MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
JOVITA JUODSNUKYTĖ
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ ISLANDINĖS KERPENOS
(CETRARIA ISLANDICA (L.) ACH.) GNIUŽULŲ, KOKYBINIS IR
KIEKYBINIS NUSTATYMAS, KIETŲJŲ KAPSULIŲ GAMYBA IR
BALTYMŲ ATSIPALAIDAVIMO IŠ KAPSULIŲ TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė:
prof. dr. Nijolė Savickienė
Konsultantas:
prof. habil. dr. Arūnas Savickas
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ ISLANDINĖS KERPENOS
(CETRARIA ISLANDICA (L.) ACH.) GNIUŽULŲ, KOKYBINIS IR
KIEKYBINIS NUSTATYMAS, KIETŲJŲ KAPSULIŲ GAMYBA IR
BALTYMŲ ATSIPALAIDAVIMO IŠ KAPSULIŲ TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas:
prof. habil. dr. Arūnas Savickas Data
Recenzentas
Darbo vadovas
prof. dr. Nijolė Savickienė Data Darbą atliko Magistrantė Jovita Juodsnukytė Data Data
KAUNAS, 2015
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų cheminė sudėtis ... 12
1.2. Islandinės kerpenos vaistinės žaliavos - gniužulų, farmakologinis poveikis ir pritaikymo galimybės medicinoje ... 12
1.2.1. Priešvėžinis poveikis ... 12
1.3.1. Gelchromatografija ... 14
1.4. Baltymų kokybinis nustatymas ... 15
1.4.2. Masių spektrometrija ... 16
1.5. Baltymų kiekybinis nustatymas ... 17
1.5.1. Lowry kiekybinio baltymų nustatymo metodas ... 18
1.5.3. Baltymų kiekybinis nustatymas Bradford metodu ... 18
1.6. Baltymų technologinis funkcionalizavimas ... 19
1.6.1 Kietųjų kapsulių gamyba ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1. Tyrimo medžiagos ... 22
2.2. Reagentai... 22
2.2.1. Reagentų paruošimas ... 23
2.2.1.1. Baltymų elektroforezei naudotų tirpalų ruošimas: ... 23
2.2.1.3. Fosfatinio buferinio tirpalo gamyba ... 24
2.3. Įranga ... 24
2.4.1. Baltymų frakcionavimas gelchromatografijos metodu ... 25
2.4.2. Kiekybinis baltymų nustatymas Bradford metodu ... 25
2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė ... 26
2.4.4. Kietųjų kapsulių su baltymais gamyba ... 27
2.4.5. Birumo greitis ir subėrimo kampas ... 28
2.4.6. Kapsulių masės vienodumo testas ... 29
2.4.7. Kietųjų kapsulių tirpimo testas ... 29
2.4.8. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas... 30
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
3.1. Baltymų frakcionavimas ... 31
3.2. Baltymų kiekybinis nustatymas ... 32
3.3. Baltymų molekulinės masės nustatymas, taikant NaDS – PAGE elektroforezę ... 33
3.4. Kietųjų kapsulių gamyba ... 34
3.5. Kapsulių masės vienodumo testas ... 34
3.6. Birumo nustatymas ... 35
3.7. Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimas ... 35
4. IŠVADOS ... 37
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
SANTRAUKA
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ ISLANDINĖS KERPENOS (CETRARIA
ISLANDICA (L.) ACH.) GNIUŽULŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS
NUSTATYMAS, KIETŲJŲ KAPSULIŲ GAMYBA IR BALTYMŲ
ATSIPALAIDAVIMO IŠ KAPSULIŲ TYRIMAS
Jovitos Juodsnukytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. Nijolė Savickienė1
Konsultantas: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2
1Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas. 2Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir sociainės
farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: Nustatyti baltymų, išskirtų iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų,
kokybinę ir kiekybinę sudėtį, pagaminti kietąsias kapsules ir atlikti baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimą.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirstyti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymus į frakcijas. 2. Nustatyti baltymų kiekį ir molekulinę masę.
3. Pagaminti kietąsias kapsules su Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų baltymais. 4. Ištirti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
Metodika:
1. Gelchromatografijos metodo pagalba Cetraria islandica (L.) Ach. baltymai išskirti į frakcijas pagal jų molekulių dydį.
2. Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio (NaDS – PAGE) elektroforezės metodu nustatyta frakcijose esančių baltymų molekulinė masė.
3. Cetraria islandica (L.) Ach. baltymai kiekybiškai nustatyti, taikant Bradford metodą. 4. Baltymų atsipalaidavimas iš kietųjų kapsulių tirtas krepšelio metodu.
Rezultatai:
1. Gelchromatografijos metu Cetraria islandica (L.) Ach. baltymai išskirstyti į 69 frakcijas. 2. NaDS – PAGE elektroforezės metu nustatyta baltymų molekulinė masė - 40, 55 ir 130 kDa.
3. Atlikus Bradford kiekybinį baltymų frakcijų tyrimą, nustatyta, kad Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų koncentracija frakcijose yra nuo 2.263± 0.07 µg/ml iki 6.722± 0.09 µg/ml.
4. Didžiausias baltymų kiekis atsipalaidavoiš kietųjų kapsulių po 60 min.
Išvados:
1. Gelchromatografijos metodas nebuvo pakankamai selektyvus baltymų atskyrimui - baltymai atsiskyrė tik dalinai.
2. Frakcijose nustatyta didžiausia baltymų koncentracija - 6.722± 0.09 µg/ml. Šiose frakcijose nustatyta 40, 50 ir 130 kDa baltymų molekulinė masė.
3. Naudojant Prosolv® ir aerosilo pagalbines medžiagas, pagamintos kietosios kapsulės, turinčios po 3.68 µg baltymų. Miltelių birumo ir kapsulių vienodumo testo rezultatai atitiko Europos farmakopėjoje keliamus reikalavimus.
4. Nustatyta, kad baltymai iš Cetraria islandica (L.) Ach. kapsulių atsipalaiduoja dalinai – iki 63±0.58 proc.
SUMMARY
PROTEINS, SEPARATED FROM CETRARIA ISLANDICA (L.)
ACH. THALLUS, QUALITATIVE AND QUANTITATIVE
ANALYSIS, CAPSULATION AND DETERMINATION OF
PROTEIN RELEASE FROM HARD CAPSULES
Jovita Juodsnukytė master thesis/ Supervisor of the research paper: prof. dr. Nijolė Savickienė1
Consultant: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2
1Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas,
Lithuania;
2 Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of
Health Sciences, Kaunas, Lithuania;
Objective of work: to perform qualitative and quantitative analysis of proteins from Cetraria islandica
(L.) Ach thallus, to accomplish capsulation and to value the release of proteins from hard capsules.
Main tasks:
1. To separate proteins into fractions.
2. To estimate the quantity and molecular mass of proteins.
3. To prepare hard capsules enriched with Cetraria islandica (L.) Ach. protein fractions. 4. To evaluate release of proteins from hard capsules.
Methods:
1. Size Exclusion Chromatography was used for the protein separation into fractions. 2. The molecular mass of proteins was estimated by using SDS – PAGE electrophoresis. 3. The quantity of protein was measured by Bradford method.
4. Proteins release from hard capsules was measured with bascet apparatus.
1. Proteins of Cetraria islandica (L.) Ach. thallus were separated into 69 fractions duringSize Exclusion Chromatography.
2. SDS-PAG electrophoresis shows results, that molecular mass of proteins is respectively 44, 55 and 130 kDa.
3. The amount of proteins fractions was determined using Bradford assay. It was estimated, concentration: 2.263± 0.07 µg/mL - 6.722± 0.09 µg/mL.
4. The maximum amount of proteins was released after 60 min.
Conclusions:
1. Method of gelfiltration was not selective enough - proteins were separated partly.
2. The highest protein concentration - 6.722 ± 0.09 µg/ml. In these fractions molecular mass of protein was 40, 50 and 130 kDa.
3. Capsules enriched of proteins were prepared using Prosolv® and aerosil excipients, with 3.68 µg of proteins. Powder flow and uniformity of capsules matched requirements of European Pharmacopea. 4. Determined, that proteins from Cetraria islandica (L.) Ach capsules realesed 63±0.58 proc.
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistrinio baigiamojo darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei bei magistrinio baigiamojo darbo konsultantui prof. habil. dr. Arūnui Savickui už visapusišką pagalbą, bendradarbiavimą ir konsultacijas magistrinio darbo metu.
Taip pat norėčiau padėkoti Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto darbuotojams, ypač Gitanai Mickienei ir Editai Mištinienei už naudingas konsultacijas bei pagalbą magistrinio baigiamojo darbo metu.
SANTRUMPOS
Akrilamido-BIS - N,N′-Metilen – bis – akrilamidas; APS – amonio persulfatas;BCR – Bicinchoninė rūgštis; Eur. Ph. - Europos Farmakopėja; IL-10 – interleukinas-10;
IL-12 – interleukinas-12; MS - Masių spektroskopija; NaDS – natrio dodecilsulfatas;
NaDS-PAGE - natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė; PBS – fosfatinio buferio tirpalas;
TEMED – N,N,N',N'-Tetrametiletan-1,2-diaminas (angl.
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine);
TRIS - Tris(hidroksimetil)aminometanas (angl. Tris (hydroxymethyl)aminomethane); TRIS-HCl - Tris(hidroksimetil)aminometano ir druskos rūgšties buferis.
ĮVADAS
Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) preparatai, pasižymintys antibakteriniu, apetitą gerinančiu poveikiu dažniausiai vartojami arbatų ar pastilių forma. Mokslinėje literatūroje aprašomi Cetraria islandica (L.) Ach, antriniai metabolitai – polisacharidai-gliukanai, tokie kaip lichenanas ar izolichenanas, tiriamas jų poveikis bei pritaikymo galimybės. Nedaug dėmesio skiriama pirminiams metabolitams, ypač baltymams, kurie gali būti naudojami profilaktikos ar gydymo tikslais.
Siekiant tiksliai nustatyti baltymų, išskirtų iš Cetraria islandica (L.) Ach. biologinį aktyvumą bei atlikti in vivo tyrimus, būtina pagaminti farmacinę formą, praturtintą baltymais. Tyrimo metu pasirinkta farmacinė forma – kietosios kapsulės, dėl paprasto gamybos būdo. Kietosios kapsulės yra puiki talpykla įvairioms vaistinėms medžiagoms. Šią vaisto formą patogu vartoti.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: Mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie Cetraria
islandica (L.) Ach esančius baltymus. Dažniausiai Cetraria islandica (L.) Ach tyrimo objektu yra gniužuluose esantys polisacharidai - lichenanas ir izolichenanas, bei antriniai Cetraria islandica (L.) Ach metabolitai - protolichesterininė bei fumarprotocetrarinė rūgštys [1], mikrobiologinių tyrimų metu nustatytas fenolinių junginių bei flavonoidų aktyvumas [2]. Todėl buvo aktualu nustatyti Cetraria islandica (L.) Ach baltymų kokybinę – kiekybinę sudėtį, kapsuliuoti bei ištirti baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
Tyrimo rezultatai žodiniu pranešimu pristatyti 2014 metais vykusioje Studentų Mokslininkų Draugijos organizuojamoje Jaunųjų Mokslininkų ir Tyrėjų Konferencijoje, tema „Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, išskirtų iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo tyrimas“. Taip pat, 2014 metais vykusioje tarptautinėje konferencijoje “The 5th International Conference on Pharmaceutical Sciences and
Pharmacy Practice“ buvo pristatytas stendinis pranešimas „Fractionation and determination of proteins isolated from Cetraria islandica (L.) Ach. thallus”. Paruošta publikacija žurnalui Acta Pharmaceutica tema „Fractionation and determination of proteins in Echinacea purpurea (L.) Moench roots“ (Gabriele Balčiūnaitė, Jovita Juodsnukytė, Arūnas Savickas, Ona Ragažinskienė, Luka Šiatkutė, Gitana Žvirblytė, Edita Mištinienė, Nijolė Savickienė).
Magistrinio darbo tyrimas yra dalis bendro Lietuvos – Baltarusijos projekto „Naujų augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius imunomoduliatorius ir citostatikus“ (Nr. TAP-LB-12-006), atlikto bendradarbiaujant su Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institutu.
Eksperimentas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmakognozijos katedroje, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje bei Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto eukariotų genų inžinerijos laboratorijoje 2013 - 2014m.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: baltymų frakcijos, išskirtos iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.)
Ach.) gniužulų, buvo paruoštos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institute.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: Mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie Cetraria
islandica (L.) Ach esančius baltymus. Dažniausiai Cetraria islandica (L.) Ach tyrimo objektu yra gniužuluose esantys polisacharidai - lichenanas ir izolichenanas, bei antriniai Cetraria islandica (L.) Ach metabolitai - protolichesterininė bei fumarprotocetrarinė rūgštys [1], mikrobiologinių tyrimų metu nustatytas fenolinių junginių bei flavonoidų aktyvumas. [2] Todėl buvo aktualu nustatyti Cetraria islandica (L.) Ach baltymų kokybinę – kiekybinę sudėtį, kapsuliuoti bei ištirti baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
Tikslas: Nustatyti baltymų, išskirtų iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.)
gniužulų, kokybinę ir kiekybinę sudėtį, pagaminti kietąsias kapsules ir atlikti baltymų atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių tyrimą.
Uždaviniai: 1. Išskirstyti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymus į frakcijas.
2. Nustatyti baltymų kiekį ir molekulinę masę.
3. Pagaminti kietąsias kapsules su Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų baltymais. 4. Ištirti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų cheminė
sudėtis
Islandinė kerpena (Cetraria islandica (L.) Ach.) priskiriama gniužuliniams (žemesniesiems) augalams, kerpių skyriui, Ascolichenes klasei ir kežinių šeimai [3]. Kerpės sudarytos iš dviejų junginių grupių: pirminių metabolitų, esančių ląstelių viduje ir antrinių metabolitų, esančių tarpląstelinėje erdvėje. Dažniausiai pasitaikantys pirminiai metabolitai yra baltymai, riebalai, angliavandeniai, amino rūgštys, karotenoidai, polisacharidai ir vitaminai. Šie junginiai yra sintetinami kerpėje, dalyvauja metaboliniuose procesuose ir yra kerpių gniužulo struktūros pagrindas. Antrinius metabolitus sintetina kerpės grybinė dalis, ir šie metabolitai yra individualūs kiekvienai rūšiai. Šiuo metu yra žinoma apie 350 antrinių kerpių metabolitų. Jie sudaro 0.1 – 10 proc. gniužulo sausos žaliavos [4, 5].
Cetraria islandica (L.) Ach gniužulo cheminėje sudėtyje daugiausia yra polisacharidų. Jie sudaro 20 – 25 proc. Pagrindiniai polisacharidai yra lichenanas, izolichenanas ir α-D-gliukanas. Taip pat islandinėje kerpenoje aptinkama natūralių cukrų, tokių kaip galaktozė, manozė ir ramnozė, rūgščių: fumaroprotocetrarinės rūgšties (2.6-11.5 proc.), protocetrarinės rūgšties (0.2-0.3 proc.), pėdsakai usninės rūgšties (0.04 proc.). Taip pat randama nedideli kiekiai mineralų, fosfolipidų, sterolių [6].
1.2. Islandinės kerpenos vaistinės žaliavos - gniužulų, farmakologinis poveikis ir
pritaikymo galimybės medicinoje
Islandinės kerpenos vaistinė augalinė žaliava – gniužulai, dažniausiai vartojama simptominiam gerklės skausmui ir dirginimui, taip pat sausam kosuliui mažinti bei esant apetito sutrikimams [7].
Analizuojant mokslinius literatūros šaltinius, randama in vivo ir in vitro tyrimų, kurių metu
nustatyta, kad islandinėje kerpenoje esančios medžiagos pasižymi antioksidaciniu, imunomoduliuojančiu, priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešvirusiniu, priešvėžiniu veikimu [6, 8].
1.2.1. Priešvėžinis poveikis
2014 metais atlikto tyrimo metu nustatytas islandinių kerpenų gniužulų priešvėžinis aktyvumas [1]. Tyrimui pasirinktas metanolinis gniužulų ekstraktas, tirtos žmogaus melanomos (FemX) ir žmogaus
tiesiosios žarnos karcinomos (LS174) ląstelės. Islandinių kerpenų gniužulų metanolinis ekstraktas pasižymėjo priešvėžiniu veikimu abiejose ląstelių grupėse. FemX ląstelių grupei IC50 buvo 22,68±2,03
µg/ml ir LS174 ląstelių grupei IC50 - 33,74±0,36 µg/ml. IC50 – ekstrakto kiekis, reikalingas 50 proc.
vėžinių ląstelių aktyvumo nuslopinimui. Kontrolei buvo naudojama cisplatina. Islandinių kerpenų gniužulų metanolinis ekstraktas pasižymėjo silpnesniu poveikiu nei cisplatina [1,9].
1.2.2. Imunomoduliacinis aktyvumas
Nustatyta, kad vandeninis islandinių kerpenų antrinių metabolitų ekstraktas pasižymi imunomoduliaciniu veikimu. 2008 metais atlikto tyrimo metu nustatytas islandinių kerpenų gniužulų ekstrakto poveikis žmogaus dendritinėms ląstelėms, matuojant IL-10 ir IL-12p40 išsiskyrimą. Tyrimo metu nustatyta, kad islandinių kerpenų gniužulų ekstraktas turi imunomoduliacinį poveikį, kadangi padidėja IL-10 ir IL-12p40 koncentracija. Nustatyta, kad lichenanas yra pagrindinis islandinių kerpenų junginys, nulemiantis augalo imunomoduliacinį poveikį [2].
1.2.3. Antioksidantininis aktyvumas
Mokslinėje literatūroje randama duomenų apie antioksidantinį islandinių kerpenų gniužulų poveikį [10–12]. Nustatyta, kad šį poveikį lemia islandinės kerpenos cheminėje sudėtyje esantys fenoliniai junginiai. 2005 metais atlikto tyrimo metu [12] palyginti 21 medicinoje vartojami augalai, tarp kurių islandinė kerpena pasižymėjo silpnu antioksidantiniu aktyvumu.
1.2.4. Antibakterinis poveikis
Atliktuose tyrimuose nustatyta, kad Parmeliaceae šeimos augaluose esančios medžiagos pasižymi antibakteriniu poveikiu [1,5,13,14]. 2014 metais publikuotame darbe teigiama, kad islandinių kerpenų gniužulų metanolinis ekstraktas pasižymi silpnu antibakteriniu ir priešgrybeliniu aktyvumu. Tyrimo metu islandinių kerpenų gniužulų metanolinis ekstraktas buvo palygintas su antibiotiku - streptomicinu ir priešgrybeliniu vaistu - ketokonazoliu. Eksperimento metu, palyginus gautus rezultatus su kontrole, nustatyta, kad Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų metanolinis ekstraktas pasižymi silpnu antibakteriniu poveikiu [1].
1.3. Baltymų išskirstymas
Siekiant kuo tiksliau atlikti augaluose esančių baltymų analizę, tikslinga atlikti junginių skirstymą. Augaluose esančių baltymų išskirstymui dažniausiai naudojami įvairūs chromatografijos metodai, tokie kaip jonų mainų chromatografija ar gelchromatografija. Jonų mainų chromatografijoje baltymų frakcionavimas pagrįstas jonine sąveika tarp baltymų ir nejudriosios fazės jonų. Gelchromatografija yra paprastesnis metodas, jis paremtas junginių skirstymu remiantis jų dalelių dydžiu. Gelchromatografija yra dažnai pasirenkams metodas, norint išskirti baltymus iš biologinių junginių [15].
1.3.1. Gelchromatografija
Gelchromatografija - medžiagų atskyrimo metodas, pagrįstas tiriamojo objekto molekulių dydžiu. Gelchromatografijos metu molekulės, tekėdamos per kolonėlėje esantį gelį, atskiriamos pagal dydžio skirtumus. Kitaip nei kitose chromatografijos rūšyse, molekulės nesijungia su nejudančia faze, kuria užpildyta kolonėlė.
Gelchromatografija yra plačiai pritaikoma molekulių, kurios yra jautrios pH, temperatūros pokyčiams, atskyrimui. Gelchromatografija gali būti atliekama įvairiomis sąlygomis, įvairiu temperatūriniu režimu [16].
Gelchromatografijos metu naudojama kolonėlė yra užpildoma porėtu geliu. Šis gelis turi būti stabilus ir nereaguoti su medžiagomis, kurias norima atskirti. Prieš pradedant gelchromatografiją, į geliu užpildytą kolonėlę įleidžiama buferio, kuris naudojamas kaip mobilioji fazė baltymams ar kitoms tiriamoms medžiagoms pernešti. Buferio įleidžiama tam, kad jis užpildytų gelio poras bei pašalintų galimai esančius oro tarpus.
Gelchromatografija paremta principu, jog medžiagos iš kolonėles išteka dalelių dydžių mažėjimo tvarka, t.y. iš kolonėlės pirmieji išteka stambiausi junginiai, kadangi jie neprasiskverbia į gelio poras. Po didesnių junginių iš kolonėlės išteka smulkesni junginiai. Visas procesas trunka tol, kol buferis prateka pro kolonėlę [16]. Iš kolonėlės ištekėjusius junginius fiksuoja UV detektoriai, grafike stebimi iš kolonėlės ištekėjusių medžiagų pikai pavaizduoti 1 paveikslėlyje.
1 Pav. Gelchromatorgafijos medžiagų atskyrimo tvarka
1.4. Baltymų kokybinis nustatymas
Siekiant identifikuoti baltymus, esančius junginyje, naudojama kokybinė analizė. Dažnai baltymų nustatymui naudojami NaDS – PAGE ir masių spektrometrijos metodai. Šie metodai yra jautrūs, greitai atliekami, pasižymi dideliu specifiškumu, jiems nereikia didelių tiriamųjų medžiagų kiekių. Taip pat, šių metodų pagalba, tuo pačiu metu galima atlikti keleto baltymų kokybinį nustatymą. Na-DS – PAGE metodas paremtas junginių atskyrimu pagal jų molekulinę masę [17]. Masių spektrometrijos metodas paremtas medžiagų jonizacija bei jonizuotų medžiagų skirstymu [18].
1.4.1. Natrio dodecilsulfato poliakrilamidinio gelio elektroforezė (NaDS-PAGE)
NaDS PAGE elektroforezė - metodas, kuris taikomas, norint apytiksliai įvertinti baltymų molekulinę masę, santykinį baltymų kiekį, esantį tiriamajame mėginyje [19]. Šis tyrimas taip pat naudojamas augalinės kilmės baltymų nustatymui. NaDS – PAGE tyrimas paremtas junginių atskyrimu pagal jų molekulinę masę [20]. Elektroforezės sistema susideda iš dviejų gelių, kuriais teka elektros srovė. Pirmasis gelis yra koncentruojantis, kuriame baltymai yra sukoncentruojami prieš jiems patenkant į antrąjį gelį. Antrasis gelis yra frakcionuojantis, jame baltymai pasiskirsto pagal jų molekulinę masę [17].
Dėl baltymuose esančių disulfidinių jungčių hidrofilinės ir hidrofobinės sąveikos, baltymai yra sferiniai, antrinės ar tretinės struktūros. Norint tiksliai nustatyti baltymų molekulinę masę, šias susiformavusias baltymo struktūras reikia išardyti. Tam naudojami detergentai. Elektroforezėje naudojamas natrio dodecilsulfatas (NaDS). Jis veikia baltymo hidrofilinę ir hidrofobinę struktūrą. NaDS taip pat padengia kiekvieną baltymo molekulę ir suteikia baltymui neigiamą krūvį, kurio pagalba baltymai elektroforezės metu gali judėti link teigiamo elektros krūvio. NaDS – PAGE elektroforezės metodo schema pateikta 2 paveikslėlyje [17,21].
2 Pav. NaDS – PAGE metodo schema.
(http://www.chem.fsu.edu/chemlab/bch4053l/character/mwdetermination/background.html)
1.4.2. Masių spektrometrija
Masių spektrometrija – plačiai naudojamas analitinis metodas junginių charakterizavimui bei kiekybiniam nustatymui. Metodo pagalba galima tirti mažos molekulinės masės junginius, baltymus bei vaistų metabolitus [22]. Masių spektrometrijos metodas yra paremtas medžiagų jonizacija bei jonizuotų medžiagų skirstymu. Molekulių jonai identifikuojami pagal masės bei krūvio santykį. Šio metodo pagalba galima sužinoti molekulinę junginio masę [23]. Masių spektrometrijos privalumai yra: reikalingas nedidelis mėginio kiekis, greitas medžiagų diferencijavimas, gali būti suderintas su kitais metodais.
Nepaisant privalumų, šis metodas turi ir trūkumų: tiesiogiai nesuteikia junginio struktūrinės informacijos, norint atlikti tyrimą, tiriamieji junginiai turi būti gryni [18].
Norint nustatyti ir charakterizuoti junginių molekulinę sudėtį, masių spektrometrija junginius paverčia jonais – jonizuoja. Tuomet jonizuoti junginiai gali judėti elektriniame ir magnetiniame laukuose. Yra trys svarbiausios masių spektrometrijos funkcijos ir komponentai: jonizacijos šaltinis, masių analizatorius ir detektorius.
Jonizacijos šaltinyje, jonai patenka į vakuuminę zoną, kur tiriamojo junginio jonai yra sumaišomi su judriosios fazės dujomis. Elektronų veikiamos judrios fazės molekulės protonizuojamos arba deprotonizuojamos, įgavę krūvį judrios fazės molekulės deprotonizuoja arba protonizuoja tiriamojo junginio – analitės molekules. Analitės, priešingo krūvio elektrodo, yra nukreipiamos į masių analizatorių [18].
Masių analizatorių yra keletas rūšių: kvadrupolinis masių analizatorius, kvadrupolinė jonų gaudyklė, lėkio trukmės masių analizatorius, jonų ciklotroninio rezonanso analizatorius. Masių analizatoriuje jonai yra suklasifikuojami ir atskiriami pagal jų krūvį ir masę. Vienas plačiausiai naudojamų analizatorių yra kvadrupolinis masių analizatorius. Jis sudarytas iš keturių, vienas prieš kitą išsidėsčiusių strypų. Šie strypai yra prijungti prie kintamosios bei nuolatinės įtampos generatoriaus. Sudaromas aukšto dažnio kintamas elektros laukas. Jonai iš jonizacijos šaltinio, patekę į kvadrupolinį masių analizatoriaus elektros lauką, jame pradeda virpėti plokštumoje, statmenoje jo judėjimo krypčiai. Elektrinio lauko stipriui sutapus su jono energija, kuri priklauso nuo jono masės ir krūvio santykio. Jonas praskrenda tarp strypų, į juos neatsitrenkdamas ir yra užregistruojamas. Priešingu atveju, jonui atsitrenkus, jis nėra registruojamas. Taigi keičiant elektrinio lauko stiprį, yra atliekamas jonų masės ir krūvio skenavimas. Iš masių analizatoriaus jonai patenka į detektorių, kur atskirti jonai yra identifikuojami ir atitinkamai pavaizduojami lentelėse. Masių spektrometrija yra plačiai taikoma augalinių baltymų identifikavimui [18,24].
1.5. Baltymų kiekybinis nustatymas
Augale esančių baltymų koncentracijai nustatyti dažniausiai naudojami spektrofotometriniai metodai, paremti UV ir regimosios šviesos absorbcija. Nustatymas pagrįstas tiriamųjų baltymų koncentracijos lyginimu su žinomos koncentracijos baltymais. Dažniausiai naudojami tradiciniai baltymų nustatymo metodai – Lowry, BCR, ir Bradfordo [25].
1.5.1. Lowry kiekybinio baltymų nustatymo metodas
Lowry baltymų kiekybinis nustatymas paremtas Cu2+ virtimo į Cu+ reakcija. Iš pradžių vyksta baltyme esančių peptidinių jungčių reakcija su Cu2+ jonais, vėliau Cu 2+ virsta Cu+ jonais, kurie reaguoja
su Folin-Ciocalteau reagentu. Reakcijos metu susidaro mėlynas junginys. Junginio spalvos intensyvumas tiesiogiai priklauso nuo amino rūgščių (tirozino, triptofano) kiekio tiriamajame junginyje. Šiuo metodu baltymų koncentracija nustatoma 1-1000 µg/ml ribose [25–27]. Lowry metodo reakcija yra jautri įvairioms medžiagoms, šis metodas išsiskiria tuo, kad tyrimas gali būti atliekamas esant stipriai šarminei aplinkai - pH 10.0-10.5 [28].
1.5.2. Bicinchoninės rūgšties kiekybinio baltymų nustatymo metodas
Kiekybinis baltymų nustatymas bicinchoninės rūgšties (BCR) metodu paremtas Cu2+ virtimo į Cu+ reakcija. Šis baltymų kiekio nustatymas remiasi tuo pačiu principu kaip ir LOWRY baltymų kiekio nustatymas. Cu2+ reaguoja su peptidinėmis baltymų jungtimis, virsta Cu+. Cu+ reaguoja su BCR reagentu, reakcijos produktas - ryškiai rožinės spalvos junginys. Spalvos intensyvumas priklauso nuo baltymų kiekio esančio junginyje. Reakcijos produkto absorbcija matuojama spektrometru ir nustatoma koncentracija, pasitelkiant jau žinomų, standartinių koncentracijų baltymų tirpalus, baltymų koncentracija nustatoma 20-2000 µg/ml ribose [25,29].
BCR kiekybinio baltymų nustatymo metodas yra pranašesnis už Lowry metodą, kadangi šiame metode naudojamų medžiagų neveikia platus spektras detergentų bei denatūruojančių medžiagų, (NaDS, šlapalas, kai kurios amino rūgštys, riebalai) kurios veikia Lowry metodą [29]. Taip pat BCR metodo reakcija yra stabili esant vidutiniškai šarminam pH. Lowry metodas yra stabilus esant pH 10.0-10.5. Lyginant su Lowry metodu, BCR metodas yra jautresnis, bet atliekant tyrimus su redukuojančiomis medžiagomis reikėtų rinktis Lowry metodą [28].
1.5.3. Baltymų kiekybinis nustatymas Bradford metodu
Bradfordo kiekybinis tyrimas yra tikslus ir greitai atliekamas metodas. Literatūros duomenimis, Bradford metodą rekomenduojama naudoti bendram baltymų kiekio nustatymui, ypač įvertinant baltymų kiekį, prieš taikant NaDS PAGE elektroforezę [30]. Augalų baltymų kiekybiniam nustatymui vienas iš dažniausiai naudojamų metodų ir yra Bradford kiekybinio baltymų nustatymo metodas [16,31,32].
Bradford kiekybinis nustatymas paremtas Coomassie G-250 dažo jungimosi su baltymais reakcija. Coomassie dažas egzistuoja keturiose skirtingose joninėse formose. Anijoninė mėlyna dažo forma jungiasi su baltymais. Reakcijos metu susidaro dažo - baltymo kompleksas. Baltymų koncentracija gali būti nustatoma, matuojant tirpalo absorbciją spektrofotometru, esant 595 nm bangos ilgiui (3 pav.). Coomassie G-250 dažas dažniausiai jungiasi prie arginino, triptofano, tirosino, histidino ir fenilalanino grupių [33]. Šis metodas yra lengvai atliekamas. Bradford metodu baltymų nustatymo ribos yra 2-2000 µg/ml [27]. Didžiausias Bradfordo metodo privalumas, lyginant jį su kitais metodais yra jautrumas ir reakcijos greitis. Šią reakciją galima atlikti per labai trumpą laiką, tai puikiai tinka greitam baltymų kiekio nustatymui. Bradfordo metodas, lyginant jį su Lowry metodu taip pat pasižymi maži jautrumu įvairiems detergentams [28].
3 Pav. Bradford kiekybinio nustatymo metodo schema [33].
1.6. Baltymų technologinis funkcionalizavimas
Baltymams gali būti suteiktos perenteralinės (injekcijos) ir neperenteralinės (geriamosios, inhaliacinės, transdermalinės) farmacinės formos. Atliekant ikiklinikinius tyrimus, tiriant baltymų atsipalaidavimą, dažnai pasirenkama farmacinė forma – kapsulės. Kapsulės yra kieta vaisto forma, dažniausiai skiriama vartoti per os. Kapsulės gali turėti kietą arba minkštą apvalkalą, gali būti įvairaus dydžio ar formos. Kietosios kapsulės, lyginant jas su kitomis farmacinėmis formomis, turi daug privalumų. Jos yra unikalios formos, lengvo vartojimo. Taip pat kapsulės turi geresnį biopraeinamumą nei tabletės. Dėl greitai suyrančio kietųjų kapsulių želatininio apvalkalo, veikliosios medžiagos atsipalaiduoja per trumpą laiką. Kietųjų kapsulių nesudėtinga gamyba, atliekama mažiau kokybę užtikrinančių testų, gamybai naudojama nedaug įrangos [34].
Nepaisant privalumų, kapsulės turi ir trūkumų. Lyginant kapsulių ir tablečių gamybą pramoniniu būdu, per tokį patį laiko tarpą, kapsuliavimo mašinos pagamina mažiau kapsulių, nei tabletavimo mašinos – tablečių. Kapsulės negali būti užpildytos koncentruotais preparatais, druskomis (bromidais, jodidais), kadangi jiems atsipalaidavus iš kapsulių, dėl lokalaus poveikio, gali kilti virškinimo trakto
dirginimas. Kietosios kapsulės negali būti užpildytos higroskopinėmis medžiagomis, kadangi jos sugeria vandenį esantį kapsulėje. Netekę vandens kapsulės tampa trapiomis [34].
1.6.1 Kietųjų kapsulių gamyba
Kapsulių apvalkalas gaminamas iš želatinos arba kitų medžiagų. Apvalkalo konsistencija gali būti keičiama pridedant įvairių medžiagų, tokių kaip glicerolis ar sorbitolis. Kietųjų kapsulių želatininio apvalkalo gamybai gali būti naudojami dažikliai, pigmentai, paviršiui aktyvios medžiagos. Gaminant kietųjų kapsulių apvalkalus, nerūdijančio plieno rezervuaruose, 60-70 °C temperatūros demineralizuotame vandenyje, ištirpinama želatina. Gaunamas klampus, turintis oro burbuliukų, 30-40 proc. želatinos tirpalas. Norint pašalinti oro burbuliukus, jie gali būti nusiurbti vakuumo pagalba. Karštame tirpale želatina hidrolizuojasi, taigi norint išsaugoti visas jos savybes, būtina optimizuoti gamybos metodą. Į želatinos tirpalą pridedama dažiklių, konservantų, pamatuojamas tirpalo klampumas viskozimetru. Jei reikia, klampa reguliuojama pridedant 60-70 °C vandens. Kapsulių apvalkalas gaminamas, panardinant į želatinos tirpalą, specialias nerūdijančio plieno formas. Tam, kad želatina tolygiai pasiskirstytų, formos sukamos aplink horizontalią ašį. Besisukančios formos yra džiovinamos šaltu oru, siekiant tolygios apvalkalo formos bei greitesnio džiovimo proceso. Sekančio etapo metu formos džiovinamos karšto oro srove krosnyse. Apvalkalams galutiniai išdžiuvus, jie nuimami nuo formų [35].
Be apvalkalui reikalingų medžiagų, į kapsules taip pat dedamos įvairios pagalbinės medžiagos. Daugeliu atveju kapsulės yra užpildytos vienkartine vaisto doze [36]. Kapsulių užpildą dažniausiai sudaro kietos konsistencijos medžiagos milteliai arba granulės [34].
Pildant kapsules milteliais arba granulėmis svarbu įvertinti fizikinės dalelių savybes. Siekiant užtikrinti turinio homogeniškumą, visos medžiagos dedamos į kapsulę, turi būti panašaus dalelių dydžio ir formos. Siekiant kokybiškai užpildyti kapsules svarbus kriterijus yra miltelių dalelių dydis. Optimalu, jei miltelių dalelių dydis yra tarp 50-150 µm. Taip pat labai svarbus kriterijus yra dalelių forma. Kapsuliuojant miltelius, kurių dalelių forma yra šiurkšti, kampuota, gali būti pridedama panašaus dydžio, apvalių pagalbinių medžiagų. Labai svarbu prieš kapsuliavimą sumažinti miltelių lipnumą. Lipnūs milteliai kimba prie metalinių konstrukcijų, lėtina kapsuliavimo procesą bei gali pažeisti kapsuliavimo mašiną. Lipnumo galima išvengti kartu nemaišant drėgmę sugeriančių medžiagų, su medžiagomis turinčiomis daug vandens [35].
Taip pat kapsulės gali būti užpildytos skystomis, kietomis ar pastos konsistencijos medžiagomis. Kapsulių užpildo sudėtyje gali būti viena ar kelios veikliosios bei pagalbinės medžiagos [36].
Kietosios kapsulės gaminamos įvairių dydžių. Dydžių skirtumas priklauso nuo kapsulės talpos, diametro, ilgio. Žmonėms gaminamų kapsulių dydžiai skirstomi nuo 000 (didžiausias) iki 5 (mažiausias) [37,38]. Kietąsias kapsules galima užpildyti nuo 0,13 ml iki 1,37 ml. [34]. Jei pasirinktas veikliosios medžiagos kiekis yra per mažas užpildyti visai kapsulei, tuomet būtina pridėti pagalbinių medžiagų, dažniausiai kaip užpildą gamintojai renkasi laktozę ir monokristalinę celiuliozę [35,39].
Kapsulių gamyba gali būti labai įvairi. Pramoniniu metu kapsulių gamybos ir kapsuliavimo procesas yra pilnai automatizuotas, pagaminamas didelis kiekis kapsulių. Kapsuliuojant kietąsias kapsules mašinėle, procesas nėra automatinis, vienu metu pagaminama iki 50 kapsulių. Klasikinė kapsuliavimo mašinėlė susideda iš plokštelių, turinčių vienodo diametro angas. Angos atitinka tam tikro dydžio kapsulių dugno ir dangtelio diametrus. Kiekviena kapsuliavimo mašinėlė tinka tik vieno dydžio kapsulėms kapsuliuoti. Norint kapsuliuoti kito dydžio kapsules, pakeičiamos mašinėlėje esančios plokštelės. Prieš kapsuliuojant kapsulės yra atidengiamos, kapsulės atskirai išdėliojamos į angas. Ant plokštelės, į kurią įstatyti kapsulių dugnai, užberiamas kapsuliuojamas turinys ir tolygiai, mentelės pagalba, užpildomos kapsulių ertmės. Užpildžius vienodai kapsules, tolygiai sudedamos plokštelės su kapsulių kepurėlėmis ir kapsulių kūnais. Plokštelės tarpusavyje stipriai suspaudžiamos, spaudimo metu kapsulės uždaromos. Atidarius plokšteles kapsulės išimamos. [35,40].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo medžiagos
Baltymų frakcijos, išskirtos iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų, paruoštos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institute.
2.2. Reagentai
„0“ dydžio želatininės kapsulės (Capsuline, JAV);
Mikrokristalinė celiuliozė, Prosolv® SMCC HD90 (JRS Pharma, Vokietija); Bevandenis koloidinis silicio dioksidas (aerosilas), (Degussa AG, Vokietija);
PBS vandeninis tirpalas (1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH = 7.4) (Sigma-Aldrich, JAV);
Jaučio serumo albuminas (BSA) (Sigma-Aldrich®, JAV);
Bradfordo reagentas (sudėtis: 100mg mėlynos spalvos briliantinio mėlynojo dažiklio G-250; 50 ml 95proc. etanolio, 100 ml 85 proc. fosforo rūgšties, skiedžiama vandeniu iki 1 litro tūrio) (Sigma–Aldrich (JAV);
Baltymų standartai (dalelių dydis 10-200 kDa, rinkinys PageRuler™, naudojamas elektroforezei) (Fermentas, Lietuva);
Dinatrio hidrofosfatas (Merck, Darmstadt, Vokietija); Natrio chloridas (Merck, Darmstadt, Vokietija);
Nekoncentruota vandenilio chlorido rūgštis (Sigma-Aldrich, JAV); TRIS (Tris(hidroksimetil)aminometanas), (Sigma-Aldrich, JAV); Natrio dodecilsulfatas (Sigma-Aldrich, JAV);
Amonio persulfato milteliai (APS), (Sigma-Aldrich, JAV);
Akrilamidas/bisakrilamidas - sudarytas iš 30 g akrilamido ir 0.8 g N,N'-metilen-bis-akrilamido (Sigma- Aldrich, JAV);
Tetrametiletilendiaminas (TEMED), 99% (Sigma-Aldrich, JAV);
Tris-Glicino NaDS buferis (25 mM Tris, 192 mM glicinas ir 0.1% NaDS, pH - 8.3). (Sigma-Aldrich, JAV);
LB buferis (Lane Marker Non-reducing Sample Buffer), sudarytas iš 0.3M TRIS-HCl, 5 proc. NaDS, 50 proc. glicerolio ir rožinio dažiklio. (Thermo Scientific, JAV);
Ultra švarus (I vandens kokybės lygio) vanduo (Biotechnologijos institutas, Lietuva);. Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkinys (Fisher Scientific, JAV);
Etanolis (reaktifikuotas spiritas 96.3%)(„Stumbras“, Lietuva). Acto rūgštis 99.8% (Standart, Lenkija)
Natrio hidroksidas (NaOH) (Sigma-Aldrich, JAV)
2.2.1. Reagentų paruošimas
2.2.1.1. Baltymų elektroforezei naudotų tirpalų ruošimas:
1. 1.5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 8.8. 18,15 g TRIS tirpinama 70 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilama 4 M HCl tiek, kad pH būtų 8,8 . Skiedžiama su ultra švariu vandeniu iki 100 ml. Saugoma +4ºC temperatūroje;
2. 0.5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 6.8. 6.0 g TRIS tirpinama 70 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilama 4 M HCl tiek, kad pH būtų 6.8.. Skiedžiama su ultra švariu vandeniu iki 100 ml. Saugoma +4ºC temperatūroje;
3. 10 proc. NaDS tirpalas. 5.0 g NaDS tirpinama nedideliame kiekyje ultra švaraus vandens. Tirpalas praskiedžiamas iki 50 ml, laikomas kambario temperatūroje;
4. 10 proc. APS tirpalas. 100 mg APS ištirpinama 1 ml ultra švaraus vandens ir praskiedžiama iki 100ml.
5. Vienkartinis (1x) elektroforezės buferinis tirpalas. 100 ml TRIS-glicino-NaDS elektroforezės buferinio tirpalo skiedžiama su ultra švariu vandeniu iki 1 litro;
2.2.1.2. NaDS – PAGE gelio paruošimas ir užpildymas
Skiriantysis 15 proc. poliakrilamido gelis sudarytas iš 5 ml 30 proc. akrilamido – BIS, 2.5 ml 1.5 M TRIS, pH 8.8 (žr. 2.2.16), 2.3 ml ultra švaraus vandens, 0.1 ml 10 proc. NaDS (žr.5.2.1.1), 0.1 ml APS (žr.5.2.1.1), 0,01 ml TEMED.
Koncentruojantis 4 proc. poliakrilamido gelis
Koncentruojantis poliakrilamido gelis sudarytas iš 1.3 ml 30 proc. akrilamido-BIS, 2.5 ml 0.5 M TRIS, pH 6.8 (žr. 5.2.1.1), 6.1 ml ultra švaraus vandens, 0.1 ml 10 proc. NaDS (žr. 5.2.1.1), 0.05 ml APS (žr. 5.2.1.1), 0.01 ml TEMED.
Gerai išmaišomos atskirai kiekvieno (skiriančiojo ir koncentruojančiojo) gelių sudedamosios dalys. Pradžioje gelio forma užpildoma skiriančiuoju geliu iki pažymėtos vietos. Tam, kad nepatektų oro, ant supilto gelio į formą užpilama ultra švaraus vandens. Geliu užpildytoje formoje vyksta gelio polimerizacija. Polimerizacija vyksta 20°C temperatūroje, apie 30 min. Sustingęs gelis praplaunamas ultra švariu vandeniu. Ant skiriančiojo gelio, esančio gelio formoje, pilamas paruoštas koncentruojantis gelis. Užpylus gelį, specialiomis gelio takelius formuojančiomis šukomis viršutiniame gelyje suformuojami takeliai. Koncentruojančiam geliui sustingus, specialios šukos ištraukiamos. Paruoštas gelis gali būti naudojamas elektroforezėje.
2.2.1.3. Fosfatinio buferinio tirpalo gamyba
Fosfatinis buferis naudojamas baltymų gryninimui gelchromatografijos metodu. Buferio
gamybai analitinėmis svarstyklėmis atsveriama 17.91 g HNa2O4P·12H2O ir 8.77 g NaCl. Šios medžiagos
tirpinamos 995 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilama 4 M HCl tiek, kad pH būtų 7.0. Skiedžiama su ultra švariu vandeniu iki 1000 ml. Saugoma +4ºC temperatūroje;
2.3. Įranga
Gelfiltracijos chromatografijos kolonėlė: GE Healthcare Superdex 200 10/300 (GE Healthcare life sciences, UK)
Gelchromatografijos sistema: AKTA purifier 100 (GEHealthcare Life Sciences, Švedija);
Baltymų elektroforezės aparatas CS-300V (Cleaver Scientific, UK); Centrifuga 5415R (Eppendorf, JAV);
Termostatas Techne Dri-Block (R) Model DB-2D (Techne, UK); Spektrofotometras Infinite M200 (Tecan, Šveicarija);
Krepšelinis aparatas (Erweka GmbH, Vokietija);
Analitinės svarstyklės CPA225D-0CE (Sartorius, Goettingen, Germany); Vandens gryninimo sistema Synergy Millipore (Merck, Germany). Automatiniai dozatoriai (Ependorf, JAV);
Laikmatis (Thermo Fisher Scientific, JAV); 2 mm sietas (Fisher Scientific, JAV);
Prietaisas miltelių birumui įvertinti Erweka AG (Erweka GmbH, Vokietija); Kapsuliavimo mašinėlė „Capsuline-15“ (Capsuline, JAV);
2.4. Tyrimo metodai
2.4.1. Baltymų frakcionavimas gelchromatografijos metodu
Siekiant išskirstyti Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų baltymus į atskiras frakcijas pagal molekulinę masę, naudota gelchromatografija.
Gelchromatografija atlikta AKTA purifier 100 gryninimo sistema, naudojant Superdex 200 10/300 GL kolonėlę. Kolonėlės sorbentas – agarozė ir dekstranas. Kaip eliuentas naudotas fosfatinis buferis, sudarytas iš 50mM HNa2O4P * 12H2O ir 0,15M NaCl, kurio pH 7.0.
Siekiant, kad kietosios mėginio dalelės neužkimštų kolonėlės, 1.5ml baltymų mėginio, buvo centrifiguota +4oC temperatūroje, 10000 apsisukimų per minutę greičiu, 15 minučių, naudojant centrifugą.
Gelchromatografija atlikta, esant +4 - +16 oC temperatūrai. Siekiant užtikrinti kolonėlės pusiausvyrą, į kolonėlę atsargiai įleidžiama 50ml ultra švaraus vandens, po to - 50ml eliuento – fosfatinio buferio. Tėkmės greitis 0.5ml/min, didžiausia slėgio riba 1.4 MPa.
Prieš leidžiant mėginį, sistemos kilpa užpildoma fosfatiniu buferiu, kad neliktų oro. Švirkšto pagalba suleidžiamas 1ml centrifuguoto mėginio skysčio, kuris yra virš nuosėdų - supernatanto. Mėginio tėkmės greitis – 0.5ml/min. Frakcijos surenkamos į ependorfus po 0.5ml.
Baltymų, išskirtų iš Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų, kiekis nustatytas, naudojant spektrofotometrinį Bradford metodą mikrolėkštelėse. Naudojant standartiniųkoncentracijų - 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 ir 2 mg/ml, jaučio serumo albuminą, sudaryta kalibracinė kreivė pavaizduota 4 paveikslėlyje. Imama 120 µl skirtingos koncentracijos jaučio serumo albumino mėginio ir gerai sumaišoma su 120 µl Bradfordo reagento.
Gauti skirtingų koncentracijų tirpalai, sumaišius jaučio serumo albuminą ir Bradfordo reagentą, laikomi 20 ºC temperatūroje 5 minutes. Praėjus nustatytam laikui, spektrofotometru matuojama mišinių absorbcija, esant 595 nm bangos ilgiui. Baltymų koncentracija skaičiuojama pagal 1 formulę.
𝑋 = 𝑌−0,0105
0,0205 (1 formulė)
Čia: X – koncentracija, µg/ml; Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
4 Pav. Kalibracinė Bradfordo metodo kiekybinio baltymų nustatymo kreivė
2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė
y = 0,0205x + 0,0105 R² = 0,9648 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 5 10 15 20 25 30
A
bs
o
rbci
ja
Standarto koncentracija (µg/ml)
Siekiant nustatyti baltymų frakcijose esančių baltymų molekulinę masę, atlikta vertikalioji NaDS-PAGE elektroforezė.
Prieš vykdant NaDS-PAGE elektroforezę, pagal (2.2.1.2.) pateiktą aprašymą, specialioje formoje paruošiamas gelis, sudarytas iš koncentruojančiojo ir skiriančiojo gelių. Elektroforezė atliekama elektroforezės aparate. Forma su geliu įstatoma į aparatą, iš gelio ištraukiamos specialios šukos. Elektroforezės indas užpildomas TRIS – glicino – NaDS buferiu. Elektroforezės eksperimento pradžioje 32 µl baltymų frakcijos sumaišoma su 8 µl LB buferiu. Gautas mišinys kaitinamas 5 minutes 95ºC termostate. Į kiekvieną takelį įleidžiama 30 µl po kaitinimo gautų mėginių ir 0.5 µl PageRuler Prestained Protein Ladder standarto. Elektroforezės metu palaikoma pastovi 200V ir 25mA elektros srovė. Elektroforezės trukmė 90 min. Gelis dažomas Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkiniu.
Gelis atsargiai dedamas į plastikinį indelį. Pradedant dažyti, 5 minutes gelis plaunamas ultra švariu vandeniu. Ultra švarus vanduo pakeičiamas, gelis plaunamas dar 5 minutes. Plaunant gelį ultra švariu vandeniu, lygiagrečiai pagaminamas tirpalas iš 30 proc. etanolio ir 10 proc. acto rūgšties, santykiu 3:1. Šiuo tirpalu užpilamas gelis ir paliekama 15 minučių. Pastarasis etapas kartojamas 2 kartus. Etanolio ir acto rūgšties tirpalas nupilamas, ir gelis du kartus plaunamas 10 proc. etanolio tirpalu po 5 minutes. Baigus šį etapą, gelis du kartus po 5 minutes plaunamas ultra švariu vandeniu.
Paruošiamas jautriklio darbinis tirpalas, sumaišant jautriklį (Silver Stain Sensitizer), esantį sidabro dažų rinkinyje, su ultra švariu vandeniu, santykiu 1:500 ir užpilamas ant gelio. Gelis laikomas 1 minutę jautriklio darbiniame tirpale. Praėjus nustatytam laikui, gelis du kartus po 1 minutę plaunamas ultra švariu vandeniu.
Paruošiamas darbinis sidabro dažų tirpalas. Ruošiant tirpalą, sumaišoma sidabro dažų stipriklis (Silver Stain Enhancer) ir sidabro dažai (Silver Stain), santykiu 1:50, ir užpilamas ant gelio. Paruoštame dažų tirpale gelis laikomas 30 minučių. Paruošiamas ryškinimo darbinis tirpalas: sumaišant sidabro dažų stipriklį (Silver Stain Enhancer) ir sidabro dažų ryškiklį (Silver Stain Developer), santykiu 1:50. Tuo pačiu metu paruošiamas ryškinimą stabdantis tirpalas, naudojant 5 proc. acto rūgštį. Prieš ryškinimą gelis du kartus plaunamas ultra švariu vandeniu po 20 sekundžių. Gelis laikomas ryškinimo tirpale, kol pradeda ryškėti esančių baltymų juostos. Išryškėjus juostoms, gelis laikomas ryškinimą sustabdančiame acto rūgšties tirpale 10 minučių. Baigus dažymą, gelis nufotografuojamas ir laikomas ultra švariame vandenyje.
3 dalys baltymų sumaišomi porcelianinėje lėkštelėje su 10 dalių aerosilo ir 3 dalimis Prosolv. Gautas mišinys paskleidžiamas ant pergamentinio popieriaus ir paliekamas džiūti 20±2 ºC temperatūroje, 24 valandas. Masei išdžiūvus, ji pertrinama per 2 mm sietą. Susidarę birūs milteliai mašinėlės pagalba kapsuliuojami. Parinktos „0“ dydžio kapsulės.
2.4.5. Birumo greitis ir subėrimo kampas
Pagal Europos Farmakopėjos (Eur. Ph (01/2010:20936) birumo indeksas nustatytas Erweka aparatu. Pasveriama 50±0,01 g medžiagos ir suberiama į prietaiso piltuvėlį, 20 sekundžių milteliai veikiami vibracijos. Atidaromas piltuvėlis, ir išmatuojamas laikas t (sek), per kurį tiriamoji medžiaga m (g) visiškai išbėga iš piltuvėlio. Birumas B (g/sek) apskaičiuojamas pagal 2 formulę. Optimalus miltelių birumo greitis - 4 – 5 g/sek.
Pagal Europos Farmakopėjos (Eur. Ph (01/2010:20936) straipsnį, miltelių subėrimo kampas matuojamas atlikus miltelių birumo tyrimą. Byrėdami milteliai suformuoja kūgį. Specialiu matlankiu matuojamas kūgio kampas. Birumo įvertinimas pagal kūgi kampą pavaizduotas 1-oje lentelėje.
20 t m B (2 formulė)
1 lentelė. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą
Birumas Kūgio kampas (o)
Puikus 25 – 30 Geras 31 – 35 Vidutiškas 36 – 40 Priimtinas 41 – 45 Prastas 46 – 55 Labai prastas 56 – 65 Itin prastas > 66
2.4.6. Kapsulių masės vienodumo testas
Kapsulių masės vienodumo testas atliekamas pagal Europos farmakopėjos 01/2008:20905 straipsnį. Testui atlikti paimama 20 nepažeistų, atsitiktinai parinktų kapsulių. Pasveriamos visos nepažeistos kapsulės. Pasvėrus kapsules, jos atidaromos ir atskirai pasveriamas kapsulės turinys bei želatininis apvalkalas. Kapsulės turinio masė - tai yra visos nepažeistos kapsulės masės ir želatininio apvalkalo masės skirtumas. Leistinas svėrinių nuokrypis yra reglamentuojamas. Kapsulėms, kurių vidutinė masė yra mažiau nei 300mg, galimas 10 proc. nuokrypis. Kapsulėms, purių vidutinė masė yra daugiau nei 300 mg, leidžiamas 7.5 proc. nuokrypis. Leidžiamas ne daugiau kaip dviejų svėrinių nuokrypis nuo masės vidurkio. Taip pat nė vienas iš svėrinių negali viršyti masės vienodumo testo normų daugiau kaip 2 kartus.
2.4.7. Kietųjų kapsulių tirpimo testas
Kapsulių tirpimo testas atliktas taikant krepšelio metodą. Testas naudojamas baltymų išsiskyrimo iš kapsulių greičio nustatymui. Tyrimas atliktas su ERWEKA DZT aparatu. Aparatą sudaro vandens vonia, į kurią įstatytas indas su tyrimui reikalinga terpe: 50 ml fosfato druskos buferinio tirpalo (PBS) pH 8.00, terpės temperatūra 37±2o C, nustatytu greičiu besisukantis krepšelis, į kurį įdedama
atsitiktinai parinkta kietoji kapsulė. Krepšelio nuotolis nuo indo dugno 20 ± 2 mm. Kapsulei pradėjus tirpti, pirmasis mėginys imamas, praėjus 15 minučių nuo tyrimo pradžios (kartojama keturis kartus: po 15, 30, 45 ir 60 min.). Kiekvieną kartą imama po 10 ml mėginio. Mėginiai imami iš vietos, esančios viduryje, tarp tirpimo terpės paviršiaus ir krepšelio apatinės dalies, ne mažesniu kaip 10 mm atstumu nuo indo sienelių. Po kiekvieno mėginio paėmimo atstatomas terpės tūris, t.y., įpilama po 10 ml PBS.
Siekiant nustatyti kapsulėse esančių baltymų koncentraciją, po baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių, išmatuota visuose keturiuose mėginiuose esančių baltymų koncentracija. Tam naudotas Bradford kiekybinis nustatymas, aprašytas (2.4.2.) skyriuje. Naudojant standartinės koncentracijos jaučio serumo albuminą, sudaryta kalibracinė kreivė, pavaizduota 5 paveikslėlyje.
𝑋 = 𝑌+0,0154
0,0604 (3 formulė)
Čia: X – koncentracija, µg/ml; Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
5 Pav. Kalibracinė Bradfordo metodo kiekybinio baltymų nustatymo kreivė
2.4.8. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas
Tyrimų duomenys įvertinti statistiškai, naudojant Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV). Visi eksperimentai pakartoti po tris kartus ir išreikšti aritmetiniu vidurkiu ± standartinė paklaida SP.
y = 0,0604x - 0,0154 R² = 0,9709 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 5 10 15 20 25 30 Abso rb cija
Standarto koncentracija (µg/ml)
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Baltymų frakcionavimas
Baltymų išskirstymui pagal molekulių dydį naudota gelchromatografija. Iš Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų išskirtų baltymų mėginys gelchromatografijos metu buvo išskirstytas į 69 frakcijų. Gelchromatografija vykdyta pagal 2.2.2 skyriuje aprašytą metodiką. Frakcijos, ties kuriomis pastebėti pikai, pasirinktos tolimesniems tyrimams. Kiekybiniams ir kokybiniams baltymų frakcijų tyrimams buvo pasirinktos 13, 23, 24, 35, 44 ir 60 baltymų frakcijos. Gelchromatografijos rezultatai pateikiami 5 paveiksle.
6 Pav.Gelchromatografijos metodu išskirstytosCetraria. islandica L. Ach. baltymų frakcijos . Gauti rezultatai prie 215nm (raudona kreivė) ir 280 nm (mėlyna kreivė) UV bangos ilgio
Baltymų peptidinės jungtys sugeria 190-230 nm bangos ilgio šviesą. Taigi, tokiame šviesos spektre jos tampa matomos [41]. Paveikslėlyje, rožine spalva pažymėtos smailės gautos prie 215 nm bangos ilgio, literatūros duomenimis tai žymi peptidinių jungčių absorbciją [42].
Esant 280 nm bangos absorbcijai, vyksta aromatinių amino rūgščių (triptofano, tirozino) absorbcija [43]. Gelchromatografijos metu, paveikslėlyje smailės, pažymėtos mėlyna spalva, vaizduoja amino rūgščių buvimą tiriamajame junginyje, darome prielaidą, kad iš kolonėlės ištekėję junginiai yra baltymai.
Vykdant baltymų išskyrimą pagal dalelių dydį. pirmieji iš kolonėlės išteka didesnio diametro baltymai, kadangi jie nepatenka į gelio, kuriuo yra užpildyta chromatografijos kolonėlė, poras. Vykdyto tyrimo rezultatai rodo, kad Cetraria islandica (L.) Ach. gniužuluose esantys baltymai atsiskyrė tik dalinai. Didžiausi pikai grafike matyti 30-42 frakcijų vietoje. Todėl galima teigti, kad Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų baltymų frakcijoje dominuoja vidutinio dydžio baltymai. Gelchromatografijos paveiksle matyti, kad nuo 50 frakcijos yra labai maži pikai, taigi, galima teigti, kad turimame mėginyje, mažos molekulinės masės baltymų yra maži kiekiai.
Grafike taip pat matyti, kad pikai, žymintys 34 ir 30 frakcijas, nėra atsiskyrę. Literatūros duomenimis, gelchromatografijos selektyvumas ir atskyrimo kokybė priklauso nuo mėginio tūrio ir kolonėlės parametrų. Taip pat baltymai gali neatsiskirti dėl tarpusavyje panašios struktūros ir molekulinės masės [16]. Vykdytos gelchromatografijos metu, galima daryti prielaidą, kad parinkti netinkami kolonėlės parametrai arba frakcijose esantys baltymai yra labai panašios struktūros. Kadangi 30, 34 frakcijos yra greta, o gelchromatografija paremta junginių atskyrimu pagal dalelių dydį, smailių neatsiskyrimas galėjo įvykti dėl junginių panašumo.
3.2. Baltymų kiekybinis nustatymas
Siekiant išsiaiškinti baltymų kiekį frakcijose, pasirinktas Bradfordo kiekybinis baltymų nustatymas. Atlikus baltymų išskyrimą gelchromatografijos metu, pasirinktos 13, 23, 24, 35, 44 ir 60 frakcijos, kadangi jose pastebėti didžiausi pikai. Nustatytas baltymų kiekis pavaizduotas 2 lentelėje.
2 lentelė. Baltymų frakcijų, išskirtų iš Cetraria islandica L. (Ach.) gniužulų, kiekybinis nustatymas Bradford metodu Frakcijos Nr. Absorbcija, nm Koncentracija, µg/ml (X± S) 12 0.0851 3.639± 0.05 13 0.1289 5.776± 0.05
23 0.1400 6.317± 0.11 24 0.1483 6.722± 0.09 25 0.0793 3.356± 0.10 29 0.0621 2.517± 0.04 44 0.0699 2.898± 0.05 60 0.0569 2.263± 0.07
Iš lentelėje esančių duomenų matyti, kad didžiausia koncentracija nustatyta 23 ir 24 frakcijose, atitinkamai – 6,722± 0.09 µg/ml ir 6,317± 0.11 µg/ml. Mažiausia koncentracija nustatyta 60 frakcijoje - 2.263± 0.07 µg/ml.
3.3. Baltymų molekulinės masės nustatymas, taikant NaDS – PAGE elektroforezę
Siekiant nustatyti Cetraria islandica (L.) Ach baltymų molekulinę masę, naudota NaDS – PAGE elektroforezė. Tyrimas atliktas pagal 4.4.4. skyriuje aprašytą metodiką. Gauti rezultatai pateikiami 6 paveiksle.
NaDS PAGE elektroforezės tyrimui pasirinktos 23 ir 24 frakcijos, kadangi jose nustatyta didžiausia baltymų koncentracija. Paveiksle pavaizduota 23 ir 24 frakcijų NaDS – PAGE elektroforezė. Elektroforezės metu nustatyta, kad 23 ir 24 frakcijoje esantys baltymai yra 40, 55 ir 130 kDa molekulinės masės.
Yra labai nedaug mokslinių duomenų apie kerpių gniužuluose esančius baltymus, jų sudėtį ar koncentraciją. Literatūros šaltiniuose aprašomi 58 kDa glikoproteinai, esantys Xanthoria parietina (L.) Th. Fr. kerpėje.
NaDS PAGE elektroforezės 7 paveiksle matyti, kad Cetraria islandica L. Ach baltymų frakcijose taip pat yra panašios molekulinės masės 40-55 kDa baltymų [44].
Nustačius baltymų, esančių Cetraria islandica L. (Ach.) frakcijose, kokybinę ir kiekybinę sudėtį NaDS-PAGE ir Bradfordo metodais, galima palyginti gautus rezultatus.
3 lentelė. 23 ir 24 baltymų frakcijų, išskirtų iš Cetraria islandica L. (Ach.) gniužulų, kokybinis (NaDS-PAGE elektroforezė) ir kiekybinis (Bradford metodas) nustatymas
Frakcijos Nr. Koncentracija, µg/ml Molekulinė masė, kDa 23 6.317± 0.11 ~40, 55 ir 130
24 6.722± 0.09 ~40, 55 ir 130
Atlikus tyrimus ir palyginus rezultatus, galima teigti, kad Cetraria islandica L. Ach. baltymų frakcijose didžiausia koncentracija yra baltymų, kurių molekulinė masė yra 40, 50 ir 130 kDa.
3.4. Kietųjų kapsulių gamyba
Iš Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų išskirtų baltymų tirpalo, turinčio 4.50±0,005 µg/ml baltymų, pagal 2.4.4 skirsnyje pateiktą metodiką pagamintos kietosios kapsulės, kurių masė 0.34 ± 0.013 g.
3.5. Kapsulių masės vienodumo testas
4 lentelė. Kietųjų kapsulių su baltymais masės nuokrypiai. Tyrimo objektas Masė, mg (X±SD; n=20) 1 2 3 Cetraria islandica (L.) Ach. kietosios kapsulės 0.34±0.013 0.34±0.004 0.34±0.005
3.6. Birumo nustatymas
5 lentelė. Baltymų ir pagalbinių medžiagų miltelių birumo parametrai (vidurkis±SN, n=5)
Tiriamasis mišinys Birumas (g/sek). Subėrimo kampas (SK), 0
Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų ir pagalbinių medžiagų mišinys
4.54±0.42 25.00±0.50
Atlikus birumo savybių tyrimus, nustatyta, kad baltymų ir pagalbinių medžiagų mišinys - tinkamas kapsuliavimui.
3.7. Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimas
Ištyrus baltymų kiekį po atsipalaidavimo iš kapsulių, nustatyta, kad didžiausias kiekis baltymų atsipalaiduoja po 60 minučių (63±0.58 proc.). Baltymų atsipalaidavimas, išreikštas procentais, pateiktas 7 paveikslėlyje.
8 Pav. Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) baltymų atsipalaidavimas iš kietųjų kapsulių.
Baltymų išsiskyrimas iš kietųjų kapsulių - proporcingas laiko intervalui. Praėjus 15 minučių nuo tyrimo pradžios, išsiskiria 50 proc. viso baltymų kiekio. Tyrimo pabaigoje, praėjus 60 minučių, iš viso išsiskyrė 63±0,58 proc. baltymų.
50 58 61 63 40 50 60 70 15 30 45 60 At sip alai d avim as % Laikas, min
4. IŠVADOS
1. Gelchromatografijos metodas nebuvo pakankamai selektyvus baltymų atskyrimui (baltymai atsiskyrė tik dalinai).
2. Frakcijose nustatyta didžiausia baltymų koncentracija - 6.722± 0.09 µg/ml. Šiose frakcijose nustatyta 40, 50 ir 130 kDa baltymų molekulinė masė.
3. Naudojant Prosolv® ir aerosilo pagalbines medžiagas, pagamintos kietosios kapsulės, turinčios po 3.68 µg baltymų. Miltelių birumo ir kapsulių vienodumo testo rezultatai atitiko Europos farmakopėjoje keliamus reikalavimus.
4. Nustatyta, kad baltymai iš Cetraria islandica (L.) Ach. kapsulių atsipalaiduoja dalinai – iki 63±0.58 proc.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Pagamintos Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų kietosios kapsulės perduotos tolimesniems biologinio aktyvumo tyrimams Baltarusijos mokslų akademijos V. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos instituto mokslininkams.
Tolimesniuose tyrimuose rekomenduojama:
Nustatyti Cetraria islandica (L.) Ach. gniužuluose esančių baltymų struktūrą.
Nustatyti biologinį Cetraria islandica (L.) Ach. gniužuluose esančių baltymų aktyvumą. Optimizuoti, tobulinti, vaistinės formos su Cetraria islandica (L.) Ach. baltymais gamybą.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Grujičić D, Stošić I, Kosanić M, Stanojković T, Ranković B, Milošević-Djordjević O. Evaluation of in vitro antioxidant, antimicrobial, genotoxic and anticancer activities of lichen Cetraria islandica. Cytotechnology. 2014;66(5):803–13.
2. Freysdottir J, Omarsdottir S, Ingólfsdóttir K, Vikingsson A, Olafsdottir ES. In vitro and in vivo immunomodulating effects of traditionally prepared extract and purified compounds from Cetraria islandica. Int Immunopharmacol. 2008;8(3):423–30.
3. Arup U, Ekman S, Grube M, Mattsson J-E, Wedin M. The sister group relation of Parmeliaceae (Lecanorales, Ascomycota). Mycologia. 2007;99(1):42–9.
4. Nash T H. Lichen Biology. Cambridge: Cambridge University Press; 1996. p. 301.
5. Türk AÖ, Yilmaz M, Kivanç M, Türk H. The Antimicrobial Activity of Extracts of the Lichen Cetraria aculeata and Its Protolichesterinic Acid Constituent. Zeitschrift fur Naturforsch - Sect C J Biosci. 2003;58(11-12):850–4.
6. European Medicines Agency Cetraria islandica. Prieiga per internetą: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2014/05/WC500167173.pdf.
7. European Medicines Agency, European Union herbal monograph on Cetraria islandica (L.). Prieiga per internetą: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_Community_herbal_monograph/2015/02/WC500182211.pdf.
8. European Scientific Cooperative of Phytotheraphy. Monograpf lichen islandicus.Prieiga per interneta: http://3p6hd548261g2ozsq64ddj4j.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/1-ESCOP-Monograph-Lichen-Islandicus-2003-de.pdf.
9. Horhant D, Lamer A-C Le, Boustie J, Uriac P, Gouault N. Separation of a mixture of paraconic acids from Cetraria islandica (L.) Ach. employing a fluorous tag—catch and release strategy. Tetrahedron Lett. 2007;48(34):6031–3.
10. Gülçin İ, Oktay M, Küfrevioğlu Öİ, Aslan A. Determination of antioxidant activity of lichen Cetraria islandica (L) Ach. J Ethnopharmacol. 2002;79(3):325–9.
11. Kotan E, Alpsoy L, Anar M, Aslan A, Agar G. Protective role of methanol extract of Cetraria islandica (L.) against oxidative stress and genotoxic effects of AFB1 in human lymphocytes in vitro. Toxicol Ind Health. 2011;27(7):599–605.
12. Ivanova D, Gerova D, Chervenkov T, Yankova T. Polyphenols and antioxidant capacity of Bulgarian medicinal plants. J Ethnopharmacol. 2005;96(1-2):145–50.
13. Nariman F, Eftekhar F, Habibi Z, Falsafi T. Anti-Helicobacter pylori activities of six Iranian plants. Helicobacter. 2004;9(2):146–51.
14. Ingólfsdóttir K. Usnic acid. Phytochemistry. 2002;61(7):729–36.
15. Janson J-C. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. New Jersey: Wiley; 2012. p. 7-10.
16. Ai E. Gel-filtration chromatography. Nat Methods. 2006;3(5):411–2.
17. Schwo H. SDS PAGE. Chapter 14. Prieiga per internetą: http://capricorn.bc.edu/bi204/wp-content/uploads/2014/07/14-SDS-PAGE_2014.pdf.
18. Tamošiūnas V. Skysčių chromatografija-tandeminė masių spektrometrija antibiotikų nustatymui maisto produktuose. Daktaro disertacija. 2009.
19. Introduction to SDS-PAGE.Prieiga per internetą: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab2.html.
20. Luo S, Feng J, Pang H-M. High-throughput protein analysis by multiplexed sodium dodecyl sulfate capillary gel electrophoresis with UV absorption detection. J Chromatogr A. 2004;1051(1-2):131– 4.
21. SDS Polyacrylamide Gel Analysis of Purified Fluorescent Protein. Prieiga per internetą: http://www.babec.org/files/GFP_Labs_2012/PAGEAnalysis_SV.pdf.
22. Božović A, Kulasingam V. Quantitative mass spectrometry-based assay development and validation: from small molecules to proteins. Clin Biochem. 2013;46(6):444–55.
23. Naujausių gamtos mokslo žinių sklaidos mokytojams tinklas. Prieiga per internetą: http://gamta.vdu.lt/mokytojai/kursai/Augaliniai_genotoksiskumo_testai.pdf.
24. Chang WW, Huang L, Shen M, Webster C, Burlingame a L, Roberts JK. Patterns of protein synthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedlings acclimated to a low-oxygen environment, and identification of proteins by mass spectrometry. Plant Physiol. 2000;122(2):295– 318.
25. Noble JE, Bailey MJA. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 2009;463:73–95.
26. Waterborg JH, Matthews HR. The lowry method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 2009.;7–10.
27. Okutucu B, Dinçer A, Habib O, Zihnioglu F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. J Biochem Biophys Methods. 2007;70(5):709–11.
28. Antharavally BS, Mallia KA, Rangaraj P, Haney P, Bell PA. Quantitation of proteins using a dye-metal-based colorimetric protein assay. Anal Biochem. 2009;385(2):342–5.
29. Walker JM. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 2009.;32:11–5.
30. Protein determination by the Bradford method. Prieiga per internetą: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/bradford.html.
31. Woodard SL, Mayor JM, Bailey MR, Barker DK, Love RT, Lane JR, et al. Maize (Zea mays)-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from transgenic plants. Biotechnol Appl Biochem. 2003;38(2):123–30.
32. Oseas Da Silva MA, Zezzi Arruda MA. Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric determination of total proteins. Anal Biochem. 2006;351(1):155–7.
33. Johnson M. Protein Quantitation. Mater Methods [Internet]. 2012 [cited 2015 Mar 8]. Available from: http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html. DOI:
http://dx.doi.org/10.13070/mm.en.2.115.
34. Banker G S, Siepmann J, Rhodes C. Modern Pharmaceutics, Fourth Edition. London:CRC Press; 2002. p. 864.
35. Podczeck F, Jones BE. Pharmaceutical Capsules. London: Pharmaceutical press; 2004. p. 119-122. 36. European Pharmacopoeia 7th Edition. Capsules. Capsulae 01/2008:0016.
37. Two-Piece Hard Capsules for Pharmaceutical Formulations. Priega per internetą: http://www.ivtnetwork.com/sites/default/files/HardCapsules.pdf.
38. Podczeck F, Jones BE. Pharmaceutical Capsules. Pharmaceutical Press; 2004. p. 272. 39. Hard gelatine capsules. Prieiga per internetą: http://www.just.edu.jo/~sfg/Lab73.html.
40. Nair R, Vemuri M, Agrawala P, Kim S. Investigation of various factors affecting encapsulation on the in-cap automatic capsule-filling machine. AAPS PharmSciTech. 2004;5(4):e57.
41. Goldfrad, Robert, Leo J. Saidel, Ervin M. The Ultraviolet Absorbtion of Spectra. 1951;397–404. 42. Kuipers BJH, Gruppen H. Prediction of molar extinction coefficients of proteins and peptides using
UV absorption of the constituent amino acids at 214 nm to enable quantitative reverse phase high-performance liquid chromatography-mass spectrometry analysis. J Agric Food Chem.
2007;55(14):5445–51.
43. Held P, Davis K. UV Fluorescence Polarization as a Means to Investigate Protein Conformational and Mass Change - Using Intrinsic Tryptophan Fluorescence in Conjunction with UV-capable Polarizers. Proteins Structure and Mass Change Determinations. 2014; 1-5.
44. Molina M, Vicente C. Purification and characterization of two isolectins with arginase activity from the lichen Xanthoria parietina. J Biochem Mol Biol. 2000;33(4):300–7.
