MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MAŽVYDAS ZUBRECKAS
GINSENOZIDŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS IR
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS KININIO
ŽENŠENIO (Panax ginseng C. A. Meyer) ŠAKNYSE IR JO
PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Rūta Marksienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto
dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
GINSENOZIDŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS IR
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS KININIO
ŽENŠENIO (Panax ginseng C. A. Meyer) ŠAKNYSE IR JO
PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovas Rūta Marksienė Darbą atliko Magistrantas Mažvydas Zubreckas KAUNAS, 2015
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. M. Meyer) apibūdinimas ... 10
1.2. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) morfologinis apibūdinimas ... 10
1.3. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) augimo sąlygos ir paplitimas ... 11
1.4. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) vaistinė augalinė žaliava ... 12
1.5. Ginsenozidų charakteristika ... 12
1.6. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) farmakologinis poveikis ... 14
1.6.1. Ginsenozidų farmakologinis poveikis ... 15
1.7. Ginsenozidų analizė ... 17
1.7.1. Ekstraktų paruošimas ... 18
1.7.2. Ginsenozidų nustatymo metodai ... 19
1.7.2.1. Plonasluoksnė chromatografija ... 20
1.7.2.2. Spektrofotometrija ... 23
1.7.2.3. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 23
2. TYRIMO METODIKA ... 25
2.1. Tyrimo objektas ... 25
2.2. Naudotos medžiagos ... 25
2.3. Naudota aparatūra ... 25
2.4. Tyrimo metodai ... 26
2.4.1. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknų ir komercinių produktų ekstraktų paruošimas ... 26
2.4.3. Bendro ginsenozidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27
2.4.4. Antioksidantinis vertinimas spektrofotometriniu metodu ... 28
3. REZULTATAI ... 29
3.1. Kokybinis ginsenozidų nustatymas Lietuvoje auginamo kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose produktuose ... 29
3.2. Suminis ginsenozidų kiekio nustatymas Lietuvoje auginamo kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose produktuose ... 32
3.3. Bioaktyvių junginių antioksidantinis vertinimas Lietuvoje auginamo kininio ženšenio (C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose produktuose ... 34
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 36
5. IŠVADOS ... 37
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
SANTRUMPOS
CNS- centrinė nervų sistema;
DAD- diodų matricos detektorius (angl. diode array detector);
DPPH- 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas;
ELSD- garinantysis šviesos sklaidos detektorius (angl. evaporative light scattering detector);
ESC- efektyvioji skysčių chromatografija;
OA- oleanolinės rūgšties grupė;
OT- okotilolio grupė;
PC- plonasluoksnė chromatografija;
PPD- protopanaksadiolio grupė;
PPT- protopanaksatriolio grupė;
Rf- pasiskirstymo faktorius;
TEAC- trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (angl. trolox equivalent antioxidant capacity);
SANTRAUKA
Mažvydas Zubreckas. Magistro baigiamasis darbas „Ginsenozidų sudėties įvertinimas ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse ir jų produktuose“. Darbo vadovė doc. dr. Rūta Marksienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas.
Tyrimo tikslas: Įvertinti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio šaknyse bei jo produktuose esančių ginsenozidų kokybinę, kiekybinę sudėtį bei antioksidantinį aktyvumą plonasluoksnės chromatografijos ir spektrofotometriniu metodu regimosios šviesos spektre.
Tyrimo uždaviniai: Nustatyti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio šaknyse bei pasirinktuose komerciniuose produktuose esančių ginsenozidų kokybinę sudėtį plonasluoksnės chromatografijos metodu. Nustatyti kininio ženšenio šaknyse ir komerciniuose produktuose esančių ginsenozidų kiekybinę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu regimosios šviesos spektre. Atlikti gautų rezultatų statistinę duomenų analizę.
Rezultatai ir išvados: Ginsenozidai Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re ir Rg1 buvo nustatyti 8, 9, 10, 11, 13 ir 14 metus Lietuvoje auginamų kininių ženšenio šaknų mėginiuose. Didžiausias bendras ginsenozidų kiekis Panax ginseng šaknyse nustatytas 11 metų Lietuvoje auginto kininio ženšenio šaknyse (0,166 ± 0,003 mg/g), o mažiausias 6 metus auginto Panax ginseng šaknyse (0,054 ± 0,004 mg/ml). Bendrasis ginsenozidų kiekis nustatytas komerciniuose produktuose- augaliniame vaistiniame preparate (0,264 ± 0,005 mg/g), maisto papilde (0,036 ± 0,003 mg/g), arbatoje (0,185 ± 0,010 mg/g) ir pastilėse (0,083 ± 0,004 mg/g) su kininio ženšenio šaknies ekstraktu. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas 6 metus Lietuvoje auginto kininio ženšenio šaknų mėginyje (43,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg) bei komerciniuose produktuose- augaliniame vaistiniame preparate (21,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg) ir arbatoje (8,67 ± 1,53 TEAC, μg/mg) su kininio ženšenio šaknies ekstraktu.
SUMMARY
Mažvydas Zubreckas. Master thesis „Evaluation of ginsenosides composition and determination of antioxidant activity in Korean ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) roots and their preparations“. Term paper supervisor doc. dr. Rūta Marksienė. Lithuania University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas.
Aim of the research: To evaluate the qualitative evaluation, quantitative determination and antioxidant activity in roots of Korean ginseng growing in Lithuania and preparations of Korean ginseng by thin layer chromatography and visible light spectrophotometry.
Objectives: To determine ginsenosides qualitative composition in Korean ginseng roots and selected commercial products by thin layer chromatography. To determine ginsenosides quantitative composition and antioxidant activity in Korean ginseng roots and selected commercial products by visible light spectrophotometry. To perform the obtained results statistical analysis of the data.
Results and conclusions: Ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re and Rg1 were identified in 8, 9, 10, 11, 13 and 14 years of growth of Korean ginseng roots. The biggest quantity of total ginsenosides was determined in the sample of Panax ginseng roots which grew 11 years (0,166 ± 0,003 mg/g). The lowest quantity of total ginsenosides were determined in Panax ginseng roots which grew 6 years (0,166 ± 0,003 mg/ml). The quantity of total ginsenosides was studied in commercial products- herbal medical product (0,264 ± 0,005 mg/g), food supplement (0,036 ± 0,003 mg/g), tea (0,185 ± 0,010 mg/g) and pastilles (0,083 ± 0,004 mg/g) with Korean ginseng extract. Antioxidant activity were determined in the sample of Korean ginseng root which grew 6 years (43,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg), herbal medical product (21,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg) and tea (8,67 ± 1,53 TEAC, μg/mg) with Korean ginseng extract.
ĮVADAS
Žmogaus organizmas kasdien reaguoja į fizinius, protinius ar emocinius stimulus, kurie gali sukelti stresą, fizinį ar psichinį nuovargį. Žmonės kovodami su nuovargiu vartoja kavą, energetinius gėrimus su kofeinu, tačiau vartojant dideliais kiekiais gali sukelti vėmimą, tachikardiją, širdies aritmiją, tremorą ar net mirtį. Kofeinas gali padidinti širdies sutrikimų problemas, pasunkinti psichikos ligas, sukelti fiziologinę priklausomybę [1]. Dėl šių priežasčių kofeino pakaitalų susidomėjimas didėja, ypač natūralių augalinių produktų [2]. Kaip natūralią prevencinę priemonę nuovargiui ir stresui sumažinti gali būti vartojami adaptogeninėmis, tonizuojančiomis savybėmis pasižymintys augaliniai preparatai, kurie didina darbingumą, mažina nuovargį bei streso sukeltus sutrikimus. Adaptogenai padeda prisitaikyti prie nepalankių fizinių, cheminių, biologinių ir psichologinių veiksnių [3]. Vienas populiariausių augalų, pasižyminčių šiomis savybėmis, yra kininis ženšenis (Panax ginseng C. A. Meyer). Šis augalas kinų medicinoje buvo naudojamas kelis tūkstančius metų kaip bendrasis tonikas, adaptogenas, kuris didina organizmo atsparumą stresui, gerina bendrąjį gyvybingumą, bei naudojamas gydant hipertenziją, diabetą ir kt. ligas [4-6].
Farmakologinis kininio ženšenio aktyvumas daugiausiai siejamas su biologiškai aktyviaisiais junginiais- triterpeniniais saponinais, vadinamais ginsenozidais. Šie unikalios struktūros junginiai turi didelę perspektyvą medicinos praktikoje, nes yra atlikta daug mokslinių tyrimų, įrodančių jų teigiamą farmakologinį poveikį širdies ir kraujagyslių, centrinės nervų sistemos, vėžio, diabeto ir kitų ligų gydime. Pagrindinis dėmesys sutelktas į atskirus, išgrynintus ginsenozidus, studijuojami jų veikimo mechanizmai, atliekami in vitro ir in vivo tyrimai siekiant pritaikyti tam tikrus ženšenio aktyviuosius junginius konkretiems gydymo tikslams [7,8].
Šių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis skiriasi priklausomai nuo augalo amžiaus, klimato, ir kitų augimo sąlygų. Daugiausia ginsenozidų kaupia kininis ženšenis augantis Rytuose, o duomenų apie Lietuvoje auginamo kininio ženšenio sudėtį apžvelgus literatūrą rasti nepavyko [9]. Siekiant išsiaiškinti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio potencialą, pritaikant terapijoje, būtina išsami cheminės sudėties kokybinė ir kiekybinė analizė.
Šiuo darbu siekiama nustatyti Lietuvoje auginamo Panax ginseng šaknyse bei jo produktuose esančių biologiškai aktyviųjų junginių- ginsenozidų kokybinę, kiekybinę sudėtį bei antioksidantinį aktyvumą naudojant chromatografinius ir spektrofotometrinius metodus.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas:
Įvertinti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse esančių ginsenozidų kokybinę, kiekybinę sudėtį bei antioksidantinį aktyvumą plonasluoksnės chromatografijos ir spektrofotometriniu metodu regimosios šviesos spektre.
Uždaviniai:
1. Atlikti mokslinės literatūros šaltinių analizę apžvelgiant kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) morfologinį apibūdinimą, augimo sąlygas, paplitimą. Apžvelgti ginsenozidų struktūrą, farmakologinį poveikį, ekstrakcijos ir analizės metodus.
2. Nustatyti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse bei pasirinktuose komerciniuose produktuose esančių ginsenozidų kokybinę sudėtį plonasluoksnės chromatografijos metodu.
3. Nustatyti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose produktuose esančių ginsenozidų kiekybinę sudėtį spektrofotometriniu metodu regimosios šviesos spektre ir įvertinti, ar kininio ženšenio augimo laikas turi įtakos šaknyse kaupiamų ginsenozidų kiekiui.
4. Ištirti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose produktuose esančių ginsenozidų antioksidantinį aktyvumą pritaikant regimosios šviesos spektrofotometrinį metodą, naudojant DPPH reagentą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. M. Meyer) apibūdinimas
Ženšenis yra daugiametis augalas, kilęs iš Azijos ir Šiaurės Amerikos. Jis priklauso augalų karalystei ir priskiriamas ženšenio (Panax L.) genčiai, o ją sudaro 13 ženšenio rūšių, iš kurių populiariausias yra kininis ženšenis (lot. Panax ginseng, angl. „Chinese ginseng“, „Korean ginseng“). Šios genties pavadinimas yra kilęs iš graikiškų žodžių junginio („pan“ ir „axos“), kurį išvertus į lietuvių kalbą reiškia „viską gydo“ [6,5,10]. Panax ginseng šaknis kinų medicinoje naudojama jau tūkstančius metų, o Vakaruose ženšenio gydymo veiksmingumas paplito XVIII amžiuje ir šiuo metu yra vienas populiariausių ir brangiausių augalų pasaulyje naudojamų terapijos tikslais [5,11-18].
Nors kininis ženšenis vartojamas nuo neatmenamų laikų, tačiau mokslininkai jo cheminę sudėtį išsiaiškino tik prieš keletą dešimtmečių [4,5,19-22]. 1963 metais Japonijos mokslininkai atliko pirmuosius tyrimus su kininiu ženšeniu ir išskyrė bei nustatė saponinų grupės junginius. Tai unikalūs triterpeniniai saponinai, kuriuos kaupia tik Panax L. genties augalai. Šie saponinai dar vadinami ginsenozidais ar panaksozidais [12-14,23]. Be šių junginių kininis ženšenis kaupia polisacharidus, poliacitilenus, amino rūgštis, alkaloidus, eterinius aliejus, baltymus, polipeptidus, vitaminus, mineralus ir kt. junginius [18,24-27]. Farmakologinį P.ginseng poveikį nulemia ginsenozidai, polisacharidai, poliacitilenai, amino rūgštys, fenoliai ir kiti, bet yra išskiriami ginsenozidai, kurie turi didžiausią farmakologinį aktyvumą [12-14,16,23]. Naujausių tyrimų duomenimis išsiaiškinta, kad ženšenio augančio Rytuose ginsenozidai sudaro apie 3- 4 proc. ir tai daugiausia šiuos junginius kaupianti ženšenio rūšis [18,24-27].
1.2. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) morfologinis
apibūdinimas
Kininis ženšenis yra lėtai augantis daugiametis žolinis augalas su būdingu šaknų šakotumu, kurių forma panaši į žmogaus kūno formą. Augalo stiebas plonas, tiesus, nešakotas, apie puse metro aukščio su ilgakočiais lapais. Lapai sudaryti iš dantytų, elipsės formos 5 lapelių, 4-15 cm ilgio ir 2-6,5 cm pločio. P. ginseng žiedai balti ar geltonai žalsvi, smulkūs, kvapūs. Ženšenis yra savidulkis augalas, o žydėti pradeda trečiaisiais augimo metais. Žydėjimo laikotarpis yra nuo birželio pabaigos iki liepos vidurio. Vaisiai raudonos spalvos, žirnio dydžio, lygūs, blizgūs turintis dvi geltonas sėklas [5,6,24]. Ženšenio šaknis mėsinga, rudai gelsva, auga stačiai. Šaknis skirstoma į pagrindinę, prie kurios yra 2 ar 5 šoninės šaknys ir šaknies plaukelius (1 pav.). Jos dydis ir forma priklauso nuo dirvožemio kokybės,
vandens kiekio, temperatūros ir kitų sąlygų. Subrendusi pagrindinė šaknis yra storesnė už kitas šaknies dalis, o jos ilgis „brandos“ laikotarpiu (4-6 metų) siekia iki 10 cm. Šaknies skersmuo- apie 3 cm. Visos šaknies ilgis dažniausiai būna apie 34 cm. Paprastai jos sveria 70- 100 g, o kai kurios gali užaugti iki 500 g [4-6,10,24].
1 pav. P. ginseng morfologinė charakteristika
Natūraliai augančio ženšenio šaknis išsišakojusi, nelygi, šiurkšti, tamsiai gelsvai rudos spalvos, dažniausiai nedidelė ir mažo svorio. Kultivuojamo ženšenio šaknis yra lygi, didesnė ir sunkesnė lyginant su natūraliai augančio ženšenio šaknimi [5].
1.3. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) augimo sąlygos ir
paplitimas
Kininis ženšenis yra paplitęs visoje Rytų Azijoje, Rusijoje. Natūraliai dažniausiai auga vėsiuose ir ūksminguose lapuočių miškuose, kurie tęsiasi nuo Korėjos, šiaurės rytų Kinijos iki tolimųjų Rytų Sibiro. Kadangi natūraliai augantis ženšenis yra retas ir jo gavyba brangi, jis buvo pradėtas kultivuoti Korėjoje, šiaurės Kinijoje, Japonijoje ir Rusijoje eksportui į kitas šalis [5,17,24].
Norint auginti ženšenį reikia specialių dirvožemio, klimato ir kitų sąlygų [5,7,28]. Todėl ženšenis auginamas skirtingose sąlygose gali kaupti skirtingą bioaktyvių junginių kiekį ir turėti
skirtingą farmakologinį poveikį [11]. Kadangi ginsenozidų kiekis literatūros duomenimis priklauso nuo minėtų faktorių, svarbu ištirti Lietuvoje auginamą Panax ginseng.
1.4. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) vaistinė augalinė žaliava
Kaip vaistinė augalinė žaliava dažniausiai naudojama kininio ženšenio šaknis, nors biologiškai aktyvūs junginiai nustatyti ir kitose augalo dalyse [29]. Šviežia kininio ženšenio šaknis naudojam retai, nes dėl didelio vandens kieko žaliavoje (70- 80 proc.) šaknis gali sugesti. Todėl ženšenio šaknis paprastai yra perdirbama, turi mažesnį vandens kiekį ir ilgesnį tinkamumo laiką [30].P. ginseng šaknis yra dviejų skirtingų formų, tai baltasis ir raudonasis ženšenis. Skirtumas tarp šių
formų yra perdirbimo metodas. Baltasis ženšenis gaminamas žaliavą išdžiovinant, o raudonojo ženšenio žaliava pirmiausia apdorojama garais ir po to išdžiovinama. Raudonojo ženšenio rausva spalva yra karamelizuotų cukrų rezultatas, kurių yra žaliavoje [31]. Biologiškai aktyvių junginių- ginsenozidų sudėtis skiriasi tarp šių formų dėl raudonojo ženšenio apdorojimo aukšta temperatūra [29]. Kininis ženšenis pasaulio rinkoje parduodamas ne tik kaip augalinis vaistinis preparatas, maisto papildas, bet ir kaip dietinis maisto papildas ar sveiko maisto produktas [32]. Komerciniai
Panax ginseng šaknies produktai gali būti įvairių formų- tabletės, kapsulės, skysti ekstraktai, tinktūros,
gazuoti gėrimai, griežinėliais supjaustyta šaknis, milteliai, geliai, pastilės, kramtomosios gumos, arbatos ir kiti. Šių produktų biologinis poveikis priklauso nuo biologiškai aktyvių junginių kiekio žaliavoje, dozėje ir dozavimo formos [33,34].
Remiantis Vokietijos E komisijos monografijomis (angl. German Commission E Monographs), esant nuovargiui ir silpnumui rekomenduojama kininio ženšenio šaknies dozė per parą- 1- 2 g (Panax ginseng produktuose, kuriuose yra mažiausiai 1,5 proc. ginsenozidų). Šiuos preparatus rekomenduojama vartoti iki 3 mėnesių [35]. Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) monografijoje nurodoma 0,5- 2 g džiovintos kininio ženšenio šaknies nuoviro per parą [34]. Kiti autoriai nurodo didesnę paros dozę- nuo 1 iki 3 g kininio ženšenio šaknies arba 200- 600 mg ekstrakto [36]. Klinikiniuose tyrimuose naudojami kur kas didesni P.ginseng šaknų kiekiai (iki 6 g per parą) [37].
1.5. Ginsenozidų charakteristika
Visose augalo dalyse, įskaitant šaknis, stiebus, lapus, žiedus, uogas, sėklas, buvo išskirti 289 skirtingi saponinai iš vienuolikos skirtingų ženšenio rūšių. Kininiame ženšenyje buvo nustatyta daugiau nei 120 skirtingų ginsenozidų [21,38].
Ginsenozidai yra didelės molekulinės masės amfifiliniai glikozidai, kurių dauguma yra steroidinės struktūros, sudarytų iš 4 žiedų su 17 anglies atomų ir šonine alifatine grandine [11,15,39-41]. Šių junginių amfifiliškumą lemia skirtingo poliškumo cukraus liekanų prisijungimas ciklinėje struktūroje. Vienas nuo kito jie skiriasi cukraus liekanomis, jų tipu, kiekiu ir prisijungimo vietomis [11,13,42]. Cukraus liekanomis gali būti gliukozė, maltozė, fruktozė, sacharozė ir kt. Dažniausiai jos jungiasi prie tam tikrų anglies atomų- C3, C6 ar C20 (2 pav.). Nuo cukraus liekanų įvairovės, jų skaičiaus ir padėties priklauso farmakologinis poveikis [11,13,22]. Taip pat ginsenozidai skiriasi hidroksilo grupių skaičiumi ir prisijungimo vietomis. Šie poliniai pakaitai sąveikauja hidrofilinėse membranos vietose, o nuo jų skaičiaus ir prisijungimo vietos priklauso ginsenozido gebėjimas įsiterpti į membraną. Hidroksilo grupių skaičius ir prisijungimo vieta taip pat turi įtakos farmakologiniam aktyvumui. Pavyzdžiui, Rh2 ir Rh3 skiriasi tik prie C20 anglies atomo esančia hidroksilo grupe Rh2 ginsenozide ir tai lemia šio ginsenozido stipresnį farmakologinį aktyvumą [11].
2 pav. Ginsenozidų (PPD ir PPT grupių) struktūrinė formulė
Ginsenozidai yra skirstomi pagal padėtis, kuriose jungiasi vandenyje tirpios cukraus liekanos su nepoliniu anglikonu [21]. Šie junginiai turi damarano (protopanaksadiolio (PPD), protopanaksatriolio(PPT), okotilolio grupės (OT)) oleanolo (oleanolinės rūgšties grupė(OA)), prie C17 prisijungusius įvairių tipų pakaitus ir kitus įvairius, niekur nepriskirtus, triterpenoidų tipų skeletus. Kininio ženšenio šaknyje būdingiausios PPD, PPT grupės. Šių tipų struktūriniai bruožai yra cukraus (gliukozė, ramnozė, kslilozė, arabinozė) ir acilo pakaitai [4,21,22,29,39]. Šios dvi grupės sudaro didžiąją dalį visų saponinų, kuriuos kaupia P. ginseng. Protopanaksadiolio grupės ginsenoziduose cukraus liekanos jungiasi prie C3 ir/ar C20, o prie protopanaksatriolio grupės jungiasi prie C6 ir/ar C20 (3 pav.) [12,39,43].
Kininio ženšenio šaknis daugiausia kaupia Rb1, Rb2, Rc, Rd Re, Rf, Rg1, Rg2 ir Rh1 ginsenozidus. Šio augalo šaknyse paprastai 90 proc. visų ginsenozidų kiekio sudaro Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1 ginsenozidai (PPD, PPT grupės junginiai) [29,31]. Okotilolio grupės ginsenozidus kaupia kitos ženšenio rūšys- P.quinquefolius, P. japonicus ir P. vietnamensis. O iš oleonolinės rūgšties grupės
P. ginseng nedideliais kiekiais kaupia tik Ro ginsenozidą, kuris yra penkiaciklinės struktūros su
oleanolinės rūgšties anglikonu (3 pav.) [43].
3 pav. Ginsenozidų suskirstymas į protopanaksadiolio, protopanaksatriolio ir oleanolinės rūgšties grupes
Glc- gliukopiranozė; Ara(p)- arabinopiranozė; Ara(f)- arabinofuranozė; Xyl- ksilopiranozė; Rha- ramnopiranozė.
1.6. Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) farmakologinis poveikis
Literatūros šaltiniuose Panax ginseng poveikis apibūdinimas kaip tonizuojantis, pasižymintis adaptogeninėmis savybėmis, palaikantis organizmo homeostazę, atsparumą nepalankiems veiksniams, stiprina fizinę ir seksualinę funkciją, taip pat didina bendrąjį gyvybingumą, pasižymi antistresiniu veikimu, lėtina senėjimą reguliuojant medžiagų apykaitą, mažinant gliukozės koncentraciją kraujyje, stimuliuojant endokrininę veiklą. Toks poveikis aiškinamas aktyviųjų junginių antioksidantiniu poveikiu, antioksidantinių fermentų, glutationo aktyvumo indukavimu, padidėjusiu deguonies ir
gliukozės sunaudojimu [4,6,11,12,44]. Ženšenyje esantys ginsenozidai nepasižymi arba pasižymi nedideliu antioksidantiniu aktyvumu [45]. Antioksidantinį aktyvumą labiausiai įtakoja fenoliniai junginiai [30].
Be šių minėtų kininio ženšenio poveikių, imuninės sistemos moduliacija, antidiabetinis, antivėžinis, antistresinis poveikiai yra vieni iš labiausiai pastebimų in vitro, in vivo ir klinikinių tyrimų metu [29].
1.6.1. Ginsenozidų farmakologinis poveikis
Dauguma farmakologinių poveikių yra siejami su ženšenio biologiškai aktyviais junginiais- ginsenozidais [11,12]. Kiekvienas jų turi skirtingus farmakologinius poveikius, o vienas jų gali sukelti kelis poveikius į tą patį audinį [13]. Tam tikri ginsenozidai gali veikti priešingai vienas kito atžvilgiu, pavyzdžiui, ginsenozidas Rg1 kelia kraujospūdį ir stimuliuoja centrinę nervų sistemą (CNS), o Rb1 mažina kraujospūdį ir slopina CNS veiklą [23]. Kai kurių atskirų ginsenozidų farmakologinis veiksmingumas yra įrodytas ne tik kliniškai, bet ir molekuliniame lygmenyje [4].
Platus ženšenio farmakologinis poveikis gali būti siejamas dėl ginsenozidų cheminės struktūros panašumo į steroidinius hormonus, bei jų amfifilinių savybių [29].
Poveikis CNS
Ginsenozidų poveikis CNS susijęs su neuronų neurodegeneracinių procesų slopinimu. Tam tikri ginsenozidai (pvz., Rg1, Rg3, Rb1) mažina oksidacinį stresą ir laisvųjų radikalų susidarymą. Taip neuronai apsaugomi nuo galimų pažeidimų, sustiprinama CNS veikla [14,23,29]. Viename in vitro tyrime mokslininkai nustatė, kad ginsenozidai Rb1 ir Rg3 turi reikšmingą neuroprotekcinį poveikį ir yra veiksmingi apsaugant neuronus nuo oksidacinės pažaidos [46].
Tyrimai su gyvūnais įrodė teigiamą Rb1, Rg1 ir Re ginsenozidų poveikį skopolamino sukeltam atminties deficitui [13,23,29]. Be to ginsenozidai didina cholino pasisavinimą, acetilcholino išsiskyrimą, taip pat didina serotonino, dopamino ir norepinefrino kiekį smegenų žievėje [6,11,29,47,48]. Eksperimentiniai duomenys rodo, kad P.ginseng gali pagerinti mąstymą, atmintį, bei reakcijos laiką.
Ženšenio aktyvieji junginiai susilaukia vis didesnio dėmesio gydant Alzhaimerio, Parkinsono, Hantingtono ir kitas neurodegeneracines ligas. Ginsenozidai gali būti naudojami šių ligų gydime padedant išvengti pažeidžiamų neuronų žūties, bei sulėtinti ligos progresavimą. Nors nėra iki galo suprasta, kaip neuroprotekcinis poveikis susijęs su šių ginsenozidų struktūromis [4,6,11,13,14]. Nustatyta, kad ženšenis yra efektyvus ir saugus Alzhaimerio liga sergantiems žmonėms [49,50].
Vartojant vaistus nuo demencijos ir kartu 4,5 ar 9,0 g 6 metų raudonojo ženšenio preparatą (kuriame Rb1- 1.96 proc., Rb2- 2.18 proc., Rc- 1.47 proc., Rd- 0.72 proc., Re- 1.11 proc., Rf- 0.24 proc., Rg1- 0.49 proc., Rg2- 0.13 proc., Rg3- 0.12 proc., Rh1- 0.12 proc., Rh2- 0.003 proc.) kelis mėnesius, reikšmingai pagerėjo kognityvinė funkcija žmonėms sergantiems šia liga [50].
Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai
Ginsenozidai pasižymi antihipertenziniu veikimu, slopina trombocitų agregaciją, skatina žaizdų gijimą, saugo širdį nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio. Antihipertenzinis veikimo mechanizmas susijęs su simpatinės nervų sistemos aktyvumo slopinimu, kraujagyslių lygiųjų raumenų atsipalaidavimu, o tuo pačiu mažina kraujo spaudimą [4,17,23,29,51,52]. Ženšenis mažina tik padidėjusį kraujo spaudimą ir nesukelia jokių reikšmingų pokyčių žmonėm su normaliu kraujospūdžiu [17].
Yra nustatyta, kad ginsenozidai veikia kaip kalcio jonų kanalų antagonistai kraujagyslėse, turi apsauginį poveikį aterosklerozinių plokštelių vystymuisi. Rg1, Rg3 pasižymi kraujagyslių lygiųjų raumenų atpalaiduojančiu, kraujo cirkuliaciją gerinančiu ir endotelio gamybą slopinančiu poveikiu. Jie indukuoja kalio ir kalcio jonų kanalų moduliaciją, dėl to išsiplečia kraujagyslės ir lygieji raumenys [41,53].
Poveikis imuninei sistemai, uždegimui ir alergijai
Imunomoduliuojantis ginsenozidų poveikis yra susijęs su antivėžiniu, priešuždegiminiu ir antialerginiu poveikiu [29]. Kai kurie ginsenozidai gali aktyvuoti makrofagus, skatinti limfocitų gamybą, o tai labai svarbu infekcijų ir auglių gydime. Rg1 didina T- helperių ląstelių kiekį ir stimuliuoja imuninę sistemą- aktyvina leukocitų, fagocitų ir makrofagų veiklą. Tyrimais įrodyta, kad ženšenis slopina bakterijų, grybelių ir parazitų aktyvumą [54].
Rb1, Rg1 ir Rg3 slopina citokinų gamybą, COX- 2, histamino atsipalaidavimą, stabilizuoja neutrofilų ir limfocitų kiekį [4,29,27]. Ginsenozidai Rb1, Rc, Rd ir Rh1 slopina histamino ir/arba leukotrieno išsiskyrimą iš putliųjų ląstelių [29].
Priešvėžinis poveikis
Ženšenio aktyvieji junginiai turi vėžinių ląstelių citotoksinį ir augimo slopinamąjį poveikį. In
vitro ir in vivo tyrimais įrodyta, kad kai kurie ginsenozidai (pvz.: Rh1, M1) turi stiprų priešvėžinį
poveikį, o vartojant P. ginseng yra mažiau tikėtina susirgti įvairiomis vėžio formomis [6,16,29,55]. Ginsenozidai gali slopinti plaučių, skrandžio karcinomos, leukemijos, hepatomos, smegenų auglių,
prostatos vėžį mažindami vėžinių ląstelių gebėjimą suformuoti kolonijas, slopindami jų augimą [4,6,17,56].
1987 metais vykusiame 67 savaičių tyrime in vivo su 2000 pelių buvo siekiama įvertinti P.
ginseng aktyviųjų junginių priešvėžinį poveikį [57]. Tiriamosios pelės buvo veikiamos įvairių
cheminių kancerogenų (N-2-fluorenilo acetamido, aflatoksino B1, tabako dūmų koncentratų ir kitų) ir tuo pačiu gydomos raudonojo ženšenio ekstraktu. Tyrimo rezultatuose atsispindėjo 22 proc. plaučių adenomos atvejų sumažėjimas (p<0,05), 75 proc. kepenų vėžio atvejų sumažėjimas (p<0,05). Šis tyrimas įrodo, kad ženšenis turi stiprų priešvėžinį poveikį ir gali būti natūrali prevencinė priemonė.
Eksperimentiniai duomenys rodo, kad ženšenio bioaktyvūs junginiai taip pat veiksmingi stiprinant antinavikinių vaistų veikimą bei mažinant jų šalutinius poveikius [4,6,17,56,58]. Siekiant sumažinti šiuos poveikius buvo atliktas tyrimas su 120 pacientų, kurie diagnozuotas kepenų pirmosios stadijos vėžys [59]. Tyrėjai siekė sumažinti deksametazono šalutinius poveikius vartojant ženšenio preparatus. Pokyčiai buvo stebimi prieš transarterinę chemoembolizaciją terapiją (TACE- terapija, kai vaistai suleidžiami kateteriu tiesiai į kepenyse esantį naviką) bei po 3 ir 7 dienų. Rezultatai parodė, kad deksametazonas kartu su ginsenozidais ženkliai sumažino pašalinius poveikius (pykinimą, vėmimą, karščiavimą), bendro bilirubino kiekį ir kitus kepenų patologiją rodančius rodiklius.
Antidiabetinis poveikis
Ginsenozidai yra veiksmingi mažinant aukštą gliukozės kiekį, didinant insulino kiekį kraujyje bei jautrumą insulinui [4,6,23,26]. Gliukozės koncentraciją mažina sveikiems ir sergantiems antro tipo cukriniu diabetu. In vivo tyrimuose nustatyta, kad ginsenozidai sumažina gliukozės kiekį kraujyje, sumažina svorį, bei diabeto sergamumo riziką [17,23].
In vivo tyrimuose su pelėmis ir žiurkėmis nustatyta, kad ženšenio ekstraktas reikšmingai
skatina insulino išsiskyrimą, mažina gliukozės kiekį kraujyje [58,59]. Taip pat vartojant 100 mg/kg ženšenio ekstrakto per dieną sumažėja diabeto komplikacijų rizika susijusi su diabeto sukelta nefropatija [62].
Siekiant įvertinti P. ginseng antidiabetinį veiksmingumą ir saugumą, buvo atliktas klinikinis tyrimas, kuriame nustatyta, kad ilgalaikio ženšenio preparatų vartojimo metu, pagerinami glikozilinto hemaglobino rodikliai ir gliukozės koncentracija plazmoje nevalgius [37].
1.7. Ginsenozidų analizė
Dėl plataus ženšenio farmakologinio aktyvumo mokslininkai sutelkė didelį dėmesį aiškindamiesi bioaktyvių junginių veikimo mechanizmus, atlikdami in vitro ir in vivo tyrimus. Dėl šių
priežasčių buvo pritaikyta įvairūs analizės metodai ginsenozidų identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui [29].
1.7.1. Ekstraktų paruošimas
Bioaktyvių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei iš augalinės žaliavos įtakos turi ekstrahavimo metodas [63]. Todėl siekiant optimizuoti ginsenozidų išeigą buvo pritaikyti įvairūs ekstrahavimo metodai. Maceracija, kaitinimas su grįžtamuoju šaldytuvu, Soksleto ekstrakcija yra įprastiniai ekstrahavimo metodai, kurie remiasi saponinų tirpumu tam tikrame tirpiklyje. Todėl ekstrahuojant aktyviuosius junginius iš žaliavos dažnai reikia didelio kiekio tirpiklio. Naujesni metodai, tokie kaip ekstrahavimas ultragarsu, naudojant mikrobangas, suslėgto skysčio ekstrakcija, pagreitinta ekstrakcija tirpikliais yra ekonomiškesni, mažiau sunaudojama tirpiklių, yra automatizuoti, vykdoma greita ir efektinga ekstrakcija. Ekstrakcija pagreitinama keičiant temperatūrą, slėgį, tačiau šie pokyčiai gali pakeisti ginsenozidų cheminę struktūrą ir modifikuoti juos į neutralius ginsenozidus [15,64-67]. Ekstrahuojant ultragarsu junginiai nėra veikiami šilumos, todėl išvengiama termolabilių junginių degradacijos [10]. Nors naujesni metodai yra efektyvesni, tačiau tradiciniai metodai, pavyzdžiui, Soksleto ekstrakcija, yra vieni pagrindinių ekstrahavimo metodų ir mokslininkai labiau linkę pasirinkti būtent šiuos metodus [63,64].
Mokslininkai norėdami palyginti ekstrahavimo metodus atliko tyrimą, kuriame siekė nustatyti didžiausią šešių neutralių (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re ir Rg1) ir keturių termolabilių ginsenozidų išeigą tarp populiariausių ekstrahavimo metodų. Visuose metoduose buvo naudojamas 70 proc. metanolio tirpalas. Nustatyta, kad didžiausia bendroji saponinų išeiga buvo naudojant Soksleto ekrakciją nors panaši išeiga buvo ir kitų metodų. Neutralių ginsenozidų išeiga buvo didžiausia naudojant taip pat Soksleto ekstrahavimą, tačiau termolabilių ginsenozidų šiuo metodu ekstrahuojant aptikta nebuvo [68].
Y. Wang ir kt. nustatė, kad ekstrahuojant 10 min mikrobangų pagalba esant aukštam slėgiui, bei naudojant 70 proc. etanolį, ginsenozidų išeiga yra didesnė lyginant su 2 h trukmės Soksleto eskstrakcija, 1 h trukmės ekstrahavimu ultragarsu ir 2 h trukmės kaitinimą naudojant grįžtamąjį šaldytuvą [65].
Literatūros šaltiniuose ginsenozidų ekstrakcijai, kaip tirpikliai, dažniausiai nurodomi metanolis, etanolis ar jų vandeniniai mišiniai. Nuo pasirinkto tirpiklio priklauso analitės tirpumas, o tuo pačiu ir ekstrakcijos efektyvumas [15,31,65]. Mokslininkai 2005 metais vertino šių tirpiklių ekstrakcijos išeigą skirtingais metodais [69]. Susmulkinta Panax ginseng šaknis buvo ekstrahuota su 100 proc. metanoliu ultragarsu 0,5 h (A metodas), su 70 proc. metanoliu ultragarsu 0,5 h (B metodas),
90° C temperatūros vandeniu silpnai maišant 1 h (C metodas) ir virinant 1 h su grįžtamuoju šaldytuvu 100 proc. metanoliu esant 60-65° C temperatūrai (D metodas). Rezultatuose matoma, kad ekstrahuojant grįžtamuoju šaldytuvu ir naudojant 100 proc. metanolį ginsenozidų išeiga yra didžiausia (4 pav.).
4 pav. Ginsenozidų ekstrahavimo išeigos skirtumai naudojant skirtingus tirpiklius ir ekstrakcijos metodus.
Remiantis atliktais tyrimais, ginsenozidų ekstrakcijos išeiga yra didžiausia naudojant 70- 100 proc. metanolį. Ekstahavimo metodai taip pat turi įtakos šių junginių išeigai. Tradicinių ekstrakcijos metodų rezultatai yra efektyvesni, tačiau ekstrahuojant šiais metodais nebuvo aptikta termolabilių junginių. Taigi, norint analizuoti šiuos junginius reikėtų rinktis naujesnius ekstrakcijos metodus (naudojant ultragarsą, mikrobangas) [68,70].
1.7.2. Ginsenozidų nustatymo metodai
Mokslininkai jau kelis dešimtmečius siekė pritaikyti įvairius analizės metodus ginsenozidų indentifikavimui ir kiekybiniam tyrimui. Šių junginių analizei pritaikyta plonasluoksnė chromatografija (PC), didelio našumo plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių
chromatografija (ESC), spektrofotometrija, dujų chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, priešpriešinė chromatografija, branduolinis magnetinis rezonansas ir kiti metodai [4,17,29]. Ginsenozidų kokybiniuose ir kiekybiniuose tyrimuose dažniausiai naudojami chromatografiniai (ESC, PC) ir spektrofotometriniai metodai, nes šie metodai pigesni, paprastesni ir greičiau atliekami lyginant su kitais. Spektrofotometrinė analize galima nustatyti bendrą saponinų kiekybinę sudėtį, o chromatografiniais metodais galima nustatyti kokybinę ir kiekybinę saponinų sudėtį [62]. Pasaulinės sveikatos organizacijos (angl. WHO) Panax ginseng monografijoje taip pat nurodomi plonasluoksnės chromatografijos ir spektrofotometrijos metodai ginsenozidų kokybinėje ir kiekybinėje analizėje [34].
1.7.2.1. Plonasluoksnė chromatografija
Plonasluoksne chromatografija galima paprastai ir greitai analizuoti tam tikrus junginius. Tai paprastas, nebrangus, universalus, gana greitas metodas, naudojamas identifikavimui, grynumo nustatymui, kuriuo galima identifikuoti ženšenio aktyviuosius junginius [15,18]. Ginsenozidų analizei dažniausiai naudojama stiklo ar aliuminio plokštelės padengtos silikageliu, o mobili fazė parenkama eksperimentiškai remiantis moksline literatūra. Šiems junginiams išryškinti naudojama sieros rūgštis ar jos mišiniai su aromatiniais aldehidais (pvz., su vanilinu ar anisaldehidu) [15,71]. PC densitometrine analize galima nustatyti ginsenozidų kiekį. Šio metodo esmė- analičių dėmių intensyvumo matavimas densitometru ir lyginimas su standartiniais mėginiais [15,18,72].
Mokslinėje literatūroje pateikiama gana daug ženšenio aktyviųjų junginių tyrimų plonasluoksnės chromatografijos metodų. 1 lentelėje nurodomos dažniausiai naudojamos tirpiklių sistemos, ryškinimo reagentai bei sąlygos naudojamos ginsenozidų kokybinėje analizėje.
1 lentelė. PC mobilios fazės, ryškinimo reagentai, sąlygos ginsenozidų analizėje Tirpiklių sistema Ryškinimo
reagentai Chromatografavimo sąlygos Rf reikšmės Chloroformas- etilo acetatas- metanolis- vanduo (15:40:22:9) [73] 0,5 ml p- anisaldehido, 10 ml ledinės acto r., 85 ml metanolio ir 5 ml sieros rūgšties tirpalas Apipurškus ryškinimo reagentu šildyti 5 min 120°C temperatūroje. Stebėti esant 535 nm bangos ilgiui Ra 0.25, Rb1 0.30, Rb2 0.35, Rc 0.39, Re 0.43, Rd 0.49, Rg1 0.53, Rf 0.56, Rg2 0.60
Etilo acetatas- vanduo- butanolis (25:50:100). Mišinį palaikyti 10 min ir naudoti viršutinį sluoksnį
[74]
Anisaldehido tirpalas
Apipurškus ryškinimo reagentu šildyti 5- 10 min 105- 110°C temperatūroje.
Stebėti dienos šviesoje
n.d.
1.Chloroformas- metanolis- vanduo
(70:30:40) 2. 1,2- dichloretanas- butanolis- etilo acetatas- vanduo (65:22:22:7) [75] 1.Vanilino fosforinės rūgšties tirpalas 2.Sieros rūgšties tirpalas 1.Stebėti prie 356 nm bangos ilgio 2.Apipurškus ryškinimo
reagentu šildyti 7 min 110°C temperatūroje. n.d. 1. Chloroformas- n-butanolis- metanolis- vanduo (20:40:15:20) 2. Butanolis: etilo acetatas- vanduo (40:10:10) [76] Acto anhidrido- sieros rūgšties- etanolio (5:5:90) tirpalas Apipurškus ryškinimo reagentu šildyti 10 min
105°C temperatūroje. 1. Rg2- 0,52; Rg1- 0,53; Rf- 0,44; Re- 0,42; Rd- 0,37; Rc- 0,28; Rb2- 0,22; Rb1- 0,21 2. Rg2- 0,40; Rg1- 0,39; Rf- 0,34; Re- 0,25; Rd- 0,26; Rc- 0,23; Rb2- 0,23; Rb1- 0,14 1. Chloroformas- etanolis- vanduo (60:45:6,5) [77] Etanolinis 10 proc. sieros rūgšties tirpalas Apipurškus ryškinimo reagentu šildyti 10 min
105°C temperatūroje. Stebėti prie 366 nm
bangos ilgio
n.d.
8 Europos Farmakopėjos straipsnyje 04/2005:1527 ženšenio šaknyje esančių ginsenozidų tapatybei nustatyti nurodomas plonasluoksnės chromatografijos metodas:
- Tiriamasis tirpalas: 1 g sumulkintos ženšenio šaknies kaitinama su grįžtamuoju kondensatoriumi 15 min su 10 ml 70 proc. (v/v) metanolio tirpalu. Vėliau tirpalas atvėsinamas, filtruojamas ir skiedžiamas su 10 ml metanolio tirpalu.
- Lyginamasis tirpalas.5 mg aescino R ir 5 mg arbutino R ištirpinama 1 ml metanolio R. - Plokštelė: silikagelio plokštelė R (5- 40 µm arba 2- 10 µm).
- Mobili fazė: etilacetatas R, vanduo R, butanolis R (1:2:4 v/v/v). Palinkti mišinį 10 min, kad atsiskirtų ir naudoti viršutinį sluoksnį.
- Mėginio užnešimo kiekis: 20 arba 4 µl mėginio.
- Judrios fazės kylimas plokštele: daugiau nei 10 arba 5 cm prisotintoje chromatografijos kameroje.
- Plokštelės džiovinimas. Ore.
- Nustatymas: apipurkšti anisaldehido R tirpalu ir kaitinti 5- 10 min esant 105- 110 °C. Rezultatus vertinti dienos šviesoje.
- Rezultatai: stebėti 2 lentelėje nurodytose chromatogramos zonose esančių lyginamojo ir tiriamojo tirpalų seką [74].
2 lentelė. Chromatograma
Plokštelės viršus Arbutinas: ruda zona
_________
_________
Aescinas: pilka zona
_________
Violetinė zona (ginsenozidas Rg1+ Rg2) Šviesiai violetinė zona (ginsenozidas Re) Violetinė zona (ginsenozidas Rd)
Šviesiai violetinė zona
_________
Violetinė zona (ginsenozidas Rc)
Violetinė zona (ginsenozidas Rb1+ Rb2) Lyginamasis tirpalas Tiriamasis tirpalas
1.7.2.2. Spektrofotometrija
Spektrofotometrija yra populiarus saponinų kiekio nustatymo būdas augaliniuose žaliavose. Šis metodas yra paprastas, greitai atliekamas ir nebrangus. Ginsenozidų kiekybiniam tyrimui Vokietijos ir Šveicarijos farmakopėjose nurodytas būtent šis metodas. Bendras saponinų kiekis dažniausiai nustatomas su vanilino- sieros rūgšties reagentu. Sieros rūgštis naudojama kaip oksidantas, o reakcijos skiriamoji spalva yra violetinė. Dažniausiai analizė atliekama prie 480- 610 nm bangos ilgių. Steroidinių saponinų nustatymas paremtas spalvinėmis reakcijomis su anisaldehido, sieros rūgšties ir etilo acetato tirpalais prie 430 nm bangos ilgio [64].
Norint palyginti efektyviosios skysčių chromatografijos ir spektrofotometrijos metodus esant skirtingiems ekstrahavimo metodams Kevers ir kt. (2004) atliko tyrimą [78]. Ginsenozidų spektrofotometrinė analizė buvo atliekama remiantis Vokietijos farmakopėja. Į 1 ml tirpalo buvo pridėtas 98 proc. acto rūgšties ir sieros mišinio (50:50 v/v) ir šildoma 25 min esant 60 °C. Atšaldžius absorbcija matuojama prie 520 nm bangos ilgiui. Ginsenozidų koncentracija apskaičiuojama pagal formulę: 4,42 × optinis tankis. ESC buvo naudojamas kartu su UV detektoriumi, o veikliųjų junginių detekcija atlikta prie 203 nm bangos ilgio. Analizė atliekama nerūdijančio plieno kolonėlėse (250×4 mm), 38 °C temperatūroje. Mobilios fazės srauto greitis buvo 1 ml/min. Šiame tyrime nustatyta, kad ekstrahavimo metodas neturėjo didelės įtakos gautiems rezultatams. Juose atsispindi, kad aptikti ginsenozidų kiekiai yra didesni atliekant analizę spektrofotometriniu metodu.
1.7.2.3. Efektyvioji skysčių chromatografija
ESC yra universalus, paprastas, tikslus metodas leidžiantis identifikuoti daugelį junginių. Jis gali būti sujungtas su skirtingų rūšių detektoriais: UV, diodų matricos (DAD), garinantysis šviesos sklaidos (ELSD) ir kt. detektoriais. Saponinų nustatymas augalinėje žaliavoje yra sudėtingas, nes daugelis junginių neturi chromoforo, todėl jie negali būti registruojami ultravioletinės spinduliuotės detektoriumi ir jų aptikimas apsiriboja ties 200- 205 nm bangos ilgiu. Todėl ESC-UV metodas nėra labai jautrus ginsenozdų analizėje, nes daugelis jungių gali absorbuoti šviesą prie trumpo bangos ilgio, o tai gali trukdyti analizei. Siekiant to išvengti, ESC metodas kombinuojamas su kitais detektoriais, pavyzdžiui su ELSD [29,72,79].
Saponinų kokybiniuose ir kiekybiniuose tyrimuose dažniausiai analizė atliekama ESC metodu [31,64]. Paprastai naudojamos atvirkštinių fazių standartinės C 18 kolonėlės (150 ar 250 x 4,6 mm). Mobili fazė dažniausiai būna acetonitrilo ir fosfatinio buferio mišinys [31,32,72].
Siekiant įvertinti ESC metodo ženšenio produktų rezultatų pasikartojamumą, atkuriamumą buvo atlikti tyrimai dvylikoje skirtingų laboratorijų. Tyrimo objektai buvo P.ginseng, P.quinquefolius
ir du ženšenio produktai. Analizuojami buvo metanoliniai ekstraktai esant tomis pačiomis sąlygomis: naudojama C 18 (250 mm x 4,6 mm) kolonėlė ir UV detektorius (203 nm). Gauti rezultatai iš skirtingų laboratorijų parodė, kad rezultatai sutapo ir metodas pakankamai gerai pritaikytas ginsenozidų analizėje. ESC metodu ženšenio aktyvieji junginiai buvo aptikti tik jei jų koncentracija buvo didesnė nei 200 mg/kg. Rg1 ir Re ginsenozidų atskyrimas buvo gana prastas, nes jų koncentracija ženšenyje turi būti ne mažiau 300 mg/kg [72].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas- Lietuvoje auginamo Panax ginseng šaknys. Ženšenis augintas Kauno rajone, Smailių kaime, ekologiniame Jono Lučkos žemės ūkyje (sertifikato nr. 980165U). Biologiškai aktyvių junginių tyrimui naudotos 6, 8, 9, 10, 11, 13 ir 14 metų augintos kininio ženšenio šaknys. Taip pat buvo tirti komerciniai preparatai, kurių sudėtyje yra kininio ženšenio ekstrakto- augalinis vaistinis preparatas (kuriame 100 mg kininio ženšenio šaknų ir 60 mg dviskiaučio ginkmedžio lapų sausojo ekstrakto), maisto papildas, arbata (kurioje nurodyta 64 proc. 6 metų raudonojo kininio ženšenio šaknų iš kurių 4 mg/g ginsenozidų (Rg1, Rb1 ir Rg3)) ir pastilės (50,85 proc. 6 metų raudonojo kininio ženšenio šaknų). Arbata ir pastilės su kininių ženšeniu buvo įsigyti Kinijoje.
2.2. Naudotos medžiagos
Saponinų standartinis mišinys įsigytas iš Chemtrec (Rockville, Kanada), kuriame ginsenozido Rg1 yra 1 proc., Re- 0,6 proc., Rb1- 1,1 proc., Rc- 0,5 proc., Rb2- 0,4 proc., Rd- 0,2 proc..
Naudoti tirpikliai- metanolis, sieros rūgštis, anisaldehido reagentas įsigyti iš Sigma ALDRICH (St. Louis, JAV). Butanolis, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH) įsigyti iš Sigma ALDRICH (Steinheim, Vokietija). Troloksas įsigytas iš Acros organics (New Jersey, JAV).
2.3. Naudota aparatūra
Žaliavos smulkinimui naudotas Clatronic D- 47906 (Kempen, Vokietija) malūnėlis. Medžiagos buvo sveriamos Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) analitinėmis svarstyklėmis. Medžiagų ekstahavimui naudojamas Heidolph (Nuremberg, Vokietija) rotacinis garintuvas su vakuumo sistema.
Plonasluoksnėje chromatografijoje naudotos stiklinės plokštelės TLC Silica gel 60 F254 25
(Merck, Vokietija) padengtos 0,25 mm sluoksnio storio silikageliu. Plokštelių matmenys- 20x20 cm. Tiriamųjų mėginių užnešimui naudotas pusiau automatinis mėginių užnešėjas CAMAG Linomat 5. Chromatografinė kamera- CAMAG Twin Trough Chamber 20x20cm. Kokybiniam ginsenozidų įvertinimui buvo naudotas chromatogramos analizavimo prietaisas CAMAG TLC Visualizer. Halo
DB-20 UV / Visible Double Beam Spectrophotometer naudotas bendram saponinų kiekio nustatymui ir
antioksidantiniam įvertinimui.
2.4. Tyrimo metodai
2.4.1.
Kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknų ir komercinių
produktų ekstraktų paruošimas
Išdžiovinta ženšenio šaknis bei komerciniai produktai susmulkinti į miltelius, atsverta 1,00 g miltelių ir supilta į 250 apvaliadugnę kolbą, vėliau buvo įpilta 70 ml 50 proc. (v/v) metanolio ir įdėta keli pemzos gabalėliai. Mėginys kaitintas 1 val. vandens vonioje su grįžtamuoju kondensatoriumi. Gautas ekstraktas centrifuguotas, o centrifugatas išgarintas iki sauso likučio esant žemo slėgio sąlygose ir ne didesnėje nei 60 °C temperatūroje. Gautas sausas likutis ištirpintas 10 ml 70 proc. (v/v) metanolyje ir filtruotas pro membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,45 μm.
2.4.2.
Ginsenozidų identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu
Kokybinis ženšenio šaknų ir komercinių produktų nustatymas atliekamas plonasluoksnės chromatografijos metodu. Mobili fazė ir ryškinimo reagentas pasirinktas eksperimentiškai, remiantis literatūros šaltiniais. Iš literatūroje pateiktų ryškinimo reagentų, ginsenozidus aiškiausiai išryškina 10 proc. sieros rūgšties tirpalas. Pasirinkta etilo acetato, vandens, butanolio (1:2:4 v/v/v) tirpiklių sistema, kuri aiškiai išskirstė tiriamuosius junginius.
Mobilios fazės paruošimas. Į dalomąjį piltuvą pilama 12,5 ml etilo acetato, 25 ml vandens ir 50
ml butanolio. Užkimšus piltuvą, mišinys sumaišomas ir paliekamas 10 minučių, kad mišinys atsiskirtų. Tyrimui naudojamas viršutinis sluoksnis. Tirpiklių sistema perkeliama į CAMAG Twin Trough
Chamber 20x20cm chromatografinę kamerą, sandariai uždaroma, kad prisisotintų tirpiklių garais. Chromatografinės plokštelės paruošimas. Tiriamieji metanoliniai ekstraktai ant plokštelės
užnešamas naudojant pusiau automatizuotą įrenginį- CAMAG Linomat 5. Mėginiai ant plokštelės užnešami brūkšniniu būdu (10 mm ilgio). Po 20 μl tiriamųjų mėginių CAMAG 100 μl švirkštu užpurškiami ant chromatografinės plokštelės. Ekstraktams išdžiuvus plokštelė dedama į chromatografinę kamerą, pripildytą tirpiklių sistemos ir stebima kol tirpiklių sistema plokštele pakils 10 cm nuo ekstraktų užnešimo linijos. Vėliau plokštelė išimama ir išdžiovinama traukos spintoje.
Siekiant tyrimo rezultato preciziškumo, buvo padarytos trys ginsenozidų chromatogramos tokiomis pačiomis sąlygomis.
Chromatografinės plokštelės ryškinimas. Išdžiūvusi plokštelė apipurškiama 10 proc. (v/v)
sieros rūgšties tirpalu, išdžiovinama ir dedama į džiovinimo spintą 7 min, kuri įkaitinta iki 110 °C temperatūros. Literatūros duomenimis zonos, kuriuose yra ginsenozidai išryškėja violetine arba ruda spalva.
Chromatogramos vertinimas. Ginsenozidų kokybinis vertinimas atliekamas naudojant CAMAG TLC Visualizer prietaisu ir winCATS programine įranga, kurių pagalba nufotografuojami vaizdai bei
apskaičiuojami ginsenozidų sulaikymo faktoriai (Rf).
2.4.3.
Bendro ginsenozidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Šių junginių kiekybinis tyrimas atliktas spektrofotometriškai, regimosios šviesos absorbcijos spektre, naudojant anisaldehido reagentą. 500 μl ženšenio ekstrakto buvo sumaišyta su 500 μl 0,5 proc. anisaldehido tirpalu ir laikoma 10 min. Vėliau pridedama 2 ml 50 proc. (v/v) sieros rūgšties tirpalo ir suplakama. Užkimšti buteliukai 10 minučių šildomi vandens vonioje 60 ºC temperatūroje. Atvėsinto mišinio absorbcija matuojama kvarcinio stiklo kiuvetėse ties 435 nm bangos ilgiu. Ginsenozidų kiekis nustatomas remiantis standartinių ginsenozidų mišinio kalibravimo kreive (0,2- 1,6 μg/ml). Ginsenozidų kalibravimo kreivė pavaizduota 5 paveiksle.
5 pav. Standartinių ginsenozidų kalibravimo kreivė.
y = 66,732x + 0,0827 R² = 0,9423 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014 0,0016 0,0018 0,002 A b s o r b c ij a Ginsenozidų koncentracija, mg/ml
2.4.4.
Antioksidantinis vertinimas spektrofotometriniu metodu
Antioksidantinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant DPPH (2,2-difenil-1-pikrihidrazilas) reagentą. 10 ml 70 proc. (v/v) etanolio tirpale ištirpinta 20 mg ekstrakto. 2 ml šio tirpalo sumaišoma su 2 ml DPPH (1x10-4
mol/L). Gauti tirpalai laikomi 30 min tamsoje, 27 °C temperatūroje. Absorbcija matuojama spektrometru prie 514 nm bangos ilgio. Antioksidantinis aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracijos kreivę, kuri rodo absorbcijos dydžio priklausomybę nuo trolokso koncentracijos. Kalibracijos kreivei sudaryti pasirinktos trolokso koncentracijos buvo- 0,005 mg/ml, 0,001 mg/ml, 0,0015 mg/ml, 0,002 mg/ml, 0,0025 mg/ml. Trolokso kalibravimo kreivė pavaizduota 6 pav. Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEAC) vienam gramui ekstrakto.
6 pav. Trolokso kalibravimo kreivė.
2.4.5.
Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenų statistinis įvertinimas atliktas „MS Excel 2010“ (Vašingtonas, JAV) ir „SPSS 20“ (Čikaga, JAV) programomis. Statistinis reikšmingumas tarp tiriamųjų mėginių nustatytas naudojant ANOVA dispersinę analizę, taikant Tuckey kriterijų. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingi, jei reikšmingumo lygmuo p<0,05. y = -25,34x + 0,5508 R² = 0,9985 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 A b s o r b c ij a Trolokso koncentracija, mg/ml
3. REZULTATAI
3.1. Kokybinis ginsenozidų nustatymas Lietuvoje auginamo kininio ženšenio
(Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose produktuose
Literatūros duomenimis kininio ženšenio šaknyje daugiausiai yra PPD (Rb1, Rb2, Rc, Rd) ir PPT (Re, Rg1) grupės ginsenozidų. Šio augalo šaknyje jie sudaro daugiau nei 90 proc. bendro ginsenozidų kiekio ir kininio ženšenio kokybė yra vertinama pagal šių ginsenozidų kiekį šaknyje [29,31,80]. Siekiant įvertinti ženšenio šaknies kokybę pirmiausiai reikia atlikti minėtų junginių fitocheminę analizę. Duomenų apie Lietuvoje auginamo Panax ginseng sudėtį rasti nepavyko, todėl atlikus ginsenozidų kokybinės sudėties analizę paaiškėtų, kokius ginsenozidus kaupia kininio ženšenio šaknis auganti Lietuvoje esančiomis klimato sąlygomis.
Skirtingų augimo metų kininio ženšenio šaknyse bei komerciniuose produktuose esančių ginsenozidų kokybinė analizė buvo atlikta plonasluoksnės chromatografijos metodu. Remiantis literatūros šaltiniais ginsenozidų analizei dažniausiai taikoma etilo acetato, vandens, butanolio (1:2:4 v/v/v) tirpiklių sistema, kuri ginsenozidus chromatogramoje išsiskirsto sekančia tvarka: Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1 [74,81]. Ginsenozidų standartinio mišinio bei skirtingų augimo metų kininio ženšenio šaknų mėginių chromatograma pavaizduota 7 paveiksle. Visuose mėginiuose buvo identifikuoti Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re ir Rg1 ginsenozidai, išskyrus mėginyje, kuriame yra 6 metus auginto kininio ženšenio šaknies ekstrakto.
7 pav. Standartinio ginsenozidų mišinio ir Panax ginseng šaknų ekstraktų chromatograma. A- standartinio ginsenozidų mišinio mėginys; B- 6 metų ženšenio šaknies ekstrakto mėginys; C- 8 metų
ženšenio šaknies ekstrakto mėginys; D- 9 metų ženšenio šaknies ekstrakto mėginys; E- 10 metų ženšenio šaknies ekstrakto mėginys; F- 11 metų ženšenio šaknies ekstrakto mėginys; G- 13 metų
ženšenio šaknies ekstrakto mėginys; H- 14 metų ženšenio šaknies ekstrakto mėginys.
Atliekant chromatogramos analizę buvo apskaičiuoti tiriamųjų junginių pasiskirstymo faktoriai (Rf- tiriamojo junginio dėmės ir tirpiklio poslinkių santykis). Remiantis gautais rezultatais visų ginsenozidų Rf reikšmių santykinis standartinis nuokrypis (proc.) neviršijo leistinos 5 proc. paklaidos (4 lentelė). Todėl galima teigti, kad pasirinktos tyrimo sąlygos yra tinkamos ginsenozidų identifikavimui plonasluoksnės chromatografijos metodu.
4 lentelė. Ginsenozidų Rf reikšmės naudojant etilo acetato- vandens- butanolio (1:2:4 v/v/v)
tirpiklių sistemą. SN- standartinis nuokrypis, SNN- santykinis standartinis nuokrypis (n=3)
Ginsenozidai Rf vidurkis Rf SN Rf SSN (proc.)
Rb1 0,183 0,006 3,279 Rb2 0,227 0,006 2,643 Rc 0,303 0,012 3,960 Rd 0,407 0,006 1,474 Re 0,497 0,012 2,415 Rg1 0,610 0,010 1,639
Tiriant komercinių produktų kokybę, augalinio vaistinio preparato mėginyje ginsenozidai identifikuoti nebuvo. Tam galėjo daryti įtaką augaliniame vaiste esantis dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstraktas, kuriame gausu fenolinių ir kt. junginių. Taip pat ženšenio saponinai nebuvo aptikti maisto papilde, kuriame gamintojai nurodė, kad 1 tabletėje yra 4 mg ginsenozidų. Ginsenozidas Rg1 (Rf= 0,607 ± 0,006) buvo nustatytas arbatoje ir pastilėse su kininiu ženšeniu, tačiau kiti ginsenozidai nustatyti nebuvo, nes taip pat aiškiai neišsiskirstė tiriamieji junginiai dėl galimų priemaišų mėginiuose. Komercinių produktų chromatograma pavaizduota 8 pav.
8 pav. Komercinių produktų chromatograma. A- standartinio ginsenozidų mišinio mėginys; B- augalinio vaistinio preparato mėginys; C- maisto papildo mėginys; D- arbatos mėginys; E-
pastilių mėginys
Apibendrinant gautus rezultatus galima teigti, jog Lietuvoje auginamo Panax ginseng šaknys kaupia Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re ir Rg1 ginsenozidus, išskyrus jie nebuvo nustatyti 6 metus auginto kininio ženšenio mėginyje. Remiantis literatūros duomenimis plonasluoksnės chromatografijos metodas šių junginių identifikavime turi tam tikrą aptikimo ribą [76]. Todėl galima teigti, kad 6 metus Lietuvoje auginto kininio ženšenio šaknies mėginyje esantis ginsenozidų kiekis buvo mažesnis už aptikimo ribą.
3.2. Suminis ginsenozidų kiekio nustatymas Lietuvoje auginamo kininio
ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose
produktuose
Nustatyta, kad kininio ženšenio sukauptas veikliųjų junginių kiekis yra vienas iš pagrindinių veiksnių vertinant jo kokybę, o mokslinių tyrimų rezultatai parodo, kad bendras ginsenozidų kiekis didėja ilgėjant augimo trukmei. Mokslinėje literatūroje rasta nedaug duomenų apie klimato, augimo sąlygų įtaką kininio ženšenio kaupiamų junginių kiekiui. Rytuose Panax ginseng turi būti auginamas 4- 6 metus norint naudoti šaknį kaip augalinę vaistinę žaliavą (ginsenozidai sudaro apie 3- 4 proc.) [18,24-26,9].
Suminis kininio ženšenio biologiškai aktyvių junginių- ginsenozidų kiekis tirtuose mėginiuose nustatytas spektrofotometriniu metodu, regimosios šviesos absorbcijos srityje. Ginsenozidų kiekių variacijos skirtingų metų šaknyse pavaizduotas 8 paveiksle. Nustatyta, kad mažiausias suminis šių junginių kiekis yra 6 metus auginto kininio ženšenio šaknyje- 0,054 ± 0,004 mg/g. Panašūs ginsenozidų kiekiai nustatyti 8 metus (0,083 ± 0,003 mg/g), 14 metų (0,086 ± 0,007 mg/g), bei 10 metų (0,092 ± 0,006 mg/g) augusių kininių ženšenių šaknyse. Didžiausias suminis ginsenozidų kiekis nustatytas 11 metų ženšenio šaknyse- 0,166 ± 0,003 mg/g. Šiek tik mažesni kiekiai nustatyti 13 (0,106 ± 0,007 mg/g) ir 9 metus (0,132 ± 0,006 mg/g) augintų Panax ginseng šaknyse.
9 pav. Suminis ginsenozidų kiekis kininio ženšenio (Panax ginseng C. A. Meyer) šaknyse (n=3). Tos pačios raidės virš diagramos žymi statistiškai nereikšmingą ginsenozidų kiekių skirtumą tarp
skirtingų auginimo metų kininių ženšenių šaknų
a a, b b a 0,0000 0,0250 0,0500 0,0750 0,1000 0,1250 0,1500 0,1750 0,2000 0,2250 0,2500 0,2750 0,3000 6 metų šaknis 8 metų šaknis 9 metų šaknis 10 metų šaknis 11 metų šaknis 13 metų šaknis 14 metų šaknis
Suminis
g
in
se
noa
zi
dų
kiekis
, mg
/g
Siekiant įvertinanti gautų rezultatų reikšmingumą buvo pritaikyta dispersinė analizė, vadinama ANOVA (angl. Analysis of Variance). Šia analize nustatytas statistinis reikšmingumas tarp skirtingų augimo metų Panax ginseng šaknų. Apskaičiavus gautų duomenų reikšmingumą tarp visų tiriamųjų kininio ženšenio šaknies mėginių nustatyta, kad ginsenozidų kiekis statistiškai nereikšmingas tarp 8, 10, 13 ir 14 metų augusių Panax ginseng šaknų (p>0,05). Bendrasis ginsenozidų kiekis tarp kitų augimo metų kininio ženšenio šaknų yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
Ginsenozidų kiekio rezultatai komerciniuose produktuose pateikiami 10 paveiksle. Atlikus komercinių produktų kiekybinę analizę, gauti duomenys rodo, kad daugiausiai ginsenozidų yra augaliniame vaistiniame preparate (0,264 ± 0,005 mg/g). Mažesni kiekiai aptikti arbatoje (0,185 ± 0,010 mg/g) ir pastilėse (0,083 ± 0,004 mg/g) su kininiu ženšeniu. Maisto papilde aptiktas mažiausias ginsenozidų kiekis (0,036 ± 0,003 mg/g). Įvertintinus komercinių produktų bendrus saponinų kiekius nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) yra tarp visų produktų.
10 pav. Suminis ginsenozidų kiekis komerciniuose produktuose (n=3)
Atsižvelgiant į gautus rezultatus, galima teigti, kad ginsenozidų kiekis kininio ženšenio šaknyje priklauso nuo augalo amžiaus. Tokią pat tendenciją nustatė ir kelios mokslininkų grupės Kinijoje [82-84]. Tačiau Lietuvoje augančio kininio ženšenio šaknyje nustatyti žymiai mažesni ginsenozidų kiekiai lyginant su kininių ženšeniu augančiu Rytuose [78,85]. Šį skirtumą tarp skirtingų
0,0000 0,0250 0,0500 0,0750 0,1000 0,1250 0,1500 0,1750 0,2000 0,2250 0,2500 0,2750 0,3000 Augalinis vaistinis preparatas
Maisto papildas Arbata Pastilės
Su mi n is g in se n o az id ų kiekis , mg /g
auginimo metų kininio ženšenio šaknyje esančių ginsenozidų gali įtakoti auginimo metu veikiančios skirtingos klimato (temperatūra, šviesos intensyvumas, krituliai ir t.t.), dirvožemio sąlygos, taip pat žaliavos apdirbimo, laikymo ir kitos sąlygos [30].
3.3. Bioaktyvių junginių antioksidantinis vertinimas Lietuvoje auginamo
kininio ženšenio (C. A. Meyer) šaknyse ir komerciniuose produktuose
Ginsenozidų antioksidantinis aktyvumas nustatytas laisvųjų radikalų surišimo metodu, naudojant DPPH reagentą. Iš visų Lietuvoje augintų skirtingų metų kininio ženšenio šaknų antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo tik 6 metus augusios kininio ženšenio šaknies mėginys, o komerciniuose produktuose- augalinis vaistinis preparatas ir arbata su kininiu ženšeniu (11 pav.).
11 pav. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu metodu su DPPH reagentu (n=3)
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad kininis ženšenis augęs Rytuose turi aukštą potenciją surišant laisvuosius radikalus, tačiau antioksidantinį aktyvumą labiausiai įtakoja ne ginsenozidai, o fenoliniai junginiai (cinamono, gentizo, benzoinė ir kt. rūgštys). Jų kokybiniams ir kiekybiniams rodikliams kininiame ženšenyje taip pat turi įtakos įvairūs veiksniai įskaitant augimo vietą, laiką,
43,33 ± 2,08 21,33 ± 2,08 8,67 ± 1,53 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
6 metų šaknis augalinis vaistinis preparatas arbata
TEA
C
, μg
klimato, dirvožemio ir žaliavos apdorojimo sąlygos (pvz., nustatyta, kad ženšenio šaknį apdorojant garais, fenolinių junginių kiekis, tuo pačiu ir antioksidantinis aktyvumas, reikšmingai padidėja, lyginant su baltuoju ženšeniu) [30].
Remiantis gautais rezultatais, galima daryti išvadą, kad Lietuvoje augęs kininis ženšenis daugiau nei 6 metus antioksidantinių junginių nekaupia šaknyse. 6 metus augusiame kininiame ženšenyje nustatytas antioksidantinis aktyvumas yra panašus su 6 metus Kinijoje augusiu kininio ženšenio lapų antioksidantiniu aktyvumu (46,08 ± 0,21 TEAC, μg/mg) [80].,
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS
Lyginant Lietuvoje auginamo kininio ženšenio šaknų kokybinę sudėtį su standartiniu ginsenozidų mišiniu, ginsenozidai Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re ir Rg1, buvo nustatyti 8, 9, 10, 11, 13 ir 14 metus augusių ženšenio šaknų mėginiuose. Nustatyti kininio ženšenio saponinų pasiskirstymo faktoriai atitinkamai buvo 0,183 ± 0,006, 0,227 ± 0,006, 0,303 ± 0,012, 0,407 ± 0,006, 0,497 ± 0,012, 0,610 ± 0,010. Pasirinktas plonasluoksnės chromatografijos metodo sąlygos leidžia identifikuoti ginsenozidus esančius Lietuvoje auginamo kininio ženšenio šaknų mėginiuose.
Eksperimentinio tyrimo metu, atlikus ginsenozidų kiekybinį nustatymą, nustatyta, kad didžiausias bendras ginsenozidų kiekis yra 11 metų Lietuvoje auginto kininio ženšenio šaknyse (0,166 ± 0,003 mg/g), mažiausias 6 metus auginto Panax ginseng šaknyje (0,054 ± 0,004 mg/ml). Apibendrinat kiekybinio tyrimo rezultatus galima teigti, kad ginsenozidų kiekis kininio ženšenio šaknyje priklauso nuo augimo laiko.
Bendrasis ginsenozidų kiekis tirtas augaliniame vaistiniame preparate, maisto papilde, arbatoje ir pastilėse su kininiu ženšeniu. Šiuose komerciniuose produktuose nustatytas ginsenozidų kiekis atitinkamai 0,264 ± 0,005 mg/g, 0,036 ± 0,003 mg/g, 0,185 ± 0,010 mg/g, 0,083 ± 0,004 mg/g. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas 6 metus Lietuvoje auginto kininio ženšenio mėginyje (43,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg). Kituose Lietuvoje auginto ženšenio šaknų mėginiuose antioksidantinis aktyvumas nenustatytas. Tai galėjo įtakoti Lietuvoje esančios klimato, dirvožemio sąlygos, augimo laikas, žaliavos apdorojimo būdas ir kt. sąlygos. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas taip pat ir komerciniuose produktuose- augaliniame vaistiniame preparate (21,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg) ir arbatoje (8,67 ± 1,53 TEAC, μg/mg) su ženšeniu. Kituose tirtuose komercinių produktų mėginiuose antioksidantinis aktyvumas neaptiktas.
Šis darbas buvo pristatytas tarptautinėje konferencijoje „The 5th international conference on pharmaceutical sciences and pharmacy practice dedicated to the 145th anniversary of prof. Petras Raudonikis“ Kaunas, 2014 m. lapkričio 22d. (1 priedas).
5. IŠVADOS
1. Atlikta mokslinių literatūros šaltinių analizė, kurioje buvo apžvelgtas kininio ženšenio morfologinis apibūdinimas, augimo sąlygos, paplitimas taip pat ginsenozidų struktūra, farmakologinis poveikis bei jų ekstrakcijos ir analizės metodai.
2. Visuose skirtingų metų Panax ginseng šaknų mėginiuose plonasluoksnės chromatografijos metodu nustatyti ginsenozidai- Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, Rd, išskyrus 6 metus auginto kininio ženšenio šaknyje, kurioje nebuvo identifikuoti ginsenozidai. Arbatoje ir pastilėse su kininiu ženšeniu buvo identifikuotas tik Rg1 ginsenozidas.
3. Suminis ginsenozidų kiekis, skirtingų metų Panax ginseng šaknyse, svyruoja nuo 0,054 ± 0,004 mg/ml iki 0,166 ± 0,003 mg/ml. Didžiausias suminis ginsenozidų kiekis yra 11 metų Lietuvoje auginto kininio ženšenio šaknyse. Mažiausias šių junginių kiekis yra šešerius metus auginto Panax ginseng šaknyse. Augaliniame vaistiniame preparate nustatytas bendrasis ginsenozidų kiekis- 0,0264 ± 0,0005 mg/ml. Arbatoje ir pastilėse su kininiu ženšeniu atitinkamai nustatytas 0,0185 ± 0,001 mg/ml ir 0,0088 ± 0,0004 mg/ml ginsenozidų kiekis. Mažiausias kiekis komerciniuose produktuose aptiktas maisto papilde, kuriame aptikta 0,0036 ± 0,0003 mg/ml ginsenozidų.
4. Didžiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas 6 metus auginto kininio ženšenio šaknyje (43,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg). Kiti Panax ginseng šaknų mėginiai antioksidantiniu aktyvumu nepasižymėjo. Komerciniuose produktuose antioksidantinis aktyvumas nustatytas augaliniame vaistiniame preparate (21,33 ± 2,08 TEAC, μg/mg) ir arbatoje su kininiu ženšeniu (8,67 ± 1,53 TEAC, μg/mg).
5. Apskaičiuotos ginsenozidų vidutinės Rf vertės, kurių santykinis standartinis nuokrypis svyravo nuo 1,474 iki 3,960 proc. ir neviršijo leistinos 5 proc. paklaidos. Tiriamųjų junginių kiekis statistiškai nereikšmingas tarp 8, 10, 13 ir 14 metų augusių Panax ginseng šaknų (p>0,05). Bendrasis ginsenozidų kiekis tarp kitų kininio ženšenio šaknų augimo metų yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Būtų tikslinga išsamiau įvertinti galimus klimato, regionų, dirvožemio kokybės, sezoniškumo, žaliavos apdirbimo ir kitus faktorius, kurie gali įtakoti Lietuvoje auginamo kininio ženšenio fitocheminę sudėtį, siekiant parinkti optimaliausias augimo sąlygas. Plonasluoksnės chromatografijos ir spektrofotometriniu metodu regimosios šviesos spektre galima nesudėtingai ir greitai atlikti kokybinę ir kiekybinę kininio ženšenio šaknyse esančių ginsenozidų sudėties analizę. Vykdant išsamesnius tyrimus reikėtų įvertinti atskirų junginių analizę pritaikant jautresnius metodus. Atskirų junginių išsami kokybinė ir kiekybinė analizė leistų vertinti Panax ginseng kokybę.
