILITA’ NELLA CAGNA ... 86
2.3 PATOLOGIE DELL’APPARATO RIPRODUTTORE ... 90
2.4 PATOLOGIE DELLA GRAVIDANZA ... 100
PARTE SPERIMENTALE ... 108
3. SCOPO DEL LAVORO ... 109
4. MATERIALI E METODI ... 110
5. RISULTATI ... 117
Gruppo A: PER MONITORARE IL CICLO ESTRALE, IN ASSOCIAZIONE ALLA CITOLOGIA VAGINALE ... 117
Gruppo B: PER MONITORARE LA GRAVIDANZA ... 120
Gruppo C: PER PREDIRE LA DATA DEL PARTO ... 122
Gruppo D: TAGLIO CESAREO PROGRAMMATO ... 126
Gruppo E: CASI CLINICI ... 130
6. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI ... 153
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ... 160
Riassunto
Parole chiave:Cane, Progesterone, Ciclo estrale, gravidanza, parto.
Scopo della tesi: I veterinari che si occupano di riproduzione dei piccoli animali hanno bisogno di una efficiente quantificazione
del progesterone (P4) sierico per identificare il momento giusto dell’accoppiamento o dell’inseminazione artificiale, per predire la data del parto, per programmare un cesareo (C-S) o per monitorare condizioni patologiche. Lo scopo della tesi è stato quello di descrivere e valutare l’utilizzo del dosaggio del P4 nella pratica clinica. Materiali e metodi: Lo studio è stato effettuato nell’arco di tre anni utilizzando diversi casi clinici pervenuti all’Ospedale Didattico Veterinario dell’Università di Pisa e all’Ambulatorio Veterinario Dott. Biondi. I casi sono stati così suddivisi: A. per monitorare il ciclo estrale, in associazione alla citologia vaginale; B. per monitorare la gravidanza; C. per predire la data del parto dal giorno dell’ovulazione (OV); D. per programmare un C-S; E. per gestire casi clinici. Per il dosaggio del P4 è stato utilizzato principalmente il metodo FEIA (AIA®-360, Tosoh Corp., Japan), oppure l’ELISA semi-quantitativo (Ovulation Test®). Risultati: A. Nei 56 cicli estrali valutati abbiamo osservato in anestro (n=7) una concentrazione media di P4 pari a 0,38±0,14ng/ml (range 0,29-0,68), in proestro (n=14) 1,03±0,67ng/ml (range 0,31-2,56) ed in
estro (n=72) 6,8±7,49 ng/ml (range 0,37-32,2). In diestro sono stati valutati 2 soli campioni: 6,7 e >44 ng/ml. B. 8 casi clinici: 1
controllo a metà gestazione (per infertilità precedente), 1 nell’ultimo terzo (per lattazione precoce e mastite); 5 controlli a termine, per stimare la data del parto o per C-S; 1 gravidanza patologica (terminata con l’aborto). C. La durata della gravidanza, dal giorno stimato dell’OV, è stata di 62,9±1,8gg (range 60-67gg). In 13/22 (59,1%) la durata della gravidanza è stata di 63±1gg, in 19/22 (86,30%) è stata di 63±2gg e in 21/22 casi è stata di 63±3gg (95.5%). In due la gestazione è stata di 60gg (8 e 9 cuccioli) e in uno di 67gg (4 cuccioli). D. 6 casi di dosaggio di P4 a termine gestazione: 0.82, 2.22 ng/ml (FEIA), tra <1 e 1-2,5 ng/ml Test®), 1-2,5 ng/ml Test®) il giorno stesso del C-S; 3,67 ng/ml (FEIA) e tra 2,5 e 8 ng/ml (Ovulation-Test®), il giorno prima del C-S. In tutti i cesarei abbiamo ottenuto il 92,6% di sopravvivenza dei cuccioli, che erano in numero di 5, 5, 3, 8, 1 e 5. E. Casi clinici: Anestro primario; Estro persistente; Gravidanza/piometra; Piometra; Infertilità; Endometrite.
Conclusioni: A. Abbiamo ottenuto una buona concordanza fra citologia vaginale e dosaggio di P4 nel periodo dell’anestro e del
proestro, mentre c’è stata una maggiore variabilità nel valutare l’estro (range 0,37-32,2). Questo perché citologia vaginale è
talvolta ambigua, e in alcuni casi un proestro è stato considerato come un estro. B. Il dosaggio del P4 in gravidanza è risultato utile per gestire i casi clinici e per indicare il termine della gestazione. C. L’accuratezza nella predizione della data del parto da quella stimata dell’OV con il metodo FEIA è comparabile a quanto osservato precedentemente in letteratura. D. I risultati per C-S programmato, sebbene scarsi, sono comparabili con quelli riportati in letteratura. E. Il dosaggio del P4 è risultato essere importante per la diagnosi, la prognosi e la terapia, nei diversi casi clinici analizzati.
Abstract
Keywords: Dog, Progesterone, estrous cycle, pregnancy, parturition.
Aim of the thesis: Veterinarians working in the field of small animals reproduction need reliable quantifications of serum
progesterone (P4), in order to identify the best time for mating or artificial insemination, to predict the day when parturition will occur, to decide when a cesarean section (C-S) should be performed, or to evaluate pathological conditions. The aim of the thesis was to describe and evaluate the use of serum P4 quantification in clinical practice. Materials and Methods: the study includes the clinical cases received at the Veterinary Teaching Hospital of Pisa University and at Ambulatorio Veterinario Dott. Biondi in the last 3 years. Clinical cases were divided and evaluated as follow: A. evaluation of estrous cycle, in association to vaginal cytology; B. evaluation of pregnancy; C. prediction of the day of parturition from the estimated day of ovulation (OV); D. elective C-S; E. clinical cases. To evaluate P4 concentration, in most cases a FEIA method (AIA®-360, Tosoh Corp., Japan) was employed, otherwise a semi-quantitative ELISA (Ovulation Test®) were used. Results: A. In the 56 evaluated estrous cycles we have observed in anestrus (n=7) a mean P4 concentration of 0.38±0.14ng/ml (range 0.29-0.68), in proestrus (n=14) 1.03±0.67ng/ml (range 0.31-2.56) and in estrus (n=72) 6.8±7.49 ng/ml (range 0.37-32.2). In diestrus only two samples were evaluated: 6.7 and >44 ng/ml. B. clinical cases were 8: 1 evaluation at mid-gestation (previous infertility), 1 in the last third (for precocious lactation and mastitis); 5 evaluations at term, to estimate the day of parturition of C-S; 1 pathologic pregnancy (ended with abortion). C. pregnancy length, from the estimated day of OV, was 62.9±1.8 days (range 60-67 days). In 13/22 bitches (59.1%) pregnancy length was 63±1 days, in 19/22 (86,30%) was 63±2 days and in 21/22 cases was 63±3 days (95.5%). In two bitches gestation lasted 60 days (8 e 9 puppies) and in one 67 days (4 puppies). D. In 6 bitches at term gestation P4 was 0.82, 2.22 ng/ml (FEIA), between <1 and 1-2,5 ng/ml (Ovulation-Test®) and 1-2,5 ng/ml (Ovulation-Test®) on the day of C-S, or 3.67 ng/ml (FEIA) e between 2,5 and 8 ng/ml (Ovulation-Test®) on the day before C-S. In all C-S a 92,6% survival of the puppies (5, 5, 3, 8, 1 and 5) was obtained. E. Clinical cases: primary anestrus; prolonged estrus; pregnancy/pyometra; pyometra; infertility; endometritis.
Conclusions: A. we have obtained a good correspondence between vaginal cytology and P4 evaluation during anestrus and
proestrus, while a higher variability was seen during estrus (range 0.37-32.2). This because vaginal cytology is sometimes ambiguous, and thus in some cases a proestrus was considered an estrus. B. P4 evaluation during pregnancy resulted to be useful to manage clinical cases and to indicate pregnancies at term. C. The accuracy in the prediction of parturition date prom the day of OV estimated by the FEIA method is comparable to what previously reported in literature. D. The results for elective C-S, although scarce, appear comparable to what previously reported in literature. E. Serum P4 evaluation was important in the diagnosis, prognosis and therapy, in the evaluated clinical cases.
P
INTRODUZIONE
La gestione della riproduzione occupa una parte importante sia nell’allevamento, per il quale possono essere utilizzati soggetti di grande valore, che nella gestione canina da parte del singolo proprietario, che può avere poca esperienza.
Il veterinario è chiamato in causa sia per la gestione dell’accoppiamento, della gravidanza e del post-partum, che per le varie patologie correlate.
Deve organizzare bene l’accoppiamento per avere la massima probabilità di ottenere una gravidanza; se necessario deve saper programmare correttamente il momento ideale per effettuare l’inseminazione artificiale.
Deve saper risolvere problemi di infertilità: problemi ormonali, infezioni, difetti congeniti o acquisiti dei tratti genitali,…
Deve fare diagnosi di gravidanza precoce e sicura per apportare le opportune variazioni ai programmi gestionali e nutrizionali della fattrice e, nel caso in cui la gravidanza fosse indesiderata, di scegliere il trattamento più corretto per la sua interruzione, qualora richiesto dal proprietario.
Deve fornire al proprietario la previsione della data del parto, che presenta importanti implicazioni nella corretta assistenza e nell’eventuale pianificazione del taglio cesareo.
Deve essere in grado di prestare la giusta assistenza, a madri e cuccioli, al momento del parto e nel post-partum.
1. FISIOLOGIA ED ENDOCRINOLOGIA
DELLA RIPRODUZIONE NELLA CAGNA
1.1 INTRODUZIONE
Il ciclo estrale è una sequenza coordinata di cambiamenti comportamentali, ovarici e utero-vaginali, che evolvono nei mammiferi per assicurare la produzione e la fertilizzazione dei gameti femminili e lo sviluppo intrauterino del prodotto del concepimento. La maggior parte dei mammiferi domestici non gravidi mostra cicli estrali continui, che comprendono il susseguirsi delle fasi: estro, quando l’oocita maturo attraversa le tube uterine e può avvenire la fertilizzazione, dopo un accoppiamento sessuale recettivo; diestro, preparazione per la gravidanza; se non ho fertilizzazione si ha il ritorno al proestro, quando si sviluppano follicoli nuovi fino ad un nuovo estro, dove può avvenire nuovamente l’accoppiamento. Animali quali maiale, bovino e cavallo tornano in calore ogni 3 settimane, circa, se non c’è stata gravidanza; ma se ho l’instaurarsi di una gravidanza, ho un prolungamento del diestro a causa delle esigenze per la gravidanza (Jeffcoate, 1998).
La cagna, invece, è una specie definita monoestrale non stagionale (Sokolowski; 1977) e non rispetta gli schemi generali, infatti:
− ogni ciclo ha una durata di circa 5 mesi;
− la gravidanza avviene durante la normale fase diestrale;
− ha un lungo periodo di inattività ovarica, chiamato anestro, che divide due cicli estrali, sia che la cagna sia gravida o no (Feldman and Nelson, 1996).
Inoltre è moderatamente influenzata dal fotoperiodo, in quanto presenta i calori in qualunque mese dell’anno, anche se l’incidenza maggiore si rileva nei mesi primaverili a luminosità crescente (Feldman et Al., 1998), per
l’esposizione alla luce naturale e alla temperatura (Concannon, 2011; Linde-Forsberg and Wallen, 1992).
1.2 CICLO ESTRALE NELLA CAGNA
Il ciclo estrale è caratterizzato dalla presenza di quattro fasi: proestro, estro, diestro ed anestro. Generalmente l’inizio della fase proestrale coincide con l’inizio del ciclo riproduttivo.
L’intervallo interestrale (calcolato dal termine della fase estrale propriamente detta all’inizio del proestro successivo) ha una durata variabile tra i 5 e i 12 mesi, in media di 6-7 mesi. Intervalli inferiori ai quattro mesi sono per lo più associati ad infertilità, e quelli superiori agli undici mesi possono associarsi sia a fenomeni di ipofertilità che ad infertilità (Feldman et Al., 1998; Concannon, 2011). La lunghezza dell’intervallo interestrale è influenzata dalla razza, dall’età e dalla presenza di gravidanze in passato. In genere cagne di piccola taglia tendono a presentare più calori all’anno rispetto a quelle di taglia grande, ma vi sono alcune eccezioni: per esempio, il Basenji, il Tibetan Mastiff, il Boston Terrier e il Dingo presentano un solo calore all’anno mentre il Pastore Tedesco e il Rottweiler raggiungono tre calori all’anno, con un intervallo fra i cicli che scende a 150 giorni (Sokolowski et Al., 1977; Linde-Forsberg and Wallen, 1992; Concannon, 2011). L’età incide sull’intervallo interestrale prolungandone la durata, come risulta da uno studio condotto su 12 femmine di Beagle che, superati gli 8 anni di età, hanno mostrato un aumento della lunghezza di tale intervallo da circa 240 a 332 giorni (Andersen et Al., 1962). Alcuni autori ritengono che in seguito alla gravidanza vi sia allungamento dell’intervallo interestrale, ma non è noto se questo fenomeno sia legato alla gravidanza oppure alla lattazione (Linde et Al., 1992; Kreeger et Al., 1992).
1.2.1 PUBERTA’
La pubertà è definita come il momento in cui il soggetto raggiunge la capacità di riprodursi e coincide con l’inizio del primo proestro evidente, primo segno chiaro di fertilità (Root Kustritz, 2012).
Razza Raggiungimento della pubertà (mesi) Airedale Terrier 15 Alano > 18 Australian sheperd 6-18 Bichon frise 8-9 Border collie 6-8 Boxer 8-24 Bullmastiff 6-16 Bull terrier 7-11 English setter 7-20 Golden retriever 9-11 Greyhound 11-30 Irish wolfhound 14-18
Pastore dei pirenei 12
Rottweiler 8 Saluki 8-24 Samoiedo > 12 Shetland sheepdog 7-17 Whippet 12-24 Yorkshire terrier 8-16
Tab.1: Raggiungimento della pubertà in alcune razze canine (Evans et Al., 1988; Clark et Al., 1983).
L’età in cui si hanno le prime manifestazioni estrali di solito dipende dal momento in cui si ha il raggiungimento dell’altezza e del peso del soggetto adulto ed è influenzata soprattutto dalla razza e dalla mole della cagna: soggetti di piccola e media taglia manifestano generalmente il primo calore tra i 4 e i 10 mesi di età mentre quelli di taglia grande e i levrieri possono presentarlo a 12 mesi ma anche a 18–24 mesi (Feldman et Al.,
Questo primo ciclo estrale può differire da quello delle femmine mature anche per l’incidenza maggiore di falsi calori, caratterizzati da manifestazioni fisiche che normalmente sono spia di estro non accompagnate però da ovulazione, e di calori silenti, dove invece abbiamo ovulazione in assenza di comportamenti o manifestazioni cliniche tipiche dell’estro (Concannon, 1980; Johnston et Al., 2001). Inoltre il calore puberale può rivelarsi più corto dei calori successivi poiché la durata del proestro – estro può essere più breve e la cagna può manifestare meno intensamente la sintomatologia riferibile al calore stesso, dal punto di vista comportamentale, nonostante l’estro sia generalmente accompagnato da ovulazione.
Occorre comunque attendere il terzo-quarto calore o il secondo-terzo anno di vita per ottenere la capacità riproduttiva ottimale (Sokoloswi, 1977; Smith et Al., 1967; Feldmann and Nelson, 1996).
1.2.2 FASI DEL CICLO ESTRALE
Figura 1. Schema dei tipici cambiamenti ormonali nel ciclo estrale della cagna, con valori basali e picco come
seguono: Estradiolo, 5-10 e 45-120 pg/ml; progesterone, 0.2-0.5 e 15-60 ng/ml; LH, 0.4-1.5 e 5-40 ng/ml; FSH, 15-40 e 200-400 ng/ml; prolattina, 0.5-2 e 5-30 ng/dl; testosterone, <0.5 e 2-5 ng/ml; androstenedione, 0.5 e 4-11 ng/ml (Concannon, 2011).
Figura 2. Illustrazione dei cambiamenti nello spessore della parete vaginale, della citologia vaginale e della
PROESTRO ESTRO DIESTRO ANESTRO
DURATA 9 giorni in media
(3-21 gg) 9 giorni in media (3-21 gg) Variabile, 62-64 gg se ho gravidanza, 49-79 gg se ho pseudogravidanza 4,5 mesi in media (da 1 a 8 mesi) CAMBIAMENTI FISICI Vulva turgida ed edematosa, perdite vulvari sanguinolente Vulva morbida, perdite vulvari siero-ematiche Perdite vulvari leggermente mucose in diestro precoce, sviluppo mammario possibile sia in vera che falsa gravidanza nessuno COMPORTAMENTO I maschi sono attratti dalle femmine che rifiutano il maschio. Vulva turgida e scolo siero- emorragico Le femmine accettano la monta e l’accoppiamento, manifestano la recettività spostando la coda di lato Le femmine rifiutano il maschio Non c’è attrazione tra maschi e femmine CITOLOGIA VAGINALE Graduale incremento di cellule cheratinizzate, diminuzione di PMNs Ho tutte cellule corneificate e più del 50% è anucleata, no PMNs Brusco ritorno a cellule epiteliali non cheratinizzate, alto numero di PMNs in diestro precoce Cellule epiteliali non cheratinizzate, occasionali PMNs ATTIVITA’ OVARICA, EVENTI ENDOCRINI PRINCIPALI Sviluppo follicolare, incremento della concentrazione sierica degli estrogeni Caduta degli estrogeni in seguito al picco di LH. Luteinizzazione preovulatoria dei follicoli per incremento preovulatorio del progesterone
Attività dei corpi lutei: incremento sierico di progesterone, caduta brusca alla fine (cagna gravida) o diminuzione graduale (cagna non gravida). La produzione di progesterone è supportata dall’LH e dalla prolattina. Il diestro termina con l’azione luteolitica delle prostaglandine FSH relativamente elevato, LH incrementa a fine stadio dopo la preparazione degli estrogeni
Tabella 2. Fasi del ciclo estrale (Feldman e Nelson, 2004; Davidson, 2006; Concannon, 2011; Root Kustritz,
PROESTRO
Il proestro è la fase del ciclo in cui ho incremento dell’attività follicolare ovarica, nella quale la cagna inizia a manifestare i segni clinici relativi al calore, che andranno accentuandosi fino alla massima intensità durante la fase dell’estro.
La durata media di tale fase è di 9 giorni (varia da 3 a 21 giorni) (Rijnberk, 1996; Feldman and Nelson, 1996).
Manifestazione clinica
Durante questa fase la vulva subisce un aumento di volume, appare allungata, turgida ed iperemica. Si osserva la presenza di perdite vulvari siero ematiche, il cui inizio si fa coincidere con il primo giorno di proestro (Rijnberk, 1996; JeffCoate, 2004). La cagna può mostrarsi più agitata e nervosa, con la tendenza a vagabondare ed a marcare il territorio con le urine, tendendo ad urinare più spesso (JeffCoate, 2004).
Etologia
Nel proestro la cagna inizia ad attrarre i maschi. Questa attrazione è spiegabile con la produzione di feromoni presenti nelle secrezioni vaginali, rettali e nelle urine (Goodwin et Al., 1979), ma la femmina si nega alla monta, allontanandosi o respingendo il compagno.
Se la cute circostante la vulva viene adeguatamente stimolata, si possono osservare tre riflessi:
− contrazioni vulvari,
− deviazione della coda,
Questi riflessi risultano assenti durante l’anestro, aumentano durante il proestro e raggiungono l’apice durante la prima metà dell’estro (Beach et Al., 1982).
Fisiologia-Endocrinologia
Dal punto di vista fisiologico, il proestro è caratterizzato dallo sviluppo dei follicoli ovarici, indotto dagli ormoni luteinizzante (LH, Luteinizing Hormone) e follicolo stimolante (FSH, Follicle-Stimulating Hormone) prodotti dall’ipofisi, a sua volta stimolata dal GnRH (Gonadotropin Relasing Hormone) liberato dall’ipotalamo. Le gonadotropine (FSH e LH) registrano un primo aumento nella fase proestrale precoce per ricadere poi a livelli basali fino all’aumento associato alle prime fasi estrali (Olson at Al., 1982).
L’aumento della produzione di estradiolo da parte dei follicoli in accrescimento è l’aspetto ormonale più rilevante nel proestro e spiega le modificazioni comportamentali ed organiche osservate nella cagna (JeffCoate, 2004). Il picco degli estrogeni viene raggiunto in tardo proestro. La concentrazione sierica dell’estradiolo in questo stadio del ciclo varia da 50 a 100 pg/ml (Concannon et Al., 1989).
L’estradiolo stimola la proliferazione e la corneificazione dell’epitelio vaginale e la desquamazione delle cellule cornificate; inoltre provoca la ritenzione di liquidi, alla base dell’aumento del volume e del turgore della vulva. La sua azione si esplica anche a livello delle gap-junction delle cellule endoteliali dei capillari della mucosa uterina, facilitando la diapedesi delle cellule ematiche nel lume vaginale, rilevabile macroscopicamente come scolo vulvare siero-ematico. All’endoscopia vaginale è facile osservare gli aspetti citati, osservando un arrossamento
e una marcata convessità-rotondità delle pieghe vaginali (JeffCoate, 2004).
Il progesterone rimane a livelli basali (<0,5-1 ng/ml) fino alla fine del proestro, momento in cui inizia ad aumentare comportando la luteinizzazione preovulatoria dei follicoli tipica di questa specie (Concannon et Al., 1977); al contempo si ha una diminuzione del tasso di estrogeni fondamentale per l’inizio della recettività all’accoppiamento.
Citologia
Gli strisci vaginali ottenuti all’inizio del proestro (figura 3) sono in genere caratterizzati dalla presenza di cellule basali-parabasali e intermedie piccole e numerosi eritrociti. Le cellule parabasali appaiono di piccole dimensioni (10-20 µm), rotonde, dai margini ben definiti, con un rapporto nucleo/citoplasma a favore del primo e un nucleolo ben evidente. Le stesse caratteristiche sono presenti nelle cellule intermedie piccole, che però hanno dimensione maggiore rispetto alle parabasali. Con l’avanzare di questa fase del ciclo (figura 4), si ha una riduzione della percentuale delle cellule parabasali e intermedie piccole e un aumento delle cellule intermedie grandi e superficiali, che saranno le dominanti nello stadio estrale. Possono essere evidenziati batteri e neutrofili (Zambelli, 2010).
Figura 3. Proestro iniziale, citologia vaginale cagna: cellule epiteliali parabasali (freccia piccola) e cellule
epiteliali intermedie (freccia grande) (Root Kustritz, 2012).
Figura 4. Proestro terdivo, citologia vaginale cagna: cellule epiteliali superficiali (freccia piccola) e cellule
ESTRO
L’estro è la fase del ciclo in cui la femmina accetta l’accoppiamento con il maschio. Nella cagna questa fase presenta una durata media di 9 giorni con un range variabile da 4 a 24 giorni (Zambelli, 2010).
Manifestazione clinica
Durante l’estro nella cagna permane l’aumento di volume della vulva, anche se meno turgida, e lo scolo vulvare, comunque presente, diventa più chiaro e paglierino per la minore componente ematica, esito della diminuita concentrazione sierica di estrogeni (Zambelli, 2010).
Etologia
L’accoppiamento segue un preciso rituale. La cagna si mostra disposta alla copula rimando ferma e deviando di lato o in alto la coda. Recepito il segnale il maschio la monta e, una volta avvenuta la penetrazione, il bulbo del pene si ingrossa formando il cosiddetto “nodo”. In seguito all’emissione delle prime due frazioni di sperma, il maschio scavalca la compagna mantenendo il pene in erezione all’interno della vagina e si dispone con il posteriore contro il posteriore della femmina fino al termine della copula (Zambelli, 2010).
Fisiologia-Endocrinologia
Nella cagna l’ovulazione si verifica 2-3 giorni dopo il picco di LH, che a sua volta avviene in genere 1-2 giorni dopo il picco di estrogeni in tardo proestro: la maggior parte delle ovulazioni avviene 30-48 ore dal picco di LH, ma alcuni follicoli impiegano anche 96 ore per ovulare (Jeffcoate, 1998).
Figura 5. Tipico profilo della concentrazione plasmatica del progesterone e stadi del ciclo tracciati dalla
media dei valori ottenuti in 8 cagne relativamente al picco di LH. Le caratteristiche che possono essere identificate ed usate per predire il periodo fertile sono: la concentrazione del progesterone è basale durante il tardo anestro (x-x) e cresce di poco ma in quantità determinabile durante il proestro (o-o). C’è un incremento preovulatorio della concentrazione plasmatica di progesterone nello stesso momento del picco preovulatorio di LH (+-+). Poiché ci sono intervalli relativamente consistenti fra il picco di LH e l’ovulazione, la concentrazione del progesterone incrementa fino al valore caratteristico (▲-▲) all’inizio del periodo fertile e continua ad aumentare (●-●) fino al 30°gg. (England and Harvey, 1998).
L’inizio dell’estro varia rispetto al picco di LH: in certe cagne può presentarsi 2-3 giorni prima del picco, mentre in altre si verifica il quarto/quinto giorno dopo il picco ormonale. Una peculiarità di questa specie è quella di ovulare un oocita immaturo, che non ha ancora estruso il secondo globulo polare ed è fermo allo stadio di metafase II. Di conseguenza, la fecondazione può avvenire solo al termine della seconda divisione meiotica, processo che si attua nell’ovidutto 48-60 ore dopo l’ovulazione. In seguito alla maturazione l’oocita rimane fecondabile per 48 ore.
Avvenuta l’ovulazione, la cagna entra nella fase luteinica di diestro gravidico o non gravidico (pseudogravidanza), a secondo che l’accoppiamento abbia dato esito a fecondazione o meno, comunque con la presenza di corpi lutei e progesterone (Zambelli, 2010).
Per la cagna la concentrazione sierica di estrogeni decresce durante tutto l’estro. Il picco preovulatorio di LH si verifica durante l’estro e stimola la ripresa della progressione meiotica del follicolo dallo stadio di profase e la liberazione da parte delle cellule della granulosa di alcune sostanze, quali le prostaglandine, favorenti la deiscenza del follicolo stesso. La durata del picco di LH presenta un range di 24-72 ore per poi diminuire fino a livello basale. La brevità di tale picco rende tale parametro difficilmente valutabile ed utilizzabile nella determinazione dell’ovulazione (Zambelli, 2010).
La concentrazione di progesterone ematico è il parametro fondamentale, associato alla citologia vaginale, per il monitoraggio del ciclo e l’individuazione del momento ottimale per l’accoppiamento o per l’inseminazione artificiale. Dall’aumento di progesterone a valori maggiori di 1 ng/ml, trascorrono 24-48 ore prima del picco di LH e altre 24-48 ore dall’ovulazione, in seguito alla quale l’oocita necessita di ulteriori 48-72 ore per la maturazione e rimane fecondabile per altre 48 ore. Ne deriva che la quarta e quinta giornata dopo l’incremento del progesterone sono le più adatte alla copertura della cagna. Valori di progesterone pari a 4-10 ng/ml vengono raggiunti in corrispondenza dell’ovulazione, in seguito l’ormone aumenta per tutto l’estro (Phemister et Al., 1973; Wildt et Al., 1978; Zambelli, 2010 ).
Citologia
Nella citologia vaginale (figura 6), nel passaggio da proestro ad estro, si evidenzia un progressivo aumento delle cellule superficiali a discapito di quelle intermedie grandi e piccole. Le cellule superficiali sono squame,
sottili, che trattengono minore colorante e, di conseguenza, appaiono colorati meno intensamente rispetto alle porzioni centrali della cellula. Le cellule superficiali possono accartocciarsi su se stesse a tal punto da dare origine a cellule allungate cosiddette “a sigaro”. Nel momento di massima corneificazione, le cellule superficiali superano il 90% nella cagna (la massima corneificazione viene raggiunta all’incirca 2 giorni dopo il picco degli estrogeni). L’assenza di nucleo nelle cellule superficiali, indice del processo degenerativo in atto, spiega l’appellativo di “cellule fantasma”; aspetto non costante in tutti gli strisci di cagne in estro. Nel quadro citologico non si evidenziano neutrofili e possono essere presenti eritrociti ma meno numerosi rispetto al proestro (Zambelli, 2010).
DIESTRO
Il diestro è la fase del ciclo estrale dominata dal progesterone, prodotto in notevole quantità dai corpi lutei.
A seconda che sia avvenuta o meno la fecondazione si individua un diestro gravidico, gravidanza (63-65 giorni) e un diestro non gravidico, pseudogravidanza (70-75 giorni) (Feldman et Al., 1977; Rijnberk, 1996). La lunghezza della fase luteinica del ciclo estrale nella cagna è correlata alla maggiore longevità del corpo luteo che, a differenza di altre specie (per esempio cavalla e bovina) non subisce una luteolisi acuta da parte delle prostaglandine (PGF2α), ma regredisce progressivamente.
Manifestazione clinica
La recettività alla monta da parte della femmina è assente in questo stadio del ciclo, scompaiono le variazioni comportamentali caratteristiche del calore. Nella cagna le modificazioni organiche riferibili all’estro si attenuano: le dimensioni della vulva si riducono e lo scolo vaginale in
genere è assente, anche se possono essere rinvenute perdite vulvari chiare nei primi giorni del diestro (Zambelli, 2010).
Etologia
L’atteggiamento diestrale della cagna è quello di rifiuto del maschio e compare nel 77% delle femmine nei 5 giorni seguenti al diestro citologico. Ho le medesime manifestazioni comportamentali sia nel soggetto gravido che in quello non gravido nei 60 giorni dopo l’ovulazione. I soggetti non gravidi, più remissivi e sensibili tendono a manifestare la “falsa gravidanza”: questo aspetto trova significato nella vita di branco dove solo le femmine dominanti si riproducono, mentre le altre femmine del gruppo si sincronizzano con quest’ultime allo scopo di adottare i loro cuccioli in caso di necessità.
Fisiologia-Endocrinologia
Il progesterone è l’ormone predominante in questa fase e promuove, nell’animale gravido o no, una serie di eventi che favoriscono il mantenimento di una gravidanza, come la produzione da parte delle ghiandole endometriali di metaboliti importanti per lo sviluppo dello zigote (il “Latte Uterino”), la prevenzione della contrattilità uterina, la chiusura della cervice e lo sviluppo delle mammelle.
Nella cagna ho concentrazioni massime di progesterone di 15-90 ng/ml circa 15-30 giorni dopo il picco di LH (Zambelli, 2010).
Nell’animale non gravido, raggiunto il picco di LH, il progesterone decresce progressivamente fino a concentrazioni basali di 1-2 ng/ml al termine del diestro non gravidico (75° giorno).
Nella cagna, poiché il progesterone viene prodotto unicamente dai corpi lutei e non dalla placenta, la situazione ormonale è la medesima sia che sia gravida oppure no, fino al 60° giorno dopo il picco di LH (P4=10 ng/ml), in
seguito al quale la discesa è più lenta nell’animale non gravido (Verstegen, 2004).
Sia la relaxina che la prolattina vengono prodotte a partire dal 20-30° giorno di gravidanza; la prima è di origine placentare, mentre la seconda centrale (ipofisi anteriore) (Feldman et Al., 1977; JeffCoate, 2004). L’azione luteotropa della relaxina si esprime in modo duplice, agendo, direttamente, sul corpo luteo e, indirettamente, stimolando la produzione di prolattina (JeffCoate, 2004). La relaxina, inoltre, coopera con il progesterone nel mantenere la quiescenza uterina (Feldman et Al., 1977). L’ormone principale ad azione luteotropa è comunque la prolattina, il cui incremento raggiunge valori massimi pochi giorni prima del termine della gravidanza, dando avvio alla produzione lattea. Il ruolo principe della prolattina nel sostegno del corpo luteo è confermato dal fatto che l’uso in gravidanza di farmaci antagonizzanti la produzione dell’ormone (bromocriptina o cabergolina) comportano la discesa del progesterone al di sotto del livello basale con conseguente aborto. La repentina caduta del progesterone è infatti il fattore che determina, a termine della gravidanza, l’innescarsi del parto. Ne deriva che l’utilizzo di farmaci antiprogestinici in corso di gravidanza provoca aborto (Zambelli, 2010).
I contemporanei calo del progesterone e aumento della prolattina al termine del diestro possono stimolare la lattazione anche in cagne non gravide. Questo segno clinico è quello osservabile con maggiore frequenza durante la condizione di “pseudogravidanza” o “falsa gravidanza”, più
evidente in certi soggetti piuttosto che in altri, ed associata alla tendenza di crearsi una cuccia, rintanarsi e mostrare anoressia.
Gli estrogeni e l’FSH sono a livello basale, mentre l’LH inizia a incrementare nella fase tardiva del diestro.
Nella cagna la lattazione non esercita effetto inibitorio sulla ripresa dell’attività ovarica, che si manifesta soltanto 3-5 mesi dopo lo svezzamento (Feldman, 1977).
Citologia
La citologia vaginale ci permette di individuare precisamente il momento di inizio del diestro. Il primo giorno di diestro (D1) si verifica un brusco cambiamento del quadro citologico: un crollo marcato (dal 20 al 50%) della quantità di cellule superficiali che lasciano il posto a cellule intermedie e parabasali, miste a neutrofili (figura 7). Conoscere il giorno D1 permette di prevedere la data del parto e di valutare se l’accoppiamento o l’inseminazione artificiale sono stati effettuati rispettando un’adeguata tempistica. Sapendo, infatti, che l’ovulazione avviene di norma 5-7 giorni prima del D1, possiamo verificare se la copertura della femmina è avvenuta nel momento di ottimale fertilità. È stato valutato che, se l’accoppiamento è avvenuto da 3 a 10 giorni prima del D1, il tasso di concepimento raggiunge il 95% (Andersen et Al., 1962). L’intervallo fra D1 e il parto è di 56-57 giorni.
Nei soggetti da poco entrati in fase diestrale, è possibile evidenziare eritrociti ed in questo caso la citologia è difficile da distinguere con quella proestrale. Il fattore che permette di distinguere fra proestro e
cheratinizzate che hanno fagocitato neutrofili, osservabili nel citoplasma, quelle schiumose appaiono cariche di vacuoli citoplasmatici, esito di un processo degenerativo in atto (Zambelli, 2010).
Figura 6. Citologia vaginale di cagna in estro. Si nota la predominanza di cellule dove non si evidenzia il nucleo
(cellule squamose anucleari) (Root Kustritz, 2012).
Figura 7. Citologia vaginale di cagna all’inizio del diestro. Si notano cellule epiteliali non cheratinizzate e la
ANESTRO
L’anestro è il periodo di quiescenza sessuale che si instaura al termine della stagione riproduttiva. Questa fase si protrae dal termine del diestro all’inizio del successivo proestro. Nella cagna gravida che ha partorito, l’anestro rappresenta l’intervallo fra il parto e il proestro, comprendente la lattazione e lo svezzamento dei cuccioli. In questa specie l’anestro ha durata di circa 4 mesi, con una certa variabilità fra razze (da un minimo di 7 settimane a un massimo di un anno o più (Andersen e Wooten, 1959).
Manifestazione clinica-Etologia
La femmina non esercita attrazione sessuale sul maschio e non è disponibile all’accoppiamento (non esprime sintomi di estro o attività ovarica). La vulva è piccola con assenza di scolo.
Fisiologia-Endocrinologia
L’assetto ormonale riflette lo stato di riposo sessuale tipico della fase anestrale: il progesterone, l’LH e gli estrogeni sono a livello basale per tutta la durata dell’anestro, mentre l’FSH presenta valori più elevati in questo stadio rispetto al proestro. In tardo anestro iniziano ad aumentare l’LH e gli estrogeni, questi ultimi un mese prima del picco di LH (Zambelli, 2010).
Citologia
Il quadro citologico presenta bassa cellularità ed è dominato dalle cellule parabasali e intermedie piccole. Si può osservare la presenza di leucociti e di numerosi detriti cellulari.
1.3 COME VALUTARE LE FASI DEL CICLO ESTRALE E
DETERMINARE IL PERIODO FERTILE
Nella cagna ho un ciclo estrale molto lungo e vista la lunga durata del periodo di recettività sessuale della cagna, la difficoltà a visualizzarne ecograficamente le ovaie, la progressiva luteinizzazione del follicolo preovulatorio e l’ovulazione non simultanea dei follicoli ovarici (Simpson et Al., 1998), individuare il momento esatto dell’ovulazione è difficile.
Diversi metodi possono però essere utilizzati per cercare di stimare il momento dell’ovulazione ed individuare quindi il momento ideale per l’accoppiamento; tra questi ricordiamo la citologia vaginale, l’ecografia, il dosaggio del progesterone e l’endoscopia vaginale (Jeffcoate, 1998; Root Kustritz, 2012).
1.3.1 CITOLOGIA VAGINALE
L’esame colpocitologico costituisce una delle indagini diagnostiche di più vasto impiego in ginecologia canina, ai fini della scelta del momento ottimale per l’accoppiamento; questo perché la mucosa vaginale è un organo bersaglio per gli estrogeni che inducono modificazioni dell’epitelio che può passare da 2-4 strati ad un epitelio pluristratificato. Il cambiamento in valore percentuale del numero di cellule superficiali cheratinizzate presenti in uno striscio vaginale può essere utilizzato per monitorare il progredire delle fasi proestrale ed estrale e per predire il momento più appropriato per l’accoppiamento.
Si consiglia solitamente di esaminare gli strisci a cominciare dal proestro, ogni 2 o 3 giorni.
Il riscontro di un quadro costituito per oltre l’80% da cellule di tipo superficiale (estro) ci autorizza ad intraprendere un primo tentativo di accoppiamento (Feldman and Nelson, 1998).
Tipologie di cellule epiteliali ritrovabili nel secreto vaginale canino
Cellule basali
Sono cellule piccole, rotondeggianti dalle quali derivano tutti i tipi di cellule dell’epitelio che si possono ritrovare nel secreto (Christie et al, 1972).
Queste cellule si trovano a livello dello strato basale della membrana e di solito non vanno incontro ad esfoliazione, quindi si osservano raramente in seguito a striscio vaginale (Roszel, 1977).
Cellule parabasali
Sono le cellule epiteliali più piccole osservabili nel secreto vaginale; sono di piccole dimensioni, il loro diametro oscilla tra i 10 e i 20 µm (Concannon e Digregorio, 1986).
La forma può variare da circolare ad ovalare; hanno nucleo centrale ben evidente.
Cellule intermedie
Cellule di varia grandezza, con diametro compreso tra i 20 e i 30 µm a margini irregolari od angolati (Olson, 1989), si presenta con rapporto nucleo/citoplasma a favore del secondo.
Cellule superficiali
denominazione è dovuta alla posizione superficiale che vanno ad occupare a livello dell’epitelio della mucosa vaginale al momento della massima stimolazione da parte degli estrogeni. I margini della membrana citoplasmatica sono irregolari ed angolari, con nucleo picnotico se non addirittura indistinguibile dal citoplasma circostante (Roszel, 1977; Post, 1985) e cheratinizzata.
Figura 8. a) cellule di cane
evidente (col. Harris-Shorr, 400x). b) cellula
dimensioni, di forma poligonale, senza nucleo e cheratinizzata (col. Harris
cheratinizzata: la cellula si presenta di grandi dimensioni, poligonale, con nucleo picnotico e cheratinizz
(col. Harris-Shorr, 400x). d) cellula
presenta di forma rotondo/ovale con rapporto nucleo/citoplasma a favore del secondo (col. Harris 400x) (Zambelli, 2010). e) cellul
Harris-Shorr, 400x). f) cellula
g
. a) cellule di cane parabasali: cellule di piccole dimensioni, di forma rotonda, con nucleo centrale ben Shorr, 400x). b) cellula superficiale cheratinizzata: la cellula si presenta di grandi dimensioni, di forma poligonale, senza nucleo e cheratinizzata (col. Harris-Shorr, 400x). c) cellula
: la cellula si presenta di grandi dimensioni, poligonale, con nucleo picnotico e cheratinizz Shorr, 400x). d) cellula intermedia piccola: la cellula, di dimensioni superiori alla parabasale, si presenta di forma rotondo/ovale con rapporto nucleo/citoplasma a favore del secondo (col. Harris 400x) (Zambelli, 2010). e) cellula intermedia grande: la cellula si presenta di forma lievemente poligonale (col.
Shorr, 400x). f) cellula metaestrale: la cellula intermedia presenta nel suo interno uno o più neutrofili : cellule di piccole dimensioni, di forma rotonda, con nucleo centrale ben : la cellula si presenta di grandi Shorr, 400x). c) cellula superficiale : la cellula si presenta di grandi dimensioni, poligonale, con nucleo picnotico e cheratinizzata : la cellula, di dimensioni superiori alla parabasale, si presenta di forma rotondo/ovale con rapporto nucleo/citoplasma a favore del secondo (col. Harris-Shorr, : la cellula si presenta di forma lievemente poligonale (col. : la cellula intermedia presenta nel suo interno uno o più neutrofili
Altre cellule ritrovabili nel secreto vaginale canino
Globuli rossi
Possono essere presenti nelle
o l’inizio del diestro. Durante il proestro la concentrazione sierica del 17 estradiolo aumenta con la maturazione del follicolo; questo aumento sembra essere responsabile della diapedesi delle emazie dal
livello uterino. Normalmente il numero di queste cellule è maggiore in cagne in fase proestrale rispetto a soggetti in estro o in diestro (Roszel, 1977).
Cellule della linea bianca
La popolazione più rappresentativa è costituita dai granulociti neutrofili, che si ritrovano numerosi in strisci ottenuti da cellule all’inizio della fase diestrale. Nel caso in cui queste cellule si ritrovino in cagne in estro bisogna prendere in consider
uterina (Roszel, 1977).
Figura 9. Citologia vaginale che mostra cellule intermedie (freccia curva) e due differenti intermedie
superficiali, una piccola (freccia chiusa) e una grande (freccia aperta) un reperto normale (Feldman and Nelson, 1996).
Altre cellule ritrovabili nel secreto vaginale canino
Possono essere presenti nelle secrezioni vaginali durante il proestro, l’estro o l’inizio del diestro. Durante il proestro la concentrazione sierica del 17 estradiolo aumenta con la maturazione del follicolo; questo aumento sembra essere responsabile della diapedesi delle emazie dal distretto capillare a livello uterino. Normalmente il numero di queste cellule è maggiore in cagne in fase proestrale rispetto a soggetti in estro o in diestro (Roszel, 1977).
Cellule della linea bianca
La popolazione più rappresentativa è costituita dai granulociti neutrofili, che si ritrovano numerosi in strisci ottenuti da cellule all’inizio della fase diestrale. Nel caso in cui queste cellule si ritrovino in cagne in estro bisogna prendere in considerazione l’ipotesi di una possibile infezione vaginale o
1977).
Citologia vaginale che mostra cellule intermedie (freccia curva) e due differenti intermedie superficiali, una piccola (freccia chiusa) e una grande (freccia aperta). i batteri nel contesto sono considerati un reperto normale (Feldman and Nelson, 1996).
secrezioni vaginali durante il proestro, l’estro o l’inizio del diestro. Durante il proestro la concentrazione sierica del 17-β-estradiolo aumenta con la maturazione del follicolo; questo aumento sembra
distretto capillare a livello uterino. Normalmente il numero di queste cellule è maggiore in cagne in fase proestrale rispetto a soggetti in estro o in diestro (Roszel, 1977).
La popolazione più rappresentativa è costituita dai granulociti neutrofili, che si ritrovano numerosi in strisci ottenuti da cellule all’inizio della fase diestrale. Nel caso in cui queste cellule si ritrovino in cagne in estro bisogna azione l’ipotesi di una possibile infezione vaginale o
Citologia vaginale che mostra cellule intermedie (freccia curva) e due differenti intermedie . i batteri nel contesto sono considerati
Cellule batteriche
Batteri vengono frequentemente ritrovati nelle secrezioni vaginali ottenute da cagne normali (Figura 9)
durante la fase proestrale rispetto a quanto si osserva in anestro, in gravidanza e durante il post
Metodica per ottenere, fissare e conservare le cellule vaginali
Le cellule esfoliate possono essere raccolte dalla vagina pr
utilizzando un tampone sterile. Per evitare di raccogliere cellule ad esempio dalla fossa clitoridea è bene inserire il tampone in vagina mantenendo una direzione dorso-craniale per poi portarsi orizzontalmente appena raggiunta la volta vaginale.
Le cellule raccolte vengono poi trasferite dal tampone su di un vetrino, facendocelo rotolare delicatamente per evitare di
stesse.
Figura 10. Come ottenere uno striscio vaginale con un tampone di cotone. A) estensione delle labbra vulvari
per l’inserimento del tampone. B) il tampone viene posto nella vulva, prima dell’inserzione con la vagina. C) il
Batteri vengono frequentemente ritrovati nelle secrezioni vaginali ottenute (Figura 9). Il loro numero aumenta in maniera notevol durante la fase proestrale rispetto a quanto si osserva in anestro, in gravidanza e durante il post-partum (Baba et Al., 1983).
Metodica per ottenere, fissare e conservare le cellule vaginali
Le cellule esfoliate possono essere raccolte dalla vagina propriamente detta utilizzando un tampone sterile. Per evitare di raccogliere cellule ad esempio dalla fossa clitoridea è bene inserire il tampone in vagina mantenendo una craniale per poi portarsi orizzontalmente appena raggiunta
Le cellule raccolte vengono poi trasferite dal tampone su di un vetrino, facendocelo rotolare delicatamente per evitare di danneggiare le cellule
. Come ottenere uno striscio vaginale con un tampone di cotone. A) estensione delle labbra vulvari per l’inserimento del tampone. B) il tampone viene posto nella vulva, prima dell’inserzione con la vagina. C) il
Batteri vengono frequentemente ritrovati nelle secrezioni vaginali ottenute . Il loro numero aumenta in maniera notevole durante la fase proestrale rispetto a quanto si osserva in anestro, in
Metodica per ottenere, fissare e conservare le cellule vaginali
opriamente detta utilizzando un tampone sterile. Per evitare di raccogliere cellule ad esempio dalla fossa clitoridea è bene inserire il tampone in vagina mantenendo una craniale per poi portarsi orizzontalmente appena raggiunta
Le cellule raccolte vengono poi trasferite dal tampone su di un vetrino, danneggiare le cellule
. Come ottenere uno striscio vaginale con un tampone di cotone. A) estensione delle labbra vulvari per l’inserimento del tampone. B) il tampone viene posto nella vulva, prima dell’inserzione con la vagina. C) il
Figura 11. Rappresentazione grafica dell’anatomia delle vagina e del vestibolo della cagna e dell’angolo
appropriato per introdurre il tampone nel vestibolo e nella porzione caudale della vagina, evitando la fossa clitoridea e raggiungendo la vagina craniale.
Figura 12. C e D: Veduta caudale della femmina da esaminare con dimostrazione del giusto angolo di
inserimento del tampone nel vestibolo e nella vagina. E: Subito dopo la raccolta il tampone vaginale viene fatto rotolare delicatamente su di un vetrino (Olson PN, Thrall MA et al: Vaginal citology. Part 1. A useful tool for staging the canine estrous cycle. Compend Contin Educ Pract Vet 6: 288-298, 1984).
Dopo questa operazione il veterinario ha a disposizione diversi tipi di colorazione tra i quali può scegliere. Il metodo più pratico, più rapido e più utilizzato prevede l’uso del colorante Diff-Quik; questo corrisponde ad un Wright-Giemsa modificato in grado di colorare efficacemente globuli rossi e cellule epiteliali (Jeffcoate, 1998).
Il vetrino, fatto asciugare all’aria e fissato in metanolo, deve essere successivamente immerso in due differenti coloranti e poi sciacquato delicatamente. Questi strisci si mantengono inalterati per parecchi
giorni, ma, nel caso si richieda conservazione protratta, sarà opportuno procedere a montaggio con balsamo e vetrino coprioggetto (Olson, 1989).
Altre colorazioni utilizzabili sono Wright-Giemsa e Nuovo Blu di metilene. Il colorante di Wright è composto da blu di metilene, trattato a caldo con bicarbonato di sodio, con l’aggiunta di eosina; il Giemsa consiste, invece, di una miscela di azzurro II ed eosina. Il Nuovo Blu di metilene è un colorante di pronto impiego, che richiede la deposizione di una goccia sul preparato e l’apposizione di un vetrino coprioggetto prima della lettura (Concannon et al, 1986).
Aspetto microscopico degli strisci
STADIO GLOBULI
ROSSI NEUTROFILI BATTERI CELLULE EPITELIALI
Proestro
iniziale Presenti Spesso Molti
Parabasali, intermedie, superficiali intermedie
Tardo
proestro Presenti
Qualcuno o
nessuno Molti Superficiali intermedie, superficiali
Estro ± Presenti ma < Nessuno Molti >80-90% superficiali
Diestro Qualcuno Molti Assenti Parabasali, intermedie, < le superficiali
Tabella 3. Stadi citologici del ciclo estrale (Feldman e Nelson, 1996).
Proestro
Le proporzioni tra i vari tipi cellulari variano nelle fasi del proestro, in particolare il numero delle emazie, che nelle fasi iniziali e finali può essere molto scarso. Nelle fasi iniziali predominano le cellule epiteliali nucleate, mentre negli stadi finali cala la percentuale di cellule parabasali e piccole intermedie e aumenta quella di cellule grandi intermedie e superficiali corneificate con nuclei picnotici. I neutrofili sono presenti nelle fasi iniziali del proestro e diventano progressivamente meno
numerosi man mano che ci si avvicina all’estro mentre i batteri possono essere presenti in numero abbondante (Feldman and Nelson, 1996).
Estro
Nel passaggio da proestro ad estro si assiste ad un notevole aumento di cellule superficiali; quando queste raggiungono e superano l’80% dei tipi cellulari presenti si parla di estro (Feldman e Nelson, 1998). Generalmente vi è totale assenza di leucociti e globuli rossi, sebbene talvolta possano persistere per tutta la durata dell’estro. Le cellule cheratinizzate sono le più rappresentate; verso la fine dell’estro vanno incontro a degenerazione assumendo un aspetto assottigliato. Sono frequentemente osservate numerose cellule batteriche. In assenza di neutrofili, la presenza di numerosi batteri durante l’estro può essere considerato un reperto normale (Feldman and Nelson, 1996).
Diestro
Vi è un repentino cambiamento dei tipi cellulari presenti: ricompaiono le cellule epiteliali parabasali ed intermedie e compaiono numerosi polimorfonucleati (PMN), soprattutto nelle prime settimane. Le emazie possono essere presenti nei primi giorni per tendere poi a scomparire.
Anestro
Vi è una diminuzione dei polimorfonucleati che, comunque, possono restare sporadicamente presenti. Il numero delle cellule è comunque generalmente scarso.
Figura 13. Colpocitologico di cagna nel corso del ciclo estrale (col. Harris
numerose cellule intermedie grandi e piccole, alcuni granulociti. b) grandi e superficiali cheratinizzate e non, globuli rossi. c)
globuli rossi. d) fine estro: cellule superficiali cheratinizzate raccolte in ammassi, presenza di detriti. e)
diestro: cellule intermedie grandi e piccole, cellula metaestrale, granulociti neutrofili e
detriti (Zambelli, 2010).
f
. Colpocitologico di cagna nel corso del ciclo estrale (col. Harris-Shorr, 200x). a)
numerose cellule intermedie grandi e piccole, alcuni granulociti. b) proestro: numerose cellule intermedie grandi e superficiali cheratinizzate e non, globuli rossi. c) estro: cellule superficiali cheratinizzate e alcuni
: cellule superficiali cheratinizzate raccolte in ammassi, presenza di detriti. e) : cellule intermedie grandi e piccole, cellula metaestrale, granulociti neutrofili e
horr, 200x). a) inizio proestro: : numerose cellule intermedie : cellule superficiali cheratinizzate e alcuni : cellule superficiali cheratinizzate raccolte in ammassi, presenza di detriti. e) inizio : cellule intermedie grandi e piccole, cellula metaestrale, granulociti neutrofili e presenza di molti
1.3.2 ECOGRAFIA DELLE OVAIE
Nella cagna i follicoli ovarici possono essere osservati con l’ecografia trans-addominale, effettuata da un operatore con molta esperienza e ben equipaggiato.
Le ovaie normali sono localizzate caudalmente e leggermente lateralmente al polo caudale del rene corrispondente. La loro localizzazione può essere facilitata dalla rilevazione dell’artefatto del cono d’ombra del contorno di ogni ovaia (figura 14).
Figura 14: Immagine sagittale dell’ovaia, si evidenza l’artefatto del cono d’ombra (Davidson and Baker, 2009).
L’aspetto delle ovaie varia con le fasi del ciclo estrale. Durante l’anestro appaiono da piccole ovali a forma di fagiolo con una ecogenicità omogenea, simile alla corteccia renale (figura 14). La corticale e la midollare di solito sono indifferenziate nella cagna. Durante la follicolo-genesi nel parenchima ovarico si evidenziano più strutture simil cistiche anecogene o ipoecogene; strutture cistiche con parete spessa si osservano durante la fase luteinica (figura 15 e 16) (Davidson and Baker, 2009).
Figura 15: Fase follicolare del ciclo ovarico: follicoli ipoecogeni con parete sottile (freccia) (Davidson and
Baker, 2009).
Figura 16: Fase luteinica del ciclo ovarico, ovaia sinistra; il corpo luteo quando è maturo ha una parete spessa
ed all’interno ha liquido ipoecogeno (Davidson and Baker, 2009).
L’ovulazione non è facilmente definita dai cambiamenti ultrasonografici, poiché i follicoli non collassano nello stesso momento dell’ovulazione e il corpo luteo spesso ha un centro cistico (England et Russo, 2008).
Per riuscire ad evidenziare il momento dell’ovulazione occorrono più valutazioni ovariche, 3 volte al giorno, in modo da mettere bene in evidenza i cambiamenti che avvengono. Durante il proestro le strutture simil cistiche anecogene si ingrandiscono sino a raggiungere un diametro maggiore di 1 cm, la parete diventa spessa ed all’interno è presente fluido anecogeno. La superficie dell’ovaia diventa irregolare e con protuberanze.
Figura 17: Immagine sagittale di un’ovaia (cursori) che ha subito recentemente l’ovulazione. I corpi emorragici
sono isoecogeni rispetto al parenchima ovarico comparandoli con i follicoli (Davidson and Baker, 2009).
Figura 18: ovaia sinistra dopo l’ovulazione, i corpi lutei sono presenti per 45-60 giorni e tendono ad avere una
Il follicolo con il fluido anecogeno diventa prima isoecogeno e poi corpo emorragico iperecogeno al momento dell’ovulazione (figura 17) e, progressivamente dopo qualche giorno, corpo luteo ipoecogeno (figura 18). I follicoli ovarici non collassano nella cagna. Durante il diestro l’ovaia sembra lobata, i corpi lutei sono strutture ipoecogene di dimensione variabile (Davidson and Baker, 2009).
Questa tecnica non è comunemente usata nella pratica clinica per determinare gli stadi del ciclo nella cagna (Root Kustritz, 2012).
1.3.3 DOSAGGIO DEL PROGESTERONE EMATICO
Il momento esatto dell’ovulazione può essere stimato con la concentrazione ematica di progesterone (P4). Il cane è infatti l’unica tra
le specie domestiche in cui la concentrazione ematica di progesterone inizia ad aumentare 2-3 giorni prima dell’ovulazione.
Durante l’anestro e per buona parte del proestro il progesterone ematico è presente in quantità inferiore a 1 ng/ml; questo valore aumenta in maniera rapida subito prima e durante il picco di LH e continua ad aumentare per tutta la durata dell’estro (Concannon, 1983; Concannon et al, 1989; Jeffcoate, 1998). Questo aumento può essere identificato attraverso un monitoraggio in serie che consente di anticipare l’ovulazione, confermarla e stabilire l’inizio del periodo di fertilizzazione. Poiché l’aumento iniziale del progesterone è progressivo, è necessario prelevare campioni ematici solo ogni due o tre giorni, e non quotidianamente come per l’identificazione del picco di LH. La concentrazione di P4 raddoppia ogni due giorni circa così che, se aumenta
In generale la concentrazione di progesterone al momento del picco di LH sarebbe intorno a 2.0 ng/ml e al momento dell’ovulazione tra 4 e 10 ng/ml (Manothaiudom et al, 1995; Johnston and Root, 1995). Si può considerare il momento fertile quello che ha valori di progesterone fra 10 e 25 ng/ml (England and Von Heimendahl, 2013).
TASSO EMATICO DI
PROGESTERONE (ng/ml) MOMENTO DEL CICLO ESTRALE
< 1 Anestro – Proestro
Da 1 a 1,9 - 3 gg dall’ovulazione
Da 2 a 2,9 - 2 gg dall’ovulazione
Da 3 a 3,9 - 1 g dall’ovulazione
Da 4 a 10 Ovulazione
> 10 con striscio cheratinizzato + 1 / + 5 gg dall’ovulazione (momento migliore per monta naturale/inseminazione artificiale)
> 10 con striscio non cheratinizzato Diestro
Tabella 4: Variazione del tasso ematico di progesterone nella cagna rispetto al momento del ciclo, e in
particolare, al momento dell’ovulazione (da Johnston SD e Root, 1995).
Riuscendo, quindi, a dosare questo ormone possiamo individuare il momento migliore per l’accoppiamento (MN) o per la fecondazione artificiale (IA) che, generalmente, coincide con il secondo e quarto giorno dopo l’ovulazione.
La concentrazione di progesterone può essere indicata sia in ng/ml che in nmol/l, considerando che 1 ng/ml = 3,17 nmol/l (England and Von Heimendahl, 2013).
La concentrazione sierica di progesterone può essere misurata con diversi metodi:
− metodo di immunoassorbimento enzimatico, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) quantitativo o qualitativo;
− metodo di immunochemioluminescenza, CLIA (Chemioluminescence Assay);
− metodo con spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida, LC/MS/MS (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry);
− metodo di dosaggio enzimatico associato a fluorescenza, ELFA (Enzyme-linked Fluorescence Assay);
− metodo di dosaggio immuno-enzimatico a fluorescenza, FEIA (Fluorescence Enzyme Immuno Assay).
Queste tecniche possono dare risultati leggermente differenti (Jeffcoate, 1998; RootKustritz, 2012).
Il metodo ELISA può essere di tipo semi-quantitativo o quantitativo.
L’ELISA semi-quantitativo è un metodo che si può utilizzare anche in ambulatorio. Sono disponibili in commercio numerosi KIT ELISA che danno risultati in 30-45 min dal prelievo del campione. Ad esempio OVULATION TESTTM (Bio Veto Test, France) (figura 19) è un test ELISA semi-quantitativo rapido su membrana a lettura visiva per determinare il tasso di P4 nel plasma o nel siero di cagna. Si basa sulla
corrispondenza di una gradazione di colori ad un intervallo di concentrazione di P4. Uno dei problemi dei test in clinica è la “finestra”
definita dalla risultante modificazione di colore, valutato in maniera soggettiva dall’operatore (figura 20). Quando P4 ematico supera i 10
ng/ml, il test interpreta il risultato come “accoppiare immediatamente” (e così permane per i successivi 2 mesi del ciclo estrale della cagna).
Figura 19: Fotografia del Kit ambulatoriale OVulation Test™, Virbac (eseguita presso l’Ambulatorio
Veterinario Dott. Biondi)
COLORE Concentrazione di P4
corrispondente Raccomandazioni C1 Blu
Chiaro
Da 0 a 1 ng/ml Livello basale di P4
Effettuare un nuovo test ogni 48 h fino ad ottenere un risultato C2 (blu chiaro)
C2 Azzurro
Da 1 a 2,5 ng/ml Il tasso di P4 ha iniziato ad aumentare
Effettuare un nuovo test ogni 24 h fino ad ottenere un risultato C3 (blu pallido)
C3 Celeste
Da 2,5 a 8 ng/ml Inizio maturazione degli oociti
Far accoppiare o inseminare con sperma fresco dopo 1 e 3 gg, con sperma congelato inseminare dopo 1, 3 e 5 gg
C4 Bianco
8 ng/ml Far accoppiare o inseminare immediatamente
Attenzione il periodo fertile può volgere al termine
Tabella 5: interpretazione dei risultati dell’OVULATION TESTTM.
Il test ELISA da effettuare in clinica fornisce risultati rilevanti solo effettuandolo almeno una volta prima dell’ovulazione e correlando i risultati dei test successivi a quelli pre-ovulazione. Se il primo test conferma che l’ovulazione è già avvenuta, si devono utilizzare altri metodi (come la citologia vaginale) per assicurarsi che la cagna non sia già in metaestro (England and Von Heimendahl, 2013). È un metodo meno accurato rispetto a RIA e CLIA, infatti è riportato in letteratura che ELISA è inaccurata all’85% e 89% rispettivamente, con errori più comuni a causa di valutazioni basse rispetto alle alte (Moxon et Al., 2010; Manothaiudom et Al., 1995).
Il metodo ELISA quantitativo fornisce dei valori più precisi: infatti quando confrontato con il RIA, ELISA quantitativo ha una forte correlazione positiva (r = 0,97, P <0,05) e una sensibilità e specificità del 70,6% e 100,0%, rispettivamente, e valori predittivi positivi e negativi del 100,0% e il 71,0%, rispettivamente, con una precisione complessiva del 90,0% (Moxon et Al., 2010).
Assay Validated for P4 in dogs Clinical studies in dogs
Quantitative ELISA e.g. Ververdis et al 2002
Maxon et al 2010
e.g. Ververdis et al 2002 Seki et al 2010
Semi-quantitative ELISA e.g. Luchetti et al 2005
Maxon et al 2010
CLIA (Amerlite®, Immulite® Elecsys 2010®….) e.g. Forsberg et al 1993 Kutzler et al 2003 e.g. Kutzler et al 2003 Chapwanya et al 2008 Levy et al 2009 Mir et al, 2011
ELFA (MiniVidas®) Brugger et al 2011
e.g. Brugger et al 2011 Grellet et al 2012 Krachudel et al 2013
Polisca et al 2013
FEIA (AIA-360®) Monino et al 2012 Rota et al 2014
Tabella 6: Validazione dei metodi e studi clinici sul dosaggio sierico del progesterone nel cane.
Il metodo radioimmuno-enzimatico (RIA) è considerata la tecnica “gold standard” per la quantificazione del progesterone, ma oggigiorno la sua sostituzione con altre tecniche analitiche è correlata alla necessità di evitare l’impatto negativo dell’uso dei rischiosi materiali radioattivi, la restrizione dell’utilizzo di laboratori autorizzati, il problema dello smaltimento dei rifiuti tossici e anche l’alto costo dei componenti (Hannon et Al., 2004; Chapwanya et Al., 2008). Così come nei laboratori umani, RIA è stato sostituito da metodi alternativi, rappresentati soprattutto dall’immunochemioluminescenza CLIA, dal metodo con spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida, LC/MS/MS (Tai et Al., 2006), dal dosaggio enzimatico associato a fluorescenza ELFA (Brugger et Al., 2011), dal metodo immuno-enzimatico a fluorescenza FEIA (Monino et Al., 2012; Rota et Al., 2014).
RIA e CLIA sono dosaggi quantitativi, che applicano i laboratori di analisi. In uno studio sono stati confrontati i due metodi e la concentrazione di progesterone con metodo CLIA risulta più alta di 0.69 ng/mL dalla media,
confrontata con metodo RIA, ma la differenza fra i due metodi non risultava significativa (Chapwanya et Al., 2008).
Il metodo ELFA, effettuato con MiniVidas System, è stato comparato con RIA in uno studio per validare il dosaggio del progesterone nel cane. I risultati dimostrano che il MiniVidas System fornisce un fidato metodo per determinare la concentrazione di progesterone dal sangue di cagna. La comparazione dei risultati ottenuti con MiniVidas con quelli del RIA, validato per il cane, dimostrano che MiniVidas misura veramente P4 nel
cane, e, sebbene i valori ottenuti con MiniVidas risultino più alti di quelli ottenuti con metodo RIA, la differenza fra i due metodi non è significativa (Brugger et Al., 2011).
In un altro studio è stato confrontato il dosaggio serico del progesterone ottenuto con metodo FEIA a quello ottenuto con CLIA. Nella comparazione dei due test, i risultati confermano un alto livello di concordanza fra FEIA e CLIA (r2=0.978). La sovrapposizione dei risultati della concentrazione di progesterone sierico ottenuta con i due metodi, indica che sono tecniche intercambiabili sulla determinazione ormonale e portano alla stessa decisione clinica (Monino et Al., 2012).
Attualmente il gold standard per il dosaggio di molte molecole, comprese gli steroidi, è la spettrometria di massa. La concordanza tra LC/MS/MS e FEIA è statisticamente significativa (r2=95.7%), come dimostra uno studio recente (Rota et Al., 2014).
1.3.4 ENDOSCOPIA VAGINALE
Sappiamo bene che la mucosa vaginale, in quanto organo bersaglio degli ormoni della riproduzione, riflette i cambiamenti del loro livello ematico man mano che il ciclo estrale progredisce. L’osservazione di questi cambiamenti tramite endoscopia può rappresentare un metodo rapido ma utile a determinare il momento dell’ovulazione (Jeffcoate e Lindsay, 1989; Goodman 2001).
Durante il proestro la mucosa appare decisamente edematosa e convoluta, in concomitanza con l’aumento del tasso estrogenico. Il lume vaginale è difficile da ispezionare e la superficie mucosale è liscia e lucida (Lindsay, 1983). Ho arrossamento e una marcata convessità-rotondità delle pieghe vaginali (Jeffcoate, 2004).
Con l’avvicinarsi della fase estrale, che coincide con un calo del tasso di estrogeni e un aumento del progesterone ematico, l’edema della mucosa tende a diminuire così come l’iperemia. Le pareti della vagina presentano pliche per la perdita di fluidi non accompagnata dalla retrazione repentina del tessuto vaginale, che rimane stirato. La mucosa mostra progressivamente sempre più pieghe e le pareti vaginali tendono a diminuire di spessore, a causa della diminuzione dell’edema. Questi segni sono massimi durante il periodo fertile, 4-7 giorni dopo il picco di LH (Lindsay, 1983).
Durante il diestro la mucosa appare appiattita e pallida. Dal momento che gli strati epiteliali protettivi tendono a diminuire, la mucosa diviene più friabile; frequentemente si possono osservare placche ed emorragie superficiali (Lindsay, 1983).
Figura 21: Immagini all’endoscopio della mucosa vaginale nelle fasi chiave del suo sviluppo durante il ciclo della
cagna (a) Proestro (b) Inizio dell’estro (c) Metà dell’estro (d) Inizio diestro (e) Diestro. (Lindsay FEF In Manual of Small Animal Reproduction and Neonatology, 1998).
1.4 GRAVIDANZA NELLA CAGNA
La cagna ovula da 3 a 15 oociti per ciclo ovarico, con una media di 7; le femmine di piccola taglia ovulano pochi oociti, mentre è più facile che quelle di taglia grande si avvicinino a 15.
Caratteristica della specie canina è che l’ovulazione non corrisponde al momento di massima fertilità: perché gli oociti siano fertilizzabili occorrono 48 ore aggiuntive. Gli oociti non fertilizzati, invece, degenerano a partire dal 6°gg postovulazione (Majolino, 2002; Feldman N., 1996; Johnston et al., 2001). Gli oociti primari rimangono per alcune ore all’interno della borsa ovarica e successivamente attraversano le tube uterine. La fertilizzazione degli oociti, a opera degli spermatozoi, può avvenire, presumibilmente, dal 2° al 5° giorno dall’ovulazione (Feldman, 1996; Johnston et al., 2001).
Gli embrioni, sotto forma di morule, si trovano nel segmento distale degli ovidotti da 6 a 8 giorni dopo l’ovulazione; il loro passaggio nelle corna uterine è permesso dall’apertura della giunzione tubo-uterina all’incirca 8 giorni dopo l’ovulazione, ovvero da 4 a 6 giorni dopo la fertilizzazione, e
