LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS
MILDA DIRMEIKYTĖ
ATSPARUMO ANTIAGREGANTAMS GENETIKA: ASPIRINAS,
KLOPIDOGRELIS, TIKAGRELORAS, PRASUGRELIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Vacis Tatarūnas
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS
TVIRTINU
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis (parašas) Data (metai, mėnuo, diena)
ATSPARUMO ANTIAGREGANTAMS GENETIKA: ASPIRINAS,
KLOPIDOGRELIS, TIKAGRELORAS, PRASUGRELIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Vacis Tatarūnas, parašas Data (metai, mėnuo, diena)
Recenzentas Darbą atliko
Vardas, pavardė, parašas Magistrantė
Milda Dirmeikytė, parašas Data (metai, mėnuo, diena) Data (metai, mėnuo, diena)
3
TURINYS
Turinys ... 3 Santrumpos ... 6 Santrauka ... 8 Summary ... 9 Padėka ... 10 Įvadas ... 11 1.Literatūros apžvalga ... 13 1.1.Aterosklerozė ir trombozė ... 13 1.2.Antiagregantai ir jų farmakogenetika ... 14 1.2.1.Klopidogrelis ... 14 1.2.2.Tikagreloras ... 15 1.2.3.Prasugrelis ... 17 1.2.4.Aspirinas.. ... 191.3.Darbe naudotos geno tyrimo metodikos apžvalga ... 20
1.3.1.DNR polimorfizmo nustatymas: DNR išskyrimas ... 21
1.3.2.DNR kokybinis nustatymas ... 21
1.3.3.DNR koncentracijos nustatymas ... 22
1.3.4.DNR polimorfizmo nustatymas: polimerazės grandininė reakcija ... 22
1.3.5.Geno polimorfizmo tyrimo metodai ... 24
2.Tyrimo metodika ... 27
2.1.Duomenų rinkimas apie tiriamuosius ligonius ... 27
2.2.DNR ekstrakcija ... 28
2.3.Koncentracijos nustatymas su nanodropo spektrofotometru ... 31
2.4.Kokybinė analizė gel-elektroforezės metodu ... 31
2.5.DNR polimorfizmo nustatymas: polimerazės grandininė reakcija ... 32
2.6.Statistinė analizė ... 34
4
3.1.Tiriamųjų, kuriems buvo atliktas plėtiklio implantavimas, imtis ... 35
3.2.CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipų dažnis tirtoje imtyje ... 35
3.3.CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipų įtaka trombocitų agregacijai ligoniams, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas ... 35
3.3.1.CYP2C19*2 genotipo įtaka trombocitų agregacijai ... 35
3.3.2.CYP4F2 G1347A genotipo įtaka trombocitų agregacijai ... 36
3.4.CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipų ir greta vartojamų vaistų įtaka trombocitų agregacijai ligoniams, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas ... 36
3.4.1.CYP2C19*2 genotipo ir vaistų įtaka ADF sužadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui ... 36
3.4.2.CYP2C19*2 genotipo ir vaistų įtaka ADR sužadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui ... 38
3.4.3.CYP2C19*2 genotipo ir vaistų įtaka arachidono rūgštimi sužadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui ... 38
3.4.4.CYP4F2 G1347A genotipo ir vaistų įtaka ADF sužadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui ... 38
3.4.5.CYP4F2 G1347A genotipo ir vaistų įtaka ADR sužadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir po 1 mėnesio ... 39
3.4.6.CYP4F2 G1347A genotipo ir vaistų įtaka arachidono rūgšties sužadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui ... 40
3.5.Ligonių, gydytų po širdies vainikinių kraujagyslių plėtiklio implantavimo ir po aortos vainikinių jungčių operacijos, genotipų dažnis ... 40
3.5.1.Vyriškos lyties ligonių, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas ir atlikta aortos vainikinių jungčių suformavimo operacija trombocitų agregacijos rodikliai ir genotipų skirtumai ... 41
3.5.2.Ligonių, turinčių CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipus, tikimybė plėtiklio implantavimui ar aortos vainikinių jungčių operacijai ... 43
4.Rezultatų aptarimas ... 43
5.Išvados... ... 45
Literatūros sąrašas ... 46
5
Magistrinio baigiamojo darbo tema paruoštas straipsnis ... 54 Priedai ... 55
6
SANTRUMPOS
A – adeninas
ADF – adenozindifosfatas
ADP – adenozindiphosphate (angl., adenozindifosfatas) ADR – adrenalinas (epinefrinas)
AIC – Akaike informacijos kriterijus
AKFI – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai Arach. r. – arachidono rūgštis
AVJO – aortos vainikinių jungčių operacija BLB – branduolių lizės buferis
C - citozinas
CABG – coronary artery bypass grafting (angl., aortos vainikinių jungčių operacija) CD – cukrinis diabetas
COX-1 – ciklooksigenazė 1 DNR – deoksiribonukleorūgštis ELB – eritrocitų lizės buferis G – guaninas
HLA (angl.) – žmogaus leukocitų antigenas KA – krūtinės angina
KKB – kalcio kanalų blokatoriai KMI – kūno masės indeksas
oMTL – oksiduotos formos mažo tankio lipoproteinai PA – platelet aggregation (angl., trombocitų agregacija)
7 PGR – polimerazės grandininė reakcija
PI – plėtiklio implantavimas
RFIP – restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmas SI – stent implantation (angl., plėtiklio įdėjimas) ŠKL – širdies kraujagyslių ligos
T – timinas
TA – trombocitų agregacija
TBE – trys boro EDTA (etildiamino tetra acto rūgštis) TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija
Tmax – laikas, per kurį pasiekiama aukščiausia vaisto koncentracija plazmoje TXA2 – tromboksanas A2
8
SANTRAUKA
M. Dirmeikytės magistro baigiamasis darbas „Atsparumo antiagregantams genetika: aspirinas, klopidogrelis, tikagreloras, prasugrelis―/ mokslinis vadovas dr. Vacis Tatarūnas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto kardiologijos institutas. – Kaunas.
Pagrindinė darbo problema – antiagregantų poveikis ne visada būna toks kokio tikimasi ir tai priklauso nuo žmogaus genų. Tam, kad būtų parinktas kuo veiksmingesnis gydymas, yra svarbu ištirti kurie genai įtakoja vaistų poveikį.
Tyrimo tikslas - remiantis trombocitų agregacijos rodikliais, klinikiniais ir genetiniais duomenimis, įvertinti priežastis, sukeliančias antiagregantų atsparumą, ligoniams, kuriems atliekamos plėtiklio implantavimo į vainikinę arteriją arba aortos vainikinių jungčių suformavimo operacijos. Norint pasiekti tikslą, buvo iškelti šie uždaviniai: įvertinti klinikinių veiksnių įtaką TA rodikliams ligoniams, kuriems atliktas PI, įsotinimo ir ilgalaikio gydymo antiagregantais metu, įvertinti genotipo įtaką ir genotipo bei vaistų įtaką TA rodikliams; palyginti genotipo dažnį tarp vyriškos lyties ligonių, kuriems atliktas PI su tais, kuriems atlikta AVJO.
Metodai: CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipų polimorfizmui nustatyti buvo naudojamas tikro laiko PGR metodas. Kategoriniai kintamieji palyginti naudojant Fišerio testą. Hardy-Weinberg analizė parodė tiriamųjų genotipų atitikimą normaliai populiacijai. Statistiškai reikšmingu laikytas dydis p<0,05.
Tyrimo kontingentas: atsitiktinės atrankos būdu į tyrimą įtraukti 94 ligoniai po PI ir 58 ligoniai po AVJO.
Rezultatai: Agregacijos induktoriais ADF ir ADR sužadinta TA buvo žemesnė tiems pacientams, kuriems buvo atliktas plėtiklio implantavimas, palyginus su pacientais, kuriems buvo atliktos AVJO. CYP2C19 GG ar CYP4F2 GG ar AG genotipus turintiems ligoniams aukštesnės TA reikšmės sužadinus ADF nustatytos ilgalaikio gydymo metu, palyginus su TA rodikliais įsotinimo metu. Vyriškos lyties ligoniams, kuriems atlikta AVJO CYP4F2 G1347A AA genotipas buvo 4,5 karto dažnesnis, palyginti su imtimi ligonių, kuriems implantuotas plėtiklis.
Išvados: Ligoniams, kuriems implantuotas plėtiklis, nustatyti žemesni TA rodikliai, nei ligoniams, kuriems atlikta AVJO. Ilgalaikio gydymo metu ligoniams, kuriems implantuotas plėtiklis, TA rodikliai buvo aukštesni tuomet, jei jie vartojo klopidogrelį, bet ne tikagrelorą. CYP4F2 G1347A genotipas gali būti susijęs su aterosklerozę provokuojančiu mechanizmu, nes AVJO ligonių imtyje AA variantas nustatytas 4,5 karto dažniau, nei ligonių, kuriems implantuotas plėtiklis imtyje.
9
SUMMARY
Master‗s thsesis of ― Genetic resistance for antiplatelet drugs: aspirin, clopidogrel, ticagrelor, prasugrel‖ written by Dirmeikytė M./ Scientific director dr. Tatarūnas V.; Institute of Cardiology of Lithuanian University of Health Sciences. – Kaunas.
The main problem of this work – the expected antiplatelet effect is not always achieved and it depends on the patients` genotype. In order to achieve the required therapeutic effect, the genes, affecting the therapeutic effect of these drugs should be performed
The aim of this study was to estimate the factors, impacting the resistance to antiplatelet therapy in patients following stent implantation (SI) or in patients after coronary artery bypass grafting (CABG) by using platelet aggregation, clinical and genetic data. Main tasks: to estimate the influence of clinical factors on the platelet aggregation (PA) during induction and long-term treatment in patients following SI, also, to find the impact of genotype and concomitant use of drugs on PA values in these patients; to find the distribution of genotypes in the patients who followed antiplatelet therapy after CABG or SI.
Methods: Real-Time PCR was used to determine the CYP2C19*2 and CYP4F2 G1347A genotypes. Fisher exact test was used to compare categorical variables. Hardy Weinberg method was used to show the concordance of analyzed patients genotypes to a normal population genotype distribution. A p value <0,05 was considered as statistically significant.
Study participants: 94 patients who followed SI and 58 patients who followed CABG, were randomly selected.
Results: PA after ADP and ADR treatment was lower in patients after SI by comparing to the patients after CABG. Patients, having CYP2C19 GG or CYP4F2 GG and AG genotypes, also had higher PA after ADP values during long–term treatment by comparing to patients during induction period. The CYP4F2 G1347A AA was 4.5 times more prevalent in CABG mans patient group, than in SI patients.
Conclusions: Patients, who followed SI, also had lower PA, by comparing to the patients, who followed CABG. During long–term treatment patients who followed SI, users clopidogrel, had higher PA, in comparing to ticagrelor users. CYP4F2 G1347A genotype AA variant might be associated with elevated risk of atherosclerosis: it was 4.5 times more prevalent in the patients who followed CABG than comparing to the SI patients.
10
PADĖKA
Noriu padėkoti savo magistrinio darbo vadovui dr.Vaciui Tatarūnui už kantrybę ir pagalbą rengiant magistrinį darbą. Taip pat, dėkoju dideliam kolektyvui, kuris padėjo renkant informaciją apie ligonius, atliekant statistinius skaičiavimus ar kaip kitaip pagelbėjus man rūpimais klausimais. Taigi, noriu padėkoti Meilutei Makštutienei, Viliui Skipskiui, Ingridai Grabauskytei, Audronei Veikutienei, Rūtai Šereivienei, Zitai Stanionienei ir Juozui Kapturauskui.
11
ĮVADAS
Širdies ir kraujagyslių ligos (ŠKL), tokios kaip miokardo infarktas (MI), insultas, krūtinės angina (KA), yra plačiai paplitusios šiuolaikinėje visuomenėje. Šios ligos yra aterosklerozės ar trombozės pasekmės [1-3]. Vystantis aterosklerozei, dėl vykstančių sudėtingų uždegiminių procesų kraujagyslės sienelėje, formuojasi aterosklerotinė plokštelė. Bėgant laikui, ji didėja ir susiaurina kraujagyslės spindį, kuriuo teka kraujas. Organai yra blogiau aprūpinami deguonimi, vystosi organų hipoksija. Aterosklerotinė plokštelė gali plyšti. Jei tai įvyksta vainikinėje arterijoje vystosi nestabili krūtinės angina ir miokardo infarktas dėl pažeidimo vietoje ant atidengto endotelio susidariusio trombo. Svarbų vaidmenį trombo susidarymo metu atlieka trombocitai ir fibrinogenas, kurie ir suformuoja fibrino krešulį. Nuo trombocitų ir fibrinogeno aktyvumo ir priklauso kraujo krešėjimo sistemos elgesys, esant padidėjusioms uždegimo ir trombozės sąlygoms [3]. Priešingu atveju, jei plokštelė neplyšta, bet reikšmingai stabdo kraujo tėkmę - pasireiškia stabili krūtinės angina [4]. Siekiant atstatyti kraujo tėkmę dėl kraujagyslių spindžio susiaurėjimo ar visiškos okliuzijos, yra taikomas specifinis gydymas. Priklausomai nuo aterosklerozės proceso išreikštumo, pažeistų vainikinių arterijų skaičiaus, trombozės ir kitų veiksnių, yra implantuojamas širdies vainikinių kraujagyslių plėtiklis arba gali būti atliekama aortos vainikinių jungčių suformavimo operacija (AVJO).
Abiem atvejais tam, kad būtų išvengta pakartotinos trombozės, implantavus plėtiklį arba atlikus AVJO, skiriami antiagregantai, kurie slopina trombocitų funkciją ir neleidžia susidaryti fibrino krešuliui. Klinikinėje praktikoje įprasta šiuos vaistus skirti derinyje: aspirinas ir tikagreloras arba klopidogrelis ir aspirinas [5-10]. Kaip pirmo pasirinkimo vaistas tarp trombocitų ADP receptorių inhibitorių šiuo metu skiriamas naujos kartos antiagregantas tikagreloras. Rečiau - klopidogrelis su aspirinu [11]. Neretai šie vaistai veikia ne taip, kaip to iš jų tikimąsi - yra įrodyta, kad antiagregantų veikimas priklauso nuo žmogaus genuose užkoduotos informacijos bei aplinkos įtakos [12]. Yra duomenų, jog aspirino poveikį gali įtakoti PEAR1, P2RY1, P2RY12 ir kiti genai, o tienopiridinų (klopidogrelio, tikagreloro, prasugrelio) antiagregantinis poveikis priklauso nuo CYP2C19, ABCB1, PON1 ir kitų genų. Genai koduoja tam tikrų kepenų fermentų išsiskyrimą, kurie lemia greitesnį ar lėtesnį vaisto metabolizmą ir poveikį [13]. Taigi, pagrindinė problema yra ta, kad vaistų norimas poveikis ne visada būna toks kokio norėtumėme ir tai priklauso nuo žmogaus genų. Todėl labai svarbu ištirti kurie genai įtakoja vaistų poveikį tam, kad būtų galima parinkti kuo veiksmingesnį gydymą.
12
Darbo tikslas – remiantis trombocitų agregacijos rodikliais, klinikiniais ir genetiniais duomenimis, įvertinti priežastis sukeliančias antiagregantų atsparumą, ligoniams, kuriems atliekamos plėtiklio implantavimo arba aortos vainikinių jungčių suformavimo operacijos.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti klinikinių veiksnių įtaką trombocitų agregacijos rodikliams ligoniams, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas įsotinimo antiagregantu ir ilgalaikio gydymo metu.
2. Įvertinti genotipo įtaką trombocitų agregacijos rodikliams įsotinimo antiagregantu ir ilgalaikio gydymo metu ligoniams, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas.
3. Įvertinti genotipo ir vaistų įtaką trombocitų agregacijos rodikliams įsotinimo antiagregantu ir ilgalaikio gydymo metu ligoniams, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas.
4. Palyginti genotipo dažnį vyriškos lyties ligoniams, tarp plėtiklio implantavimo ir aortos vainikinių jungčių suformavimo operacijos, imčių.
5. Įvertinti klinikinių ir genetinių veiksnių įtaką trombocitų agregacijai vyriškos lyties ligoniams, kuriems atlikta AVJO ir palyginti su TA rodikliais ligonių, kuriems implantuotas plėtiklis.
13
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Aterosklerozė ir trombozė
Aterosklerozė yra uždegiminė būklė, kuriai būdingas gausus aterosklerotinių plokštelių aktyvavimas. Toms plokštelėms plyšus yra sukeliamos širdies ligos. Aterosklerotinių plokštelių pagrindinė sudedamoji dalis yra oksiduotos formos mažo tankio lipoproteinai (oMTL), kurie ir turi uždegimą sukeliantį poveikį, todėl oMTL gamyba yra pagrindinis veiksnys skatinantis aterosklerozę. oMTL yra ir trombocitus aktyvinantis faktorius, kuris taip pat sukelia imuninį stimuliuojamą efektą [14].
Trombozė – tai krešulio arba kitaip trombo susidarymas kraujagyslėje. Šio krešulio susidarymo mechanizmas gana sudėtingas. Mechanizme dalyvauja visi krešėjimo faktoriai. Svarbu tai, kad Xa faktorius komplekse su Va faktoriumi ant endotelio ląstelių ar trombocitų paviršiaus protrombiną (II faktorių) greitai verčia į trombiną (IIa faktorių). Trombinas ne tik aktyvuoja krešėjimo faktorius VIII, V, XI, trombocitus, bet tuo pačiu metu inicijuoja ir fibrinogeno proteolizę, t.y. fibrinolizės procesą. Be to, trombinas yra labai svarbus trombocitų aktyvintojas. Jis aktyvina trombocitų adhezijos ir agregacijos procesus, ekspresuoja receptorius, kurie kartu su endotelio ląstelių receptoriais, fokusuoja koaguliacinį procesą ir lokalizuoja fibrino susidarymą pažeidimo vietoje [3].
Širdies vainikinių arterijų aterosklerozės ir trombozės sukeltos ligos gydomos atliekant aortos vainikinių jungčių suformavimo operaciją (AVJO) ar įdedant širdies vainikinės kraujagyslės plėtiklį (stentą). AVJO tai tokia operacija, kai užsikimšta kraujagyslė apeinama užblokuojant dalį vainikinės kraujagyslės su kitu kraujagyslės gabalėliu. Jungčių suformavimui gali būti naudojamos venos gabalėliai, paimtos iš kojos, arba vidinė krūtinės arterija. Vienas paimtos kraujagyslės galas jungiamas virš stenozės, o kitas pritvirtinamas žemiau kraujagyslės susiaurėjimo vietos. Tokiu būdu kraujo tėkmė apeina užsikimštą kraujagyslės vietą ir pasiekia širdį. Stento įdėjimas – tai tokia procedūra, kai kraujagyslės stenozę išplėtus įvedamas plėtiklis tam tikru kateteriu į atvertą kraujagyslės vietą. Išsiplėtęs stentas prispaudžia riebalinį audinį prie arterijos sienelių ir leidžia toliau tekėti kraujui [9,10].
Yra duomenų, kad aterosklerozės ir trombozės išsivystymas priklauso ir nuo genetinių veiksnių. Aterosklerozė priklauso nuo LDLR, APOB, APOA1 ir kitų genų, o trombozė nuo APCR ar FVII genų [15,16].
14
1.2. Antiagregantai ir jų farmakogenetika
1.2.1. Klopidogrelis1 pav. Klopidogrelio cheminė struktūra
Veikimo mechanizmas:
Klopidogrelis yra trombocitų ADP receptorių antagonistas. Jis negrįžtamai slopina trombocitų funkciją. Pats klopidogrelis yra neaktyvus pirmtakas, todėl kepenyse yra konvertuojamas į aktyvų tiolio metabolitą. Šią biotransformaciją kepenyse atlieka fermento citochromo P450 izoformos: CYP2C19, CYP2B6, CYP3A4, CYP3A5. Aktyvus tiolio metabolitas kovalentiškai jungiasi prie trombocitų membraninių P2Y12 receptorių. Kadangi P2Y12 receptoriai yra užblokuojami, nėra trombocitų atsako į ADP. Viso to rezultatas – trombocitų funkcijos slopinimas. Šis poveikis trunka nuo 7 iki 10 dienų, tai yra, tiek kiek trunka trombocitų gyvavimo laikas [17,18].
Farmakologiniai aspektai:
Klopidogrelis per os greitai absorbuojamas, tačiau jo metabolizmas yra lėtas. Visų pirma klopidogrelis transformuojamas į 2 – oksoklopidogrelį, kuris veikiamas karboksilesterazės – 1 yra verčiamas į neaktyvų junginį ( apie 50%), o kita dalis verčiama į aktyvų metabolitą. Taigi, susidaręs neaktyvus junginys riboja aktyvaus metabolito kiekį ir poveikį trombocitų receptoriams [19].
Standartinė klopidogrelio dozė yra 75 mg. Didesnės dozės, kaip 300 mg ar 600 mg, geriau slopina trombocitų agregaciją. 600 mg klopidogrelis didžiausią koncentraciją plazmoje pasiekia per 2 val., o maksimalus trombocitų slopinimas pasireiškia po 4 – 6 val. Pusinis eliminacijos laikas yra 6 val., o aktyvaus metabolito pusinis eliminacijos laikas – 8 val. Vaistas šalinamas su šlapimu ir tulžimi [20].
15 Farmakogenetika:
Klopidogrelio antiagregacinis poveikis priklauso nuo CYP2C19 genotipo. Literatūros šaltiniais, ligonius, turinčius *2 alelio variantą (t.y. CYP2C19 *1*2 heterozigotas), klopidogrelis veikia silpniau negu turinčius *1*1 alelį (kitaip dar vadinamus laukinio tipo homozigotais). Ligoniams, turintiems laukinio tipo *1 alelį, gydymui klopidogreliu užtenka 75mg palaikomosios dozės, o turintiems *2 alelio variantą patariama dozes didinti iki 300mg ar 600mg, nes šis alelis slopina vaisto metabolizmą. Tokiu poveikiu pasižymi ir *3 alelis. Tačiau, ligoniams, turintiems CYP2C19*4, *5, *6, *7, *8 ir kitus alelius, gydymas klopidogreliu nėra tinkamas, nes vaisto metabolizmas visiškai slopinamas, todėl net padidinus dozę iki 600mg ar daugiau gydomasis poveikis nebus pasiektas. Tokiu atveju, patariama klopidogrelį pakeisti prasugreliu arba tikagreloru [17,21-24].
Be to, įdomu tai, jeigu ligonis turi *17 alelį, tai klopidogrelio metabolizmas bus visiškai skirtingas nuo anksčiau minėtų alelių. Lyginant su laukinio tipo *1 aleliu, vaisto metabolizmas bus greitesnis ir ligoniams gali grėsti nukraujavimas [25,26].
1.2.2. Tikagreloras
2 pav. Tikagreloro cheminė struktūra
Tikagreloras – tai ciklopentiltriazolo pirimidinas, kuris tiesiogiai ir grįžtamai jungiasi prie P2Y12 receptorių. Vaistas užblokuoja endogeninio adenozindifosfato (ADP) prisijungimą prie trombocitų membranose esančių receptorių. Vienas iš jo pirmtakų yra kangreloras, kurio poveikis į P2Y12 receptorius stipresnis, tačiau klinikinėje praktikoje buvo sunkiai pritaikomas dėl vaisto struktūroje esančios trifosfatinės grupės, kuri sąlygojo labai trumpą pusinės eliminacijos laiką (3 paveikslas) [27,28].
16
3 pav. Kangrelorio cheminė struktūra
Kangreloras prisidėjo prie tikagreloro molekulės sukūrimo. Kangrelorio struktūroje įterpus puriną su triazolopirimidino heterociklu, gautas tikagreloras. Skirtingai, nei kangreloras, tikagreloras pasižymėjo metaboliniu stabilumu [29,30].
Veikimo mechanizmas:
Kaip jau minėta, tikagreloras grįžtamai blokuoja trombocitų P2Y12 receptorius ir slopina jų funkciją. Vaisto nereikia metaboliškai aktyvuoti (4 paveikslas) [31].
4 pav. Tikagreloro veikimo mechanizmas [32]
(Deepak L. Bhatt) ADP P2Y12receptorius Aktyvus junginys jungiasi grįžtamai Nėra in vivo biotransformacijos Trombocitas Trombocitų veiklos inhibavimas G baltymas Greita absorbcija žarnyne po vartojimo per os Tikagreloras
17 Farmakologiniai aspektai:
Tikagreloras vartojamas per os ir yra greitai absorbuojamas. Tmax 1,3 – 2 val., pusinis eliminacijos laikas 7 – 12 val.. Metabolizuojamas iki aktyvaus metabolito AR – C124910XX. Metabolizme dalyvauja fermentas CYP3A4 [27,33]. Šis vaistas ir jo aktyvusis metabolitas 99,8% jungiasi su plazmos baltymais [34,35], bioprieinamumas apie 36% [36]. Tikagreloro ir AR – C124910XX eliminacija vyksta pro kepenis ir tulžį [33].
Tikagreloras vartojamas du kartus dienoje po 90 mg, paros dozė 180 mg. Lyginant tikagreloro poveikį su klopidogreliu, tikagreloras yra efektyvesnis ir veiksmingesnis, nei vienkartinė 600 mg klopidogrelio dozė ar 75 mg dozė. Taip pat, šis vaistas sukelia mažiau nepageidaujamų poveikių [37-39].
Santos PC su kolegomis atliko tyrimą, kuriame buvo lyginamas tikagreloro ir prasugrelio efektyvumas trombocitų agregacijai. Buvo nustatyta, jog šių vaistų poveikis labai panašus ir beveik nesiskiria [40].
Farmakogenetika:
Įvairių šaltinių duomenimis, nė vienas iš CYP2C19 koduojančio alelių (* 2 * 3 * 4, * 5,* 6, * 7 * 8 ir * 17 ) neturėjo įtakos tikagreloro efektyvumui ir trombozės rizikai ar nukraujavimui [13,21].
1.2.3. Prasugrelis
5 pav. Prasugrelio cheminė struktūra
Prasugrelis kaip ir klopidogrelis bei tikagreloras yra tienopiridinų darinys. Jis slopina trombocitų agregaciją negrįžtamai jungdamasis su juose esančiais P2Y12 receptoriais [41,42].
Metabolizmas:
Šis vaistas metabolizuojamas į aktyvų metabolitą kepenyse citochromo P450 super šeimos fermentų [41-43] (6 paveikslas).
18
6 pav. Prasugrelio ir klopidogrelio metabolizmo schema [41] (Katsunobu Hagihara, Miho Kazui ir kiti)
Prasugrelio poveikis pasireiškia greičiau, nes jo metabolinis kelias yra trumpesnis nei klopidogrelio (6 paveikslas). Prasugrelis veikiamas esterazių verčiamas į neaktyvų metabolitą, o po to citochromo P450 fermentų į aktyvųjį metabolitą (R – 138727). Klopidogrelis turi du metabolinius kelius. Pirmasis yra vaisto virtimas į neaktyvųjį rūgšties metabolitą esterio hidrolizės metu veikiant kepenų karboksilesterazei [41,44]. Antrasis – virtimas į aktyvųjį metabolitą. Iš schemos matyti, kad iš pradžių klopidogrelis kaip ir prasugrelis paverčiamas neaktyviu metabolitu, o po to aktyviu. Metabolizme dalyvauja šie kepenų fermentai: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4. CYP1A2, CYP2B6 ir CYP2C19 klopidogrelį verčia į neaktyvųjį metabolitą, o CYP2B6, CYP2C19, CYP2C9 ir CYP3A4 – į aktyvųjį. Prasugrelio metabolizme dalyvauja tokie patys fermentai kaip ir klopidogrelio, išskyrus CYP1A2 [45-48]. Todėl jei ligoniui reikia didelių klopidogrelio dozių reikiamam efektui pasiekti, vertinant šiuos metabolinius kelius ir greitesnį prasugrelio veiksmingumą, racionalu skirti prasugrelį [49].
Farmakologiniai aspektai:
Po vaisto absorbcijos didžiausia prasugrelio koncentracija plazmoje pasiekiama per 30 min., o pusinis eliminacijos laikas yra 7 val. [50]. Po įsotinamosios dozės maksimalus trombocitų agregacijos slopinimas ( 75 – 85%) pasiekiamas po 2 – 4 val. [51]. Rekomenduojama prasugrelio įsotinimo dozė yra 60 mg, o dienos dozė 10 mg. Pacientams, kurių svoris yra mažesnis nei 60 kg, kurie vyresni nei 75 metų amžiaus, persirgę insultu ar trumpalaikiu išeminiu priepuoliu, prasugrelio dozė turi būti sumažinama iki 5 mg per dieną, kad būtų išvengtas mirtino nukraujavimo pavojus arba turėtų būti skiriami kiti antiagregantai [52,53].
Klopidogrelio tiolaktono rūgšties metabolitas Klopidogrelio rūgšties metabolitas
Klopodogrelio aktyvusis metabolitas Klopidogrelio tiolaktono metabolitas
Klopidogrelis
Prasugrelio aktyvus metabolitas Prasugrelio tiolaktono metabolitas
e sterazė Prasugrelis
19 Farmakogenetika:
Kaip jau minėta anksčiau, klopidogrelio poveikis priklauso nuo CYP2C19 geno polimorfizmo, tačiau prasugrelio poveikiui šis genas jokios įtakos neturi. Todėl, pacientams, kurie turi CYP2C19*2 alelį yra racionalu skirti ne klopidogrelį, o prasugrelį [54-57].
1.2.4. Aspirinas
7 pav. Aspirino cheminė struktūra
Aspirinas yra vienas iš dažniausiai vartojamų antiagregantų išeminėms būklėms gydyti. Jungtinėse Amerikos Valstijose šį vaistą, širdies kraujagyslių ligų profilaktikai, reguliariai vartoja apie 36% piliečių [58].
Veikimo mechanizmas:
Acetilsalicilo rūgštis negrįžtamai slopina ciklooksigenazę – 1 (COX–1), kuri arachidono rūgštį verčia į prostaglandiną H2. Šis prostaglandinas skatina tromboksano A2 susidarymą, kuris jungiasi prie TXA2 receptorių ir sukelia krešėjimo procesus. TXA2 sintezė yra trombocitų atsakas į tokius dirgiklius kaip kolagenas, trombinas ir adenozindifosfatas. Taigi, aspirinas blokuodamas COX-1 susidarymą, sutrikdo trombocitų agregaciją [59-61].
Farmakologiniai aspektai:
Antiagregaciniam efektui pasiekti vartojama 100 mg aspirino dozės. Išgėrus vaisto per os, jis greitai absorbuojamas iš skrandžio ir dvylikapirštės žarnos. Iš skrandžio acetilsalicilo rūgštis absorbuojama pasyviosios difuzijos būdu, nes skrandyje pH yra rūgštinis, o vaisto hidrolizė minimali. Vaisto bioprieinamumas apie 50%. Aukščiausia koncentracija plazmoje pasiekiama maždaug po 1 val., o pusinis eliminacijos laikas apie 20 min. Acetilsalicilo rūgštis plazmoje ir endotelyje esterazių hidrolizuojama į salicilo rūgštį. Be to, apie 50% absorbuoto vaisto yra konjuguojama kepenyse pirmo metabolinio kelio metu [61-63].
20
Nors aspirinas ir apsaugo nuo padidėjusio kraujo krešėjimo ir miokardo infarkto, insulto, tačiau jis turi ir pašalinį poveikį žmogaus organizmui. Šis vaistas gali sukelti kraujavimus ir didina hemoraginio insulto tikimybę [64,65].
Farmakogenetika:
Literatūros šaltinių duomenimis aspirino poveikiui įtakos turi genų polimorfizmas. Svarbus genas PEAR1 (rs12041331). PEAR1 rs12041331 AA ir GA genotipai susiję su mažesniu aspirino poveikiu. rs12041331 AA alelis lyginant su GG homozigotiniu variantu, didina tikimybę susirgti ŠKL. Taigi PEAR1 (rs12041331) mažina aspirino poveikį [66,67].
Timur su bendraautoriais išsiaiškino, kad P2RY1 ir P2RY12 polimorfizmas susijęs su aspirino poveikiu ir trombocitų aktyvumu pacientams, kurie serga ŠKL. Labai dideliu aktyvumu pasižymi P2RY12 vieno nukleotido polimorfizmu rs9859538, vidutiniu - P2RY12 vieno nukleotido polimorfizmu, rs1491974, rs10513398, rs3732765 ir rs10935841, o mažu - rs7615865, rs1388623, rs1388622, rs7634096 ir rs7637803. P2RY1 vieno nukleotido polimorfizmas, rs1439010, rs1371097, rs701265, rs12497578 ir rs2312265 yra susijęs su tromboksano B2 stimuliavimu [68]. Tačiau, Goodman su bendraautoriais savo darbe pažymi, jog P2Y1 ar P2Y12, COX-1 genų polimorfizmas nesusijęs su aspirino poveikiu. Šie autoriai parodo, jog PlA1/A2 variantas yra reikšmingas norint sumažinti ŠKL [69].
Aspirino nepageidaujamas poveikis – kraujavimas, yra susijęs su tam tikrais genais žmogaus organizme. Shiotani ir bendraautorių atlikto tyrimo su CYP4F11 ir CYP2D6 rezultatai parodė, jog šie genai didina kraujavimo riziką. Su kraujavimu labiausiai susiję yra CYP2D6 (rs28360521) GG ir CYP4F11 (rs1060463) GG [70].
1.3. Darbe naudotos geno tyrimo metodikos apţvalga
DNR (deoksiribonukleorūgštis) – tai molekulė, kuri saugo daugumos genų informaciją naudojamą organizmų vystymuisi, funkcionavimui ir dauginimuisi. DNR molekulė sudaryta iš dviejų gijų ir primena dvigubos spiralės formą. DNR gija sudaryta iš nukleotidų. Kiekvienas nukleotidas sudarytas iš heterociklinių bazių: citozino (C), guanino (G), timino (T), adenino (A), kurios tarpusavyje jungiasi komplementariai: A su T, C su G. Heterociklinės bazės tarpusavyje susijungusios vandeniliniais ryšiais (A su T – dvi vandenilinės jungtis, C su G – trys). Be heterociklinių bazių į nukleotido cheminę struktūrą įeina ir deoksiribozė bei fosfatinė grupė [71].
21
Polimorfizmas – tai sąvoka, kuri apibūdina įvairių organizmų tam tikrų formų variacijas ir padeda atskirti vienas organizmų rūšis nuo kitų. Genetikai naudoja sąvoką genetinis polimorfizmas, kuris apibūdina savitą DNR seką. Ši seka kiekvieno žmogaus genomą padaro unikaliu [72].
1.3.1. DNR polimorfizmo nustatymas: DNR išskyrimas
DNR ekstrakcija – tai procesas, kurio metu DNR yra išskiriama iš kraujo ar kitų audinių. Tik išskyrus DNR galima nustatyti jos polimorfizmą. DNR ekstrakcija atliekama šiais etapais:
1. Ląstelių suardymas naudojant fizikinius ir cheminius metodus – maišymą, malimą, ultragarsą.
2. Lipidų pašalinimas iš membranų pridedant detergentų ar surfaktantų, kurie atlieka ląstelių lizę.
3. Baltymų pašalinimas pridedant proteazių. 4. RNR pašalinimas pridedant RNazių.
5. DNR išvalymas nuo detergentų, baltymų, druskų ir reagentų, naudotų ląstelės lizei sudaryti [73].
1.3.2. DNR kokybinis nustatymas
Norint sužinoti ar po DNR ekstrakcijos mėginyje nėra pašalinių medžiagų, yra atliekamas kokybinis nustatymas. Šis nustatymas atliekamas gel-elektroforezės tyrimu.
Gel-elektroforezė – tai toks atskyrimo ir makromolekulių (DNR, RNR ar baltymų) bei jų fragmentų tyrimo metodas, kuris paremtas dalelių dydžiu ir krūviu [77].
Nustatant DNR kokybę šiuo metodu visų pirma pagaminamas agarozės gelis, kuris dedamas į vonelę, pripildytą buferio (8 paveikslas). Į agarozės gelio šulinėlius įterpiami pavyzdžiai, kurie prieš tai sumaišomi su tam tikru dažu (etidžio bromidu). Tuomet vonelė uždengiama ir įjungiamas maitinimo blokas. Kuomet dažai pasiekia tam tikrą ribą arba gelio pabaigą, tuomet elektros energijos šaltinis išjungiamas. Po elektroforezės agarozės gelis atsargiai išimamas iš vonelės ir dedamas į UV šviestuvą, kuriame gelis vizualizuojamas ir nufotografuojamas [78].
22
8 pav. Vonelė pripildyta buferiu [78] (Thermo Fisher Scientific)
DNR kokybės nustatymui be elektroforezės agarozės gelyje gali būti taikomi ir kitokie metodai, tokie kaip spektrofotometrija, masių spektrometrija, PGR, fluorescencija ir kita [82-84].
1.3.3. DNR koncentracijos nustatymas
Po DNR kokybinės analizės yra atliekamas DNR koncentracijos nustatymas. DNR koncentracija reikalinga nustatyti tam, kad sužinotumėme apie DNR grynumą, kuris svarbus DNR polimorfizmo nustatyme. Kuo grynesnė DNR, tuo geriau vyks polimerazės grandininė reakcija. Taigi nuo DNR koncentracijos priklauso polimerazės grandininės reakcijos kokybė.
Norint nustatyti DNR koncentraciją naudojamas NanoDrop 1000 spektrofotometras. Jis tiksliai matuoja DNR pavyzdžius 3700µg/µl be skiedimo. Koncentracijos nustatymui pavyzdžio imama 1µl. Absorbcijai matuoti naudojamos 260 nm ir 280 nm bangos ilgiai (matavimo kelias 10 mm). Išmatuojamas santykis tarp jų (260/280), pagal kurį galima spręsti apie DNR grynumą. 1,8 santykis rodo, kad DNR yra gryna. Jei šis santykis yra mažesnis, tuomet pavyzdyje yra baltymų, fenolių ar kitų medžiagų, kurios absorbuojamos prie 280 nm bangos ilgio. 260/230 yra kitas santykis, kuris taip pat rodo DNR grynumą ir jis gali būti didesnis – nuo 1,8 iki 2,2. Koncentracijos tyrimui spektras nustatomas 340 nm bangos ilgiui, kuris yra arti nulinės absorbcijos [76].
1.3.4. DNR polimorfizmo nustatymas: polimerazės grandininė reakcija
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) atliekama tam, kad pagausinti reikiamą geno fragmentą tiek kartų, kad jį galima būtų nustatyti arba vizualizuoti.
Po DNR išskyrimo yra atliekamas genotipavimas, naudojant polimerazės grandininės reakcijos (PGR) tyrimą. Atliekant PGR tyrimą reikiamas DNR fragmentas pagausinamas tiek kartų
Agarozės gelio šulinėlis
Makromolekulių judėjimo kryptis
23
kiek reikia tyrimui atlikti. PGR atlikti naudojami specifiniai oligonukleotidai, DNR polimerazė, buferiniai tirpalai, mononukleotidai. Gausinimo ciklą sudaro trys stadijos (9 paveikslas):
1. Denatūracija. Terminė DNR mėginio denatūracija pakeliant temperatūrą reakcijos mėgintuvėlyje iki 95οC. Jos metu DNR išsivynioja ir atsiskiria. Aktyvuojama polimerazė.
2. Renatūracija. Temperatūra pažeminama iki 50 - 60οC. Pradmuo (oligonukleotidas) pagal komplementariškumo principą prisijungia prie DNR.
3. Sintezė. Temperatūra pakeliama iki optimalios temperatūros DNR polimerazei (72οC) [75].
9pav. PGR schema
Kiekvieno etapo metu vyksta skirtingi procesai. Pavyzdžiui, denatūracijos metu tam, kad DNR gijos išsivyniotų ir atsiskirtų, aktyvuotųsi DNR polimerazė, optimaliausia temperatūra yra 95οC. Antrosios stadijos (renatūracijos) metu, kad pradmuo galėtų jungtis prie DNR optimaliausia temperatūra yra nuo 50 iki 60οC. Tam, kad trečiosios stadijos metu tinkamai veiktų DNR polimerazė, temperatūra jau turi būti pakeliama iki 72οC. Pasibaigus sintezės etapui, ciklas yra kartojamas.
DNR sintezė yra inicijuojama kiekvieno pradmens 3´-OH gale [75].
PGR procesas pagal produkto gausėjimą mišinyje yra skirstomas į tris stadijas: eksponentinę, linijinę ir plato (10 paveikslas).
24
10 pav. Įprastinės PGR fazės [81]
(Real-Time PCR Vs. Traditional PCR. Applied Biosystems)
Eksponentinės fazės metu produkto gausėja tiksliai du kartus kas ciklą. Reakcija labai specifinė ir tiksli. Besibaigiant reagentams, išeikvojami reakcijos komponentai ir reakcija ima lėtėti – linijinė fazė. Plato fazė – tai reakcijos pabaiga. Šios fazės metu reakcija sustoja ir daugiau produktų nebegaminama [81].
1.3.5. Geno polimorfizmo tyrimo metodai
Restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo (RFIP angl. RFLP) metodas
Restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo (RFIP) metodas pagrįstas gel-elektroforezės būdu frakcionuoto PGR produkto vizualizavimu UV šviesos pagalba. Šis polimorfizmo metodas parodo skirtumus tarp homologinių DNR sekų, kurios gali būti aptiktos skirtingų ilgių fragmentų po DNR pavyzdžių įgijimo su specifinėmis restrikcijos endonukleazėmis (11 paveikslas).
Log [D NR] Eksponentinė Linijinė Kintamas kiekis C iklas Plato
25
11 pav. RFIP metodas [87]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrflp/
RFIP, kaip molekulės žymuo, yra specifinis kiekvienam klonui ar restrikcijos fermento kombinacijai. Dauguma RFIP žymenų yra bendrai dominuojantys ir labai specifiniai. DNR atskyrimo RFIP zondas, žymintis DNR seką, hibridizuojasi su vienu ar daugiau fragmentų (sukarpyto DNR pavyzdžio). Taigi, kaip RFIP zondai, dažniausiai naudojami vienos ar mažos DNR genomo kopijos. RFIP zondai dažnai naudojami genomų žemėlapiams ir variacijų analizėms, tokiom kaip tėvystės testai, paveldimų ligų diagnostikai ir kita. Po gel-elektroforezės gauti rezultatai vizualizuojami UV šviesos pagalba ir analizuojami skirtumai tarp homologinių DNR sekų [87].
Sekoskaita
Sekoskaita (sekvenavimas) – tai nukleotidų sekos DNR molekulėje nustatymas [79]. Yra išskiriamos Sanger ir naujos kartos sekoskaitos.
Sangerio sekoskaitos metodas laikomas „Auksiniu standartu―. Šis metodas turi savų privalumų ir trūkumų. Privalumas yra tai, kad metodas gana greitas ir palyginti paprastas, tačiau, jis gali būti naudojamas tik vienai susuktai DNR gijai (12 paveikslas) [80].
Įprastas Liga Gel elektroforezė Įprastas Liga Mst1 ribojama vieta Zondo sritis Mutacija sunaikina vieną ribojamą vietą
26
12 pav. Sangerio sekoskaita [80] (Korkut Ulucan)
Sangerio sekoskaitoje DNR polimerazė naudojama tam, kad būtų iššifruota tam tikra DNR sritis. Pagaminamos įvairaus ilgio DNR molekulės. Tuomet DNR molekulės modeliai susintezuojami, o tam, kad būtų nustatyta DNR seka naudojama gel-elektroforezė [80].
Naujos kartos sekoskaita produktyvesnė už Sangerio sekoskaitą. Taip pat, naujos kartos sekoskaita yra greitesnė, pasižymimi dideliu pralaidumu ir yra tikslesnė. Ši sekoskaita yra pranašesnė už Sangerio dėl automatizuotos įrangos, kuri žymiai palengvina darbą [74,80,86].
Tikro laiko PGR
Be tradicinės PGR galima išskirti ir tikro laiko PGR. Tikro laiko PGR atliekamas kaip ir tradicinis PGR, tačiau turi ir skirtumų (13 paveikslas).
27
13 pav. Tikro laiko PGR reakcijos pagrindinė linija ir slenkstis [75] (Applied biosystems, life technologies. Real-time PCR handbook)
Tikro laiko PGR gausinimui stebėti naudojama fluorescencija. Šis metodas tūri platų pritaikymą: gali būti naudojamas kiekybiniam genų nustatymui, kokybės kontrolei ir tyrimų validacijai, patogenų aptikimui, genotipavimui, kopijų kiekio variacijoms, virusų kiekiui. Be to, įprastinis PGR turi daugiau trūkumų: prastas tikslumas, mažas jautrumas, žema rezoliucija, neautomatizuota, rezultatai neišreiškiami skaičiais. Tikro laiko PGR turi didesnį dinaminį aptikimo diapazoną, aptikimo riba keičiasi iki dviejų kartų, augimo fazė yra eksponentiška [75,81].
Eksperimentinė dalis
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Duomenų rinkimas apie tiriamuosius ligonius
Atsitiktiniu būdu pasirinkti 94 ligoniai, kuriems buvo atliktas plėtiklio implantavimas ir 58 ligoniai, kuriems atlikta AVJO. Surenkami duomenys apie tiriamų ligonių amžių, svorį, lytį, apimtį, ūgį, KMI, vartojamus vaistus, ADF, ADR ar arachidono rūgštimi sužadintą trombocitų agregaciją.
Slenkstis
Pagrindinė linija
28
2.2. DNR ekstrakcija
Bandinio paėmimas
DNR ektrakcijai atlikti buvo naudojamas kraujas iš periferinės venos. Kraujas tyrimams imamas su konservantu EDTA ar Natrio citratu. Paimtas kraujas (3ml) iki tyrimo laikomas kambario temperatūroje 24 val., +4οC temperatūroje iki 1 sav.
Naudojami reagentai buvo pritaikyti molekuliniams tyrimams (sterilūs, be DNRazės ir RNRazės)
Natrio chloridas
Chloroformas (trichlormetanas)
96% etanolis
70% etanolis
Sterilus distiliuotas vanduo
Amonio chloridas
Natrio vandenilio karbonatas
Tris HCl
EDTA
SDS (Lauryl sulfatas)
Natrio šarmas Techninės priemonės
Centrifuga (iki 3500 aps/min.)
Plastikinės pipetės
Plastikiniai mėgintuvėliai su dangteliu, 12ml
Polipropileninis chloroformui atsparus mėgintuvėlis, 12ml
Traukos spinta
Eppendorf tipo mėgintuvėlis, 1,5 – 2ml
53οC termostatas Tirpalų paruošimas 1. Eritrocitų lizės buferis:
29
b) Pasveriama 0,84g NaHCO3 ir supilama į tą patį butelį. c) Pripilama distiliuoto vandens iki 1 l ir išmaišoma.
d) Tirpalas neautoklavuojamas! Tirpalas laikomas kambario temperatūroje. 2. Branduolių lizės buferis:
a) 10ml 1M TrisHCl + ~500ml distiliuoto vandens.
b) Į gautą tirpalą įpilame 80ml 5M NaCl ir 4ml 0,5M EDTA.
c) Pasveriama ir suberiama 100g SDS (Lauryl sulfato). SDS sveriamas dėvint kaukę, kad dulkės nepatektų į kvėpavimo takus.
d) Į gautą tirpalą pilame distiliuoto vandens iki 1 litro.
e) Maišoma, kol visos sudėtinės dalys ištirps ir tirpalas pasidarys skaidrus; kad lengviau ištirptų galime jį įdėti į 37οC termostatą.
Tirpalui ilgiau pastovėjus kambario temperatūroje, vėl gali iškristi nuosėdos, kurios ištirpsta, tirpalą sušildžius iki 37οC.
1M TrisHCl paruošimas: 15,76g TrisHCl/ 100ml sterilaus distiliuoto vandens; tirpalas titruojamas su NaOH iki pH-8,1.
Tris rūgšties pH matuojamas popierine juostele.
5M NaCl paruošimas: 146,1g NaCl/500ml sterilaus distiliuoto vandens.
0,5M EDTA: 18,61g EDTA/100ml distiliuoto vandens; kad lengviau ištirptų, galima pridėti 20g natrio šarmo (NaOH); tirpalo pH turi būti 7,5-8,0.
3. 6M natrio chlorido tirpalas
a) pasveriama 175,5g natrio chlorido (NaCl) ir suberiama į graduotą indą. b) pripilama distiliuoto vandens iki 500ml.
c) tirpalas laikomas kambario temperatūroje. Tirpalas persotintas natrio chloridu, todėl nuosėdos visiškai neištirpsta.
DNR išskyrimas iš kraujo: darbo eiga
1. Centrifuguojamas kraujas 1300g (2500 aps/min. Eppendorf 5810 centrifugoje) 10 min. Pipete nusiurbiama plazma (kad liktų nesudrumstas ląstelių sluoksnis). Po to, pipetė įkišama į mėgintuvėlio dugną, išsiurbiama kiek galima daugiau eritrocitų.
2. Iki mėgintuvėlio viršaus užpilama eritrocitų lizės buferio (ELB). Laikoma 10 min. (galima ant maišytuvo).
30
4. Nupilamas turinys taip, kad liktų tik dugne nusėdusios ląstelės, pipete stengiamasi nusiurbti raudoną sluoksnį, kad liktų tik baltos ląstelės.
5. Vėl užpilama eritrocitų lizės buferio, sumaišoma ir laikoma 10 min. (galima ant maišytuvo).
6. Centrifuguojama 1800g (3000 aps/min.) 10 min.
7. Nupilamas turinys ir nusiurbiama pipete taip, kad dugne liktų tik baltų ląstelių sluoksnis. Jei dar liko nemažai eritrocitų, lizavimą galima dar kartą pakartoti.
8. Pagal baltų ląstelių sluoksnio storį užpilama 5-10ml BLB (branduolių lizės buferio) ir supilama į chloroformui atsparų mėgintuvėlį. Mėgintuvėlis įdedamas į -30οC šaldiklį, kol susirinks daugiau tyrimų.
9. Iš vakaro sudedami iš šaldiklio išimti mėgintuvėliai į 53οC inkubatorių arba vandens vonią. 10. Kitos dienos ryte į kiekvieną mėgintuvėlį pridedama po 1ml 6M NaCl. Uždengiama ir
suplakama.
11. Traukos spintoje įpilama po 1ml chloroformo. Vėl uždengiama ir gerai suplakama. Kiek atlaisvinami dangteliai ir dedama į centrifugą.
12. Centrifuguojama 2100g (3200 aps/min.) 20 min.
13. Pipete nusiurbiamas viršutinis tirštas sluoksnis be nuosėdų į 2 švarius mėgintuvėlius (stengiamasi nesudrumsti nuosėdų).
14. Į mėgintuvėlius įpilama 96% etanolio (~2 tūriai etanolio: 1 tūris nusiurbto turinio). Jei nusiurbtas turinys gana skystas, etanolio reikės mažiau.
15. Uždengiami mėgintuvėliai ir labai švelniai vartomi, kol išryškės DNR siūlai.
16. Perplaunami DNR siūlai 70% etanoliu (pipete prilaikomos DNR siūlės ant sienelės ir užpilamas 96% etanolis). Mėgintuvėlis atsargiai pavartomas.
17. DNR išgriebiame į ependorfo mėgintuvėlį arba 0,5ml mėgintuvėlį. Stengiamasi perpilti kuo mažiau spirito. Spiritą galima išgarinti palikus atvirą mėgintuvėlį (galima 56οC termostate) arba centrifuguojant mikrocentrifugoje, kad DNR nusėstų į dugną, o spiritą nusiurbti. (Spirito likučiai trukdo DNR ištirpti)
18. DNR ištirpinamas 100-1000µl steriliu vandeniu (priklausomai nuo DNR kiekio, geriau pradžioje pilti mažiau vandens, vėliau, jei reikia, pridėti). Kad geriau ištirptų galima kuriam laikui mėgintuvėlį įdėti į 56οC termostatą (apie 30 min.). Ištirpęs turinys turi būti ne per klampus – nekibti prie pipetės antgalio. Naudojamas antgalis su filtru.
19. Paruošta DNR iki tyrimo laikoma +4οC temperatūroje iki 1 mėn., vėliau perkeliama į -20οC šaldiklį.
31
2.3. Koncentracijos nustatymas su nanodropo spektrofotometru
Koncentracijos nustatymas buvo atliekamas naudojantis NanoDrop 1000 spektrofotometru. Matuojama esant 260 ir 280 nm bangos ilgiui.
Darbo eiga:
Naudojama 10µl pipetė. Spektrofotometras nuplaunamas su 5µl distiliuotu vandeniu. Distiliuotas vanduo nuvalomas ir dedama 1µl distiliuoto vandens, kad aparatas susikalibruotų. Distiliuotas vanduo nuvalomas ir dedama 1µl DNR. DNR koncentracija išmatuojama ng/µl. Patikrinamas santykis (260/280), kuris rodo DNR švarumą. Visų tiriamųjų švarumo rodiklis buvo 1,8 – 2 ribose.
2.4. Kokybinė analizė gel-elektroforezės metodu
Agarozės gelio gaminimas: Pasigaminamas 100 ml tirpalas, kuriame būtų 1% agarozės. Į 100 ml 0,5x TBE tirpalą įberiama 1 g agarozės, išmaišoma ir agarozė tirpinama mikrobangų krosnelėje 3 min. (tam, kad agarozė ištirptų iki galo). Gavus agarozės tirpalą, palaukiama kol ji atvės ir į atvėsusį tirpalą įpilama 30µl etidžio bromido. Nudažytas tirpalas supilamas į agarozės elektroforezės formą ir laukiama 20 min. kol gautas mišinys sustings.
Kai agarozė sustingsta, iš agarozės elektroforezės formos išimamos šakutės, kurios yra nuvalomos. Tuomet išimamas gautas gelis, kuris dedamas į vonelę pripildytą distiliuoto vandens (vanduo turi apsemti gelį).
Daţo ir mėginio sumaišymas: 8µl glicerino ir dažo (Thermo Scientific; 6x Orange DNA; Loading Dge) mišinys su pipete užlašinamas ant polimerinio popierėlio. Tuomet iš kiekvieno mėginio paimama po 5µl ir sumaišoma su dažu. Sumaišyti mėginiai su dažu atsargiai įpilami į šulinėlius, esančius gelyje.
Elektroforezė: Kai visi mėginiai jau yra gelio šulinėliuose, vonelė uždengiama ir įjungiamas maitinimo blokas. Elektros srovės stiprumas iš pradžių nustatomas 70V, o po to 10 min. – 200V, elektroforezės laikas – 105 min. Po elektroforezės gelis dedamas į UV šviestuvą ir gauti duomenys tikrinami per BioDOC Analyzer kompiuterinę programą. Nustatyta, jog tiriamųjų DNR kokybiški, nedegradavę.
32
2.5. DNR polimorfizmo nustatymas: polimerazės grandininė reakcija
PGR reakcijos mišinio tinkamumo naudojamiems bioţymenims, įvertinimas: Visų pirma reikėjo nusistatyti, kuris tyrimui naudojamas PGR reakcijos mišinys yra tinkamiausias numatytam geno polimorfizmo tyrimui, naudojant specifinius žymenis. Buvo renkamasi iš 2 PGR skirtų reagentų: Kapa ir TaqMan mišinių. Atlikus įprastinę PGR, buvo atliekamas gel – elektroforezės tyrimas. Gelį išryškinus, gauta nuotrauka, kurioje matosi lyginamų PGR mišinių fluorescencijos skirtumai (14 paveikslas).
14 pav. Kapa ir TaqMan mastermiksų palyginimas gel-elektroforezės metodu.
1,2,3 – pirma DNR; 4,5,6 – antra DNR; 7,8 – H2O; 9,10,22 – pirma DNR; 12,13,14 – antra DNR, 15,16 - H2O.
Iš 14 paveikslo matyti, jog TaqMan PGR mišinys yra tinkamesnis pasirinktiems žymenims, nei Kapa. Tolesniems tyrimams pasirinktas TaqMan PGR mišinys.
Metodo pasirinkimas tyrimams atlikti
Atlikus rinkoje esančių komercinių žymenų paiešką, rasti tiek įprastinei PGR skirti pradmenys, tiek ir TL-PGR skirti fluorescuojantys biožymenys. Įvertinus laiko sąnaudas, DNR polimorfizmo tyrimui atlikti eksperimento keliu pasirinktas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodas (TL-PGR). Šis tyrimo metodas buvo greičiau atliekamas, nei įprastinė PGR ir po jos sekanti gel-elektroforezė, bei buvo mažiau kenksmingas (nedirbama su etidžio bromidu).
Tikro laiko PGR tyrime naudojami reagentai:
po 5,3µl TaqMan PGR mišinio,
po 4,3µl distiliuoto vandens,
33
po 0,2µl fluorescuojančio TaqMan žymens,
po 1,0µl tiriamųjų DNR.
Tikro laiko PGR tyrime naudojamos techninės priemonės:
0,5 ml talpos mėgintuvėliai,
pipetės,
centrifuga,
plokštelės,
speciali termotarpinė,
tikro laiko PGR aparatas (7900 HT Fast Real – Time PCR System),
kompiuterinė SDS2,3 programa. Tikro laiko PGR tyrimo eiga:
1. Pasigaminami du mišiniai su skirtingais biožymenimis: dedamas CYP4F2, o į kitą CYP2C19 žymuo. Pagal tiriamųjų kiekį apsiskaičiuojame kiek į gaminamą mišinį reikės įdėti TaqMan PGR mišinio, distiliuoto vandens, fluorescuojančio žymens.
2. Į 0,5 ml mėgintuvėlius supilama apskaičiuotų reagentų kiekiai ir išmaišoma.
3. Iš gauto mišinio imama po 9,7µl ir supilama į atskirus mėgintuvėlius. Po to į kiekvieną mišinį įdedama po 1µl skirtingo DNR. Mėgintuvėliai užkemšami ir centrifuguojami (1500 apsisukimų, kelias sekundes).
4. Baigus centrifuguoti, mišinys sudedamas į plokšteles, kurios uždengiamos specialia termotarpine. Tuomet dedama į tikro laiko PGR aparatą ir gausinama 2 val.
5. Po 2 val., naudojantis SDS2,3 kompiuterine programa analizuojami gauti duomenys. Duomenys programoje pateikiami eksponentinės kreivės išraiška (15 ir 16 paveikslai).
34
15 pav. Homozigotas. 1- AA alelis, 2- GG alelis
16 pav. Heterozigotas. 1- AA alelis, 2- GG alelis
2.6. Statistinė analizė
Fisher`io testas taikytas kategoriniams duomenims analizuoti. Hardy-Weinberg lygtis taikyta alelių atitikimui normaliai populiacijai įvertinti. Vienanarės logistinės regresinės analizės metu vertinti ligonių, patekusių į AVJO ir PI grupes, genotipų pasiskirstymas. Duomenys laikyti statistiškai reikšmingais, jei p<0,05.
35
3. REZULTATAI
3.1. Tiriamųjų, kuriems buvo atliktas plėtiklio implantavimas, imtis
Vyrai buvo jaunesni nei moterys (p<0,05). Vyrai turėjo didesnę kūno masę bei didesnę liemens apimtį nei moterys (p<0,05) (1 lentelė), taip pat jie buvo ir aukštesni (p<0,00001). Nors vyrų svoris, apimtis ir ūgis skyrėsi nuo moterų svorio, apimties ir ūgio, tačiau vyrų ir moterų KMI reikšmingai nesiskyrė (p>0,05) (1 lentelė). Nesiskyrė ir trombocitų agregacijos rodikliai sužadinus induktoriais ADR ar arach. r. (p>0,05). Moterims ADF sužadintos TA vertė buvo aukštesnė nei vyrams (p=0,0283) (1 lentelė).
1 lentelė. Ligonių, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas, imtis
Vyrai Moterys Bendras p
n 65 29 94 Amžius 63,27±12,3 71,61±7,7 65,84±1,71 0,0011 Svoris 92,3±18,67 79,96±14,3 88,2±18,2 0,0021 Ūgis 175,2±6,59 160,48±4,93 170,67±9,17 <0,00001 Liemens apimtis 99,87±12,4 94,02±11,68 97,94±12,4 0,0342 KMI 30,04±5,51 31,09±5,70 30,36±5,56 0,4006 Su ADF 30,15±12,46 36,65±14,34 32,16±13,14 0,0283 Su ADR 38,8±17,21 38,34±22,12 38,65±18,74 0,9132 Su arachidono r. 17,78±10,49 18,89±15,66 18,13±12,26 0,6870
3.2. CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipų daţnis tirtoje imtyje
Tirtų genų aleliai pasiskirstę pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį (p>0,05).
3.3. CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipų įtaka trombocitų
agregacijai ligoniams, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas
3.3.1. CYP2C19*2 genotipo įtaka trombocitų agregacijaiNustatyti reikšmingi trombocitų agregacijos skirtumai sužadinus ADF. Gydymo pradžioje ADF sužadintos trombocitų agregacijos vertė buvo žemesnė 32,16±13,34proc.agr, nei po 1 mėn.
36 45,57±24,82proc.agr
, (p<0,00001). Ligonių, kurie turėjo GG genotipą, ADF sužadintos TA vertė po 1 mėn. buvo aukštesnė 45,53±26,82proc.agr, nei gydymo pradžioje 31,92±14,36proc.agr
, (p=0,0005). Pamatavus ligonių, turėjusių CYP2C19 AG alelį trombocitų agregaciją antrą kartą, gauta aukštesnė ADF vertė (p=0,0315) (1 priedas). Be to, aukštesnė ADF vertė buvo ir pacientų, turėjusių AA genotipą (p=0,0463) (1 priedas).
ADR ir arach. r. vertės ligonių imtyje reikšmingai nesiskyrė (1 priedas). 3.3.2. CYP4F2 G1347A genotipo įtaka trombocitų agregacijai
Nustatyta, jog trombocitų agregacija, sužadinta ADF, buvo aukštesnė po 1 mėn. 45,57±24,82proc.agr, nei gydymo pradžioje 32,16±13,34proc.agr
, (p<0,00001) (2 priedas). Ligoniai, kurie turėjo GG genotipą, po 1 mėn. turėjo ir aukštesnes ADF vertes (p=0,0008) (2 priedas). Ligoniai, kurie turėjo CYP4F2 AG alelį, taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes 44,82±22,49proc.agr
, nei gydymo pradžioje 33,0±13,27proc.agr
, (p=0,0116). Ligoniai, turėję CYP4F2 AA alelį, taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0492) (2 priedas).
Trombocitų agregacijos, sužadintos ADR ar arach. r., vertė reikšmingai nesiskyrė (2 priedas).
3.4. CYP2C19*2 ir CYP4F2 G1347A genotipų ir greta vartojamų
vaistų įtaka trombocitų agregacijai ligoniams, kuriems atliktas
plėtiklio implantavimas
3.4.1. CYP2C19*2 genotipo ir vaistų įtaka ADF suţadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui
Ligoniai, kurie gydymui vartojo klopidogrelį įsotinimo metu turėjo žemesnes ADF vertes 35,09±12,71proc.agr, nei po mėnesio 48,11±20,58proc.agr
, (p=0,0001). Ligoniai, kurie vartojo klopidogrelį ir turėjo GG genotipą po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes nei gydymo pradžioje (p=0,0061) (3 priedas).
Tikagrelorą vartoję ligoniai reikšmingų trombocitų agregacijos skirtumų įsotinimo metu ir po mėnesio neturėjo.
Pamatavus ligonių, vartojusių aspiriną, trombocitų agregaciją po 1 mėn., pastebėta, kad ADF vertė aukštesnė 41,43±20,93proc.agr
, nei įsotinant 31,02±12,69proc.agr, (p=0,0002). Ligoniai, turėję GG genotipą ir vartoję aspiriną, po 1 mėn. turėjo aukštesnę ADF vertę (p=0,0067) (3 priedas). Ligoniai,
37
pas kuriuos vyravo CYP2C19 AA alelis, turėjo žemesnes ADF vertes įsotinimo metu 22,25±2,22proc.agr, nei po 1 mėn. 59,0±29,27proc.agr, (p=0,0463). Ligoniai, kurie aspirino nevartojo, neturėjo reikšmingų ADF sužadintos TA skirtumų gydymo pradžioje ir po 1 mėn. (3 priedas). Pastebėta, jog tarp aspirino nevartojusių pacientų, nepateko tiriamųjų turinčių AA genotipą.
Ligoniai, kurie vartojo atorvastatiną, įsotinimo metu turėjo žemesnes ADF vertes 32,21±13,24proc.agr, nei po mėnesio 42,38±22,03proc.agr, (p=0,0006). Tiriamieji, turėję GG genotipą ir vartoję atorvastatiną, po 1 mėn. gydymo, turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0201) (3 priedas). Ligoniai, kurie turėjo CYP2C19 AG alelį, taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes nei gydymo pradžioje (p=0,0446) (3 priedas). Pacientai, kurie atorvastatino nevartojo, reikšmingų ADF sužadintos TA skirtumų neturėjo.
Ligoniai, kurie vartojo spironolaktoną, reikšmingų TA skirtumų neturėjo. Pacientai, kurie spironolaktono nevartojo, gydymo pradžioje turėjo žemesnes ADF vertes 32,97±13,01proc.agr
, nei po 1 mėn. 43,10±21,63proc.agr
, (p=0,0015). Ligoniai, kurie šio vaisto nevartojo ir turėjo GG genotipą, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0098) (3 priedas). Pastebėta, kad tarp tiriamųjų, vartojusių ir nevartojusių spironolaktono, nepasitaikė turinčių CYP2C19 AA alelį.
Ligoniai, kurie vartojo KKB, reikšmingų TA skirtumų neturėjo. Ligoniai, kurie KKB nevartojo, įsotinimo metu turėjo žemesnes ADF vertes, nei po mėnesio (p<0,00001) (3 priedas). Tiriamieji, kurie KKB nevartojo ir turėjo CYP2C19 GG alelį, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes 47,10±27,12proc.agr, nei įsotinimo metu 31,27±14,33proc.agr, (p=0,0001). Nevartojantys šio vaisto ir turėję AG genotipą, po 1 mėn. taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0201) (3 priedas). Pastebėta, kad tarp vartojusių ir nevartojusių KKB ligonių, nebuvo tiriamųjų, turinčių CYP2C19 AA alelį.
Gydymo pradžioje AKFI vartoję ligoniai turėjo žemesnes ADF vertes (p=0,0001) (3 priedas). Ligoniai, kurie vartojo šį vaistą ir turėjo GG genotipą, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0030) (3 priedas). Ligoniai, kurie AKFI nevartojo, reikšmingų skirtumų neturėjo.
CD sergantys ligoniai, reikšmingų TA skirtumų įsotinimo metu ir po mėnesio neturėjo. Nesergantys CD po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0001) (3 priedas). Ligoniai, kurie nesirgo CD ir turėjo CYP2C19 GG alelį, po mėnesio turėjo aukštesnes ADF vertes 38,73±22,54proc.agr, nei įsotinimo metu 26,96±10,26proc.agr, (p=0,0036).
38
3.4.2. CYP2C19*2 genotipo ir vaistų įtaka ADR suţadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui
Įsotinimo metu ir po 1 mėn. klopidogrelį ar tikagrelorą vartoję ligoniai reikšmingų ADR sužadintos trombocitų agregacijos skirtumų neturėjo.
Ligoniai, kurie vartojo aspiriną, neturėjo reikšmingų TA skirtumų, sužadintos ADR. Ligoniai, kurie šio vaisto nevartojo, po mėnesio turėjo aukštesnes ADR vertes, tačiau jos nėra statistiškai reikšmingos (4 priedas).
Atorvastatiną ar spironolaktoną, ar AKFI vartoję ir nevartoję ligoniai, reikšmingų TA skirtumų, sužadintos ADR, neturėjo.
KKB vartoję ligoniai, reikšmingų TA skirtumų neturėjo, tačiau ligoniai, kurie šio vaisto nevartojo, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADR vertes (p=0,0243) (4 priedas).
CD sergantys tiriamieji neturėjo reikšmingų ADR sužadintos TA skirtumų įsotinimo metu ir po 1 mėn. Ligoniai, kurie šia liga nesirgo, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADR vertes (p=0,0116) (4 priedas). Ligoniai, nesergantys CD ir turėję GG genotipą, taip pat turėjo aukštesnes ADR vertes 43,22±19,89proc.agr po mėnesio, nei įsotinimo metu 32,03±13,10proc.agr, (p=0,0044).
3.4.3. CYP2C19*2 genotipo ir vaistų įtaka arachidono rūgštimi suţadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui
Jau anksčiau minėtų vaistų vartoję ar nevartoję ligoniai reikšmingų arach. r. sužadintos TA skirtumų neturėjo (5 priedas).
3.4.4. CYP4F2 G1347A genotipo ir vaistų įtaka ADF suţadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui
Klopidogrelį vartoję ligoniai po mėnesio turėjo aukštesnes ADF vertes 48,11±20,58proc.agr , nei įsotinant 35,09±12,71proc.agr
, (p=0,0001). Ligoniai gydyti klopidogreliu ir turėję GG genotipą, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0037) (6 priedas). Ligoniai, kurie turėjo AG genotipą, taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes 49,16±15,83proc.agr po mėnesio, nei įsotinant 37,26±13,90proc.agr
, (p=0,0187).
39
Ligoniai, kurie buvo gydyti aspirinu, įsotinimo metu turėjo žemesnes ADF reikšmes 31,02±12,69proc.agr, nei po 1 mėn. 41,43±20,93proc.agr
, (p=0,0002). Ligoniai, kurie vartojo aspiriną ir turėjo GG genotipą, po mėnesio turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0060) (6 priedas). Tiriamieji, vartoję vaistą ir turėję AG genotipą, po mėnesio, taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0200) (6 priedas). Ligoniai, kurie gėrė aspiriną ir turėjo CYP4F2 AA alelį įsotinimo metu turėjo žemesnes ADF vertes 26,80±9,36proc.agr, nei po 1 mėn. 43,60±13,24proc.agr, (p=0,0492). Ligoniai, kurie gydymui aspirino nevartojo, reikšmingų ADF sužadintos TA skirtumų neturėjo (6 priedas).
Ligoniai, kurie vartojo atoravastatiną po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0006) (6 priedas). Ligoniai, kurie vartojo šį vaistą ir turėjo CYP4F2 GG alelį, po mėnesio turėjo aukštesnes ADF vertes 42,80±24,80proc.agr, nei įsotinant 31,61±13,20proc.agr, (p=0,0083). Tiriamieji, kurie atorvastatino nevartojo, reikšmingų TA skirtumų neturėjo.
Spironolaktoną vartoję ligoniai, neturėjo reikšmingų ADF sužadintos TA skirtumų. Ligoniai, kurie spironolaktono nevartojo, įsotinimo metu turėjo žemesnes ADF vertes 32,37±12,88proc.agr, nei po 1 mėn. 44,0±22,17proc.agr
, (p=0,0002). Tiriamieji, kurie vaisto nevartojo ir turėjo GG genotipą, po 1 mėn. gydymo turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0037) (6 priedas).
Ligoniai, kurie vartojo KKB, neturėjo reikšmingų TA skirtumų. Tiriamieji, kurie KKB nevartojo, po mėnesio gydymo turėjo aukštesnes ADF vertes (p<0,00001) (6 priedas). Ligoniai, kurie nevartojo KKB ir turėjo GG genotipą, turėjo aukštesnes ADF vertes 48,22±27,49proc.agr
po 1 mėn, nei įsotinant 32,14±13,53proc.agr
, (p=0,0004). Ligoniai, turėję CYP4F2 AG alelį ir nevartoję KKB, po 1 mėn. taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0039) (6 priedas).
AKFI vartoję ligoniai įsotinimo metu turėjo žemesnes ADF vertes (p=0,0001), o ligoniai, kurie vartojo AKFI ir turėjo GG genotipą, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes 45,0±25,66proc.agr
, nei įsotinant 30,88±12,49proc.agr
, (p=0,0022). Ligoniai, kurie AKFI nevartojo, reikšmingų ADF sužadintos TA skirtumų neturėjo.
Sergantys CD reikšmingų TA skirtumų neturėjo. Ligoniai, kurie nesirgo CD po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADF vertes (p=0,0001) (6 priedas). Ligoniai, kurie CD nesirgo ir turėjo CYP4F2 GG alelį, taip pat turėjo aukštesnes ADF vertes po 1 mėn. (p=0,0022) (6 priedas), nei įsotinimo metu.
3.4.5. CYP4F2 G1347A genotipo ir vaistų įtaka ADR suţadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir po 1 mėnesio
Ligoniai, kurie vartojo klopidogrelį ar tikagrelorą, reikšmingų ADR sužadintos TA skirtumų neturėjo.
40
Ligoniai, kurie vartojo aspiriną ar atorvastatiną, ar AKFI, bei šių vaistų nevartoję ligoniai, reikšmingų ADR sužadintos TA skirtumų įsotinimo metu ir po 1 mėn. neturėjo.
Ligoniai, kurie vartojo spironolaktoną, reikšmingų agregacijos skirtumų neturėjo, o ligoniai, kurie vaisto nevartojo ir turėjo AG genotipą, po mėnesio turėjo aukštesnes ADR vertes 49,0±21,22proc.agr, nei įsotinant 37,83±15,99proc.agr
, (p=0,0469) (7 priedas).
Ligoniai, kurie vartojo KKB, reikšmingų TA skirtumų neturėjo. Ligoniai nevartoję KKB įsotinant turėjo žemesnes ADR vertes (p=0,0366) (7 priedas). Tiriamieji, kurie nevartojo KKB ir turėjo CYP4F2 AG alelį, po 1 mėn. turėjo aukštesnes ADR vertes (p=0,0240) (7 priedas).
CD sergantys ligoniai neturėjo reikšmingų TA skirtumų, o šia liga nesergantys ligoniai įsotinimo metu turėjo žemesnes ADR vertes 33,82±14,83proc.agr, nei po 1 mėn. 41,66±18,03proc.agr
, (p=0,0116). Ligoniai, kurie nesirgo CD ir turėjo CYP4F2 AG alelį, po mėnesio turėjo aukštesnes ADR vertes 45,50±18,59proc.agr, nei įsotinant 34,05±14,90proc.agr, (p=0,0352) (7 priedas).
3.4.6. CYP4F2 G1347A genotipo ir vaistų įtaka arachidono rūgšties suţadintai trombocitų agregacijai įsotinimo metu ir praėjus 1 mėnesiui
Jau anksčiau minėtų vaistų vartoję ar nevartoję ligoniai neturėjo reikšmingų arach. r. sužadintos TA skirtumų (8 priedas).
3.5. Ligonių, gydytų po širdies vainikinių kraujagyslių plėtiklio
implantavimo ir po aortos vainikinių jungčių operacijos, genotipų
daţnis
Ligoniams, kuriems atlikta AVJO dažniau nustatytas CYP4F2 G1347A AA genotipas (20,7proc.), nei ligoniams, kuriems implantuotas plėtiklis (5,3proc.), p<0,05. Priešingai, ligoniai, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas, dažniau turėjo CYP4F2 G1347A GG genotipą (59,6proc.) nei ligoniai, kuriems buvo atlikta AVJO (41,4proc.), p<0,05. CYP4F2 G1347A AG genotipo dažnis šiems ligoniams nesiskyrė (p>0,05) (2 lentelė).
CYP2C19*2 genotipo dažnis nesiskyrė (p>0,05) tarp ligonių, kuriems atlikta AVJO ir implantuotas plėtiklis. CYP2C19*2 GG genotipo dažnis ligoniams su plėtikliu buvo 68,1proc., o ligoniams, kuriems atlikta AVJO - 75,9proc. CYP2C19*2 AG genotipo dažnis ligoniams su plėtikliu
41
buvo 27,7proc., o ligoniams po AVJO - 20,7proc. CYP2C19*2 AA genotipo dažnis atitinkamai buvo 4,3proc. ir 3,4proc. (3 lentelė).
2 lentelė. CYP4F2 G1347A genotipų daţnis tarp ligonių, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas ir atlikta AVJO
Ligoniai, kuriems atliktas plėtiklio
implantavimas (n=94) Ligoniai, kuriems atlikta AVJO (n=58)
Genotipas n Proc. n Proc. p
GG 56 59,6 24 41,4 0,03
AG 33 35,1 22 37,9 0,7276
AA 5 5,3 12 20,7 0,004
3 lentelė. CYP2C19*2 genotipų daţnis tarp ligonių, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas ir atlikta AVJO
Ligoniai, kuriems atliktas plėtiklio
implantavimas (n=94) Ligoniai, kuriems atlikta AVJO (n=58)
Genotipas n Proc. n Proc. p
GG 64 68,1 44 75,9 0,3035
AG 26 27,7 12 20,7 0.3347
AA 4 4,3 2 3,4 0,7825
3.5.1. Vyriškos lyties ligonių, kuriems atliktas plėtiklio implantavimas ir atlikta aortos vainikinių jungčių suformavimo operacija trombocitų agregacijos rodikliai ir genotipų skirtumai
Renkant informaciją apie tiriamųjų lytį, paaiškėjo, kad visi ligoniai, kuriems buvo atlikta AVJO, buvo vyriškos lyties. Tarp ligonių, kuriems buvo implantuotas plėtiklis, buvo ir vyrų, ir moterų,
42
tačiau moterų kiekis nebuvo didelis, todėl lyginant ligonių po plėtiklio implantavimo ir po AVJO trombocitų agregaciją bei genotipų skirtumus, moterys įtrauktos nebuvo.
Ligonių po plėtiklio implantavimo (PI) ir ligonių po aortos vainikinių jungčių suformavimo operacijos (AVJO) amžius, svoris, ūgis ir KMI reikšmingai nesiskyrė (p>0,05) (4 lentelė).
Trombocitų agregacija, sužadinta agregacijos induktoriais ADF ir ADR, po PI ir AVJO imtyse reikšmingai skyrėsi: atitinkamai, 30,15±12,46proc.agr
ir 48,77±23,33proc.agr (p<0,001), bei 38,8±17,21proc.agr
ir 58,4±33,07proc.agr (p<0,001) (4 lentelė).
Ligonių, kuriems buvo implantuotas plėtiklis ir ligonių po AVJO, geno CYP4F2 AA genotipo dažnis reikšmingai skyrėsi: atitinkamai, 4,6% ir 20,7% (5 lentelė). CYP2C19 genotipo dažnis reikšmingai nesiskyrė (p>0,05) (5 lentelė).
4 lentelė. Vyriškos lyties ligonių po PI ir po AVJO imties skirtumai
Vyrai po PI (n=65) Vyrai po AVJO (n=58) p
Amžius (m.)±SN 63,266±12,3 63,60±9,48 0,8675 Svoris (kg)±SN 92,3±18,67 88,52±14,21 0,2313 Ūgis (cm)±SN 175,2±6,59 175,77±6,48 0,6302 KMI(kg/m2)±SN 30,0398±5,512 28,655±4,364 0,1281 ADP(proc.agr)±SN 30,15±12,46 48,77±23,33 <0,001 ADR(proc.agr)±SN 38,8±17,21 58,4±33,07 <0,001
5 lentelė. CYP4F2 G1347A ir CYP2C19*2 genotipų daţnis tarp vyrų – ligonių po PI ir po AVJO
Vyrai, kuriems atliktas PI (n=65)
Vyrai, kuriems atlikta AVJO (n=58) χ2 p n % n % p CYP4F2 G1347A AG AA GG 24 3 38 36,92 4,615 58,46 22 12 24 37,93 20,69 41,38 0,9082 0,0075 0,0610 8,277 p=0,016 CYP2C19*2 AG AA GG 19 3 43 29,23 4,615 66,15 12 2 44 20,69 3,45 75,86 0,2783 0,8369 0,2397 1,398 p=0,497
