LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
RASA STARŠELSKYTĖ
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ
LEKTINAIS, IŠSKIRTŲ IŠ URTICA DIOICA L.
ŽOLĖS, ANTIMUTAGENINIO, CITOTOKSINIO IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Nijolė Savickienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠSKIRTŲ IŠ
URTICA DIOICA L. ŽOLĖS, ANTIMUTAGENINIO, CITOTOKSINIO
IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantės
dr. Annabella Vitalone
prof. Gabriela Mazzanti
dr. Antonella Di Sotto
Data
Recenzentas
Darbo vadovas
Prof. Nijolė Savickienė
Data
Darbą atliko
Magistrantė
Rasa Staršelskytė
Data
Data
KAUNAS, 2014
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 1. SANTRUMPOS ... 10 SĄVOKOS ... 11 2. ĮVADAS ... 113. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
4.1. Biologiškai aktyvių junginių - lektinų, apibūdinimas ... 13
4.2. Lektinų paplitimas ir funkcijos augaluose ... 14
4.3. Augalinių lektinų biologinis aktyvumas ... 15
4.3.1. Priešvėžinis aktyvumas ... 15 4.3.2. Mitogeninis aktyvumas ... 16 4.3.3. Priešvirusinis aktyvumas ... 17 4.3.4. Antibakterinis aktyvumas ... 17 4.3.5. Priešgrybelinis aktyvumas ... 18 4.4. Lektinų pritaikymas ... 18
4.5. Didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) lektinas (UDA) ... 19
4.7. Natūralūs antimutagenai ... 21 5. TYRIMO METODIKA ... 22 5.1. Tyrimo medžiaga ... 22 5.2. Reagentai ... 23 5.3. Įranga ... 23 5.4. Analitiniai metodai ... 24
5.4.1. AMES testas (bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas) ... 24
5.4.2. MTT dažo redukcijos reakcijos metodas ... 28
5.4.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 29
5.4.4. Statistinė analizė ... 30
6. REZULTATAI ... 30
6.1. Antimutageninio aktyvumo tyrimo rezultatai ... 30
6.3. Antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatai ... 34
6.3.1. Antioksidacinio aktyvumo testo, naudojant 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS·+) modelinį radikalą, rezultatai ... 34
6.3.2. Antioksidacinio aktyvumo testo, naudojant superoksido anijono modelinį radikalą, rezultatai ... 35
7. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36
8. IŠVADOS ... 38
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40
SANTRAUKA
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠSKIRTŲ IŠ
URTICA DIOICA L. ŽOLĖS, ANTIMUTAGENINIO, CITOTOKSINIO
IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
R. Staršelskytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. N. Savickienė; Konsultantės: dr. Annabella Vitalone, prof. Gabriela Mazzanti, dr. Antonella Di Sotto;Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas. Romos universiteto La Sapienza, Fiziologijos ir farmakologijos katedra. – Roma.
Darbo tikslas: baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, išskirtų iš Urtica doica L. žolės,
antimutageninio, citotoksinio ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti Urtica dioica L. baltymų frakcijų įtaką Salmonella typhimurium ir Escherichia coli kamienų mutageniškumui, naudojant AMES testo metodą.
2. Ištirti Urtica dioica L. baltymų frakcijų citotoksiškumą HepG2 ląstelių proliferacijai, naudojant MTT dažo redukcijos reakcijos metodą.
3. Ištirti Urtica dioica L. baltymų frakcijų antioksidacinį aktyvumą, naudojant modelinius ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)) ir superoksido radikalus.
Metodai:
1. Lektinais praturtintų baltymų frakcijų antimutageniškumas tiriamas AMES testo metodu (grįžtamosios mutacijos modeliu in vitro) su S9 metabolinės aktyvacijos sistema (supernatantu iš žiurkių (paveiktų fenobarbitalio/β-naftoflavono mišiniu) kepenų lątelių mitochondrijų) ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos. Eksperimentui naudojami trys bakterijų kamienai: S.
typhimurium TA98, S. typhimurium TA100 ir E. coli WP2uvrA.
2. Citotoksiškumas nustatomas MTT dažo redukcijos reakcijos metodu, įvertinant lektinų turinčių baltymų frakcijų poveikį HepG2 proliferacijai.
3. Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, antioksidacinis aktyvumas nustatomas spektrofotometrijos metodu, inkubuojant su ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) katijono) ir superoksido radikalų tirpalais.
Rezultatai:
1. Didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos parodė antimutageninį poveikį prieš mutageną 2-aminoantraceną (2-AA). Esant didžiausiai koncentracijai (800 µg), antimutageninis poveikis pasiekė maksimalią 56 proc., 78 proc. ir 61 proc. inhibiciją atitinkamai TA98, TA100 ir WP2uvrA bakterijų padermėse. Baltymų frakcijos neturėjo antimutageninio poveikio (maksimali inhibicija < 25 proc.) prieš 2-nitrofluoreną (2-NF), natrio azidą (SA) ir metilmetano sulfonatą (MMS).
2. Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos nesumažino HepG2 ląstelių proliferacijos nei po 24 valandų, nei po 48 valandų veikimo.
3. Naudojant modelinį radikalą ABTS, stebėta koreliacija tarp bendro antiradikalinio aktyvumo ir koncentracijos. Maksimalus antioksidacinis aktyvumas (apie 93.8 proc.) nustatytas, kai lektinais praturtintos frakcijos koncentracija buvo 120 µg/ml. Naudojant modelinį superoksido anijono radikalą, taip pat stebėta koreliacija tarp bendro antiradikalinio aktyvumo ir koncentracijos. Maksimalus antioksidacinis aktyvumas (apie 90.2 proc.), nustatytas kai lektinais praturtintos frakcijos koncentracija buvo 400 µg/ml.
Išvados:
1. Atlikus bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymą, Urtica dioica L. žolės lektinais praturtintos baltymų frakcijos parodė stiprų antimutageninį aktyvumą prieš mutageną 2-aminoantraceną (2-AA) S. typhimurium TA98, S. typhimurium TA100 ir E. coli WP2uvrA kamienuose.
2. MTT bandymo metu didžiųjų dilgėlių žolės lektinų turinčios baltymų frakcijos neinhibavo HepG2 ląstelių proliferacijos.
3. Baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, parodė stiprų antioksidacinį aktyvumą, naudojant ABTS ir superoksido modelinius radikalus.
Reikšminiai žodžiai: didžioji dilgėlė, Urtica dioica, lektinai, citotoksiškumas, antimutageniškumas, antioksidacinis aktyvumas, 2-aminoantracenas, Ames testas, MTT, superoksido anijonas, ABTS.
SUMMARY
INVESTIGATION OF ANTIMUTAGENIC ACTIVITY,
CYTOTOXICITY AND ANTIOXIDANT ACTIVITY IN
LECTIN-ENRICHED PROTEIN FRACTIONS FROM HERB OF URTICA
DIOICA L.
Rasa Staršelskytė master thesis/ Supervisor of the research paper: prof. Nijolė Savickienė1 Consultants: PhD Annabella Vitalone, prof. Gabriela Mazzanti, PhD Antonella Di Sotto2
1Department of Pharmacognosy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences,
Lithuania
2Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy
Objective of work: evaluation of antimutagenicity, cytotoxicity and antioxidant activity of
lectin-enriched protein fractions from herb of Urtica dioica L.
Main tasks:
1. To evaluate antimutagenic activity of lectin-enriched protein fractions by bacterial reverse mutation assay.
2. To determine cytotoxicity of lectin-enriched protein fraction by the tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay.
3. To evaluate antioxidant activity of lectin-enriched protein fraction against ABTS-free radical and superoxide-radical.
Methods:
1. The antimutagenicity was studied in a bacterial reverse mutation assay (Ames test), both in the absence and presence of an exogenous metabolic activator S9 (the liver postmitochondrial supernatant of rats treated with the mixture phenobarbital/β-naphthoflavone to induce the hepatic microsomal enzymes). A set of three strains, S. typhimurium TA98, S. typhimurium TA100 and E. coli WP2uvrA, was used.
2. Cytotoxicity was determined by the tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay in HepG2 human hepatoblastoma cell line.
3. The antioxidant activity was evaluated by ABTS-free radical scavenging activity test and superoxide-radical scavenger assay using spectrophotometry.
Results:
1. Lectin-enriched protein fractions from Urtica dioica L. herb showed antimutagenic effect against 2-AA (2-aminoanthracene), which reached, at the highest concentration (800 µg) tested, the maximal inhibition of 56%, 78% and 61% in TA98, TA100 and WP2uvrA strains, respectively. In contrast, lectin-enriched fractions produced no significant antimutagenic effects (maximal inhibition < 25%) against 2-NF (2-nitrofluorene), SA (sodium azide), MMS (methyl methanesulfonate).
2. Lectin-enriched protein fractions did not display any significant reduction in the cell viability of HepG2 cells, neither after 24 h nor after 48 h of treatment.
3. The inhibition of the ABTS radical and the superoxide anion was concentration-dependent and reached 93.8% scavenger activity at 120 µg/ml, 90.2% scavenger activity at 400 µg/ml, respectively.
Conclusions:
1. Lectin-enriched fractions exhibited a strong antimutagenic activity against the mutagen 2-AA in all strains tested.
2. Lectin-enriched protein fractions did not inhibited the cell proliferation in tumour hepatic HepG2 cells.
3. Lectin-enriched protein fractions exhibited a remarkable scavenger activity against ABTS radical and superoxide anion.
Key words: nettle, Urtica dioica, lectins, cytotoxicity, antimutagenicity, antioxidant activity,
PADĖKA
Dėkoju Romos universiteto La Sapienza Fiziologijos ir farmakologijos katedrai ir mokslininkams už suteiktą galimybę ir materialinę bazę, vykdant mokslinį - tiriamąjį darbą „Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, išskirtų iš Urtica dioica L. žolės, antimutageninio, citotoksinio ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas“. Dėkoju prof. N. Savickienei už pagalbą ir konsultacijas.
1. SANTRUMPOS
CD4, CD8 – T limfocitų paviršiuje esantys glikoproteinaiTA98 – Salmonella typhimurium kamienas, negalintis sintetinti histidino, esant mutacijai hisD3052 alelyje
TA100 – Salmonella typhimurium kamienas, negalintis sintetinti histidino, esant mutacijai hisG46 alelyje
WP2uvrA – Escherichia coli kamienas, dėl mutacijos trpE65 alelyje negalintis sintetinti triptofano HepG2 – žmogaus kepenų vėžio ląstelių linija
MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas 2-NF – 2-nitrofluorenas 2-AA – 2-aminoantracenas SA – natrio azidas MMS – metilmetano sulfonatas DMSO – dimetilsulfoksidas °C – laipsniai Celsijaus % – procentai h – valandos min – minutės PBS – fosfatinis buferis
SEM – standartinė vidurkio paklaida
IC50 – pusinė maksimali inhibicinė koncentracija
ABTS – 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) NBT – nitro mėlynasis tetrazolis
NADH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas PMS – fenazino metosulfatas
SĄVOKOS
Autofagija – molekulinis mechanizmas, kurio tikslas – suardyti bei perdirbti senus baltymus ir pažeistas organeles.
Glikokonjugatai – angliavandeniai, kovalentiškai susijungę su kitais junginiais (lipidais, baltymais), pvz., glikoproteinai, glikopeptidai, glikolipidai.
Mutageniškumas – fizikinio, cheminio arba biologinio veiksnio geba sukelti mutaciją. Revertantas – organizmas, kuris išsivystė po grįžtamosios mutacijos.
Supernatantas – virš nuosėdinis skystis.
2. ĮVADAS
Augalų lektinai yra neimuninės ir nefermentinės kilmės baltymai, kurie atpažįsta ir jungiasi prie įvairių angliavandenių struktūrų ir gali sukelti ląstelių agregaciją ir agliutinaciją. Susidomėjimas šia junginių grupe ypač išaugo dėl jų priešvėžinio veikimo. Naujausi tyrimai parodė, kad lektinai ne tik atpažįsta vėžines ląsteles, bet ir sukelia jų adheziją, apoptozę ir mitogeninį citotoksiškumą. Be priešvėžinio poveikio augalų lektinai dar pasižymi mitogeniniu, priešvirusiniu, antibakteriniu, priešgrybeliniu aktyvumu. Šiuo metu yra išskirta daugiau nei 100 augalinių lektinų, o didelė jų dalis – nuodugniai ištirta. Didžiųjų dilgėlių lektinų biologinio aktyvumo tyrimų atlikta nedaug. Geriausiai ištirti lektinai, išskirti iš Urtica dioica L. šaknų, tačiau lektinų, išskirtų iš didžiųjų dilgėlių žolės, biologinio aktyvumo tyrimų trūksta.
Bendradarbiaujant Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmakognozijos katedros mokslininkams ir Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto genetikos laboratorijos mokslo darbuotojams, iš Urtica dioica L. žolės išskirtos baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, ir nustatytas jų specifinis agliutinacinis aktyvumas, baltymų koncentracija ir lektinų kiekis (tirti lektinai priklauso hololektinų klasei, heveino tipui). Sutikus bendradarbiauti Romos universiteto La Sapienza Fiziologijos ir farmakologijos katedros mokslininkams, pirmą kartą ištirtas lektinų turinčių baltymų frakcijų, išskirtų iš Urtica dioica L. žolės, citotoksinis, antimutageninis ir antioksidacinis aktyvumas. Citotoksiškumo tyrimai atlikti, naudojant kepenų vėžio ląstelių HepG2 liniją, kuri toksikologijoje yra gerai apibūdintas vėžio modelis in vitro. Lektinais praturtintų baltymų frakcijų, išskirtų iš didžiųjų dilgėlių žolės, antimutageninis aktyvumas nustatytas, atliekant bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymą (Ames testą). Bakterijos, skirtingai nei žinduoliai, negali citochromo P450 sistemos pagalba metabolizuoti neaktyvių cheminių medžiagų, todėl antimutageniniam tyrimui naudota S9 metabolinės aktyvacijos sistema, kuri padeda nustatyti, ar tiriamoji frakcija gali inhibuoti mutagenų metabolinę
aktyvaciją. Antioksidacinis aktyvumas ištirtas, naudojant modelinius ABTS ir superoksido anijono radikalus, siekiant įvertinti baltymų frakcijų apsauginį veikimo mechanizmą.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: lektinais praturtintos baltymų frakcijos, išskirtos iš Urtica dioica L. žolės. Temos aktualumas ir tyrimo problema: atlikta daug augalų lektinų priešvėžinio aktyvumo in vitro ir in vivo tyrimų, tačiau jų antimutageninis aktyvumas ištirtas labai mažai. Nustatyta, kad
lektinai, išskirti iš didžiųjų dilgėlių šaknų, turi gausybę biologinių savybių, tokių kaip antivirusinių, priešgrybelinių, antiproliferacinių ir imunomoduliacinių. Tačiau lektinų, išskirtų iš Urtica dioica L. žolės, biologinis aktyvumas neištirtas. Atlikus šį tyrimą, pirmą kartą nustatytas lektinų turinčių baltymų frakcijų, išskirtų iš didžiųjų dilgėlių žolės, citotoksinis, antimutageninis ir antioksidacinis aktyvumas.
Tyrimui paruošta publikacija „A lectin-rich fraction from aerial parts of Urtica dioica L. with antimutagenic activity” (Antonella Di Sotto, Gabriela Mazzanti, Nijolė Savickienė, Rasa Staršelskytė, Vaida Bakšenskaitė, Silvia Di Giacomo, Annabella Vitalone) ir atiduota žurnalo „Pharmaceutical biology” redakcijai. Paruošti pranešimai dviejose Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Studentų mokslinės draugijos (SMD) organizuojamose konferencijose: tarptautinėje konferencijoje International Health Science Conference 2013, Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje 2013 (Farmacijos sekcijoje užimta pirmoji vieta ir tezės pristatytos plenarinėje sesijoje). Taip pat pristatytas stendinis pranešimas tarptautinėje konferencijoje „Отечественные противоопухолевые препараты 2013”, kuri vyko Minske.
Tikslas: Urtica doica L. žolės baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, antimutageninio,
citotoksinio ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.
Uždaviniai:
1. Įvertinti Urtica dioica L. lektinų turinčių baltymų frakcijų įtaką Salmonella
typhimurium ir Escherichia coli kamienų mutageniškumui, naudojant AMES testo metodą.
2. Ištirti Urtica dioica L. lektinų turinčių baltymų frakcijų citotoksiškumą HepG2 ląstelių proliferacijai, naudojant MTT dažo redukcijos reakcijos metodą.
3. Ištirti Urtica dioica L. lektinų turinčių baltymų frakcijų antioksidacinį aktyvumą, naudojant modelinius ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)) ir superoksido radikalus.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Biologiškai aktyvių junginių - lektinų, apibūdinimas
Lektinai – tai glikoproteinai, randami įvairiuose organizmuose. Jie buvo aptikti 1888 m., kai Peter Hermann Stillmark paprastojo ricinmedžio (Ricinus communis L.) sėklų ekstraktuose atrado hemagliutininą ir pavadino jį ricinu (Sharon et al., 2004). Iš gyvūnų išskirtų lektinų kiekiai paprastai yra maži, lyginant su augaliniais lektinais. Lektinai turi priešvėžinių, imunomoduliacinių, priešgrybelinių, inhibuojančių ŽIV-1 atvirkštinę transkriptazę aktyvių savybių, antibakterinį ir apvaliąsias kirmėles naikinantį poveikį (Lam et al., 2011). Dėl savo biologinio aktyvumo ši unikali glikoproteinų grupė susilaukė didelio susidomėjimo ir yra naudojama imunologijoje, membranų struktūros, ląstelių atpažinimo, vėžio tyrimuose ir klinikinėje mikrobiologijoje (Bah et al., 2013). Lektinai pasižymi specifiškumu angliavandeniams, turi bent vieną tretinės baltymų struktūros elementą, kuris grįžtamai jungiasi prie specifinių monosacharidų ir oligosacharidų, gali agliutinuoti eritrocitus.
Lektinai yra apibūdinami kaip baltymai, kurie gali prisijungti prie angliavandenių, tačiau jie nėra antikūnai ar fermentai. Literatūros šaltiniuose yra nurodomi trys lektinų ypatumai:
1. Lektinas yra glikoproteinas, kuris prisijungia prie agliavandenių. Šiuo apibūdinimu lektinai yra išskiriami iš kitų junginių grupių, tokių, kaip taninai, tam tikri lipidai, katijoniniai junginiai ir giminingi angliavandeniai, kurie sukelia angliavandenių tarpusavio sąveikas (Rüdiger & Gabius, 2001).
2. Lektinai nėra imunoglobulinai (antikūnai). Iš pradžių lektinai dėl savo specifiškumo buvo apibūdinami kaip medžiagos, kurios yra panašios į antikūnus. Vėliau šio apibrėžimo atsisakyta, nes imunoglobulinų sintezei reikia antigeninio veiksnio. Visgi yra žinoma, kad lektinų sintezė gali suintensyvėti dėl išorinio stimulo, pavyzdžiui, augalų lektinų ekspresija padidėja dėl virusinės infekcijos, sausros ar didelės druskų koncentracijos (Rüdiger & Gabius, 2001).
3. Lektinai nepakeičia angliavandenių, prie kurių prisijungia, biocheminės struktūros. Šis ypatumas lektinus atskiria nuo glikoziltransferazių, glikozidazių ir fermentų, kurie į angliavandenių struktūrą įterpia pakaitą, pavyzdžiui, sulfato grupę. Yra žinomos tam tikros glikozidazės, kurios agliutinuoja ląsteles žemoje temperatūroje, jeigu jų prisijungimas prie ląstelės paviršiaus angliavandenių įvyksta greičiau nei glikozidinių jungčių hidrolizė. Lektinams nėra priskiriami prie angliavandenių prisijungiantys baltymai, kurie sudaro kompleksinius junginius tik su monosacharidais ir disacharidais,
bet nesudaro ryšių su polisacharidais (pvz., kai kurie transportiniai baltymai, chemotaksyje dalyvaujantys receptoriai) (Rüdiger & Gabius, 2001).
4.2. Lektinų paplitimas ir funkcijos augaluose
Daugiausiai lektinų turi tokios augalų šeimos kaip Leguminosae (pvz., sojos agliutininas),
Gramineae (pvz., kviečių gemalų agliutininas), Solanaceae (pvz., pomidorų lektinas). Lektinai gali
būti paplitę įvairiose augalų dalyse: lapuose, stiebuose, žievėje, šakniagumbiuose, šakniastiebiuose, šaknyse, vaisiuose, žieduose, floemoje (karnienoje) ir kt. Lektinų kiekis šiose augalų dalyse yra labai įvairus, kinta priklausomai nuo metų laiko ir dažniausiai yra daug mažesnis nei sėklose, tačiau kartais gali sudaryti 30 proc. viso augalo dalies baltymų kiekio. Sėklose esantys lektinai randami sėklaskiltėse arba endosperme ir gali sudaryti iki 10 proc. viso baltymų kiekio (Sharon & Lis, 2007; Bah et al., 2013).
Daugiausiai augaliniai lektinai yra kaupiami ląstelės vakuolėje, tačiau jie taip pat nustatyti ląstelės citoplazmoje, branduolyje ir tarpląstelinėje terpėje. Šie glikoproteinai yra sintetinami šiurkščiajame endoplazminiame tinkle, o vėliau transportuojami per Goldžio aparatą. Skirtingai nei sekreciniai baltymai, kurie pūslelių pagalba prasiskverbia pro membraną ir išsiskiria iš ląstelės egzocitozės būdu, lektinai, kaip ir kiti atsarginiai baltymai, patenka į vakuolę (Rüdiger & Gabius, 2001; Peumans & Van Damme, 2005).
Lektinai atlieka daug skirtingų ir svarbių funkcijų augaluose. Jie dalyvauja augalo angliavandenių transporte, ląstelės sienelės ilgėjimo, tarpląstelinių sąveikų, augimo, membranų receptorių atpažinimo, kryžminio apdulkinimo, simbiozės su bakterijomis procesuose, be to, vykdo atsarginių baltymų ir fermentų funkcijas (Peumans & Van Damme, 2005). Lektinai apsaugo augalus nuo vabzdžių ir patogeninių mikroorganizmų, prisijungdami prie jų paviršiuje esančių glikoproteinų ir veikdami jų dauginimosi, augimo ir vystymosi procesus. Nustačius įvairių lektinų insekticidines savybes, paaiškėjo, jog baltosios snieguolės (Galanthus nivalis L.) agliutininas (GNA) turi vieną stipriausių insekticidinį aktyvumą (Michiels et al., 2010). Lektinų dalyvavimas augalų gynyboje nuo patogeninių mikroorganizmų buvo aprašytas, ištyrus, kad paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA), valgomojo arachio (Arachis hypogaea L.) agliutininas (PNA) ir gauruotosios sojos (Glycine max L.) lektinas (SBA) sustabdė Trichoderma viride, Penicilium notatum ir Aspergillus
niger sporų vystymąsi ir augimą (Sharon et al., 2004). Toksiški lektinai, tokie kaip paprastojo
ricinmedžio (Ricinus communis L.) agliutininas (RCA) ir daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.) lektinas (PHA), apsaugo augalus nuo gyvūnų (Rüdiger & Gabius, 2001). Lektinai prisijungia prie glikokonjugatų, esančių žarnyno ląstelių membranų paviršiuje, ir sutrikdo normalią gyvūnų žarnyno
funkciją. Dėl šios priežasties gyvūnai turi evoliucijos eigoje susiformavusį instinktą - neėsti šių augalų (Peumans & Van Damme, 2005).
4.3. Augalinių lektinų biologinis aktyvumas
4.3.1. Priešvėžinis aktyvumas
Augalų lektinai pasižymi dideliu biologiniu aktyvumu. Dauguma lektinų yra rezistentiški virškinimui. Jie prisijungia prie virškinimo kanalo gleivinės ląstelių ir/arba patenka į kraujo apytaką, išlaikydami savo biologinį aktyvumą. In vitro ir in vivo bandymų metu buvo atrasti lektinai, turintys priešvėžinių savybių. Jie jungiasi prie vėžinių ląstelių ar jų receptorių, ir taip išreiškia savo citototoksiškumą, sukeldami ląstelių apoptozę ar inhibuodami auglio augimą. Svarbu paminėti, kad lektinai slopina vėžinių ląstelių DNR, RNR ir baltymų sintezę, bet neturi šio poveikio sveikoms ląstelėms. Šie junginiai gali sukelti vėžinių ląstelių agregaciją ir/arba agliutinaciją. Lektinai paveikia žarnų sienelių ląsteles taip, kad jos suriša poliaminus, apriboja organizmo poliaminų išteklius ir tokiu būdu stabdo navikinių ląstelių augimą. Jie taip pat turi poveikį imuninei sistemai, nes keičia įvairių interleukinų gamybą ir aktyvuoja tam tikras proteinų kinazes. Lektinai gali jungtis prie kelių angliavandenių, esančių limfocitų paviršiuje, ir yra polikloniniai žmogaus limfocitų aktyvatoriai. Šie augaliniai junginiai gali jungtis prie ribosomų ir inhibuoti baltymų sintezę, sumažinti telomerazės aktyvumą ir slopinti angiogenezę. Lektinai kaip priešnavikiniai preparatai turi didelį potencialą, tačiau yra būtini tolimesni tyrimai. Vieni iš svarbesnių lektinų, kurie turi priešvėžinį aktyvumą, yra paprastosios pupos (Vicia faba L.) agliutininas (VFA), paprastojo amalo (Viscum album L. ) agliutininas (VAA), uodeguotojo burnočio (Amaranthus caudatus L.) lektinas (ACA), lenktosios kardapupės (Canavalia ensiformis L.) lektinas (ConA), paprastojo ricinmedžio (Ricinus communis L.) agliutininas (RCA), paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA), gauruotosios sojos (Glycine max L.) agliutininas (SBA), daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.) lektinas (PHA), didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) agliutininas (UDA) ir kt. (De Mejía & Prisecaru, 2005; Bah et al., 2013).
Buvo įrodyta, kad gauruotosios sojos (Glycine max L.) agliutininas (SBA) slopino krūties vėžio ląstelių MCF7 ir kepenų vėžio ląstelių HepG2 proliferaciją (Lin et al., 2008). Vieno tyrimo rezultatai parodė, kad paprastojo ricinmedžio (Ricinus communis L.) agliutininas (RCA) suaktyvino kaspazes ir sukėlė Hodžkino limfomos L540 ląstelių apoptozę (Letizia et al., 2009). Daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.) lektino (PHA) įtraukimas į mitybą stipriai sumažino pelių ne Hodžkino limfomos naviko augimą (Liu et al., 2010). Klinikinių tyrimų metu nustatyta, kad paprastųjų amalų
vandeninis ekstraktas, praturtintas Viscum album L. lektinais (ML) buvo saugus ir efektyvus, pagerinant krūties vėžiu sergančių pacienčių gyvenimo kokybę (Semiglazov et al., 2006). Vieno tyrimo metu buvo nustatytas priešvėžinis Viscum album L. agliutinino (VAA-1) poveikis, veikiant vienam ir kartu su chemoterapiniais vaistais (doksorubicinu, cisplatina, taksoliu) žmogaus plaučių naviko ląstelėse. Stiprus sinergistinis VAA-1 poveikis buvo išreikštas kartu su visais tirtais vaistais (Siegle et al., 2001). Lenktosios kardapupės (Canavalia ensiformis L.) konkavalinas A (ConA) sukėlė melanomos ląstelių A375 mirtį, pažeisdamas mitochondrijas, aktyvindmas kaspazes, inicijuodamas apoptozę (Liu, 2009). A. Merkel vėžinių ląstelių sąveikos su lektinais tyrimai pademonstravo, kad N-acetilgliukozaminui specifiški UDA (Urtica dioica agliutininas) lektinai stipriai jungiasi prie navikinės stromos ląstelių (Sames et al., 2001).
4.3.2. Mitogeninis aktyvumas
Vienas iš svarbiausių tyrimų lektinų istorijoje buvo atliktas 1960 m., kai Peter C. Nowell nustatė, kad daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.) lektinas (PHA) stimuliuoja limfocitų mitozę. Vėliau buvo atrasti ir kiti lektinai, turintys mitogeninį aktyvumą. Mitogeniniai lektinai veikia panašiai kaip antigenai, tačiau lektinai aktyvina 70-80 proc. limfocitų, o antigenai stimuliuoja tik specifinius klonus, kurie sudaro nedidelę dalį limfocitų. Dėl šios savybės lektinai yra priskiriami polikloniniams mitogenams. Lenktosios kardapupės (Canavalia ensiformis L.) konkavalinas A (ConA) yra svarbus mitogenas, nes skirtingai nei PHA, jį gali inhibuoti mažos monosacharidų, pavyzdžiui, manozės koncentracijos. Šis atradimas įrodė, kad lektinų mitogeninio aktyvumo priežastis yra jų jungimasis prie limfocitų paviršiuje esančių angliavandenių. Manoma, kad lektinai sąveikauja su specifiniais membranų komponentais, kurie veikia kaip stimuliuojantys mitozę receptoriai, o nemitogeniniai lektinai prie šių komponentų neprisijungia. Dėl šios ypatybės lektinai, turintys mitogeninį aktyvumą, yra naudojami signalo perdavimo ląstelėje ir aktyvuotų limfocitų biocheminių procesų tyrimuose in
vitro (Sharon & Lis, 2004; Bah et al., 2013).
Dauguma lektinų aktyvina tik T ląstelių mitozę, o kitus limfocitus inhibuoja arba jų neveikia. Buvo nustatyta, kad stiprų žmogaus limfocitų proliferaciją stimuliuojantį poveikį turi didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) lektinai (CMI). Atlikus tyrimus paaiškėjo, kad valgomojo lęšio (Lens culinaris L.) lektinas (LCA) stimuliuoja ne tik žmogaus T ląstelių, bet ir B ląstelių proliferaciją (Ashraf & Khan, 2003). Mitogeninį aktyvumą turintys lektinai – geltonžiedžio žingio (Arisaema flavum L.) lektinas (AFL), stambiojo duonmedžio (Artocarpus heterophyllus L.) agliutininas, paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA), juoduogio šeivamedžio (Sambucus
dilgėlės (Urtica dioica L.) agliutininas (UDA) ir kt. (Ashraf & Khan, 2003; Bah et al., 2013).
4.3.3. Priešvirusinis aktyvumas
Lektinų priešvirusinis aktyvumas priklauso nuo jų specifiškumo angliavandeniams ir gali būti paaiškinamas keliais veikimo mechanizmais. Retrovirusų, pavyzdžiui, žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) paviršius yra padengtas užkoduotais glikoproteinais. ŽIV paviršiuje esantys glikoproteinai gp120 ir gp41 yra stipriai glikozilinti (gp120 angliavandenių dalis sudaro daugiau nei 50 proc. molekulinės masės). Prie angliavandenių prisijungiantys baltymai gali sudaryti ryšius su viruso paviršiuje esančiais glikanais ir taip sutrikdyti viruso sąveiką su šeimininko ląstelėmis. Kitas lektinų veikimo mechanizmas yra ŽIV atvirkštinės transkriptazės, pagrindinio viruso cikle dalyvaujančio fermento, slopinimas. Dauguma augalinių lektinų, inhibuojančių žmogaus imunodeficito virusą, yra kilę iš vienaskilčių augalų šeimų, pavyzdžiui, Amaryllidaceae, Orchidaceae, Alliaceae, ir dviskilčių augalų šeimų, tokių kaip Fabaceae, Moraceae, Urticaceae and Cecropiaceae (Bah et al., 2013).
Tyrimai parodė, kad lektinai gali būti potencialūs koronavirusų inhibitoriai, nes sutrikdo viruso replikacijos ciklą. Pirmasis lektinų taikinys buvo nustatytas ankstyvajame replikacijos cikle, o antrasis – ciklo pabaigoje. Ištirta, kad itin veiksmingi prieš koronavirusus yra manozei specifiški lektinai, pavyzdžiui, daržinio poro (Allium porrum L.) agliutininas (APA). Taip pat įrodyta, kad lektinai gali užkirsti kelią viruso įsiskverbimui į šeimininko ląstelę. Dėl šios savybės jie yra tinkami išoriniam vartojimui, ir yra mažiau toksiški nei daugelis dabartinių priešvirusinių vaistų (Bah et al., 2013).
4.3.4. Antibakterinis aktyvumas
Lektinai yra veiksmingi prieš Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis ir Klebsiella sp. Augalų lektinai negali pakeisti bakterijos
membranos struktūros ir/ar pralaidumo arba sutrikdyti normalius bakterijos viduląstelinius procesus. Visgi, lektinai atlieka svarbų vaidmenį augalų apsaugoje nuo bakterijų, todėl, manoma, kad jie veikia bakterijas netiesiogiai, sąveikaudami su ląstelės sienelės angliavandeniais ar ekstraląsteliniais glikanais. Nustatyta, kad lektinai jungiasi su bakterijų sienelėje esančiais peptidoglikanais, lipopolisacharidais ir teicho rūgštimis ir taip neigiamai veikia gram–teigiamas ir gram–neigiamas bakterijas. Antibakterinį poveikį turi vienažiedės eugenijos (Eugenia uniflora L.) lektinas (EUL),
aliejinės moringos (Moringa oleifera L.) agliutininas (MOL), mimozinio senmedžio (Archidendron
jiringa Jack, I.C. Nielsen) lektinas (AJL) ir kt. (Paiva et al., 2010; Bah et al., 2013).
4.3.5. Priešgrybelinis aktyvumas
Lektinai slopina grybelių augimą netiesiogiai, prisijungdami prie ląstelės sienelės angliavandenių. Kaip ir bakterijų atveju, lektinai negali prisijungti prie membranos glikokonjugatų, patekti į citoplazmą ar pakeisti membranos struktūrą ir/arba pralaidumą. Manoma, kad lektinai specifiškai prisijungia prie tam tikrų grybelio sienelės angliavandenių ir taip pakeičia jos aktyvumą bei gyvybingumą. Dauguma lektinų atpažįsta acetilneuramino rūgštį, acetilgliukozaminą, N-acetilgalaktozaminą, galaktozę, manozę ir fukozę. Lektinų prisijungimas prie grybelių hifų sutrikdo maistinių medžiagų absorbciją ir sporų augimą (Paiva et al., 2010; Bah et al., 2013).
Atlikus tyrimus, buvo nustatytas ir kitas lektinų priešgrybelinio veikimo mechanizmas, susijęs su chitinu. Šis pagrindinis grybelio ląstelės sienelės komponentas yra sudarytas iš modifikuotų gliukozės vienetų (N-acetilgliukozamino). Lektinai gali atpažinti N-acetilgliukozaminą kaip gliukozę ir taip imituoti sąveiką su angliavandeniais. Prisijungiant prie chitino, lektinai suardo ląstelės sienelę, pasižymi didesniu toksiškumu. Priešgrybeliniai lektinai yra sėjamojo žirnio (Pisum sativum L.) lektinas (PSL), krūminės paprikos (Capsicum frutescens L.) (CFL) lektinas, daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.) lektinas (RKBL), soforos (Sophora alopecuroides L.) lektinas (SAL), dygliuotojo kapario (Capparis spinosa L.) lektinas (CSL) ir kt. Ištirta, kad lektinai yra veiksmingi prieš Aspergillus flavus, Trichoderma viride, Fusarium oxysporum, Fusarium moniliforme, Coprinus
comatus, Rhizoctonia olani, Penicillium digitatum, Alternaria alternata, Valsa mali grybelius (Paiva et
al., 2010; Bah et al., 2013).
4.4. Lektinų pritaikymas
Lektinai yra plačiai naudojami įvairiuose moksliniuose tyrimuose, bet daugiausiai – susijusiuose su angliavandenių aptikimu, identifikavimu ir funkciniu įvertinimu. Lektinai turi nemažai privalumų, tokių, kaip paplitimas, skirtingas specifiškumas ir geras stabilumas. Specifinė medžiagos ar ląstelės sąveika su lektinu gali būti laikoma įrodymu, kad jos turi angliavandenių. Todėl lektinų jungimasis su angliavandeniais buvo dažnai naudojamas, norint įrodyti, kad daugelio hormonų, augimo faktorių, neurotransmiterių ir toksinų receptoriai yra glikokonjugatai. Be to, lektinai yra
bandomi kaip vaistų, fermentų, nukleino rūgščių, genų ir kitų ląstelinių medžiagų taikiniai (Sharon & Lis, 2007).
Daugiausiai lektinai yra naudojami glikoproteinų identifikavimui, išskyrimui, struktūros tyrimams; angliavandenių, esančių ant ląstelių ir subląstelinių organoidų, tyrimams; histochemijai ir citochemijai; baltymų glikozilinimo tyrimams; neuronų žemėlapių sudarymui; ląstelių identifikavimui ir atskyrimui; mitogeninei limfocitų stimuliacijai; diagnozei ir kaip taikiniai; lektinams atsparių mutantų selekcijai. Skirtingai nei moksliniuose tyrimuose, lektinų pritaikymas klinikinėje praktikoje yra siauresnis. Jie yra panaudojami kraujo grupės nustatymui, kariotipavimui, kaulų čiulpų išvalymui, paciento imuniteto būklės nustatymui ir Gošė ligos gydymui (Sharon & Lis, 2007).
Vis daugiau yra išskiriama naujų lektinų ir atliekama jų biologinio aktyvumo tyrimų, todėl lektinų gamyba gali būti tobulinama ir atrandamos naujos jų pritaikymo galimybės. Lektinai galėtų būti naudojami kaip naujos kartos vaistai, jei būtų iki galo suprastas jų veikimas. Reikia daugiau mokslinių tyrimų, kad lektinai būtų patvirtinti kaip priešvėžinės, antimikrobinės priemonės ir vaistų nešikliai. Norint žinoti lektinų biologinio aktyvumo pagrindą, reikia tęsti jų tyrimus molekuliniame lygmenyje (Bah et al., 2013).
4.5. Didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) lektinas (UDA)
Didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) agliutininas (UDA) yra monomerinis baltymas, kurio molekulinė masė yra 8.5 kDa. Nuo kitų augalų lektinų jis skiriasi molekuline struktūra ir itin mažu specifiniu agliutinacijos aktyvumu. Atlikus tyrimus, buvo identifikuoti genai, koduojantys septynis UDA izolektinus su 79-99 proc. aminorūgščių sekų homologija. Cheminės sudėties analizė parodė, kad IV UDA izolektiną sudarantys du domenai yra sujungti tetrapeptidine grandine ir susideda atitinkamai iš 42 ir 43 aminorūgščių su 42 proc. sekų homologija. Domenai yra sudaryti iš nelygiagrečių β klosčių. Kiekvienas Urtica dioica agliutinino domenas turi angliavandenius prijungiančią sritį, tačiau skiriasi savo trauka ligandams. Angliavandenius prijungiančios sritys yra išsidėsčiusios molekulės paviršiuje. UDA, kaip ir paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA), yra specifiškas β-1,4-glikozidiniu ryšiu susijungusiems N-acetilgliukozamino oligomerams (Sharon & Lis, 2007; Galelli et al., 1993).
Daugiausia biologinio aktyvumo tyrimų atlikta su lektinais, išgautais iš didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) šaknų. Buvo ištirta, kad Urtica dioica agliutininas slopina epiderminio augimo faktoriaus (EAF) prisijungimą prie jo receptoriaus (EAF-R) epidermoidinės karcinomos A431 linijos ląstelėse. Kiti lektinai, tokie kaip paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA), kuris turi tą patį specifiškumą angliavandeniams kaip ir UDA lektinas, ir manozei specifiškas
lenktosios kardapupės (Canavalia ensiformis L.) konkavalinas A (Con A), buvo mažiau aktyvūs nei didžiosios dilgėlės agliutininas. Inhibicinis Urtica dioica agliutinino poveikis buvo panaikintas su N-acetilgliukozamino trimeru. Manoma, kad UDA lektinas gali būti pagrindinis didžiųjų dilgėlių vaistinės žaliavos – šaknų, junginys, kuris nulemia prostatą gydantį poveikį, nes blokuoja epiderminio augimo faktoriaus receptorius prostatos audinyje (Wagner et al., 1995).
Nustatyta, kad chitiną prisijungiantis Urtica dioica agliutininas inhibuoja chitino sintezę ir/arba nusėdimą ir taip sustabdo grybelio augimą. Didžiųjų dilgėlių vaistinės žaliavos – šaknų, lektino poveikis grybelio ląstelės sienelei ir hifų morfologijai parodė, kad šis agliutininas reguliuoja šaknų endotrofinę mikorizę (Lam et al., 2011). Antimikrobinio aktyvumo tyrimai įvertino, kad N-acetilgliukozaminui (GlcNAc) specifiški didžiųjų dilgėlių šaknų lektinai yra aktyvūs prieš tokius mikroorganizmus kaip Botrytis cinerea, Colletotrichum lindemuthianum, Phoma betae, Phycomyces
blakesleeanus, Septoria nodorum, Trichoderma hamatum ir Trichoderma viride (Paiva et al., 2010).
Iš specifiškų N-acetilgliukozaminui (GlcNAc) lektinų tik Urtica dioica agliutininas parodė stiprų veikimą prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) (Wu & Bao, 2013). UDA lektinas inhibavo Simian imunodeficito virusą (SIV) ir du žmogaus imunodeficito viruso tipus (ŽIV-1, ŽIV-2) (Francois et al., 2008). Buvo ištirtas inhibicinis UDA lektino poveikis ūmaus kvėpavimo takų sindromo (SARS) sukelėjui koronavirusui mirtinai užkrėstuose BALB/c pelių modeliuose. Urtica dioica agliutininas sumažino plaučių patologiją ir apsaugojo peles nuo svorio mažėjimo bei mirties. Vėliau buvo nustatyta, kad šį terapinį efektą pelėms UDA lektinas sukelia, inhibuodamas ankstyvąsias koronaviruso replikacijos stadijas: adsorbciją ir infiltraciją. Didžiųjų dilgėlių vaistinės žaliavos lektinas prisijungia prie N-acetilgliukozamino liekanų, esančių glikozilintame baltyminiame apvalkale, ir neleidžia koronavirusui prisijungti prie ląstelės (Kumaki et al., 2011).
Urtica dioica lektinas yra T ląstelių mitogenas, tačiau iš kitų mitogeniškų lektinų išsiskiria savo savybe neveikti CD4+ ir CD8+ T ląstelių, specifiniu T limfocitų aktyvinimo būdu ir citokinų gamyba. Urtica dioica agliutinino molekulinis T limfocitų aktyvinimo mechanizmas yra panašus į struktūriškai nesusijusių bakterinių ir retrovirusinių superantigenų, T ląsteles aktyvuojančių baltymų, veikimo mechanizmą, todėl UDA lektinas yra priskiriamas superantigenams (Galelli et al., 1993). Tyrimai parodė, kad didžiųjų dilgėlių vaistinės žaliavos – šaknų lektinas neleidžia progresuoti eksperimentinėse pelėse dirbtinai sukeltai sisteminei raudonajai vilkligei. UDA lektinu gydytoms pelėms neišsivystė akivaizdūs šios autoimuninės ligos klinikiniai požymiai ir nefritas. Be to, Urtica dioica agliutininas sumažino antikūnų gamybą tik moteriškos lyties pelėse (Musette et al., 1996).
N. Savickienė ir kt. (2012) išskyrė lektinais praturtintas baltymų frakcijas iš žolės (šviežios ir džiovintos) bei sausojo dilgėlių ekstrakto, nustatė jose baltymų, lektinų kiekį ir agliutinacinį aktyvumą, naudojant tripsinu paveiktus triušio eritrocitus. Baltymų kiekis šviežioje ir džiovintoje Urtica dioica L. žolėje, lyginant pirmąją frakciją (pirminio ekstrakto, prisotinto iki 40 proc. amonio sulfato tirpalu,
nuosėdos) su antra (pirminio ekstrakto, prisotinto iki 80 proc. amonio sulfato tirpalu, nuosėdos), didesnis buvo antrojoje. Šviežios Urtica dioica L. žolės baltymų ekstraktas pasižymėjo specifiniu agliutinaciniu aktyvumu prieš tripsinu paveiktus triušio eritrocitus. Šviežios Urtica dioica L. žolės antrojoje frakcijoje (pirminio ekstrakto, prisotinto iki 80 proc. amonio sulfato tirpalu, centrifūgate) stebėtas didžiausias agliutinacinis aktyvumas. Didžiausias lektinų kiekis (0.02 – 0.33 proc.) buvo baltymų frakcijose, iškirtose iš sausojo Urtica dioica L ekstrakto.
4.7. Natūralūs antimutagenai
Mutagenai dalyvauja ne tik genotoksiškumo ir kancerogenezės procesuose, bet ir lėtinių ligų, pavyzdžiui, kepenų, neurodegeneracinių, širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto, artrito, lėtinio uždegimo, pradžioje ir patogenezėje. Vienas iš būdų, mažinant mutagenų žalingą poveikį, yra natūralių antimutagenų vartojimas. Mokslinių tyrimų metu atrandama ir išskiriama vis daugiau natūralių antimutagenų, kurie apsaugo nuo kai kurių toksinių cheminių medžiagų. Jiems yra priskiriami flavonoidai, kumarinai, karotenoidai, antrachinonai, taninai, saponinai ir kiti junginiai (Bhattacharya, 2011).
Atliekami įvairūs bandymai su prokariotinėmis ir eukariotinėmis ląstelėmis, nustatant aplinkos mutagenus ir kancerogenus, juos pritaikant antimutageniniam potencialui ir veikimo mechanizmui ištirti. Populiarūs neilgai trunkantys ir nereikalaujantys didelių sąnaudų antimutageniniai tyrimai yra testai su bakterijomis. Jie suteikia preliminarią, tačiau svarbią informaciją apie antimutagenezės metu vykstančius ląstelinius procesus. Panaudojus žinduolių fermentus, antimutageninio aktyvumo tyrimai su bakterijomis gali suteikti informaciją apie junginio metabolinę aktyvaciją arba detoksikaciją, kurios galėtų įvykti in vivo. Po kelis dešimtmečius trukusių tyrimų su bakterijų ir žinduolių ląstelėmis buvo išsamiai ištirtas įvairių augalinių junginių antimutageninis poveikis (Nikolić et al., 2012).
Antimutagenai pagal savo veikimo mechanizmą yra skirstomi į desmutagenus ir bioantimutagenus. Desmutagenai yra medžiagos, kurios fermentinės arba cheminės sąveikos metu dalinai arba visiškai inaktyvuoja mutagenus. Šie antimutagenai veikia, dar neįvykus mutageno sąveikai su DNR. Bioantimutagenai slopina mutacijos procesą jau po įvykusio genų pažeidimo. Jie gali teigiamai veikti mutageno paveiktos DNR taisymo ir replikacijos procesus (Bhattacharya, 2011). In
vitro ir in vivo tyrimų metu atrasti įvairūs augaliniai antimutagenai, turintys skirtingus veikimo
mechanizmus. Terpenoidų frakcija, išskirta iš vaistinio šalavijo (Salvia officinalis L.), žymiai sumažino chromosomų struktūros pakitimų skaičių pelėse, paveiktose mitomicinu C (Vujosevic & Blagojevic, 2004). Vieno palyginamojo tyrimo metu buvo nustatyta, kad vaistinio šalavijo (Salvia
officinalis L.), kvapiojo baziliko (Ocimum basilicum L.) monoterpenais praturtinti ekstraktai ir
monoterpenų frakcijos veikė kaip desmutagenai ir bioantimutagenai (Nikolić et al., 2012). Kvapiojo mairūno (Origanum majorana L.) ekstraktai parodė antimutageninį poveikį prieš netiesioginio veikimo mutagenus, todėl, manoma, kad slopino citochromo CYP 1A2 izofermento aktyvumą (Khan et al., 2012). Sieros junginiai, išskirti iš vaistinės pikulės (Sisymbrium officinale L.) sausojo vandeninio ekstrakto, sumažino tiesioginių ir netiesioginių mutagenų aktyvumą ir manoma, kad veikė specifinius mechanizmus, pavyzdžiui, DNR nukleotidų iškerpamąją pataisą (ekscizinę reparaciją) (Di Sotto et al., 2012). Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit lektino antimutageninis aktyvumas ištirtas bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymu (Ames testu), naudojant S. typhimurium TA98 kamieną. Tyrimo rezultatai parodė, kad šis lektinas turi stiprų antimutageninį poveikį prieš mutageną Trp-P-1 (3-Amino-1,4-dimetil-5H-pirido[4,3-b]indolą) (Inglum et al., 2011). Atlikus Ames testą, paprastojo amalo (Viscum album L. var. coloratum) agliutininas (VCA) parodė nestiprų antimutageninį poveikį prieš tiesioginio veikimo mutagenus natrio azidą (SA) ir furilfuramidą (AF-2) ir buvo veiksmingesnis prieš netiesioginio veikimo mutageną 2-aminoantraceną (2-AA) (Hong & Lyu, 2012). Juoduogio šeivamedžio (Sambucus nigra L.) lektinai Kinijos žiurkėno ląstelėse sumažino nikelio chlorido (NiCl2)
sukeltą DNR pažaidą. Manoma, kad apsauginis Sambucus nigra L. lektinų veikimo mechanizmas yra DNR reparacijos aktyvinimas, nikelio pasisavinimo mažinimas ir nespecifinis nikelio jonų jungimasis su baltymų molekulėmis (Macewicz et al., 2005).
5. TYRIMO METODIKA
5.1. Tyrimo medžiaga
Šviežios Urtica dioica L. žolės lektinais praturtintos baltymų frakcijos, paruoštos LSMU farmakognozijos katedroje, bendradarbiaujant su Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro sodininkystės ir daržininkystės institutu (Babtai, Lietuva). Baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, buvo išskirtos iš Urtica dioica L. žolės, išsūdant 80 proc. amonio sulfato tirpalu. Frakcijų dalelių dydis (120 kDA ir 30 kDA) nustatytas SDS-PAGE elektroforezės metodu. 1ml Urtica dioica L. žolės lektinais praturtintų baltymų frakcijų, ištirpintų fosfatiniame buferyje be natrio chlorido, yra 8,922 mg baltymų ir 3,46 mM amonio sulfato (Savickienė ir kt., 2012).
5.2. Reagentai
2-nitrofluorenas (2-NF) 98 proc., CAS numeris 607-57-8, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV 2-aminoantracenas (2-AA) 96 proc., CAS numeris 613-13-8, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV Natrio azidas (SA) > 99.5 proc., CAS numeris 26628-22-8, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV Metilmetano sulfonatas (MMS) 99 proc., CAS numeris 66-27-3, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
Dimetilsulfoksidas (DMSO) >99.5 proc., CAS numeris 67-68-5, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
S9 metabolinės aktyvacijos sistema, Moltox®, Molecular Toxicology, Boone, JAV
Salmonella typhimurium TA98 (hisD3052galbiochl1008rfa1001 ΔuvrBpKM101) kamienas, Research
Toxicological Centre, Roma, Italija
Salmonella typhimurium TA100 (hisG56galbiochl1005rfa1004ΔuvrB pKM101) kamienas, Research
Toxicological Centre, Roma, Italija
Escherichia coli WP2uvrA (trpE65ΔuvrA) kamienas, Research Toxicological Centre, Roma, Italija
Žmogaus kepenų vėžio HepG2 ląstelių linija, ATCC® 77400TM, American Type Culture Collection, Milanas, Italija
Mitybos terpė, Oxoid®, Basingstoke, Didžioji Britanija Mitybos agaras, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
Bakteriologinis agaras, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
5.3. Įranga
Mikroplokštelių spektrofotometras, BioTeK®, Winooski, JAV Inkubatorius, Jouan®, Ramsey, JAV
Laminarinė traukos spinta, Steril®, Milanas, Italija Vandens vonia 750, Asal®, Milanas, Italija
5.4. Analitiniai metodai
5.4.1. AMES testas (bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas)
5.4.1.1. Reagentų paruošimas
Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos ištirpintos steriliame dejonizuotame vandenyje ir praskiestos serijiniu būdu (praskiedimo santykis 1:2). Mutagenai: 2-nitrofluorenas (2-NF) ir 2-aminoantracenas (2-AA), ištirpinti dimetilsulfokside, o natrio azidas (SA) ir metilmetano sulfonatas (MMS) – dejonizuotame vandenyje. S9 metabolinės aktyvacijos sistema (supernatantas iš žiurkių (paveiktų fenobarbitalio/β-naftoflavono mišiniu) kepenų lątelių mitochondrijų) paruošta prieš pat naudojimą, sumaišius 500 µl fosfatinio buferio (0.2 M), 130 µl dejonizuoto vandens, 100 µl KCl (0.33 M), 80 µl MgCl2 (0.1 M), 100 µl S9 frakcijos, 50 µl gliukozės-6-fosfato (0.1 M) ir 40 µl NADP (0.1 M). Tyrimo metu mišinys laikomas ant ledo.
5.4.1.2. Bakterijų kamienai
AMES testui naudojami trys bakterijų kamienai: Salmonella typhimurium TA98 (hisD3052galbiochl1008rfa1001 ΔuvrBpKM101), Salmonella typhimurium TA100 (hisG56galbiochl1005rfa1004ΔuvrB pKM101), Escherichia coli WP2uvrA (trpE65ΔuvrA). Kiekvienas iš šių kamienų turi būdingą genotipą, todėl bakterijų kamienai yra jautrūs skirtingiems mutacijų tipams. Dėl mutacijos S. typhimurium TA98, TA100 ir E. coli WP2uvrA negali sintetinti pagrindinės aminorūgšties, tačiau bandymo metu mutagenas pakeičia šių kamienų mutacijas ir sugrąžina jiems funkcinį gebėjimą sintetinti aminorūgštį, t.y. paverčia kamieną į laukinį tipą. S.
typhimurium TA98 ir TA100 negali sintetinti aminorūgšties histidino, nes yra mutacija hisG gene,
atitinkamai, hisD3052 ir hisG46 aleliuose. Mutagenai, kurie sukelia „rėmelio poslinkio” mutaciją (geno kodonų skaitymo pasislinkimą dėl nukleotidų iškritų (delecijų) ir intarpų (insercijų)), paverčia
hisD3052 alelį į laukinį tipą. hisG46 alelio mutacija įvyksta dėl aminorūgšties leucino (GAG/CTC)
pakeitimo aminorūgštimi prolinu (GGG/CCC). Mutagenai, kurie sužadina nukleotido pakaito mutaciją GC bazių poroje, gali S. typhimurium TA100 kamieną paversti į laukinį tipą (Levin & Ames, 1986; DeMarini, 2000). S. typhimurium TA98 ir TA100 kamienai yra netinkami, nustatant oksiduojančius mutagenus, pavyzdžiui, laisvųjų radikalų generatorius, kurie veikia adenozino ir timino nukleotidų poras. Tokios oksiduojančios medžiagos gali būti nustatomos, tiriant E. coli WP2uvrA kamieną (OECD, 1997). E. coli WP2uvrA yra priklausoma nuo triptofano dėl pakaitos trpE65 alelyje. Ši
mutacija atsiranda, įvykus klaidingam pažaidų taisymui arba replikacijai adenino ir timino sekoje. Mutagenai, kurie indukuoja nukleotido pakaito mutaciją, gali paversti kamieną į laukinį tipą (Brusick et al., 1980; Ohta et al., 2002). Atsižvelgiant į galimą reaktyvių deguonies formų (ROS) įtaką genotoksinių procesų indukcijai, tyrime naudota E. coli WP2uvrA padidina bakterijų kamienų jautrumą skirtingoms genotoksinėms žaloms (Wilcox et al., 1990).
Prieš pradedant tyrimą, eksperimentinės bakterijų kultūros, kurios paruošiamos iš užšaldytų pradinių bakterijų kultūrų, inkubuojamos per naktį (16 h, 37 °C), kol pasiekiamas tankis 1×109 bakterijų mililitre. Pagal Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 471 metodą (1997) gyvybingų bakterijų skaičius nustatomas kiekvieno eksperimento metu. Bakterijų kamienų TA98, TA100 ir WP2uvrA gyvybingumas buvo atitinkamai: 240.0 ± 13.10, 209.0 ± 9.49 ir 371.5 ± 12.87 gyvybingų ląstelių lėkštelėje.
5.4.1.3. Citotoksiškumo nustatymas
Didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijų citotoksiškumas įvertinamas, nustatant revertantų (organizmų, kurie išsivysto po grįžtamosios mutacijos) kolonijų skaičiaus sumažėjimą, lyginant su kontroliniais bandiniais (Maron & Ames, 1983). Šiam tikslui lektinais praturtinta baltymų frakcija (800 µg, 1000 µg, 1200 µg, 1500 µg) įlašinama į per naktį inkubuotas bakterijų kultūras (100 µl) ir S9 metabolinės aktyvacijos sistemos mišinį arba 500 µl fosfatinį buferį (0.1 M). Mėgintuvėliai su mišiniais purtomi kratytuvo pagalba ir inkubuojami (37 °C, 30 min). Pasibaigus išankstinei inkubacijai, TA98 ir TA100 kamienai padengiami agaru (2 ml), turinčiu 10 proc. histidino/biotino (0.5 mM), o WP2uvrA kamienas – agaru, turinčiu 10 proc. triptofano (0.5 mM). Galiausiai šie mišiniai užpilami ant minimalaus agaro, turinčio minimalios Vogel-Bonner terpės ir gliukozės. Po inkubacijos (37 °C, 48 h) skaičiuojamos revertantų kolonijos, galinčios sintetinti histidiną arba triptofaną.
5.4.1.4. Mutageninio aktyvumo nustatymas
Ištyrus citotoksiškumą, nustatyta didžiausia netoksiška didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos koncentracija (800 µg lėkštelėje). Pradedant nuo šios koncentracijos, Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos praskiestos serijiniu būdu (praskiedimo santykis 1:2), ir tyrimui naudotos koncentracijos: 50 µg, 100 µg, 200 µg, 400 µg ir 800 µg. Atsižvelgiant į Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) gaires (1997), įvertinamas lektinais praturtintos
Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos tirpumas galutiniame veikimo mišinyje. Netirpumas gali būti
nustatomas atliekant bandymą ir stebint precipitato susidarymą galutiniame veikimo mišinyje.
Didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos mutageniškumas tiriamas, naudojant išankstinės inkubacijos būdą (Green & Muriel, 1976; Maron & Ames, 1983). Kaip etaloninės medžiagos (teigiami kontroliniai mėginiai) naudojami šie mutagenai: 2-nitrofluorenas (2-NF) (2 µg/lėkštelėje su S.
typhimurium TA98 ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos), 2-aminoantracenas (2-AA) (1
µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA98 ir S9 metabolinės aktyvacijos sistema; 1 µg/lėkštelėje su S.
typhimurium TA100 ir S9 metabolinės aktyvacijos sistema; 10 µg/lėkštelėje su E. coli WP2uvrA ir S9
metabolinės aktyvacijos sistema); natrio azidas (SA) (1 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA100 ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos), metilmetano sulfonatas (MMS) (500 µg/lėkštelėje su E. coli
WP2uvrA ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos). Tirpiklis (dimetilsulfoksidas) naudojamas kaip
neigiamas kontrolinis mėginys.
Per naktį inkubuotos bakterijų kultūros (100 µl) įdedamos į didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakciją arba į mutagenų tirpalus (50 µl), o po to – į S9 metabolinės aktyvacijos sistemos mišinį arba 500 µl fosfatinį buferį (0.1 M). Mišiniai keletą kartų iš lėto pavartomi steriliuose mėgintuvėliuose, po to purtomi kratytuvo pagalba ir inkubuojami (37 °C, 30 min). Pasibaigus išankstinei inkubacijai, TA98 ir TA100 kamienai padengiami agaru (2 ml), turinčiu 10 proc. histidino/biotino (0.5 mM), o WP2uvrA kamienas – agaru, turinčiu 10 proc. triptofano (0.5 mM). Mišiniai iš lėto pavartomi ir užpilami ant minimalaus agaro, turinčio minimalios Vogel-Bonner terpės ir gliukozės. Lėkštelės inkubuojamos (37 °C, 72 h) ir skaičiuojamos revertantų kolonijos, galinčios sintetinti histidiną arba triptofaną.
Eksperimentai kartojami du kartus, o kiekviena koncentracija tiriama trijuose mėgintuvėliuose. Mutageninio tyrimo teigiamas atsakas apibūdinamas kaip nuo histidino ir triptofano nepriklausomų revertantų kolonijų skaičiaus padidėjimas (bent du kartus didesnis už neigiamą kontrolinį bandymą) kiekviename bakterijų kamiene (Ames et al., 1975).
5.4.1.5. Antimutagenininio aktyvumo nustatymas
Antimutageniškumas nustatomas, naudojant tokias pačias baltymų frakcijų koncentracijas kaip ir mutageniškumo tyrime (50 µg, 100 µg, 200 µg, 400 µg, 800 µg). Lektinais praturtintų baltymų frakcijų antimutageniškumas tiriamas išankstinės inkubacijos būdu (Edenharder & Tang, 1997). Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos antimutageninis aktyvumas nustatomas prieš mutagenus: 2-nitrofluoreną (2-NF) (6 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA98 ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos), 2-aminoantraceną (2-AA) (5 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA98 ir S9 metabolinės aktyvacijos sistema; 5 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA100 ir S9 metabolinės
aktyvacijos sistema; 25 µg/lėkštelėje su E. coli WP2uvrA ir S9 metabolinės aktyvacijos sistema), natrio azidą (SA) (5 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA100 ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos), metilmetano sulfonatą (MMS) (1700 µg/lėkštelėje su E. coli WP2uvrA ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos) (1 lentelė). Šios mutagenų koncentracijos pasirinktos dėl to, kad sukelia submaksimalų (mažesnį nei maksimalų – 70 proc.) mutageninį poveikį. Lėkštelės su mutagenais (100 proc. mutageninis aktyvumas) arba tirpikliu (DMSO 2 proc. v/v; be mutageninio aktyvumo) taip pat įtraukiamos į tyrimą. Ištiriamos ir lėkštelės su bakterijų kamienais bei lektinais praturtinta didžiųjų dilgėlių baltymų frakcija, nes revertantų kolonijų skaičius gali sumažėti ir dėl citotoksinio poveikio.
Lentelė Nr. 1. Mutagenai, naudoti baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, išskirtos iš Urtica dioica L. žolės, antimutageninio aktyvumo tyrime.
Mutagenas [µg/Petri
lėkštelė] TA98 TA100 WP2uvrA S9 frakcija PBS
2-NF [6] + + 2-AA [5] + + [5] + + [25] + + SA [5] + + MMS [1700] + +
Per naktį inkubuotos bakterijų kultūros (100 µl), mutagenai, didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcija, praturtinta lektinais, ir S9 metabolinės aktyvacijos sistemos mišinys arba fosfatinis buferis 0.1 M (500 µl) purtomi kratytuvo pagalba ir po to inkubuojami (37 °C, 30 min). Pasibaigus išankstinei inkubacijai, TA98 ir TA100 kamienai padengiami agaru (2 ml), turinčiu 10 proc. histidino/biotino (0.5 mM), o WP2uvrA kamienas – agaru, turinčiu 10 proc. triptofano (0.5 mM). Mišiniai iš lėto pavartomi ir užpilami ant minimalaus agaro, turinčio minimalios Vogel-Bonner terpės ir gliukozės. Lėkštelės inkubuojamos (37 °C, 72 h) ir skaičiuojamos revertantų kolonijos, galinčios sintetinti histidiną arba triptofaną.
Kiekvienos lektinais praturtintos baltymų frakcijos koncentracijos bandinys tiriamas trijose lėkštelėse ir kiekvienas eksperimentas pakartojamas du kartus. Antimutageniškumas apskaičiuojamas kaip mutageninio poveikio slopinimo procentinis santykis (1 formulė).
Inhibicija % = 100 –𝑇
𝑀 × 100
1 formulė
Kur T – revertantų kolonijų skaičius lėkštelėje su mutagenu ir tiriamąja medžiaga, M – revertantų kolonijų skaičius lėkštelėje tik su mutagenu.
Pagal Negi ir kt. (2003) antimutageninis poveikis yra stiprus, kai inhibicija didesnė nei 40 proc., o vidutinis – kai inhibicija 25-40 proc.. Mažesnė nei 25 proc. inhibicija laikoma silpna.
5.4.2. MTT dažo redukcijos reakcijos metodas
5.4.2.1. HepG2 ląstelių linija
Tyrimui pasirinkta žmogaus kepenų vėžio HepG2 ląstelių linija, nes ji išsaugo gerai diferencijuotų hepatocitų savybes ir turi stiprų metabolinį citochromo P450 aktyvumą (Silvers et al., 1997). HepG2 ląstelės laikomos standartinėse sąlygose (37°C, 5 proc. CO2, 95 proc. drėgmė),
auginamos DMEM-Ham’s F12 terpėje, pridedant 5 proc. jaučio vaisiaus serumo, 100 U/ml penicilino ir 100 µg/ml streptomicino 75 cm2 flakonuose. Ląstelės subkultivuojamos (periodiškai kultivuojamos) kas 4 dienas. Auginimo terpė atnaujinama kas 2-3 dienas.
5.4.2.2. Citotoksinio aktyvumo nustatymas
Citotoksiškumas nustatomas MTT dažo redukcijos reakcijos metodu, įvertinant didžiųjų dilgėlių žolės lektinų poveikį mitochondrijų funkcijai (ląstelės gyvybingumo rodikliui) (Vitalone et al., 2011). Metodas yra paremtas mitochondrijos dehidrogenazės vykdoma tetrazolio druskos konversija į netirpų violetinės spalvos formazaną. MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) ištirpinamas fosfatinio buferio druskos tirpale (PBS) (5 mg/ml). Atliekant bandymą, HepG2 ląstelės užnešamos ant 24 duobučių plokštelių (5 x 104 ląstelių vienoje duobutėje). Po 48 valandų ląstelės paveikiamos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijų serijiniais praskiedimais (0.06 – 2 mg/ml, 1:2 praskiedimo santykis). Šios koncentracijos pasirinktos, atsižvelgiant į literatūros šaltiniuose nurodytas ankstesniuose tyrimuose naudotas lektinų koncentracijas (Wong et al., 2003). Po 24 valandų veikimo, į kiekvieną duobutę įpilama po 30 µl MTT tirpalo ir inkubuojama. Pasibaigus inkubacijai (80 min, 37°C), terpė atsargiai pašalinama. Į kiekvieną duobutę įpilama po 250 µl dimetilsulfoksido ir 24
duobučių plokštelės kratomos 5 minutes, kol ištirpsta formazanas. Violetinės spalvos absorbcija išmatuojama mikroplokštelių analizatoriumi (bangos ilgis 595 nm). Kiekvienos baltymų frakcijos koncentracijos bandinys ištirtas trijose duobutėse ir kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent du kartus.
5.4.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Urtica dioica L. žolės lektinais praturtintų baltymų frakcijų antioksidacinio aktyvumo
nustatymo testai atliekami 96 duobučių plokštelėse toliau nuo tiesioginių saulės spindulių. Antioksidacinis aktyvumas tiriamas kaip frakcijos gebėjimas surišti radikalus ir apskaičiuojamas pagal neigiamą kontrolinį bandymą kaip procentinė inhibicija. Kiekviena frakcijos koncentracija tiriama trijose duobutėse ir kiekvienas eksperimentas pakartojamas du kartus. Absorbcijos pokytis išmatuojamas mikroplokštelių spektrofotometru. Tyrimui pripildomos ir duobutės tik su Urtica dioica L. frakcija, kad būtų nustatyta jos galima absorbcija.
5.4.3.1. Antioksidacinio aktyvumo tyrimas, naudojant
2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS·+) modelinį radikalą
ABTS·+ radikalo sujungimo testas atliekamas pagal Kim ir kt. (2002). Vienodi ABTS (5 mM) ir radikalinio iniciatoriaus AAPH (2 mM) tirpalų kiekiai sumaišomi ir inkubuojami (68 °C, 45 min.), norint paruošti ABTS·+ radikalo tirpalą. Gautas tirpalas praskiedžiamas su fosfatinio buferio druskos tirpalu (PBS) (0.1 M; pH = 7.0). Skirtingų koncentracijų (0.1 – 640 µg/ml) lektinų turinčios
Urtica dioica L. frakcijos tirpalai (20 µl) įpilami į ABTS·+ radikalo tirpalą (180 µl) ir inkubuojami (37
°C, 10 min). Teigiamam kontroliniam mėginiui naudojamas troloksas, o neigiamam kontroliniam mėginiui – ABTS·+ radikalo tirpalas. Po inkubacijos absorbcijos pokytis išmatuojamas spektrofotometru (bangos ilgis 734 nm).
5.4.3.2. Antioksidacinio aktyvumo tyrimas, naudojant superoksido anijono
modelinį radikalą
Superoksido anijono radikalų sujungimo testas atliekamas pagal Verma ir kt. (2008). 50 µl nitro mėlynojo tetrazolio tirpalo (NBT, 0.27 mM) įpilama į vienodą kiekį nikotinamido adenino
dinukleotido tirpalą (NADH, 0.84 mM). Mišinys sumaišomas su skirtingų koncentracijų (4 – 1200 µg/ml) didžiųjų dilgėlių lektinais praturtintų baltymų frakcijų tirpalais (90 µl). Reakcijos pradžioje į mišinį įpilama 10 µl fenazino metosulfato tirpalo (PMS, 60.0 µM). Susidaręs mišinys inkubuojamas 5 minutes 25 °C temperatūroje. Neigiamam kontroliniam mėginiui naudojamas NBT/NADH/PMS mišinys, o teigiamam kontroliniam mėginiui – troloksas su NBT/NADH/PMS mišiniu. Po inkubacijos absorbcijos pokytis išmatuojamas spektrofotometru (bangos ilgis 560 nm).
5.4.4. Statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta su GraphPad Prism™ 4.00 programine įranga (GraphPad Software, Inc., San Diegas, Kalifornija, JAV). Rezultatai išreikšti kaip vidurkiai ± SEM. Vienos krypties variacinė analizė (vienos krypties ANOVA, Dunnett’s Multiple Comparison Post Test) naudojama, įrodant teigiamo atsako reikšmingumą. Kai P<0.05, rezultatai laikomi statistiškai reikšmingi.
6. REZULTATAI
6.1. Antimutageninio aktyvumo tyrimo rezultatai
Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos lėkštelėje nuosėdų nesudarė, kol buvo pasiekta 800 µg koncentracija, taip pat neturėjo ir citotoksinio poveikio. Taigi, mutageninio aktyvumo tyrimui ši koncentracija pasirinkta kaip didžiausia koncentracija.
Lentelė Nr. 2. Urtica dioica L. lektinų turinčios baltymų frakcijos citototoksinis poveikis revertantų kolonijoms Salmonella typhimurium TA98 ir TA100, Escherichia coli WP2uvrA kamienuose (n=6,
(± SEM), (p < 0.05)).
[µg/Petri lėkštelė]
Revertantų kolonijų skaičius
TA98 TA100 WP2uvrA
Urtica dioica L. žolės baltymų frakcija 1000 80.7 ± 3.1 322.4 ± 8.3 99.1 ± 1.9 1200 64.3 ± 1.4 303.1 ± 9.4 87.0 ± 2.1 1500 43.1 ± 0.5 270.4 ± 4.2 71.9 ± 1.1
Urtica dioica L. žolės baltymų (lektinų) frakcija (koncentracijos 50 µg, 100 µg, 200 µg, 400
µg, 800 µg) nesukėlė reikšmingo revertantų kolonijų skaičiaus padidėjimo visuose tirtuose bakterijų kamienuose su ar be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos. Galime teigti, kad didžiųjų dilgėlių žolės baltymų (lektinų) frakcija neturėjo mutageninio poveikio. Šie rezultatai leido toliau tirti frakcijos gebėjimą slopinti mutagenų (2-NF, SA, MMS ir 2-AA) poveikį.
Antimutageninis aktyvumas įvertintas kaip didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos geba inhibuoti 2-nitrofluoreno (2-NF), 2-aminoantraceno (2-AA), natrio azido (SA) ir metilmetano sulfonato (MMS) mutageninį poveikį. Lektinais praturtinta baltymų frakcija parodė statistiškai reikšmingą ir nuo koncentracijos priklausantį antimutageninį poveikį prieš mutageną 2-aminoantraceną (2-AA) visuose tirtuose bakterijų kamienuose (1 pav.).
1 pav. Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, poveikis
2-aminoantraceno (2-AA) indukuotų revertantų kolonijų skaičiui Salmonella typhimurium TA98, TA100 ir Escherichia coli WP2uvrA kamienuose su S9 metabolinės aktyvacijos sistema (n=6, (± SEM), (p < 0.05)). Stiprus: inhibicija > 40 proc.; vidutinis: inhibicija 25 – 40 proc.; silpnas:
inhibicija < 25 proc.. Koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivė sudaryta, naudojant Hill lygtį: E = Emax / [1 + (1050LogEC/A)HillSlope], kur E yra poveikis, esant tam tikrai agonisto
