MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
GRETA KALVAITYTĖ
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ DIDŽIOSIOS UGNIAŽOLĖS
(CHELIDONIUM MAJUS L.) ŽOLĖS, KOKYBINĖ –
KIEKYBINĖ ANALIZĖ, ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO TYRIMAS BEI KIETŲJŲ KAPSULIŲ
GAMYBA
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
prof. dr. Nijolė Savickienė
Konsultantas:
prof. habil. dr. Arūnas
Savickas
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ DIDŽIOSIOS UGNIAŽOLĖS (CHELIDONIUM
MAJUS L.) ŽOLĖS, KOKYBINĖ – KIEKYBINĖ ANALIZĖ,
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS BEI KIETŲJŲ
KAPSULIŲ GAMYBA
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas:
Darbo vadovas:
prof.habil. dr. Arūnas Savickas
prof. dr. Nijolė Savickienė
Data
Data
Recenzentas
Darbą atliko
...
Magistrantė
...
Greta Kalvaitytė
Data
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 10
SĄVOKOS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Chelidonium majus L. žolės cheminė sudėtis ir farmakologinės savybės ... 13
1.2. Baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, biologinės ir farmakologinės savybės ... 13
1.3. Chelidonium majus L. žolės cheminėje sudėtyje esančių biologiškai aktyvių junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimai ... 14
1.4. Baltymų frakcionavimas ir kokybinė analizė ... 15
1.4.1. Baltymų frakcionavimo metodas – gelchromatografija ... 15
1.4.2. Kokybinis baltymų nustatymas – plonasluoksnė chromatografija ... 16
1.4.3. Kokybinis baltymų nustatymas – baltymų NaDS – PAGE elektroforezė ... 17
1.5. Kiekybinis baltymų nustatymas ... 18
1.5.1. Vario jonų surišimu pagrįstas kiekybinis baltymų nustatymas ... 18
1.5.2. Kumasi (Coomasie) briliantinio mėlio dažiklio surišimu pagrįstas kiekybinis baltymų nustatymas ... 19
1.6. Technologinės baltymų formos ... 20
1.7. Kietųjų kapsulių gamyba ... 21
1.8. Veikliosios medžiagos atsipalaidavimo ypatumai ir nustatymo metodai ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo objektas ... 23
2.2. Reagentai ... 23
2.2.1. Reagentų paruošimas ... 24
2.2.1.1. Gelchromatografijoje naudotas fosfatinis buferis………..24
2.2.1.2. Tirpalai, naudoti baltymų elektroforezėje……….24
2.2.1.3. Geliai, naudoti baltymų elektroforezėje……….25
2.2.1.4. Jaučio serumo albumino standarto, naudoto Bradford metodo kalibracinei kreivei sudaryti, tirpalų gamyba……….25
2.2.1.5. ABTS radikalo – katijono tirpalo gamyba……….26
2.3. Įranga ... 26
2.4. Analitiniai metodai ... 27
2.4.1. Baltymų frakcijų skirstymas gelchromatografijos metodu ... 27
2.4.2. Baltymų kiekybinis nustatymas ... 27
2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė ... 28
2.4.4. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės, gamyba ... 29
2.4.5. Miltelių technologinių savybių vertinimas ... 30
2.4.5.2. Subėrimo kampo nustatymas ... 30
2.4.6. Pagamintų kietųjų kapsulių kokybės vertinimas ... 31
2.4.6.1. Pagamintų kietųjų kapsulių masės vienodumo testas………31
2.4.6.2. Pagamintų kietųjų kapsulių tirpimo testas……….31
2.4.7. Baltymų, išsiskyrusių iš pagamintų kietųjų kapsulių, kiekio nustatymas ... 32
2.4.8. Baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymas, naudojant (ABTS•+) modelinį radikalą ... 33
2.4.9. Statistinis duomenų vertinimas ... 33
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 34
3.1. Baltymų skirstymo gelchromatografijos metodu rezultatai ... 34
3.2. Baltymų kiekio nustatymas ... 35
3.3. Baltymų molekulinės masės tyrimas ... 35
3.4. Miltelių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės, birumo nustatymas... 37
3.5. Kietųjų kapsulių su ugniažolių žolės baltymais gamyba ir kapsulių masės vienodumo nustatymas ... 37
3.6. Baltymų kiekybinis nustatymas po išsiskyrimo iš kietųjų kapsulių ... 38
3.7. Baltymų antioksidantinio aktyvumo tyrimas, naudojant (ABTS•+) modelinį radikalą ... 38
4. IŠVADOS ... 41
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 43
SANTRAUKA
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ DIDŽIOSIOS UGNIAŽOLĖS (CHELIDONIUM
MAJUS L.) ŽOLĖS, KOKYBINĖ – KIEKYBINĖ ANALIZĖ,
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS BEI KIETŲJŲ
KAPSULIŲ GAMYBA
G. Kalvaitytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. N. Savickienė1
; Konsultantas: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2.
1Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
2Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra, –
Kaunas.
Darbo tikslas: Atlikti kokybinę – kiekybinę baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium
majus L.) žolės, analizę, įvertinti baltymų tirpalo antioksidantinį aktyvumą ir pagaminti su šiais baltymais kietąsias kapsules.
Darbo uždaviniai:
1. Atskirti Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcijas pagal dalelių dydį; 2. Kiekybiškai nustatyti baltymų kiekį gautose frakcijose;
3. Baltymų frakcijose nustatyti baltymų molekulinę masę;
4. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, tirpalu; 5. Nustatyti, kiek baltymų (%) atsipalaiduoja, tirpstant kietajai kapsulei;
6. Įvertinti iš Chelidonium majus L. žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinį aktyvumą, panaudojant modelinį ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)) radikalą – katijoną.
Metodai:
1. Baltymų frakcijos pagal dalelių dydį atskirtos gelchromatografijos metodu; 2. Bradford metodu kiekybiškai nustatyta baltymų sudėtis išskirtose frakcijose;
3. NaDS – PAGE elektroforezės metodu frakcijose nustatyta baltymų molekulinė masė;
4. Kietosios kapsulės pagamintos, baltymų tirpalus džiovinant 20 ± 2°C temperatūroje kartu su adsorbentais;
5. Baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, kiekis nustatytas Bradford metodu;
6. Iš didžiųjų ugniažolių žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai, matuojant mėginių gebą surišti ABTSradikalą – katijoną.
Rezultatai:
1. Baltymai pagal molekulių dydį suskirstyti į 44 frakcijas;
2. Nustatyta didžiausia baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, koncentracija frakcijose – 19,654 ± 0,04 µg/ml;
3. Nustatytos baltymų molekulinės masės atskirose frakcijose: 15, 20, 35 ir 38 kDa;
4. Pagamintos kietosios kapsulės su didžiųjų ugniažolių žolės baltymais. Pagalbinės medžiagos – mikrokristalinė celiuliozė Prosolv® SMCC HD 90 ir bevandenis koloidinis silicio dioksidas (aerosilas);
5. Atlikus baltymų išsiskyrimo iš kapsulių testą, po 60 minučių kapsulių tirpimo išsiskyrė 91 ± 0,58 % baltymų;
6. Maksimalus antioksidantinis aktyvumas (71,29 ± 0,9%) nustatytas, kai baltymų koncentracija tirpale buvo 7 μg/ml. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas (8,15 ± 1,2 %) pasiektas, kai baltymų koncentracija tirpale buvo 3 μg/ml. Didžiausias baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinis aktyvumas (35 ± 0,7%) stebėtas, kai iš kietųjų kapsulių išsiskyrė 3,85 ± 0,05 μg baltymų.
Išvados:
1. Atlikus didžiųjų ugniažolių žolės baltymų gelchromatografiją, baltymai atsiskyrė tik dalinai. 2. Frakcijose nustatyta nuo 0,312 ± 0,09 µg/ml iki 19,654 ± 0,04 µg/ml baltymų koncentracija. 3. Nustatyta frakcijose esančių baltymų molekulinė masė atitiko fermentinės kilmės baltymų ir su
chitinu besijungančių glikoproteinų – lektinų molekulinę masę. Reikalingi tolimesni tyrimai, norint nustatyti šių baltymų tapatybę.
4. Pagamintoje kiekvienoje kietojoje kapsulėje yra 4,86 ± 0,03 µg baltymų. Baltymų ir pagalbinių medžiagų mišinys yra tinkamas kapsuliavimui, nes pasižymi geru birumu ir atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus (pagal miltelių birumo greitį ir subėrimo kūgio kampą).
5. Kietųjų kapsulių gamybai pasirinktas tinkamas būdas, nes baltymų atsipalaidavimas iš jų yra efektyvus, atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus (iš kietosios kapsulės atsipalaidavo daugiau nei 75% baltymų per 45 min).
6. Baltymai, išskirti iš didžiųjų ugniažolių žolės, geba surišti laisvuosius radikalus. Stebėtas sumažėjęs baltymų antiradikalinis aktyvumas, pagaminus kapsules. Baltymų aktyvumo sumažėjimą galėjo lemti jų denatūracija dėl netinkamai parinktų eksperimentinių sąlygų, gaminant kapsules (temperatūros, ilgo džiovinimo ar kapsulių laikymo laiko).
Reikšminiai žodžiai: Chelidonium majus, baltymai, gelchromatografija, NaDS – PAGE,
SUMMARY
QUALITATIVE – QUANTITATIVE ANALYSIS OF PROTEINS
ISOLATED FROM CHELIDONIUM MAJUS L. HERB. EVALUATION OF
ANTIOXIDANT ACTIVITY AND PRODUCTION OF HARD CAPSULES
WITH THESE PROTEINS
Greta Kalvaitytė master thesis/ Supervisor of the research paper: prof. dr. Nijolė Savickienė1 Consultant: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2.
1
Department of Pharmacognosy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania;
2
Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania;
Objective of work: to perform the qualitative – quantitative analysis, antioxidant activity of proteins
from Chelidonium majus L. herb, to produce hard capsules with these proteins.
Main tasks:
1. To fractionate proteins from Chelidonium majus L. herb by their particle size; 2. To evaluate the amount of protein in prepared fractions;
3. To assess the molecular mass of protein from Chelidonium majus L. herb in fractions; 4. To produce hard capsules with solution of proteins;
5. To evaluate the amount of protein (%) released from capsule after dissolution;
6. To evaluate antioxidant activity of protein solution and proteins released from hard capsules against ABTS free radical – cation.
Methods:
1. Protein fractions, depending on their particle size, were separated by gel chromatography; 2. The amount of protein in prepared fractions was evaluated by Bradford assay;
3. The molecular mass of protein from Chelidonium majus L. herb was assesed by SDS – PAGE assay;
4. Hard capsules were produced by drying solution of proteins in 20 ± 2°C temperature with adsorbents;
5. The amount of protein (%), released from hard capsules, was evaluated by Bradford assay; 6. The antioxidant activity was evaluated by ABTS free radical – cation scavenging activity test
Results:
1. Proteins depending on particle size were separated into 44 fractions;
2. The biggest amount of proteins in prepared fractions was 19,654 ± 0,04 µg/mL; 3. The particle size in different fractions was 15, 20, 35 and 38 kDa;
4. Hard capsules with proteins from Chelidonium majus L. herb were produced. Support materials: silicified microcrystalline cellulose Prosolv® SMCC HD 90 and colloidal silicon dioxide (aerosil);
5. The amount of protein (%), released from hard capsules after 60 min, was 91 ± 0,58 %;
6. Antioxidant activity reached 71,29 ± 0,9 % at 7 μg/ml of protein solution. Least antioxidant activity (8,15 ± 1,2 %) was achieved at 3 μg/ml of protein solution. The highest antioxidant activity of proteins, released from hard capsules, was 35 ± 0,7 %, when hard capsules released 3,85 ± 0,05 μg of proteins.
Conclusions:
1. After the gel chromatography of proteins, isolated from Chelidonium majus L. herb, proteins were separated only partially.
2. The amount of protein in prepared fractions was from 0,312 ± 0,09 µg/mL to 19,654 ± 0,04 µg/mL.
3. The determined protein particle size matched up enzymatic proteins and chitin – binding glycoproteins (lectins) particle size. Further investigation is necessary to determine the sameness of protein.
4. Every produced hard capsule contains 4,86 ± 0,03 µg of proteins. Compound of proteins and support materials is suitable for encapsulation because of a good powder flow. It meets the requirements of European Pharmacopoeia (by powder flow rate and angle of repose).
5. Method of production of hard capsules was selected properly. Release of proteins from hard capsules is effective and meets the requirements of European Pharmacopoeia (hard capsule released more than 75% of proteins in 45 min).
6. Protein fractions are able to bind free radicals. This activity decreased after encapsulation of proteins. Decreased activity of proteins could be determined by their denaturation, which was caused by inappropriate conditions of producing capsules (temperature, long time of drying or storage).
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei už atsakingą požiūrį, kantrybę ir nepaprastai vertingas konsultacijas, rengiant mokslinį – tiriamąjį darbą.
Taip pat prof. habil. dr. Arūnui Savickui už skirtą laiką ir pagalbą priimant technologinius sprendimus. Vilniaus Universiteto Biotechnologijos instituto darbuotojams dėkoju už suteiktą materialinę bazę ir kokybiško darbo sąlygas, vykdant numatytuosius tyrimus.
SANTRUMPOS
CmGRP1 – glicinu praturtintas, su RNR besijungiantis baltymas (Chelidonium majus L. Glycine Rich RNA – binding protein);
CMP – fermentinės kilmės baltymas – peroksidazė;
CMN1, CMN2 – fermentinės kilmės baltymai – nukleazės;
CBL-1 – didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) glikoproteinas lektinas; PC – plonasluoksnė chromatografija;
JSA – jaučio serumo albuminas (anglų k. BSA – bovine serum albumin); BCR – bicinchoninė rūgštis (anglų k. BCA – bicinchoninic acid);
PBS – fosfatinio buferio tirpalas;
ABTS – 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); IP – išaktyvinimo procentas;
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas;
NaDS – natrio dodecilsulfatas (anglų k. SDS – sodium dodecyl sulfate); NaDS – PAGE – natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė; TRIS – 2-amino-2-hidroksimetil-propano-1,3-diolis;
TEMED – N, N, N´, N´- tetrametiletilendiaminas; APS – amonio persulfatas.
SĄVOKOS
Adsorbcija – medžiagos sugėrimas iš dujų ar skysčių adsorbento paviršiumi. Apoptozė – savaiminė ląstelių žūtis.
Chelacija – susijungimas su metalų jonais ir netirpių junginių sudarymas. Chitinas – angliavandenis, sudarytas iš N-acetilgliukozamino monomerų. Glicinas – pakeičiamoji amino rūgštis.
Lektinai – neimuninės ir nefermentinės kilmės baltyminės medžiagos, gebančios atpažinti ir jungtis prie įvairių angliavandenių bei sukelti ląstelių agliutinaciją.
Supernatantas – virš nuosėdų esantis skystis po centrifugavimo.
ĮVADAS
Šio tyrimo objektas – iš didžiųjų ugniažolių žolės išskirti baltymai. Didžioji ugniažolė (Chelidonium majus L.) – vaistinis augalas, pasižymintis antiuždegiminiu, choleretiniu, spazmolitiniu, analgetiniu, antimikrobiniu, antivirusiniu, antioksidantiniu, antinavikiniu, imunomoduliuojančiu veikimu [2]. Vaistinėje augalinėje žaliavoje – žolėje – kaupiami alkaloidai, organinės rūgštys, flavonoidai, karotinoidai ir kiti biologiškai aktyvūs junginiai [4].
Vaistinių augalų farmakologiniai poveikiai priklauso ne tik nuo biologiškai aktyvių antrinių metabolitų, bet ir nuo pirminių metabolitų, pvz., baltymų. Atlikta daug tyrimų in vivo ir in vitro su Chelidonium majus L. žolėje esančiomis biologiškai aktyviomis medžiagomis, tačiau vis dar mažai žinoma apie šioje vaistinėje augalinėje žaliavoje esančius baltymus, jų savybes ir biologinį aktyvumą. Todėl ši tiriamojo darbo tema yra aktuali.
Siekiant įvertinti biologinį ir farmakologinį baltymų aktyvumą, baltymams turi būti suteikta technologinė forma. Kietosios kapsulės – preliminariems baltymų in vivo tyrimams tinkama technologinė forma. Kapsulių gamybos metodas yra paprastas ir nereikalaujantis itin daug gamybos etapų bei įrengimų. Ši farmacinė forma užtikrina tikslų dozavimą bei priimtiną ir paprastą vartojimą [39].
Literatūros duomenimis, didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) žolės ekstraktuose esantys alkaloidai, fenoliniai junginiai, β – karotenas pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, tačiau antioksidantinis baltymų, išskirtų iš žolės, aktyvumas iki šiol tirtas nebuvo. Šiems baltymams nebuvo pritaikyta ir technologinė forma, todėl antioksidantinio baltymų nustatymo ir kietųjų kapsulių gamyba yra šio darbo naujumas.
Darbo tikslas: atlikti kokybinę – kiekybinę baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) žolės, analizę, įvertinti baltymų tirpalo antioksidantinį aktyvumą ir pagaminti su šiais baltymais kietąsias kapsules.
Magistro baigiamojo darbo tikslas įgyvendintas bendradarbiaujant kartu su Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V. F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institutu (vykdant bendrą projektą: „Naujų augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius immunomoduliatorius ir citostatikus“ (Paraiškos registracijos Nr. TAP-LB-12-006)). Šiame institute iš Chelidonium majus L. žolės išskirti baltymai. Sutikus bendradarbiauti ir Vilniaus Universiteto Biotechnologijos instituto mokslo darbuotojams, didžiųjų ugniažolių žolės baltymai įvertinti kokybiškai (natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės metodu) ir kiekybiškai (spektrofotometriniu Bradford metodu). Su tiriamųjų baltymų tirpalu, džiovinant jį 20 ± 2°C temperatūroje kartu su adsorbentais, pagamintos kietosios kapsulės, kurių atsipalaidavimas ištirtas krepšelio metodu. ABTS radikalo – katijono surišimo metodu nustatytas iš didžiųjų ugniažolių žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinis aktyvumas.
Atlikus tyrimus, paruoštas pranešimas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Studentų mokslinės draugijos (SMD) organizuojamoje Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijose 2014 metais. Taip pat pristatytas stendinis pranešimas tarptautinėje konferencijoje „5th International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practise, dedicated to 145th Anniversary of prof. Petras Raudonikis 2014“.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Atlikti kokybinę – kiekybinę baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės
(Chelidonium majus L.) žolės, analizę, įvertinti baltymų tirpalo antioksidantinį aktyvumą ir pagaminti su šiais baltymais kietąsias kapsules.
Darbo uždaviniai:
1. Atskirti Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcijas pagal dalelių dydį; 2. Kiekybiškai nustatyti baltymų kiekį gautose frakcijose;
3. Baltymų frakcijose nustatyti baltymų molekulinę masę;
4. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, tirpalu; 5. Nustatyti, kiek baltymų (%) atsipalaiduoja, tirpstant kietajai kapsulei;
6. Įvertinti iš Chelidonium majus L. žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinį aktyvumą, panaudojant modelinį ABTS radikalą – katijoną.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Chelidonium majus L. žolės cheminė sudėtis ir farmakologinės savybės
Didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) vaistinė augalinė žaliava – žolė, yra aprašyta Europos Farmakopėjos monografijoje (01/2008:1861) [1]. Augalas priklauso aguoninių (Papaveraceae) šeimai ir pasižymi antiuždegiminiu, choleretiniu, spazmolitiniu, analgetiniu, antimikrobiniu, antivirusiniu, antioksidantiniu, antinavikiniu, imunomoduliuojančiu veikimu [2].
Chelidonium majus L. žolė kaupia antrinius metabolitus – alkaloidus [3]. Žolėje identifikuojama per 20 skirtingų alkaloidų (iki 1 %), kurie yra skirstomi į kelias grupes: benzofenantridino darinius (chelidoninas, cheleritrinas, sangvinarinas, izochelidoninas), protoberberino darinius (berberinas, koptizinas) bei protopiną. Randama ir organinių rūgščių – chelidoninės, p-hidroksibenzoinės, obuolių, citrinų, kofeino (0,4%), p-kumarino (0,06%). Taip pat žolėje nustatyti saponinai, flavonoidai, karotenoidai, chelidocistatinas [4]. 2013 metais Rumunijoje spektrometriškai nustatytos įvairios mineralinės medžiagos Chelidonium majus L. žolėje – daugiausia aptikta kalio (4420mg/kg) ir kalcio (4402mg/kg) [5].
Pastaruoju metu didesnis dėmesys skiriamas Chelidonium majus L. žolėje esantiems baltymams išskirti ir analizuoti. 2007 metais iš Chelidonium majus L. sulčių išskirtas 21 baltymas [6]. Tais pačiais metais identifikuoti kiti du fermentinės kilmės baltymai – peroksidazė (CMP) ir nukleazės: CMN1 (20 kDa) ir CMN2 (36kDa) [7]. 2014 metais atlikta proteominė Chelidonium majus L. žolės ektrakto analizė. Ekstrakte nustatytas 1240 skirtingų baltymų rinkinys. Daugiausia rasta baltymo 14-3-3 (17%), šiluminio šoko baltymo (anglų k. heat shock protein) (16%), peroksidazės (13%), peroksiredoksino (9%) ir glioksalazės (9%) [8]. Augalo žolėje esančiose geltonos spalvos sultyse aptinkama glikoproteinų, tokių kaip lektinai [9]. Šių glikoproteinų sudėtyje dominuojančios amino rūgštys yra serinas (13,04%), asparto rūgštis (11,61%), glicinas (9,51%), leucinas (9,06%), treoninas (7,82%) [10].
1.2. Baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, biologinės ir farmakologinės
savybės
Nustatyta, kad Chelidonium majus L. žolės sultyse rastas glicinu praturtintas baltymas (CmGRP1) priklauso su RNR besijungiančių baltymų klasei. Tai baltymai, padedantys augalams greitai reaguoti į aplinkos pasikeitimus, sužeidimus ir patogenų (bakterijų, virusų) invazijas. Atsiradus patogeno sukeltai infekcijai, šie baltymai per signalinius kelius aktyvuoja už gynybą atsakingus genus
ir inicijuoja augalo atsparumą, t.y., infekcija nuslopinama. Atsiradus virusinei infekcijai, šie baltymai atpažįsta ir tiesiogiai susijungia su viruso RNR, paveikdami jos replikaciją [11].
2008 metais Lenkijoje vykdytas tyrimas atskleidė, kad iš Chelidonium majus L. žolės išskirti fermentinės kilmės baltymai nukleazės (CMN1 ir CMN2) paskatina moters gimdos kaklelio vėžinių ląstelių apoptozę. Šie baltymai geba hidrolizuoti nukleino rūgščių fosfodiesterines jungtis. Po 48 valandų inkubacinio periodo su 13,3 ng/ml koncentracijos nukleaze CMN2, 62 ± 3% vėžinių ląstelių sukelta apoptozė [12].
2014 metais Gruzijoje įrodyta, kad su chitinu besijungiantis baltymas lektinas (CBL-1), išskirtas iš Chelidonium majus L. augalo, pasižymi agliutinaciniu aktyvumu. Tyrimo metu agliutinavo triušio eritrocitai, bet nebuvo paveikti žmogaus eritrocitai. Yra žinoma, kad lektinai geba agliutinuoti ne vien eritrocitus, bet ir kitas ląsteles, bakterijas, grybelius bei virusus. Tai, kad tyrimo metu buvo atmestas šių baltymų toksiškumas žmogui, didesnį potencialą įgijo tolimesni lektinų biologinių savybių tyrimai ir pritaikymas medicinos praktikoje [13].
1.3. Chelidonium majus L. žolės cheminėje sudėtyje esančių biologiškai aktyvių
junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimai
Antioksidantinis Chelidonium majus L. vaistinėje žaliavoje – žolėje – kaupiamų junginių aktyvumas nustatytas in vitro metodais. Pirmą kartą antioksidantinis žolės ekstraktų aktyvumas geležies redukcijos antioksidantinės galios (FRAP) metodu buvo nustatytas 2003 metais Vengrijoje [14]. Pakartotinai antioksidantinis žolės ekstraktų aktyvumas įrodytas, panaudojus kitą – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalų surišimo metodą [15]. 2008 metais Rumunijoje ištirtas β-karoteno antioksidantinis aktyvumas žolėje [16]. Vėliau ištirtas nuo fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio priklausantis antioksidantinis Chelidonium majus L. žolės aktyvumas [17]. Aprašyta ir stipri alkaloido berberino geba slopinti superoksido radikalus [18]. Korėjos mokslininkai išaiškino Chelidonium majus L. žolės ekstraktų antioksidantinio aktyvumo mechanizmą: ekstraktuose esantys junginiai aktyvuoja transkripcijos faktorių FOXO3a, kuris dalyvauja įvairiuose ląstelės procesuose – ciklo kontrolėje, apoptozėje, DNR atkūrime ir laisvųjų deguonies radikalų surišime. FOXO3a sumažina aktyvių deguonies (O2•-) formų gamybą, aktyvindamas antioksidantiniu poveikiu pasižymintį fermentą – superoksido dismutazę [19]. Atlikus proteominę Chelidonium majus L. žolės ekstrakto analizę, jame rasta daugelis fermentinės kilmės baltymų (gliutationo peroksidazė, superoksido dismutazė, peroksiredoksinas), gebančių surišti laisvuosius radikalus, taigi, pasižyminčių antioksidantiniu aktyvumu [8].
1.4. Baltymų frakcionavimas ir kokybinė analizė
Baltymai identifikuojami ir charakterizuojami kokybiniais analizės metodais. Tyrimo metodai turi būti greitai ir paprastai atliekami, nesunkiai pritaikomi, atrankūs, tikslūs ir ekonomiški. Šiuos kriterijus atitinkantys kokybinio nustatymo metodai yra plonasluoksnė chromatografija (PC) ir natrio dodecil sulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS – PAGE). Plonasluoksnė chromatografija pagrįsta baltymuose esančių aminorūgščių adsorbcija ant sorbento paviršiaus, o NaDS – PAGE – įkrautų baltymų molekulių judėjimu elektriniame lauke [20, 21]. Prieš vykdant kokybinę baltymų analizę, rekomenduojama baltymus išskirstyti į atskiras frakcijas. Taip užtikrinamas geresnis kokybinių tyrimų rezultatų tikslumas ir patikimumas [22].
1.4.1. Baltymų frakcionavimo metodas – gelchromatografija
Gelchromatografija – tai kolonėlinės skysčių chromatografijos būdas molekulių atskyrimui pagal jų dydį ir formą, panaudojant polimerines medžiagas – gelius. Šis metodas yra pagrįstas sieto principu: tiriamajame bandinyje esančios molekulės viena nuo kitos atskiriamos minėtą bandinį perleidžiant per tam tikro skersmens poras turinčius sorbentus, esančius kolonėlėje [23]. Tai stacionarioji kolonėlės fazė. Baltymų atskyrimui, siekiant išvengti jų denatūracijos, dažniausiai naudojami hidrofiliniai sorbentai, tokie kaip dekstranas ir agarozė. Iš pradžių kolonėlė pripildoma sorbento funkciją atliekančiu išbrinkusios struktūros dariniu – geliu. Kad būtų užtikrinta gera eliuojamų medžiagų kartu su judančiąja faze tėkmė, gelis turi būti chemiškai inertiškas, o jo grūdeliai mechaniškai stiprūs. Prieš leidžiant mėginį, į sistemos kilpą prileidžiama buferių, kurių sudėtyje nėra ištirpusių dujų (kad neliktų oro burbuliukų). Ant kolonėlės užnešamas tiriamasis skirtingą molekulių dydį turintis bandinys, o kai jis įsigeria į gelį, pradedama leisti ir judančioji fazė – eliuentas. Kaip eliuentai dažnai panaudojami buferiai ar tirpikliai. Gelfiltracijos metodu tiriant krūvio neturinčias daleles, eliuentu gali būti distiliuotas vanduo. Tiriant krūvį turinčias daleles, pvz., baltymus, naudojami buferiai (natrio chloridas, katijoninis fosfatinis, anijoninis TRIS-HCl ir kt.), kontroliuojantys pH ir joninę jėgą. Molekulės, didesnės už gelio poras, tekėdamos į jas nepatenka, todėl iš kolonėlės išteka greičiausiai. Mažesnio skersmens molekulės išskiriamos lėčiau, nes iš pradžių pasiskirsto tarp gelio porų ir tik vėliau išteka iš kolonėlės (1 pav.).
1 pav. Gelchromatografijos principas
(https://drgpinstitute.wordpress.com/2014/12/26/gel-permeation-chromatography/)
Iš kolonėlės pradėjęs tekėti buferis su atsiskyrusiomis dalelėmis (eliuatas), prateka pro detekcijos kiuvetę, kurioje matuojama individuali medžiagos savybė – ultravioletinės spinduliuotės absorbcija. Registratorius nenutrūkstamai žymi pratekančio tirpalo absorbciją ir užfiksuoja medžiagų absorbcijos pikus. Pratekėjęs detekcijos kiuvetę, eliuatas mažais tūriais surenkamas automatiniu frakcijų kolektoriumi. Siekiant gelfiltracijos metodu nustatyti molekulines tiriamųjų bandinių mases, kaip standartas panaudojami žinomų molekulinių masių baltymai (aprotininas, ribonukleazė, ovalbuminas, feritinas, tiroglobulinas ir kt.) [24, 25]. Gelchromatografija yra greitas, paprastas, lengvai pakartojamas, ekonomiškas ir plačiai pritaikomas metodas. Tačiau išskiriami ir keli jo trūkumai. Būtina kruopščiai parinkti gelchromatografijos vykdymo sąlygas (sorbentus, eliuentus, tiriamųjų mėginių koncentraciją ir tūrį), kad būtų išvengta nepageidaujamų reakcijų kolonėlėje ir jos užteršimo. Taip pat nėra lengva interpretuoti gautus rezultatus, o tai gali iškreipti tyrimų išvadas [26, 27].
1.4.2. Kokybinis baltymų nustatymas – plonasluoksnė chromatografija
Plonasluoksnė chromatografija – tai kokybinis tyrimo metodas, paremtas tiriamųjų medžiagų adsorbcija and sorbento paviršiaus. Šiuo metodu galima identifikuoti po gelchromatografijos surinktų baltymų frakcijų sudėtį. Remiantis Europos Farmakopėjos monografija (01/2008:1861), šis metodas taikomas didžiųjų ugniažolių žolėje esantiems alkaloidams identifikuoti [1]. Literatūros duomenimis,
plonasluoksnė chromatografija panaudojama ir aminorūgščių nustatymui, kuris yra svarbus, vertinant baltymų struktūrą [28]. Metodo principas: kaip stacionarioji fazė yra naudojama chromatografinė stiklo, plastiko ar aliuminio folijos plokštelė, padengta plonu sorbento sluoksniu. Sorbentu dažniausiai parenkami aliuminio oksidas arba silicio dioksidas (silikagelis). Ant sorbento pieštuku neryškiai pažymima linija, ant kurios kapiliaru užlašinami maži tiriamojo baltymų tirpalo ir standartinių aminorūgščių tirpalų kiekiai. Tuomet plokštelė dedama į uždaromą stiklinį indą, prisotintą judančiosios fazės – eliuento – garų. Judančiąja faze būna organinių polinių ir nepolinių tirpiklių mišinys. Dažniausiai naudojami acetonas, chloroformas, etanolis, butanolis, etilacetatas ir kiti tirpikliai. Eliuentas dėl adsorbcijos jėgų pradeda kilti plokštele aukštyn ir kartu neša jame ištirpusias tiriamąsias baltymų mėginio daleles. Jos plokštele kyla skirtingu greičiu ir pasiekia skirtingą aukštį. Tai priklauso nuo baltymų mėginio sąveikos (cheminių jungčių susidarymo) su sorbentu stiprumo: kuo aminorūgščių funkcinės grupės labiau sąveikauja su sorbentu, tuo į mažesnį chromatografinės plokštelės aukštį jos pakyla. Kai eliuentas pakyla maždaug 10 cm atstumu nuo pradžios linijos, tyrimas baigiamas. Plokštelė išimama iš indo, išdžiovinama 20 ± 2oC temperatūroje ir ryškinama cheminiais reagentais (dragendorfo, ninhidrinu, platinos chlorido tirpalu). Plonasluoksnė chromatografija yra kokybinis metodas, kuriuo galima identifikuoti baltymų sudėtį pagal sulaikymo rodiklio Rf reikšmes.
Šis rodiklis yra tiriamosios medžiagos ir tirpiklio, nueito plokštele, kelio santykis. Baltymų sudėtyje esančios aminorūgšys nustatomos, palyginus gautas Rf reikšmes su standartinių aminorūgščių Rf
reikšmėmis [29]. Plonasluoksnės chromatografijos privalumai: nesunkiai atliekama; sunaudojami maži tiriamųjų medžiagų kiekiai; nereikalauja brangios įrangos; platus sorbentų ir tirpiklių pasirinkimas; chromatografuojant šiuo metodu netaikomas šildymas, todėl išvengiama baltymų denatūracijos; metodas gali būti pritaikomas ir kiekybiniam nustatymui (analičių dėmės gali būti nugramdomos nuo plokštelės, ištirpinamos ir tiriamos kitais metodais). Tačiau šis metodas mažiau jautrus už kitus metodus, pvz., NaDS – PAGE elektroforezę [20].
1.4.3. Kokybinis baltymų nustatymas – baltymų NaDS – PAGE elektroforezė
Elektroforetinis baltyminių kompleksų frakcionavimas poliakrilamidiniame gelyje yra kokybinės analizės metodas, padedantis skirstyti baltymus, įvertinti tokias jų charakteristikas, kaip krūvis ar molekulinė masė. Dažniausiai baltymų analizei yra naudojama natrio dodecil – sulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS – PAGE), kai dėl anijoninio detergento – natrio dodecil sulfato (NaDS) – įtakos denatūravę ir bendrą neigiamą krūvį įgiję baltymai poliakrilamido gelyje migruoja link teigiamą krūvį turinčio anodo. Kadangi baltymų komplekse esančios baltymų molekulės turi skirtingą molekulinę masę, skiriasi ir jų krūvio kiekis, tenkantis masės vienetui. Dėl šios
priežasties galutinis baltymų frakcionavimas priklauso vien tik nuo molekulinės masės. Priklausomai nuo poliakrilamido gelio koncentracijos, galima frakcionuoti skirtingos molekulinės masės makromolekules. Didinant poliakrilamido gelio koncentraciją, jo poros mažėja, todėl 5 % gelis rekomenduojamas atskirti denatūruotus baltymus, kurių molekulinė masė yra 57–212 kDa, 10% gelis: 16 – 68 kDa, o 15 %: 12 – 13 kDa [30]. Atlikus elektroforezę, baltymai ant gelio fiksuojami ir ryškinami dažais. Jautrus, pigus ir mažiems baltymų kiekiams nustatyti tinkamas dažymas yra sidabro nitrato tirpalu. Dažymo sidabru principas pagrįstas sidabro jonų ir tam tikrų baltymo molekulėje esančių cheminių grupių (COO
-) susijungimu, kuris tampa vizualiai matomas gelyje [31]. NaDS – PAGE elektroforezės privalumai: universalumas (galima tirti baltymus ir nukleino rūgštis), selektyvumas, patikimumas, rezultatų tikslumas. Trūkumai: šiam metodui atlikti būtini geri technologo įgūdžiai, kad būtų išvengta gelio deformacijos ir rezultatų netikslumo; ilgai trunkantis analizės metodas, sunaudojantis daug cheminių reagentų [21].
1.5. Kiekybinis baltymų nustatymas
Baltymų kiekiui frakcijose nustatyti dažniausiai naudojami spektrofotometriniai metodai, kurie yra skirstomi į dvi grupes:
I) metodai, paremti baltymo – vario jonų chelatų sudarymu su netiesiogine redukuoto vario jono detekcija;
II) metodai, paremti baltymo – dažiklio susijungimo reakcija su tiesiogine gauto junginio spalvos pokyčio detekcija [32].
1.5.1. Vario jonų surišimu pagrįstas kiekybinis baltymų nustatymas
Baltymų ir vario jonų chelacija yra paremti Louri bei bicinchoninės rūgšties kiekybinio baltymų nustatymo metodai. Louri (Lowry) metodas vykdomas dviem etapais. Pirmojo etapo metu baltymai per peptidinėse jungtyse esančius azoto atomus ir aromatinių aminorūgščių tirozino bei triptofano liekanas jungiasi su dvivalenčiais vario jonais (Cu2+
) ir redukuoja juos iki vienvalenčių (Cu+). Susiformavęs tarpinis junginys toliau reaguoja su Folin Ciocalteu reagentu (fosfomolibdeno – fosfovolframo rūgščių tirpalu). Antrojo etapo metu vyksta redokso reakcija ir šis reagentas yra redukuojamas, kai pirmajame etape susidaręs polipeptidų ir vario kompleksas atiduoda jam savo elektronus. Reakcijos eigoje susidaro mėlynos spalvos kompleksas, kurio sugertis matuojama, esant 750 nm bangos ilgiui. Louri metodu galima nustatyti baltymus, kurių koncentracija svyruoja nuo 0,01
iki 1,0 mg/ml. Šis metodas apibūdinamas kaip jautrus, tačiau rezultatams įtakos gali turėti pernelyg daug skirtingų priemaišų, tokių kaip: paviršiui aktyvios medžiagos, tioliai, disulfidai, glicerolis, K+
jonai ir kt. [33].
Bicinchoninės rūgšties (BCR) metodas turi panašumų su Louri metodu, kadangi taip pat vykdoma dvivalenčių vario jonų redukcija iki vienvalenčių. Susidaręs tarpinis kompleksas per vienvalenčius vario jonus (Cu+
) jungiasi su bicinchonine rūgštimi ir suformuoja violetinės spalvos kompleksą, sugeriantį šviesą prie 562 nm bangos ilgio. BCR metodo privalumai – didesnis jautrumas (juo galima nustatyti 0,5 μg/ml baltymų koncentracijas) ir galimybė nustatyti baltymų koncentraciją mėginiuose, kuriuose yra iki 5% įvairių priemaišų. Šio metodo trūkumas: norint išgauti labiau matomą susidariusio komplekso spalvą, reikalingas šildymas, o tai gali denatūruoti baltymus [34].
Abiem metodais baltymų kiekis nustatomas, palyginus gautus šviesos sugerties rezultatus su kalibracine kreive, kuriai sudaryti, kaip standartas, dažniausiai panaudojamas jaučio ar žmogaus serumo albuminas [35].
1.5.2. Kumasi (Coomasie) briliantinio mėlio dažiklio surišimu pagrįstas kiekybinis
baltymų nustatymas
Šis metodas (dar kitaip vadinamas Bradford metodu) po 2007 metais Turkijoje vykdyto palyginamojo tyrimo, skirto baltymų koncentracijai plazmoje, nustatyti, pripažintas kaip greitesnis, paprastesnis, lengviau atliekamas ir jautresnis už kitus metodus [36]. Pagrindinis metodo principas: baltymų frakcija paveikiama specifiniu reagentu – Kumasi (Coomasie) briliantinio mėlio dažikliu, su kuriuo sudaro mėlynos spalvos junginį (spalvos intensyvumas tiesiogiai priklauso nuo baltymų koncentracijos). Susidariusio junginio absorbcija pamatuojama, esant 595 nm UV bangos ilgio. Baltymo koncentracija nustatoma pagal kalibracinę kreivę. Metodo privalumai: Kumasi reagentas yra stabilus ir suderinamas su druskomis, tirpikliais, buferiniais tirpalais, o susidariusio komplekso spalvos pokytis matomas iškart, nekeičiant temperatūros sąlygų. Pagrindinis šio metodo trūkumas – nesuderinamumas su paviršiui aktyviomis medžiagomis. Net ir mažiausias šių medžiagų kiekis mėginyje nusodina reagentą. Bradfordo metodu galima nustatyti 10 – 100 µg baltymų koncentracijas, o pritaikius metodą mikroanalizei, galima nustatyti ir baltymus, kurių koncentracija yra 1 – 10µg [37].
1.6. Technologinės baltymų formos
Norint atlikti baltymų tyrimus in vivo, baltymams turi būti suteikta technologinė forma. Jos parinkimas gali lemti baltymų biologinį ir farmakologinį aktyvumą. Šiuo metu rinkoje yra apie 160 baltyminės kilmės vaistų, kuriems suteiktos parenteralinės, inhaliuojamos, rektalinės ar geriamosios formos. Visas šias technologines formas sieja bendri reikalavimai: baltymai jose turi būti labai išgryninti ir koncentruoti, turėti trumpą pusinės eliminacijos laiką ir mažiausiai dviejų metų tinkamumo vartoti laiką.
Yra du baltyminės kilmės vaistų vartojimo keliai: parenteralinis ir neparenteralinis (inhaliuojamas, rektalinis, peroralinis). Parenteralinis kelias (į veną, raumenis, po oda) laikomas pačiu efektyviausiu terapiniam aktyvumui užtikrinti, nes baltymams nereikia įveikti fermentinio ir žarnų epitelio barjerų. Tačiau dažniausiai vartojami injekciniai preparatai turi būti sterilūs, o tai lemia ypatingus jų gamybos, tyrimų, laikymo ir vartojimo reikalavimus.
Inhaliacinis baltyminės kilmės vaistų vartojimas yra patogus, saugus ir praktiškas. Didelis kapiliarinis tinklas aplink plaučius užtikrina greitą baltymų absorbciją, bet ji yra sąlyginai maža, nes inhaliuotas vaistas dažniausiai pasiskirsto tik viršutinėje plaučių dalyje.
Rektalinės baltyminės kilmės vaistų formos yra gerai pasisavinamos dėl geros kraujotakos. Apeinamas virškinamasis traktas. Šis vartojimo būdas tinkamas vaistams, kurie sukelia pykinimą ir virškinamojo trakto gleivinės trikdymą. Žvakutėje gali būti patalpinta didesnė baltymų dozė.
Peroralinės formos (tabletės, kapsulės) užtikrina paprastą vartojimo būdą, todėl yra populiariausios tarp vartotojų. Tačiau gaminant jas, būtina atsižvelgti į virškinamojo trakto įtaką baltymams. Baltymai turi įveikti fermentinį ir žarnyno epitelinį barjerą, kad būtų užtikrintas jų terapinis efektas. Siekiant, kad virškinamajame trakte baltymai nebūtų paveikti fermentų proteazių, kuriamos technologinės formuluotės su pagalbinėmis medžiagomis (buferiais, paviršiui aktyviomis medžiagomis, proteazių inhibitoriais). Žarnyno epitelis sudarytas iš tvirtai susijungusių ląstelių, kurios sunkiai praleidžia vandenyje tirpias medžiagas. Norint pagerinti baltymų absorbciją per žarnų epitelį, į technologines formuluotes dedama riebiųjų rūgščių, paviršiui aktyvių medžiagų, gliceridų ir tulžies druskų, kurios laikinai atidaro jungtis tarp ląstelių ir leidžia vandenyje tirpiems baltymams pereiti per epitelį [38]. Atlikta nedaug tyrimų su kapsuliuotomis baltymų formomis, bet yra žinoma, kad tai – preliminariems baltymų in vivo tyrimams tinkama technologinė forma. Kapsulių gamybos metodas yra paprastas ir nereikalaujantis itin daug gamybos etapų bei įrengimų. Kapsulių vidus veikliosiomis ir pagalbinėmis medžiagomis užpildomas, nevykdant presavimo, kuris gali pažeisti vaistinę medžiagą. Kapsulės apvalkalas apsaugo viduje esančias medžiagas, nepraleisdamas lakių skysčių, dujų ar oro deguonies. Ši farmacinė forma užtikrina tikslų dozavimą bei priimtiną ir paprastą vartojimą [39].
1.7. Kietųjų kapsulių gamyba
Kietosios kapsulės – kietą apvalkalą turintys, įvairios formos ir talpos preparatai, dažniausiai talpinantys vienkartinę vaistinės medžiagos dozę [40]. Kietųjų kapsulių gamybą palengvina pramonės paruošti kapsulių apvalkalai. Populiariausi kapsulių apvalkalai yra gaminami iš želatinos – gyvūninės kilmės polimero, kuris yra stabilus sausoje aplinkoje, bet tirpsta šiltuose skysčiuose. Dėl šių savybių želatininės kapsulės išlieka stabilios jas laikant, o pavartojus peroraliai, greitai tirpsta ir atpalaiduoja veikliąsias medžiagas [41].
Kadangi kapsulių apvalkalai jau būna pagaminti pramoniniu būdu, pagrindiniu technologo darbu tampa kietosios kapsulės užpildymas veikliąja ir pagalbinėmis medžiagomis. Pagalbinės medžiagos naudojamos, siekiant padidinti kapsuliuojamo užpildo masę (skiedikliai: manitolis, mikrokristalinė celiuliozė, laktozė, krakmolas), pagerinti birumą (slidinančios medžiagos: talkas, aerosilas), pagreitinti miltelių suirimą ir tirpumą (suirimą greitinančios medžiagos: natrio kroskarmeliozė, algino rūgštis). Kai kapsuliuojami skysti arba tiršti augaliniai ekstraktai, nedidelius jų kiekius galima adsorbuoti poringomis, didelį paviršiaus plotą turinčiomis pagalbinėmis medžiagomis ir gauti birias mases, tinkamas kapsulių pildymui [42].
Kapsulių pildymas gali būti atliekamas rankinėmis, pusiau automatinėmis ir visiškai automatinėmis mašinėlėmis. Visais šiais būdais pildant kapsules, atliekami sekantys veiksmai: kapsulių apvalkalai dedami į kapsuliavimo mašinėlę ir paskirstomi į specialius lizdus. Tuomet kapsulių kepurėlės atskiriamos nuo korpusų. Į korpusus duozuojamas kapsulių užpildas. Kapsulės uždaromos ir išimamos iš pildymo mašinėlės. Įvertinus kapsulių kokybę, jos yra pakuojamos ir ženklinamos [43, 44].
Prieš kapsuliavimą svarbu įvertinti technologines kapsuliuojamų veikliųjų ir pagalbinių medžiagų savybes: birumą, homogeniškumą, dalelių morfologiją. Nuo birumo priklauso kapsulių masės vienodumas. Gerai byrantys milteliai neprilips prie kapsulių apvalkalo, kapsulėse nesusidarys oro tarpų. Tokiu būdu kapsulės bus užpildytos tolygiai, kartu išvengiant didelių masės nuokrypių. Didesnės ir apvalią formą turinčios dalelės lemia geresnį birumą. Kad būtų užtikrintas geras miltelių birumas, atliekamas laisvai beriamų miltelių greičio ir subėrimo kampo nustatymas [45].
1.8. Veikliosios medžiagos atsipalaidavimo ypatumai ir nustatymo metodai
Efektyvus veikliosios medžiagos atsipalaidavimas iš kietųjų želatinos kapsulių yra sąlygojamas greito apvalkalo tirpimo. Kapsulės gali būti ir modifikuoto – pailginto ar uždelsto – atpalaidavimo. Pailginto atpalaidavimo modifikacija (celiuliozės darinių naudojimas, dvigubas apvalkalas) sulėtina
kapsulės turinio atsipalaidavimą, todėl užtikrinamas ilgiau trunkantis veikliosios medžiagos veikimas. Uždelstą kapsulės atpalaidavimą sąlygoja pagalbinių medžiagų įterpimas į kapsulių turinį ar apvalkalą, dėl kurio veiklioji medžiaga nėra paveikiama skrandžio sulčių ir atsipalaiduoja tik žarnyne [46, 47, 48].
Veikliosios medžiagos atsipalaidavimas priklauso nuo daugelio veiksnių: kapsulės užpildo dalelių dydžio, ilgalaikio kapsulės laikymo, temperatūros ir drėgmės poveikio. 2013 metais Lietuvoje vykdyto tyrimo metu kietosios kapsulės buvo užpildytos skirtingais sausųjų augalinių ekstraktų dalelių dydžiais (milteliais, granulėmis). Buvo atliktas tirpumo ir aktyvių junginių atpalaidavimo testas iškart po kapsulių užpildymo ir po ilgalaikio laikymo, trukusio iki 12 mėnesių, esant skirtingoms temperatūros bei santykinės oro drėgmės sąlygoms. Tyrimo metu nustatyta, kad mažesnės dalelės, turėjusios didesnį paviršiaus plotą, dėl geresnio skysčių skverbimosi į jas buvo nesunkiai atpalaiduotos tirpimo metu. Granulės didesnės, stabilesnės ir ne tokios jautrios drėgmei, todėl kapsulės, užpildytos jomis, parodė nepakitusį aktyvių junginių atpalaidavimą net po ilgalaikio laikymo. Tai įrodė gamybos technologijos įtaką aktyvių junginių atpalaidavimui. Pradinis aktyvių junginių atpalaidavimas buvo geresnis, palyginus su atpalaidavimu po ilgalaikio laikymo. Dėl temperatūros ir santykinės oro drėgmės pokyčių ilgalaikio laikymo metu kapsulėse susikaupė pernelyg daug drėgmės, kas apsunkino kapsulės suirimą ir aktyvių junginių atpalaidavimą [49].
Kapsulėse esanti veiklioji medžiaga veikia tik kapsulei ištirpus, todėl svarbu nustatyti vaistinės medžiagos tirpimo greitį. Tai įvykdyti padeda farmakopėjiniai – krepšelio ir mentinis – metodai. Krepšelio prietaisą sudaro stiklinis ar kitos inertiškos medžiagos permatomas indas, motoras, velenas ir poras turintis cilindrinis krepšelis (maišymo elementas). Indas pusiau įmerktas į pritaikytą vandens vonelę, kurioje kaitiklio dėka tirpimo testo metu palaikoma 37 ± 0,5 °C temperatūra. Kietoji kapsulė įdedama į sausą krepšelį, kuris yra pamerkiamas į indą su vandeniu ar kita tyrimui parinkta terpe. Krepšelis sukamas 50 – 200 apsisukimų per minutę greičiu, kol kapsulė ištirpsta. Mentinis prietaisas sudarytas tuo pačiu principu kaip ir krepšelio, išskyrus tai, kad, kaip maišymo elementai, yra naudojama mentė su velenu. Atsitiktinai parinkta kapsulė dedama į indą su vandeniu ir maišoma su prie veleno pritvirtinta mente, kol ištirpsta.
Abiem metodais tiriant kapsulių tirpumą, vaistinių medžiagų koncentracijos nustatomos tam tikrais laiko tarpais, paėmus mėginius iš indo, ir pripildant jį atitinkamu tūriu vandens ar kito tyrimui parinkto tirpalo, kad būtų kompensuojamas ir palaikomas pastovus terpės tūris. Siekiant atkartoti in vivo vykstantį veikliųjų medžiagų atsipalaidavimą, tyrimo metu gali būti parenkamos kitos terpės, pvz., dirbtinės skrandžio sultys (0,1 mol/l HCl tirpalas) ar fosfatinis buferis (pH 6,8), kartu su kasos fermentais, pvz, pankreatinu, kurie imituoja veikliųjų medžiagų atpalaidavimą žarnyne [50]. Reikalaujama, kad per 45 minutes ištirptų ne mažiau kaip 75% medžiagos [51].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Baltymų frakcijos, išskirtos iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) žolės, paruoštos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos V. F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institute.
2.2. Reagentai
1. Ultra švarus vanduo, ruošiamas Millipore vandens valymo sistema (VU Biotechnologijos institutas, Lietuva);
2. 0,01 M buferinis tirpalas – PBS, pH 7,4 (sudėtis: NaCl – 8,0 g/l; KCl – 0,2 g/l; Na2HPO4 –1,44
g/l; KH2PO4 – 0,24 g/l) (anglų k. phosphate buffered saline) (Sigma-Aldrich®, JAV);
3. azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) diamonio druska (ABTS) (anglų k. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) (Sigma-Aldrich®, JAV);
4. Kalio persulfatas (K2S2O8 ) (Sigma-Aldrich®, JAV);
5. Jaučio serumo albuminas (JSA) (Sigma-Aldrich®, JAV);
6. Bradford reagentas (sudėtis: 100mg mėlynos spalvos briliantinio mėlynojo dažiklio G-250; 50 ml 95% etanolio, 100 ml 85% fosforo rūgšties. Skiedžiama ultra švariu vandeniu iki 1 litro tūrio) (Sigma-Aldrich, JAV);
7. Etanolis (reaktifikuotas spiritas 96,3%) (C2H5OH) (Stumbras, Lietuva);
8. 99,8 % acto rūgštis (CH3COOH) (tirpalas) (Standart, Lenkija);
9. Natrio hidroksidas (NaOH) (milteliai) (Sigma-Aldrich®, JAV); 10. Prosolv® SMCC HD 90 (JRS Pharma, Vokietija);
11. Bevandenis koloidinis silicio dioksidas – aerosilas (Degussa AG, Vokietija) 12. Dinatrio hidrofosfatas (Na2HPO4 • 12H2O) (Sigma-Aldrich®, JAV);
13. Natrio chloridas (NaCl) (milteliai) (Carl-Roth, Vokietija);
14. Praskiesta vandenilio chlorido rūgštis (HCl) (tirpalas) (Merck, JAV); 15. Akrilamidas – BIS (30% tirpalas) (Sigma-Aldrich®, JAV);
16. TRIS (2-amino-2-hidroksimetil-propano-1,3-diolis)(NH2C(CH2OH)3) (Sigma-Aldrich®, JAV);
17. Natrio dodecilsulfatas (CH3(CH2)11OSO3Na)(tirpalas) (Sigma-Aldrich®, JAV);
18. Amonio persulfatas ((NH4)2S2O8)(APS)(milteliai) (Sigma-Aldrich®, JAV);
19. N, N, N´,N´ – tetrametiletilendiaminas (TEMED)(C6H16N2) (Sigma-Aldrich®, JAV);
(2-amino-2-hidroksimetil-propano-1,3-diolio) bazės, 9,4 g glicino (C2H5NO2), 5 ml 10 % NaDS) (Sigma-Aldrich®, JAV);
21. Neredukuotas pavyzdžio buferinis tirpalas (Lane Marker Non-reducing Sample Buffer) (penkis kartus koncentruotas), pH 6,8 (sudėtis: 0,3 M TRIS • HCl, 5% NaDS, 50% glicerolio, patentuotas rožinės spalvos dažiklis)(Thermo Fisher Scientific, Didžioji Britanija);
22. Baltymų standartas (rinkinys PageRuler™ #26616, naudojamas elektroforezei; dalelių dydis 10 – 170 kDa) (Fermentas Life Science, Lietuva);
23. Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkinys (Thermo Fisher Scientific, JAV); 24. „0“ dydžio želatininės kapsulės (Capsuline, JAV)
2.2.1. Reagentų paruošimas
Gelchromatografijai atlikti paruoštas fosfatinis buferis (pH 7,0); natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezei vykdyti pagamintas gelis ir paruošti naudoti tirpalai; kalibracinei kiekybinio baltymų nustatymo kreivei sudaryti paruošti skirtingų koncentracijų jaučio serumo albumino tirpalai; baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymui aktyvuotas ABTS radikalas – katijonas.
2.2.1.1. Gelchromatografijoje naudotas fosfatinis buferis
Buferis paruoštas tokiu būdu: 17,91 g Na2HPO4·12H2O ir 8,77 g NaCl tirpinta
995 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų 7,0. Gautas tirpalas skiestas ultra švariu vandeniu iki 1000 ml. Pagamintas buferis saugomas +4ºC temperatūroje.
2.2.1.2. Tirpalai, naudoti baltymų elektroforezėje
1. 1,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 8,8. 18,15 g TRIS tirpintas 70 ml ultra švaraus vandens. Į
tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų 8,8. Gautas tirpalas skiestas ultra švariu vandeniu iki 100 ml. Saugomas +4ºC temperatūroje;
2. 0,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 6,8. 6,0 g TRIS tirpintas 70 ml ultra švaraus vandens. Į
tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų 6,8. Gautas tirpalas skiestas ultra švariu vandeniuiki 100 ml. Saugomas +4ºC temperatūroje;
3. 10 % Natrio dodecilsulfato (NaDS) tirpalas. 5,0 g NaDS tirpinta nedideliame tūryje ultra švaraus
vandens. Gautas tirpalas praskiestas iki 50 ml, laikomas 20 ± 2°C temperatūroje;
4. 10 % amonio persulfato (APS) tirpalas. 100 mg APS ištirpinta 1 ml ultra švaraus vandens.
Tirpalas tinkamas naudoti tik pagaminimo dieną;
5. Vienkartinis (1x) elektroforezės buferinis tirpalas. 100 ml TRIS – glicino – NaDS
elektroforezės buferinis tirpalas (10x) skiedžiamas ultra švariu vandeniu iki 1 litro.
2.2.1.3. Geliai, naudoti baltymų elektroforezėje
Atskirai ruošiami 15% frakcionuojantis ir 4 % koncentruojantis poliakrilamido geliai. Frakcionuojantis gelis gaminamas sumaišant 5 ml 30 % akrilamido-BIS tirpalo, 2,5 ml 1,5 M TRIS-HCl buferinio tirpalo (pH 8,8), 2,3 ml ultra švaraus vandens ir 0,1 ml 10 % NaDS tirpalo. Gelio polimerizacijai sukelti, į pagamintą tirpalą pripilama 0,1 ml APS ir 0,01 ml TEMED. Koncentruojantis gelis gaminamas atitinkamai sumaišant 1,3 ml 30 % akrilamido-BIS tirpalo, 2,5 ml 0,5 M TRIS-HCl buferinio tirpalo (pH 6,8), 6,1 ml ultra švaraus vandens ir 0,1 ml 10 % NaDS tirpalo. Gelio polimerizacijai sukelti, į pagamintą tirpalą pripilama 0,05 ml APS ir 0,01 ml TEMED.
Paruoštas frakcionuojančio gelio tirpalas pilamas į sukonstruotą formą iki tam tikros pažymėtos vietos (4 cm nuo stiklo viršaus) ir atsargiai užpilamas ultra švariu vandeniu. Polimerizacija trunka apie 40 min. Ant sustingusio skiriamojo gelio pilamas koncentruojančio gelio tirpalas ir įstatomos specialios gelio takelius formuojančios šukos. Polimerizacija trunka apie 40 min. Vėliau šukos ištraukiamos, o takeliai praplaunami ultra švariu vandeniu.
2.2.1.4. Jaučio serumo albumino standarto, naudoto Bradford metodo kalibracinei
kreivei sudaryti, tirpalų gamyba
Prieš nustatant baltymų koncentracijas tirpaluose Bradford metodu, yra sudaroma kalibracinė kreivė, naudojant jaučio serumo albumino (JSA) standartinius tirpalus. Standartiniai pramoniniu būdu paruošti jaučio serumo albumino tirpalai skiedžiami ultra švariu vandeniu 1 ml mėgintuvėliuose. 1 lentelėje pateikta informacija apie pirminio jaučio serumo albumino standarto tirpalo koncentraciją bei tūrį ir naudojamo praskiedimui ultra švaraus vandens tūrį, ruošiant tam tikros koncentracijos galutinį jaučio serumo albumino standartą.
1 lentelė. Jaučio serumo albumino standarto tirpalų koncentracijos, tūriai bei ultra švaraus vandens tūriai
Mėgintuvėlio numeris
Pirminis jaučio serumo albumino standartas Ultra švaraus vandens tūris, µl Galutinė jaučio serumo albumino standarto koncentracija, µg/ml Tirpalo koncentracija, mg/ml Tirpalo tūris, µl 1 2 10 790 25 2 2 10 990 20 3 1,5 10 990 15 4 1 10 990 10 5 0,5 10 990 5 6 0,25 10 990 2,5 7 0,125 10 990 1,25 8 (tuščias mėginys) - - 1000 0
2.2.1.5. ABTS radikalo – katijono tirpalo gamyba
Antioksidantiniam aktyvumui nustatyti ruošiamas ABTS radikalo – katijono tirpalas: atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių ir ištirpinama 50 ml ultra švaraus vandens. Po to į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato ir gerai išmaišoma. Aktyvacijai būtinas tam tikras laiko tarpas, tad šis radikalas kartu su aktyvatoriumi kalio persulfatu laikomas tamsioje, 9 – 15°C temperatūroje ne trumpiau nei 16 valandų.
2.3. Įranga
1. Analitinės svarstyklės CPA225D-0CE (Sartorius, Vokietija); 2. Spektrofotometras TECAN infinite M200 (Tecan, Vokietija); 3. Automatiniai dozatoriai (pipetmanai) (Eppendorf Research, JAV); 4. Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5415R (Eppendorf Research, JAV);
5. Gelfiltracijos kolonėlė GE Healthcare Superdex 200 10/300 GL (dydis – 1x30cm; tūris – 24ml) (GE Healthcare, Švedija),
6. Gelfiltracijos chromatografijos sistema AKTA purifier 100 (GE Healthcare, Švedija); 7. Krepšelio aparatas Erweka DZT (Erweka GmbH, Vokietija);
8. Laikmatis (Thermo Fisher Scientific, JAV);
9. Termostatas Dri – Block® DB – 2D (Techne, Didžioji Britanija);
11. Vandens gryninimo sistema Synergy millipore (Merck, JAV); 12. 2 mm skersmens sietas (Fisher Scientific, JAV);
13. Kapsuliavimo mašinėlė Capsuline – 15 (Capsuline, JAV);
14. Aparatas birumo nustatymui ERWEKA AG (ERWEKA GmbH, Vokietija);
2.4. Analitiniai metodai
2.4.1. Baltymų frakcijų skirstymas gelchromatografijos metodu
Siekiant atskirti Chelidonium majus L. žolės baltymus pagal dalelių dydį, atlikta gelchromatografija. Ji vykdyta, naudojant AKTA gryninimo sistemą ir cilindro formos Superdex 200 10/300 GL gelchromatografijos kolonėlę. Kolonėlė užpildyta sorbentu – agarozės ir dekstrano mišiniu. Prieš gelchromatografiją 1,5 ml baltymų tirpalo centrifuguota +4 ± 1oC temperatūroje 15 minučių, 10000 apsisukimų per minutę greičiu, naudojant Eppendorf Centrifuge 5415R centrifugą, surinktas baltymų mėginio supernatantas. Gelchromatografija atlikta, esant +4 – +16oC temperatūrai. Kolonėlė pusiausvyrinama, leidžiant 50 ml distiliuoto vandens, po to – 50 ml eliuento – fosfatinio buferio (pH 7,0). Gelchromatografijos sąlygos: tėkmės greitis 0,5 ml per minutę; maksimali slėgio riba – 14 barų. Prieš leidžiant mėginį, sistemos kilpa užpildyta judančiąja faze – fosfatiniu buferiu (pH 7,0), kad neliktų oro burbuliukų. Švirkštu sušvirkštas 1 ml mėginio supernatanto. Registruoti frakcijų pikai, esant 215 nm ir 280 nm UV bangos ilgiui. Baltymų frakcijos surinktos po 0,5 ml į 44 ependorfus.
2.4.2. Baltymų kiekybinis nustatymas
Baltymų kiekis tiriamosiose baltymų frakcijose nustatytas spektrofotometriniu Bradford metodu. Baltymų tirpalą paveikus Bradford reagentu, susidaro mėlynos spalvos junginys, kurio šviesos absorbcija nustatoma spektrofotometriškai. Baltymo kiekis yra tiesiogiai proporcingas spalvos intensyvumui ir yra nustatomas pagal kalibracinę kreivę, sudarytą naudojant standartinius jaučio serumo albumino (JSA) tirpalus.
Automatiniu dozatoriumi paimama po 120 µl pagamintų standartinių jaučio serumo albumino tirpalų ir mikrolėkštelėse sumaišoma su tokiu pat kiekiu Bradford reagento. Po 5 minutes trunkančio inkubacinio laikotarpio 20 ± 2°C temperatūroje, spektrofotometru pamatuojama absorbcija, esant 595 nm bangos ilgiui. Remiantis optinio tankio reikšmėmis, brėžiamas grafikas – šviesos sugerties
priklausomybė nuo baltymo koncentracijos. Gauta kalibracinė baltymų kiekio nustatymo tiesė, pavaizduota 2 paveiksle.
2 pav. Kalibracinė Bradford metodo baltymų kiekio nustatymo kreivė
Tyrimo eiga pakartota, sumaišant po 120µl tiriamųjų baltymų frakcijų, surinktų po gelfiltracijos, su tokiu pat kiekiu Bradford reagento. Po 5 minučių vėl matuota absorbcija, esant 595 nm bangos ilgiui. Absorbcijos priklausomybė nuo baltymo koncentracijos yra tiesinė. Gautos kalibracinės kreivės funkcija yra y = 0,0205x + 0,0105, o koreliacijos koeficientas R2
= 0,9956. Kadangi jis yra artimas 1, tokia kalibracinė kreivė yra laikoma patikima ir gali būti naudojama baltymų koncentracijų nustatymui tiriamosiose frakcijose. Pagal funkciją apskaičiuotas tiriamosiose frakcijose esančių baltymų kiekis. Bradford tyrimas atliktas du kartus: prieš baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus (L.) žolės, kapsuliavimą ir tiriant baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, kiekį.
2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė
Siekiant nustatyti baltymų molekulines mases, buvo atlikta natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS – PAGE).
Mėginių paruošimas. Po gelchromatografijos atrinktos baltymų tirpalų frakcijos, turinčios didžiausią baltymų koncentraciją. Imama po 32 µl baltymų frakcijos, sumaišoma su 8 µl neredukuoto pavyzdžio buferinio tirpalo (Lane Marker Non – reducing Sample Buffer). Toliau mėginiai kaitinami termostate 5 minutes, esant 95oC temperatūrai.
Elektroforezės eiga. Elektroforezė atliekama vertikaliame elektroforezės aparate, naudojant poliakrilamidinį gelį, kuris yra sudarytas iš 15 % koncentracijos frakcionuojančio (apatinio) gelio ir 4 % koncentruojančio (viršutinio) gelio. Prieš įleidžiant į gelio takelius mėginius, iš gelio ištraukiamos šukos, o viršutinis ir apatinis aparato rezervuarai užpildomi vienkartiniu elektroforezės tirpalu: TRIS – glicino – NaDS buferiu. Ant gelio užnešama po 30 µl paruoštų mėginių ir 0,5 µl standarto. Kaip standartas naudojami žinomų molekulinių masių baltymai (PageRuler™ #26616, dalelių dydis 10 – 170 kDa). Elektroforezė atliekama, esant 200 V elektrinei įtampai, per gelį tekant 25 mA stiprio elektros srovei. Tyrimas vykdomas 90 minučių, kol dažo frontas pasiekia skiriamojo gelio apačią. Po to srovės šaltinis išjungiamas, gelio plokštelė išimama iš buferio sistemos. Iš plokštelės išimtas skiriamasis gelis dažomas sidabro nitrato tirpalu.
Gelio dažymas. Po elektroforezės poliakrilamido gelis dedamas į plastikinę vonelę ir dukart plaunamas ultra švariu vandeniu. Tuomet fiksuojamas 30 % etanolio ir 10 % acto rūgšties tirpalu. Perplovus 10% etanoliu ir ultra švariu vandeniu, gelis aktyvinamas jautrumą didinančiu darbiniu tirpalu (0,2 % „Silver Stain Sensitizer“ tirpalas ultra švariame vandenyje). Dar kartą perplovus ultra švariu vandeniu, į vonelę ant gelio plokštelės pilama 2 % „Silver Stain Enhancer“ ir „Silver Stain“ mišinio. Gelis dažomas pusvalandį ir perplaunamas vandeniu. Ant perplauto gelio užpilama ryškinamojo tirpalo (2 % „Silver Stain Enhancer“ su „Silver Stain Developer“), kuris išryškina gelyje atsiradusias baltymų juosteles. Stabilizuojant nudažytą gelį, jis apdorojamas 5 % acto rūgštimi.
2.4.4. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės,
gamyba
Baltymų tirpalai išdžiovinti, naudojant adsorbentus – poringas kietas medžiagas su dideliu paviršiaus plotu: silicifikuotą mikrokristalinę celiuliozę Prosolv® SMCC HD 90 ir bevandenį koloidinį silicio dioksidą – aerosilą. Baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) žolės, tirpalas porcelianinėje lėkštelėje sumaišytas su pagalbinėmis medžiagomis: 3 dalys baltymų tirpalo sumaišyta su 10 dalių Prosolv® SMCC HD 90 ir 3 dalimis aerosilo. Gauta masė paskleista ant pergamentinio popieriaus ir palikta džiūti 20 ± 2°C temperatūroje 24 valandas iki 10 % sausojo likučio. Tuomet masė pertrinta per 2 mm dydžio angelių sietą. Kapsulėms gaminti naudota kapsuliavimo mašinėlė. Susidarę birūs milteliai kapsuliuoti į „0“ dydžio kapsules, pripildant didesnįjį cilindrą (korpusą) milteliais ir užvelkant ant jo mažesnįjį cilindrą (kepurėlę). Pagamintos kietosios želatinos kapsulės jautrios drėgmės ir temperatūros pokyčiams, todėl buvo laikomos 4 ± 1°C temperatūros sąlygomis, esant 30 – 60% santykinei oro drėgmei.
2.4.5. Miltelių technologinių savybių vertinimas
Miltelių technologinėms savybėms vertinti nustatytas laisvai beriamų miltelių greitis ir miltelių kūgio kampas.
2.4.5.1. Birumo greičio nustatymas
Pasverta 50 ± 0,01 g tiriamųjų miltelių mišinio (0,01 g tikslumu) ir suberta į prietaiso Erweka AG (Vokietija) piltuvėlį. Taikyta 20-ties sekundžių vibracija. Po purtymo atidarius piltuvėlį, išmatuotas laikas t (sek), per kurį tiriamieji milteliai m (g) išbėgo į surinkimo indą. Birumo greitis B (g/sek) apskaičiuotas pagal 1 formulę:
20
t
m
B
(1 formulė) Birumas turi būti ne mažesnis kaip 4 – 5 g/s [52].
2.4.5.2. Subėrimo kampo nustatymas
Subėrimo kampas matuotas, naudojant prietaisą Erweka AG (Vokietija). Miltelių mišinio dalelės, laisvai byrėdamos per fiksuotą piltuvą į surinkimo indą, suformuodavo kūgį, kurio aukštis buvo išmatuotas į prietaisą integruotu matlankiu.
2 lentelėje pavaizduotas miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą, remiantis Eur. Ph. 2.9.36 [52].
2 lentelė. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą
Birumas Kūgio kampas (o)
Puikus 25 – 30 Geras 31 – 35 Vidutiškas 36 – 40 Priimtinas 41 – 45 Prastas 46 – 55 Labai prastas 56 – 65 Itin prastas > 66
Kuo mažesnis kūgio kampas (o), tuo geresnės miltelių birumo savybės, taigi ir kapsuliavimo
galimybės.
2.4.6. Pagamintų kietųjų kapsulių kokybės vertinimas
Pagamintų kietųjų želatininių kapsulių kokybės rodiklių vertinimui atliktas masės vienodumo ir kapsulių tirpimo testas.
2.4.6.1. Pagamintų kietųjų kapsulių masės vienodumo testas
Tyrimas atliktas pagal Eur. Ph. 01/2008:20905 – „Vienadozių preparatų masės vienodumo nustatymas“[53].
Testui atlikti paimama 20 atsitiktinai parinktų, nepažeistų kapsulių, kurios yra pasveriamos ir apskaičiuojama vidutinė vienos kapsulės masė. Kietoji kapsulė yra atidaroma ir visas jos turinys išberiamas. Atskirai pasveriamas ir želatininis kapsulės apvalkalas. Kapsulės turinio masė yra skirtumas tarp nepažeistos kapsulės masės ir jos apvalkalo masės. 3 lentelėje parodytas leistinas svėrinių nuokrypis. Leidžiamas tik ne daugiau kaip 2 svėrinių nuokrypis procentais nuo masės vidurkio, didesnis nei nurodytas šioje lentelėje. Be to, nė vienas iš svėrinių neturi leistinų nuokrypio ribų viršyti daugiau kaip 2 kartus.
3 lentelė. Leistinas svėrinių nuokrypis
2.4.6.2. Pagamintų kietųjų kapsulių tirpimo testas
Šio tyrimo tikslas – įvertinti baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių greitį. Kapsulių tirpimo tyrimui naudotas krepšelinis prietaisas.
Tyrimas atliktas, naudojant aparatą Erweka DZT. Prietaisą sudaro vandens vonia, kurioje yra įstatytas indas su tyrimui reikalinga terpe (50 ml fosfatinio druskos buferinio tirpalo (PBS) ir natrio
Vaistinė forma Vidutinė masė Procentinis nuokrypis
Kapsulės Mažiau nei 300 mg 10 % 300 mg ir daugiau 7,5 %
šarmo (NaOH) mišiniu (pH=8)). Į indą įmerktas nustatytu greičiu (100 apsisukimų per minutę) besisukantis krepšelis. Terpės temperatūra (37 ± 0,5 o
C) palaikoma termostatinio vandens šildytuvo pagalba. Krepšelio nuotolis nuo indo dugno – 20 ± 2 mm. Į krepšelį dedama atsitiktinai parinkta kapsulė. Kapsulei su baltymų frakcija pradėjus tirpti, kas 15 minučių imami baltymų tirpalų mėginiai po 10 ml (paimti viso 4 mėginiai – po 15, 30, 45, 60 minučių). Mėginiai imami iš vietos, esančios viduryje tarp tirpimo terpės paviršiaus ir krepšelio apatinės dalies, ne mažesniu kaip 10 mm atstumu nuo indo sienelių. Kiekvieną kartą iš indo paėmus 10 ml baltymų tirpalo mėginio, atgal į indą įpilta 10 ml terpės, kad būtų kompensuojamas ir palaikomas pastovus terpės tūris.
2.4.7. Baltymų, išsiskyrusių iš pagamintų kietųjų kapsulių, kiekio nustatymas
Siekiant nustatyti, kiek baltymų, tirpstant kapsulei, atsipalaidavo, buvo atliktas Bradford tyrimas. Atlikta surinktų mėginių po 15, 30, 45 ir 60 minučių analizė.
Naudojant 0,125, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 ir 2 mg/ml koncentracijų jaučio serumo albuminą, kaip standartą, sudaryta nauja kalibracinė kreivė, pavaizduota 3 paveiksle.
3 pav. Kalibracinė Bradfordo metodo kiekybinio baltymų nustatymo kreivė
Pamatavus tiriamųjų mėginių tirpalų absorbciją, baltymų koncentracija apskaičiuota pagal lygtį y = 0,0604x – 0,0154. Koreliacijos koeficientas R² = 0,9899. Kalibracinė kreivė yra patikima, kadangi koreliacijos koeficientas artimas 1. Didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) atsipalaidavusių iš kapsulių baltymų kiekis palygintas su baltymų kiekiu kapsulėje.
