Fenformino ir metformino poveikio smegenų ląstelėms tyrimas normoksijos ir hipoksijos sąlygomis

(1)

Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas

Fenformino ir metformino poveikio smegenų ląstelėms

tyrimas normoksijos ir hipoksijos sąlygomis

Baigiamasis magistro projektas

Žaneta Zalomskytė Projekto autorė

dr. Paulius Čižas Vadovas

(2)

Fenformino ir metformino poveikio smegenų ląstelėms

tyrimas normoksijos ir hipoksijos sąlygomis

Baigiamasis magistro projektas

Medicininė chemija (6281CX001)

Žaneta Zalomskytė Projekto autorė dr. Paulius Čižas Vadovas dr. Lina Jankauskaitė Recenzentė

(3)

Žaneta Zalomskytė

Fenformino ir metformino poveikio smegenų ląstelėms

tyrimas normoksijos ir hipoksijos sąlygomis

Akademinio sąžiningumo deklaracija

Patvirtinu, kad mano, Žanetos Zalomskytės, baigiamasis projektas tema „Fenformino ir metformino poveikio smegenų ląstelėms tyrimas normoksijos ir hipoksijos sąlygomis“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.

Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno technologijos universitete galiojančia tvarka.

(4)

Zalomskytė, Žaneta. Fenformino ir metformino poveikio smegenų ląstelėms tyrimas normoksijos ir hipoksijos sąlygomis. Baigiamasis magistro projektas / vadovas dr. Paulius Čižas; Kauno technologijos universitetas, Cheminės technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas.

Studijų kryptis ir sritis (studijų krypčių grupė): chemija, fiziniai mokslai.

Reikšminiai žodžiai: fenformino hidrochloridas, metformino hidrochloridas, smegenų ląstelės. Kaunas, 2019. 49 p.

Santrauka

Šiuo metu yra žinoma daugiau nei 60 skirtingų junginių grupių, slopinančių mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso aktyvumą, tačiau priklausomai nuo naudojamo slopiklio mitochondrijų kvėpavimo grandinės aktyvumas gali skirtis [1]. Yra žinoma, kad išemijos ir reperfuzijos sąlygų metu keičiant mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso aktyvumą skirtingų grupių slopikliais gali pasireikšti ir apsauginis šių junginių poveikis skirtingų audinių ląstelėms [1, 2, 3, 4, 5], o naujausių tyrimų, atliktų su žiurkių smegenų žievės ir smegenėlių mitochondrijomis, duomenimis nustatyta, kad metformino hidrochloridas ir fenforminno hidrochloridas pasižymi mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmo komplekso slopinimu [13, 14]. Nors atlikti tyrimai ir atskleidė metformino hidrochlorido poveikį smegenų audiniams, tačiau jų metu gauti rezultatai gali būti sąlygoti netolygiai pasiskirsčiusių audinių pažeidimų, smegenų ląstelių heterogeniškumo, skirtingo deguonies poreikio ar vykdomo metabolizmo. Todėl išsamesnė analizė, siekiant nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido poveikį mišrios neuronų-glijos kultūros neuronų gyvybingumui hipoksijos ir išemijos sąlygų metu, yra būtina.

Tyrimo metu buvo siekiama nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido poveikį mišrios neuronų-glijos kultūros ląstelių gyvybingumui hipoksijos ir išemijos sąlygų metu. Šiam tikslui įgyvendinti išsikelti uždaviai: 1. nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido junginių koncentracijas, nemažinančias mišrios neuronų-glijos kultūros gyvybingumo ir tinkamas tolimesnies tyrimams; 2. nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido poveikį mišriai neuronų-glijos kultūrai esant hipoksijos ir reoksigenacijos sąlygomis.

Siekiant įgyvendinti tyrimo metu išsikeltus uždavinius buvo pritaikyti normoksijos, hipoksijos ir reoksigenacijos eksperimentiniai modeliai, kurių metu naudota žiurkės smegenėlių mišri neuronų-glijos kultūra, išskirta iš 7–9 parų amžiaus Wistar veislės žiurkių naujagimių.

Taikant eksperimentinį normoksijos modelį buvo nustatytos fenformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, tinkamos tolimesniems mišrios neuronų-glijos kultūros gyvybingumo tyrimams, o pritaikius eksperimentinį 24 val. hipoksijos modelį nustatyta, kad fenformino hidrochloridas ir metformino hidrochloridas išemijos sąlygų metu sumažina mišrios neuronų-glijos kultūros neuronų gyvybingumą, taip pat pastebėtas teigiamas preinkubacijos poveikis metformino hidrochlorido veikimui. Taikant eksperimentinį 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos modelį su 1 val. preinkubacija ir pakeičiant mišrios neuronų-glijos kultūros terpę buvo nustatyta, kad šio modelio pritaikymas turi neigiamą poveikį mišrios neuronų-glijos kultūros neuronų gyvybingumui

(5)

Zalomskytė, Žaneta. Investigation of Phenformin and Metformin Effect on Brain Cells under Normoxia and hypoxia. Master's Final Degree Project / Dr. Paulius Čižas; Faculty of Chemical Technology, Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences.

Study field and area (study field group): Chemistry, Physical Sciences. Keywords: phenformin hydrochloride, metformin hydrochloride, brain cells. Kaunas, 2019. 49 pages.

Summary

Currently, there are more than 60 different groups of compounds that inhibit the activity of the first complex of mitochondrial respiratory chain, but depending on the inhibitor used, the activity of the mitochondrial respiratory chain may vary [1]. It is known that during the mitochondrial respiratory chain first complex inhibition with different groups of inhibitors under ischemic and reperfusion conditions these compounds may have a protective effect on cells [1, 2, 3, 4, 5]. This is supported by recent studies performed on rats cortex and cerebral tissues, in which metformin hydrochloride and fenformin hydrochloride have been shown ability to inhibit the first complex of mitochondrial respiratory chain [13, 14]. Although studies have shown the effect of metformin hydrochloride on brain tissue, but the results can be effected by unevenly distributed tissue damages, brain cell heterogeneity or different oxygen demand and metabolism of cells. Therefore, a more detailed analysis of the effect of metformin hydrochloride and fenformin hydrochloride on the viability of mixed neuronal-glial culture neurons during hypoxic and ischemic conditions is necessary.

The study was designed to determine the effect of metformin hydrochloride and fenformin hydrochloride effect on the viability of mixed neuron-glial cultures during hypoxic and ischemic conditions. To achieve our main goal, the following tasks have been set: 1. Determine the concentrations of metformin hydrochloride and fenformin hydrochloride compounds, which do not diminish the viability of mixed neuronal-glial culture and are suitable for further research; 2. Determine the effect of metformin hydrochloride and fenformin hydrochloride on mixed neuronal-glial culture under hypoxia and reoxygenation.

In order to achieve these goals, experimental models of normoxia, hypoxia, and reoxygenation were used by using 7–9 days old Wistar breed rats mixed neuronal-glial cell culture derived from rats neonates.

The experimental normoxia model was used to determine the concentrations of fenformin hydrochloride and metformin hydrochloride, suitable for further analysis of mixed neuronal-glial culture viability. The hypoxia model showed that phenformin hydrochloride and metformin hydrochloride reduce viability of mixed neuronal-glial culture neurons during ischemic conditions, as well as a positive pre-incubation effect on metformin hydrochloride. Applying experimental 24 h hypoxia and 6 h reoxygenation model with 1 h of preincubation and having replacement of the mixed neuronal-glial culture medium revealed that application of this model has a negative effect on the viability of mixed neuronal-glial culture neurons during hypoxia-reoxygenation conditions. We also observed 2-deoxy-D-glucose inhibition in ischemic conditions during this experiment.

(6)

Turinys

Lentelių sąrašas ... 8

Paveikslų sąrašas ... 9

Santrumpų ir terminų sąrašas ... 10

Įvadas ... 11

1. Literatūros apžvalga ... 13

1.1. Insulto etiologija ir patogenezė ... 13

1.1.1. Ūminio išeminio galvos smegenų insulto etiologija ir patogenezė ... 13

1.2. Organų, audinių, ląstelių ir organelių pažeidimai išemijos sąlygų metu ... 14

1.2.1. Organų ir audinių pažeidimai išemijos ir reperfuzijos sąlygų metu ... 14

1.2.2. Smegenų pažeidimai išemijos sąlygų metu ... 15

1.2.3. Ląstelių žūties mechanizmai išemijos sąlygų metu ... 15

1.2.4. Mitochondrijų funkcijos išemijos sąlygų metu ... 16

1.3. Mitochondrijų struktūra ... 16

1.3.1. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos ... 16

1.3.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė ... 17

1.4. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso struktūra ir funkcijos išemijos sąlygų metu...19

1.4.1. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso struktūra ir veikimo mechanizmas ... 19

1.4.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso svarba išemijos sąlygų metu ... 20

1.5. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso slopikliai ir jų veikimo mechanizmas ... 20

1.5.1. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso slopiklių klasės ... 20

1.5.2. Biguanidai ir jų veikimo mechanizmai ... 21

2. Medžiagos ir tyrimų metodai ... 22

2.1. Tyrimo objektas ... 22

2.2. Reagentai, medžiagos ir aparatūra ... 22

2.2.1. Reagentai ir medžiagos... 22

2.2.2. Aparatūra ... 22

2.3. Terpės ... 23

2.3.1. Ląstelių kultūros augimo terpė ... 23

2.3.2. Ląstelių kultūros išskyrimo terpė ... 23

2.4. Ląstelių kultūros ... 23

2.4.1. Žiurkės smegenėlių mišrios neuronų kultūros paruošimas ... 23

2.4.2. Ląstelių kiekio ir gyvybingumo nustatymas... 23

2.4.3. Ląstelių sėjimas ... 24

2.5. Eksperimentiniai modeliai ... 24

2.5.1. Eksperimentinis neuronų kultūros normoksijos modelis ... 24

2.5.2. Eksperimentinis neuronų kultūros hipoksijos modelis ... 24

2.5.3. Eksperimentinis neuronų kultūros preinkubacijos-hipoksijos modelis ... 25

2.5.4. Eksperimentinis neuronų kultūros preinkubacijos-hipoksijos-reoksigenacijos modelis ... 25

2.5.5. Žiurkės smegenėlių mišrios neuronų kultūros terpių keitimo modelis ... 26

(7)

3.1. Fenformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido poveikis mišriai neuronų-glijos

kultūrai ... 28 3.2. Fenformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido poveikis mišriai neuronų-glijos

kultūrai hipoksijos ir išemijos sąlygomis ... 32 3.3. Fenformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido poveikis mišriai neuronų-glijos

kultūrai reoksigenacijos sąlygomis ... 36 3.4. Fenformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido poveikis mišriai neuronų-glijos

kultūrai taikant terpių keitimo modelį ... 37 Išvados ... 41 Literatūros sąrašas ... 42

(8)

Lentelių sąrašas

1 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 24 val. normoksija ... 23 2 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 24 val. hipoksija ... 24 3 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 24 val. hipoksija su 1 val. preinkubacija ... 24 4 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 1 val. preinkubacija, 24 val. hipoksija ir 6 val. reoksigenacija ... 25 5 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 1 val. preinkubacija, 24 val. hipoksija ir 6 val. reoksigenacija, terpių keitimas... 25

(9)

Paveikslų sąrašas

1 pav. Mitochondrijos struktūra...17 3 pav. Bisbenzimido H33343 trihidrochlorido (Hoechst 33343) ir propido jodido dažų

fluorescencija... 26 4 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta fenformino hidrochloridu normoksijos

sąlygomis...28 5 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu normoksijos sąlygomis ... 29 6 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta fenformino hidrochloridu normoksijos sąlygomis, nekrotinės ir apoptotinės neuronų ląstelės ... 29 7 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu normoksijos sąlygomis, nekrotinės ir apoptotinės neuronų ląstelės ... 30 8 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta fenformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos sąlygomis su 1 val. preinkubacija ... 31 9 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos

sąlygomis su 1 val. preinkubacija ... 32 10 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta fenformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos

sąlygomis, nekrozinės ir apoptozinės neuronų ląstelės ... 33 11 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos

sąlygomis, nekrozinės ir apoptozinės neuronų ląstelės ... 34 12 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta fenformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos sąlygomis su 1 val. preinkubacija ... 35 13 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos sąlygomis su 1 val. preinkubacija ... 35 14 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta fenformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos sąlygomis su 1 val. preinkubacija taikant terpių keitimą ... 36 15 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos sąlygomis su 1 val. preinkubacija taikant terpių keitimą ... 37 16 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta fenformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos sąlygomis su 1 val. preinkubacija taikant terpių keitimą, nekrozinės neuronų

ląstelės ... 39 18 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos sąlygomis su 1 val. preinkubacija taikant terpių keitimą, nekrozinės neuronų

ląstelės ... 39 19 pav. Mišri neuronų-glijos kultūra, paveikta metformino hidrochloridu 24 val. hipoksijos ir 6 val. reoksigenacijos sąlygomis su 1 val. taikant terpių keitimą, apoptozinės neuronų ląstelės ... 39

(10)

Santrumpų ir terminų sąrašas Santrumpos:

ADJ – aktyvūs deguonies junginiai; ADP – adenozino difosfatas; ATP – adenozino 5'-trifosfatas;

DMEM – Dulbecc‘o modifikuota Eagle mitybinė terpė; EDTA – etilendiaminotetraacto rūgštis;

FMN – flavino mononukleotidas;

KoQH2 – kofermento Q, redukuota forma (Ubichinolis);

MLKL – mišrus kinazėms giminingas domenas; MNPP – mitochondrijų nespecifinio laidumo pora;

NAD+ – nikotinamido adenino dinukleotidas, oksiduota forma; NADH – nikotinamido adenino dinukleotidas, redukuota forma; Pn – neorganinis fosfatas;

RET – atgalinė elektronų pernaša;

RIPK – su receptoriais sąveikaujanti baltymų kinazė; TNF – auglių nekrozės veiksnys.

(11)

Įvadas

Insultas yra viena iš aktualiausių visuomenės sveikatos problemų, sukelianti nuolatinį neįgalumą, demenciją ar mirtį, tai trečia pagal dažnį mirties priežastis pasaulyje ir Lietuvoje [6, 7]. Atliktų tyrimų duomenimis, per metus galvos smegenų insultą patiria daugiau nei 1.1 mln. Europos gyventojų ir yra prognozuojama, kad 2025 metais insultą patiriančių individų kiekis gali siekti 1.5 mln. [7], todėl vaistinių preparatų paieška ir analizė, siekiant sumažinti insulto sukeliamų pažeidimų riziką, yra būtina.

Priklausomai nuo kraujotakos sutrikimo pobūdžio išskiriami du pagrindiniai insulto tipai: hemoraginis ir išeminis. Hemoraginio insulto metu plyšus galvos smegenų kraujagyslei pasireiškia kraujo išsiliejimas į smegenis, o išeminio – pastebimas ūminis galvos smegenų kraujotakos nepakankamumas, kurio metu slopinamas galvos smegenų aprūpinimas deguonimi ir maistinėmis medžiagomis. Apie 80 proc. pacientų, patyrusių galvos smegenų insultą, yra diagnozuojamas išeminis galvos smegenų insultas, todėl tinkamas gydymo metodikų ir vaistinių preparatų pasirinkimas yra būtinas siekiant užtikrinti efektyvesnį ir greitesnį gydymą bei tinkamą individų integraciją į visuomenę.

Insulto sukeliamos pasekmės priklauso nuo pažeidimo vietos ir ploto galvos smegenyse, gydymo metodikos pasirinkimo ir laikotarpio, praėjusio nuo insulto identifikavimo pradžios. Tai viena iš aktualiausių visuomenės sveikatos problemų, apimančių didelius medicininių ir socialinių priemonių mastus siekiant užtikrinti efektyvesnį ir greitesnį gydymą bei tinkamą individų integraciją į visuomenę. Pacientų, patyrusių insultą, skaičius nuolat didėja, o gydymo metodai ir naudojamų vaistinių preparatų veikimas yra labai ribotas. Klinikinėje praktikoje yra naudojami smegenų kraujotaką gerinantys vaistiniai preparatai, tačiau dėl lėto veikimo ir padidėjusios kraujavimo rizikos jie taikomi retai. Tik 5 proc. pacientų atliekama intraveninė trombozė, kurios metu yra pašalinamas trombas arba embola, esanti galvos smegenų arterijoje, atstatant normalią smegenų kraujotaką [25]. Atliktų studijų metu nustatyta, kad pradėjus gydymą per 30 minučių nuo įvykusio išeminio insulto, pacientai turi 8 proc. didesnes galimybes atstatyti pažeistas motorines funkcijas ir išlikti visavertiškais visuomenės nariais [9], tačiau atlikus intervenciją per 60 minučių nuo ligos pasireiškimo motorinių funkcijų atstatymo tikimybė yra mažesnė [10]. Siekiant parinkti tinkamiausią ir efektyviausią gydymo metodiką, sumažinant gydymo trukmę, yra ieškoma naujų, efektyvesnių terapinių priemonių, sumažinančių insulto sukeliamus pažeidimus.

Tiriant insulto sukeliamus pažeidimus ir atliekant vaistinių preparatų analizę gydant insultą padidėjo ir gyvūnų modelinių organizmų pritaikymas. Mokslinėje literatūroje atskleidžiamas analizuojamų vaistinių preparatų potencialas apsaugant organus, audinius ir ląsteles nuo išemijos, reoksigenacijos ar reperfuzijos sukeltų pažeidimų, tačiau ne visi mokslinėje literatūroje analizuoti junginiai pasižymėjo apsauginiu poveikiu, kadangi šio aktyvumo stoka gali būti sąlygojama išemijos sąlygų metu aktyvuojamų ląstelės apsauginių mechanizmų, kurie paskatina nekrozinę ar apoptozinę ląstelių žūtį. Taip pat atskleista ir mitochondrijų funkcijų svarba išeminių sąlygų metu. Yra manoma, kad mitochondrijų funkcijų sutrikimai, ATP trūkumas, Ca2+_{perteklius, oksidacinis stresas ir}

mitochondrijų nespecifinio laidumo poros (MNPP) atidarymas yra veiksniai, galintys sukelti smegenų ląstelių žūtį. In vitro tyrimų metu nustatyta, kad mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmo komplekso slopiklių panaudojimas mažina vėžinių ląstelių, kepenų ir kardiomiocitų žūties mechanizmus, tačiau informacijos apie šių slopiklių poveikį neuronų ląstelėms nėra [11, 12].

(12)

Remiantis naujausių tyrimų, atliktų su žiurkių smegenų žievės ir smegenėlių mitochondrijomis, duomenimis nustatyta, kad metformino hidrochloridas pasižymi mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmo komplekso slopinimu, kuris paskatina mitochondrijų nespecifinio laidumo poros jautrumą Ca2+

ir inicijuoja jos atsidarymą, taip paskatindamas ląstelių žūties mechanizmus [13, 14]. Nors atlikti tyrimai ir atskleidė metformino hidrochlorido poveikį smegenų audiniams, tačiau jų metu gauti rezultatai gali būti sąlygoti netolygiai pasiskirsčiusių audinių pažeidimų, smegenų ląstelių heterogeniškumo, skirtingo deguonies poreikio ar vykdomo metabolizmo, o tai gali lemti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido poveikio skirtumus ląstelėms. Todėl išsamesnė analizė, siekiant nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido poveikį mišrios neuronų-glijos kultūros ląstelėms, yra būtina.

Darbo tikslas:

Nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido poveikį mišrios neuronų–glijos kultūros ląstelių gyvybingumui hipoksijos ir išemijos sąlygomis.

Darbo uždaviniai:

1. nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido junginių koncentracijas, nemažinančias mišrios neuronų-glijos kultūros gyvybingumo ir tinkamas tolimesnies tyrimams;

2. nustatyti metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido poveikį mišriai neuronų-glijos kultūrai esant hipoksijos ir reoksigenacijos sąlygomis.

(13)

1. Literatūros apžvalga

1.1. Insulto etiologija ir patogenezė

Insultas yra ūminis neurologinis kraujotakos sutrikimas, pasireiškiantis bendrais ir židininiais galvos smegenų neurologiniais simptomais, galinčiais išlikti ilgiau kaip 24 valandas nuo simptomų pasireiškimo pradžios [15, 16]. Bendri galvos smegenų insulto sukelti simptomai pasireiškia galvos skausmu, pykinimu, sąmonės sutrikimu, kvėpavimo padažnėjimu, bradikardija arba tachikardija. Šie simptomai būdingi ir židininiam galvos smegenų insultui, kurio metu yra identifikuojama kraujo išsiliejimo vieta smegenyse [15]. Insultas nėra kontroliuojamas ar lengvai identifikuojamas procesas, kurio metu sutrikdomas ar sustabdomas kraujo pratekėjimas į smegenis, lemiantis galvos smegenų ląstelių žūtį, komą arba mirtį [15, 16]. Remiantis kraujotakos sutrikimo pobūdžiu išskiriami du pagrindiniai insulto tipai: hemoraginis ir išeminis. Hemoraginis insultas pasireiškia plyšus galvos smegenų kraujagyslei ir įvykus kraujo išsiliejimui į smegenis. Priklausomai nuo kraujo išsiliejimo vietos hemoraginis insultas skirstomas į spontaninę intracerebrinę ir spontaninę subarachnoidinę kraujosrūvas. Spontaninės intracerebrinės kraujosrūvos metu kraujas išsilieja į smegenų parenchimą, o spontaninės subarachnoidinės kraujosrūvos metu – į subarachnoidinį tarpą tarp galvos smegenų švelniojo ir voratinklinio dangalų. Ūminio išeminio galvos smegenų insulto metu, įvykus galvos smegenų kraujagyslės okliuzijai, sutrinka kraujo pratekėjimas smegenų kraujagyslėmis, kuris paskatina smegenų ląstelių žūtį [16].

Insulto eigą bei vystymąsi gali lemti ir anksčiau patirtas miokardo infarktas, hipertenzinės ligos ar aterosklerozė – tai dažniausiai aptinkami insulto rizikos veiksniai, lemiantys jo raidą. Atliktų studijų metu nustatyta, kad vainikinių arterijų ligos, siejamos su hipertenzija, didina insulto riziką, kraujo spaudimui didėjant daugiau nei 110/75 mmHg [18, 24]. Prie retesnių insulto rizikos veiksnių priskiriami: navikai, tromboliziniai vaistai, plyšusios aneurizmos, rūkymas, viršsvoris, nutukimas, cholesterolio kiekio padidėjimas kraujyje, mažas fizinis aktyvumas ir cukrinis diabetas [17]. Insulto pasireiškimą gali lemti ir individų amžius, lytis, rasė ar paveldimumas, taip pat insultą sukeliantys veiksniai gali būti laikomi ir jį apsunkinančiais veiksniais, kurie mažina insulto gydymo efektyvumą. Šiems veiksniams priskiriamas cukrinis diabetas, padidėjęs cholesterolio ir lipoproteinų kiekis organizme ir kraujo serume, kai kurie vaistiniai preparatai (varfarinas ir kiti antikoaguliantai bei fenilpropanolaminas) ir narkotinės medžiagos (amfetaminas ir kokainas) [24, 20, 21]. Taigi, insultas yra aktuali visuomenės sveikatos problema, apimanti didelius medicininių ir socialinių priemonių mastus, jo gydymui ir profilaktikai skiriama daug dėmesio ir laiko siekiant užtikrinti efektyvesnį ir greitesnį gydymą bei tinkamą individų integraciją į visuomenę, sumažinti ligos metu pacientų ir valstybės patiriamus finansinius kaštus.

1.1.1. Ūminio išeminio galvos smegenų insulto etiologija ir patogenezė

Ūminis išeminis galvos smegenų insultas pasireiškia smegenų kraujotakos sutrikimu, sukeliančiu smegenis maitinančios kraujagyslės okliuziją [16]. Remiantis galvos smegenų pažeidimo pobūdžiu ūminis išeminis galvos smegenų insultas gali būti skirstomas į trombinį, embolinį ir hipoperfuzinį. Trombinio insulto metu yra pažeidžiamas galvos smegenų audinys, susiaurėjus kraujagyslės spindžiui ar susiformavus kraujo krešuliui smegenų kraujagyslėje, o embolinio galvos smegenų insulto metu smegenų arterija yra užkemšama embolu. Dažniausiai embolai kyla iš širdies ar stambiųjų arterijų, kai atplyšusios aterosklerozinės plokštelės patenka į kraujotaką ir užkemša smulkesnes kraujagysles ar susiaurina jų spindį. Hipoperfuzinis insultas yra artimas emboliniam,

(14)

tačiau atplyšusios aterosklerozinės plokštelės yra homogeninės kilmės, o insulto sukeliami simptomai pasireiškia tik sumažėjus kraujospūdžiui ar sulėtėjus kraujotakai. Visi šie ūminio išeminio galvos smegenų insulto tipai pasižymi viena bendra savybe – gebėjimu sukelti nekrozę ar edemą pažeistos kraujagyslės maitinamoje srityje [22]. Taip pat ūminis išeminis galvos smegenų insultas dažniausiai pasireiškia sumažėjus arteriniam kraujo spaudimui, dėl kurio sumažėja pernešamų maistinių medžiagų ir deguonies kiekis smegenyse, bei veninės okliuzijos metu, kuriai įvykus smegenyse pradeda kauptis skysčiai ir susidaro smegenų edema [23].

Ūminį išeminį galvos smegenų insultą gali lemti pagrindiniai insultą sukeliantys veiksniai: anksčiau patirtas miokardo infarktas, hipertenzinės ligos ar aterosklerozė, tačiau pastebimi ir retesni tik išeminiam galvos smegenų insultui būdingi veiksniai, kuriems priskiriama sisteminė embolija, smulkiųjų kraujagyslių lipohialinozė ir dėl aterotrombozinių pažeidimų susidarę intraarteriniai embolai. Prie retesnių priežasčių priskiriamas kaklo arterijos atsisluoksniavimas, vaskulitas arba koagulopatijų sukelta trombozė [24]. Net 80 proc. pacientų, patyrusių galvos smegenų insultą, yra diagnozuojamas ūminis išeminis galvos smegenų insultas, todėl tinkamos gydymo metodikos pasirinkimas yra būtinas tikslingam vaistinių preparatų pritaikymui insulto diagnostikoje ir gydyme. 1.2. Organų, audinių, ląstelių ir organelių pažeidimai išemijos sąlygų metu

1.2.1. Organų ir audinių pažeidimai išemijos ir reperfuzijos sąlygų metu

Išemijos sąlygų metu iš dalies slopinamas ar visiškai nutraukiamas organų ir audinių aprūpinimas deguonimi ir maistinėmis medžiagomis. Taip pat sutrikdomas metabolitų pašalinimas, kuris lemia organų funkcijų sutrikimus. Remiantis išemijos veikimo mechanizmu, išemija gali būti grįžtama ir negrįžtama [8]. Grįžtamos išemijos metu pažeisti organizmo organai ir audiniai gali atgauti pradines savo funkcijas ir toliau normaliai funkcionuoti, o negrįžtamosios išemijos metu yra negrįžtamai pažeidžiami, nebeatlieka savo funkcijų ir žūva. Išemija gali būti skirstoma į lėtinę ir ūminę. Lėtinės išemijos metu kraujo tekėjimas į organus sumažėja tolygiai ir iš lėto, o ūminės – kraujotaka nutrūksta staiga. Kraujotakai atstatyti yra taikoma reperfuzija, kurios metu pašalinami kraujotaką slopinantys veiksniai ir kraujo pratekėjimas į organus ir audinius yra atstatomas [8]. Nors reperfuzijos metu ir yra atstatoma kraujotaka, tačiau tam tikri audinių pažeidimai, pasireiškę išemijos (padidėjusi Ca2+

koncentracija) ar reperfuzijos (padidėjusi aktyvių deguonies junginių gamyba) sąlygų metu, gali ir išlikti [8].

Mokslinėje literatūroje pateikiami aerobinių organų ir audinių pažeidimai yra siejami su energijos sumažėjimu, pasireiškiančiu išemijos ir reperfuzijos sąlygų metu, kuriam esant labiausiai paveikiama širdis, smegenys, inkstai, kepenys ir žarnynas [26, 27]. Šių organų ir audinių ląstelių energetiniai poreikiai dažniausiai patenkinami oksidacinio fosforilinimo metu, kadangi anaerobinės glikolizės metu energijos tiekimas yra negalimas [26]. Esant energijos trūkumui sutrinka viduląsteliniai procesai, sąlygojantys organų ir audinių pažeidimus, atsiradusius dėl ląstelių funkcijų pakitimų. Taigi, išemijos sąlygų metu slopinamas ar nutraukiamas smegenų ląstelių aprūpinimas deguonimi ir maistinėmis medžiagomis bei sutrikdomas metabolitų pašalinimas, o reperfuzijos metu stebima padidėjusi aktyvių deguonies junginių (ADJ) gamyba, kuri gali paskatinti ląstelių žūties mechanizmų aktyvaciją.

(15)

1.2.2. Smegenų pažeidimai išemijos sąlygų metu

Išeminio galvos smegenų insulto metu sutrikus kraujotakai ir atsiradus maistinių medžiagų bei deguonies trūkumui sukeliama apoptozinė ar nekrozinė ląstelių žūtis, o išemijos sąlygų metu atsiradęs ATP stygius ląstelėse ir įvykę mitochondrijų pažeidimai lemia įvairių nešiklių funkcijų pakitimus, kurie sąlygoja sutrikusią jonų pusiausvyrą ląstelėse. Esant ATP stygiui sutrinka plazminės membranos potencialas, kurio metu skatinamas glutamato atpalaidavimas iš neuronų [28, 29, 30]. Fiziologinių sąlygų metu neuronuose palaikomos mažos glutamato koncentracijos, kurias reguliuoja nuo Na+ priklausomi nešikliai. Išemijos sąlygų metu atsiradęs jonų pusiausvyros pokytis bei pakitęs plazminės membranos potencialas paskatina nekontroliuojamą glutamato atpalaidavimą iš neuronų ir kaupimąsi užląsteliniame skystyje, o tai lemia ilgalaikį glutamato receptorių aktyvumą ir Ca2+_bei

Na+ koncentracijos padidėjimą ląstelėse. Glutamato padidėjimas sąlygoja didesnius pusiausvyros pokyčius ląstelėje [31, 32, 33, 34, 35]. Taigi, išemijos sąlygų metu padidėjęs glutamato kiekis užląsteliniame skystyje yra laikomas toksišku, kuriam esant inicijuojami smegenų ląstelių žūties mechanizmai [36, 37, 38, 39].

Fiziologinių sąlygų metu Na+_/Ca2+_{nešikliai ir organelės palaiko Ca}2+_{balansą ląstelėje, tačiau}

išemijos metu pastebimas Ca2+_{kaupimasis ląstelėje, lemiantis viduląstelinės Ca}2+_{koncentracijos}

padidėjimą, atsiradusį dėl energijos trūkumo išemijos sąlygų metu dėl kurio Ca2+_{nėra pašalinami iš}

ląstelės, o tai sąlygoja negrįžtamus ląstelės pažeidimus, paskatinančius ląstelių žūties mechanizmų aktyvaciją [40, 41, 42]. Ląstelių žūties mechanizmus lemia ir mitochondrijų funkcijų pakitimai bei padidėjusi aktyvių deguonies junginių gamyba, kuri paskatina mitochondrijų nespecifinio laidumo poros (MNPP) formavimąsi ir atsivėrimą. Atsivėrus MNPP mitochondrijų užpilde esantys baltymai, elektrolitai ir vanduo patenka į tarpmembraninę ertmę ir sukelia mitochondrijų brinkimą, kurio metu visiškai suardoma išorinė mitochondrijų membrana ir į citozolį atpalaiduojami ląstelės žūtį inicijuojantys baltymai, sukeliantys mitochondrijų vidinės membranos potencialo pokyčius. Siekdama išlaikyti šios membranos potencialą ATP sintazė paskatina ATP molekulių hidrolizę, sąlygodama dar didesnį ATP trūkumą, kuris išemijos sąlygų metu sukelia ląstelių žūtį [43, 44, 45, 46, 47, 48].

1.2.3. Ląstelių žūties mechanizmai išemijos sąlygų metu

Išemijos sąlygų metu susiformavę ląstelių pažeidimai aktyvuoja ląstelių žūties mechanizmus, paskatinančius apoptozinę ir nekrozinę/nekroptozinę ląstelių žūtį [39]. Apoptozė – tai daug energijos reikalaujanti, genetiškai užprogramuota ir reguliuojama ląstelių ir jos komponentų žūties forma, nesukelianti imuninės sistemos uždegiminio atsako, o nekrozė – nekontroliuojama ląstelių ir jos komponentų žūties forma, sukelianti imuninės sistemos uždegiminius procesus. Ilgą laiką buvo manoma, kad nekrozinė ląstelių žūtis yra nulemta išemijos sąlygų, kurių metu paskatinami ląstelių žūties mechanizmai, pastebimas ląstelių brinkimas, plazminės membranos suirimas ir ląstelių turinio išsiliejimas į tarpląstelinę erdvę, lemiantis imuninių ląstelių atsaką [49, 50, 5]. Tačiau remiantis naujausių tyrimų duomenimis įrodyta, kad nekrozinė ląstelių žūties forma išemijos sąlygų metu gali būti reguliuojama.

Nekroptozinė ląstelių žūties forma yra inicijuojama įvykus Fas ar TNF-α prisijungimui prie auglių nekrozės veiksnių (TNF) šeimos receptorių, o ląstelių žūties mechanizmas paskatinamas susidarius signaliniam ląstelės žūties kompleksui, kuris susiformuoja ligandui-receptoriui sąveikaujant su baltymų kinaze 1 ir žūties domenu TNF-R1. Susidaręs kompleksas fosforilina ir aktyvuoja kinazes

(16)

RIPK1 ir RIPK3 [52, 53, 54], o joms sąveikaujant su mišriu kinazėms giminingu domenu (MLKL) ir tarpusavyje susiformuoja nekrosoma [47, 55, 47], kuri paskatina fosforilinto MLKL jungimąsi prie lipidų, esančių membranos struktūroje, taip suardant membranos vientisumą ir paskatinant nekrozinę ląstelių žūtį [39, 56]. Taip pat nustatyta, kad esant RIPK3 ar MLKL trūkumui nutrūksta nekroptozinė ląstelių žūties forma ir paskatinama apoptozinė ląstelių žūtis [52].

Išemijos sąlygotos apoptozinės ląstelių žūties metu pastebima branduolių fragmentacija į apoptotinius kūnelius, kurių susiformavimą sąlygojantys signaliniai keliai gali būti skirstomi į mitochondrijų sužadinamą vidinį ir mirties receptorių skatinamą išorinį kelius. Vidinis signalinis kelias inicijuojamas, dalyvaujant mitochondriniams Bcl-2 šeimos baltymams, kai proapoptotiniai, Bax ir Bak, baltymai sukelia išorinės mitochondrijų membranos pokyčius, suardant membranos vientisumą [57, 58]. Tada į citozolį patekę proapoptotiniai citochromo c ir 14 Smac/DIABLO baltymai aktyvuoja nuo kaspazių priklausomą apoptozinę ląstelės žūtį, o citozolyje susijungę su d-ATP, apoptozės proteazes aktyvinančiu faktoriumi Apaf-1 ir kaspaze-9 suformuoja apoptosomą ir paskatina nuo kaspazių priklausomą ląstelių mirtį [57, 19]. Taigi, remiantis eksperimentinių ir klinikinių tyrimų duomenimis nustatyta, kad audinių, ląstelių ir mitochondrijų pažeidimai išemijos sąlygų metu aktyvina ląstelių žūties mechanizmus ir jų sąveiką tarpusavyje.

1.2.4. Mitochondrijų funkcijos išemijos sąlygų metu

Mitochondrijos laikomos vienu iš svarbiausių ląstelės komponentų, atsakingų už ląstelės funkcijų palaikymo procesus, o atsiradę mitochondrijų funkcijų pakitimai ir sutrikimai siejami su tam tikra patologija [27]. Išemijos sąlygų metu sukelti mitochondrijų pažeidimai yra siejami su dideliais energijos ir deguonies kiekio poreikiais, būtinais ląstelių gyvybingumo palaikymui. Šį energijos kiekio poreikį patenkina mitochondrijos, kurios oksidacinio fosforilinimo metu pagamina ląstelių funkcionavimui būtinus ATP kiekius, tačiau esant deguonies trūkumui, kuris atsiranda išemijos sąlygų metu, įvyksta mitochondrijų pakitimai ir slopinama jų veikla, lemianti ląstelių žūties mechanizmų aktyvaciją. Oksidacinio fosforilinimo slopinimas išemijos sąlygų metu paskatina turimos energijos išeikvojimą ir ląstelių žūties mechanizmų aktyvaciją, sąlygojančią mitochondrijų nespecifinio laidumo poros (MNPP) formavimąsi ir atsivėrimą. Atsivėrus MNPP mitochondrijų užpilde esantys baltymai, elektrolitai ir vanduo patenka į tarpmembraninę ertmę ir sukelia mitochondrijų brinkimą, kurio metu visiškai suardoma išorinė mitochondrijų membrana ir į citozolį atpalaiduojami ląstelės žūtį inicijuojantys baltymai, sukeliantys mitochondrijų vidinės membranos potencialo pokyčius, kurie paskatina ATP sintazės inicijuojamą ATP molekulių hidrolizę, sąlygojančią dar didesnį ATP trūkumą, kuris išemijos sąlygų metu sukelia ląstelių žūtį [43, 44, 45, 46, 47, 48]. Reperfuzijos sąlygų metu atstatomas deguonies kiekis taip pat sąlygoja ląstelių žūties mechanizmų aktyvaciją, kadangi staigus deguonies kiekio padidėjimas gali lemti aktyvių deguonies junginių susidarymą, kuris sukelia ląstelės ar jos komponentų pažeidimus, privedančius prie ląstelių žūties. Taigi, išemijos sąlygų metu atsiradę mitochondrijų funkcijų pakitimai sąlygoja ląstelių žūties mechanizmų aktyvaciją privedančią prie žūties ir atskleidžia mitochondrijų svarbą ląstelių funkcijų palaikyme.

1.3. Mitochondrijų struktūra

(17)

ertmės ir vidinės membranos vidaus užpildo – matrikso (1 pav.). Tiek vidinė, tiek išorinė mitochondrijų membranos sudarytos iš fosfolipidų bisluoksnio.

Vidinė mitochondrijų membrana formuoja įlinkius – kristas, didinančias vidinio paviršiaus plotą, kurių skaičius ir gylis priklauso nuo ląstelės kvėpavimo aktyvumo ir ATP poreikio. Vidinėje membranoje yra išsidėstę ir mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai, kurie oksidacinio fosforilinimo metu patenkina ląstelės energetinius poreikius. Energijos gamyba – viena iš pagrindinių mitochondrijų vykdomų funkcijų, kurios metu atpalaiduojant energiją iš makroenerginių junginių gaunama ATP [61, 62].

Vidinė mitochondrijų membrana apgaubia matriksą, kuriame aptinkamos ribosomos, vykdančios baltymų sintezę, ir dvigrandė žiedinė DNR, kuri lemia mitochondrijų gebėjimą savarankiškai dalintis ir daugintis [62, 63].

Tarpmembraninėje ertmėje yra aptinkamas citochromas c, kreatino kinazė ir adenilatų kinazė [63], o išorinė mitochondrijų membrana pasižymi dideliu laidumu vandeniui, jonams ir nedidelės molekulinės masės metabolitams. Ląstelėse mitochondrijos juda lėtai, keisdamos savo dydį ir formą [64], o jų kiekis gali kisti priklausomai nuo ląstelės, energetinių poreikių ir funkcinio aktyvumo.

1 pav. Mitochondrijos struktūra [60].

1.3.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė

Mitochondrijų kvėpavimo grandinė – sudėtinga oksidacijos – redukcijos sistema, sudaryta iš keturių stambiamolekulinių fermentinių kompleksų, išsidėsčiusių vidinėje mitochondrijų membranoje, kurių struktūrą sudaro daugiau nei 90 baltyminių komponentų [68]. Visi šie kvėpavimo grandinės kompleksai susideda iš įvairių redokso centrų, tokių kaip chinonai, flavinai, geležies-sieros grupės, hemai ir vario jonai [66]. Taip pat visi šie komponentai yra hidrofobiniai membraminiai baltymai (išskyrus citochromą c), išdėstę teigiamai didėjančia oksidacijos – redukcijos potencialo kryptimi ir sąveikaujantys tarpusavy dalyvaujant kofermento Q ir citochromo c elektronų nešikliams [68]. Mitochondrijų kvėpavimo grandinę sudarantys kompleksai gali būti tiek redukuotoje, tiek oksiduotoje formoje. Labiau elektroneigiami kompleksai aptinkami redukuotoje formoje – elektronai prijungiami, o mažiau elektroneigiami kompleksai aptinkami oksiduotoje formoje – elektronai atiduodami [67] ir priklausomai nuo turimos formos atlieka tik jiems būdingas funkcijas mitochondrijų kvėpavimo grandinėje (2 pav.).

(18)

Pirmasis kvėpavimo grandinės kompleksas, NADH dehidrogenazė arba NADH – ubichinono oksidoreduktazė, katalizuojanti kofermento Q redukciją ir redukuoto NAD+ oksidaciją. Tai flavoproteinas, sudarytas iš 45 subvienetų, turintis L formos struktūrą [68], kurią sudaro hidrofobinė ir hidrofilinė dalys. Šio komplekso struktūroje aptinkama ir viena FMN molekulė bei septyni – aštuoni Fe–S centrai ir kofermentas Q [68].

Antrasis kvėpavimo grandinės kompleksas, sukcinato dehidrogenazė arba sukcinato – ubichinono oksidoreduktazė, vykdo elektronų pernašą nuo sukcinato (FADH2) į kofermentą Q. Sukcinato

dehidrogenazė sudaryta iš 4 subvienetų, FAD prostetinės grupės ir Fe-S centrų, o pats fermentinis kompleksas yra įsiterpęs į vidinę mitochondrijų membraną [27]. Taip pat šio komplekso hidrofilinė dalis susideda iš dviejų subvienetų, kurie sudaryti iš redokso kofaktorių [66].

Trečiasis kvėpavimo grandinės kompleksas, citochromo bc1 kompleksas arba ubichinolio – citochromo c oksidoreduktazė, vykdo elektronų pernašą nuo KoQH2 į citochromą c, taip pat lemia

apoptozės metu vykstančius procesus [68, 27]. Tai vandenyje tirpus dimerinis fermentas, sudarytas iš 11 subvienetų, pasižymintis nesimetrišku išsidėstymu membranoje [66]. Fermentą sudarantis citochromas c1 ir neheminės geležies Fe-S baltymas aptinkamas išorinėje membranos pusėje, kuri

nukreipta į tarpmembraninę ertmę, o citochromas b kerta membraną ir yra laikomas transmembraniniu baltymu.

Ketvirtas kvėpavimo grandinės kompleksas, citochromo c oksidazė, katalizuoja deguonies redukcijos reakcijas, pasitelkdamas citochromą c, kurių metu susidaro vanduo. Šis kompleksas sudarytas iš 13 subvienetų, koduojamų mitochondrijų ir branduolio genų, bei dviejų hemo grupių (hemo a ir hemo a3) ir dviejų Cu2+ centrų (Cu2+ A ir Cu2+ B) [31].

Mitochondrijų kvėpavimo grandinei taip pat galima priskirti ir ATP sintazę, kuri laikoma penktuoju kvėpavimo grandinės kompleksu. Šis kompleksas oksidacinio fosforilinimo metu panaudodamas kvėpavimo grandinės elektrocheminį gradientą iš adenozino difosfato (ADP) ir fosfatinės grupės (Pn) susintetina ATP [27], kuri panaudojama ląstelių funkcijų palaikyme.

(19)

1.4. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso struktūra ir funkcijos išemijos sąlygų metu

1.4.1. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso struktūra ir veikimo mechanizmas Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas, NADH dehidrogenazė arba NADH – ubichinono oksidoreduktazė, yra didžiausias mitochondrijų kvėpavimo grandinės L formos flavoproteinas, sudarytas iš daugiau nei 45 baltymų subvienetų, kurio bendra molekulinė masė – 1000 kDa [68, 34]. Šį kompleksą sudaro hidrofobinė ir hidrofilinė dalys. Hidrofobinė dalis yra įsiterpusi į membraną, o hidrofilinė nukreipta į mitochondrijų matriksą. Hidrofilinėje dalyje aptinkami visi redokso kofaktoriai, reikalingi mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso substrato kofermento NADH oksidacijai bei elektronų pernašai, o ilga, nežymiai susisukusi alfa spiralinė membraninė dalis – atsakinga už protonų pernašą [66]. Taip pat šio komplekso struktūroje aptinkama ir viena FMN molekulė bei septyni – aštuoni Fe-S centrai ir kofermentas Q [68]. Šie fermento struktūros ypatumai lemia ir komplekso katalizuojamas NADH oksidacijos ir kofermento Q redukcijos reakcijas, kurių metu vykdoma elektronų pernaša nuo NADH link kofermento Q per FMN ir Fe-S centrus. Fe-S centrų ir kofermento Q redukcijos reakcijų metu gali įvykti pirmojo komplekso konformaciniai pokyčiai, kurių metu protonai pernešami į tarpmembraninę ertmę ir taip sukuriamas elektrocheminis membranos potencialas, kuris panaudojamas ATP gamybai [19, 71, 72, 73, 74]. Remiantis in vitro tyrimų duomenimis nustatyta, kad NADH ubichinono oksidoreduktazės katalizuojama reakcija gali būti ir grįžtama, kadangi elektronams pereinant nuo kofermento Q įvyksta NAD+ + H+ redukcija, kuri sumažina elektrocheminį protonų gradientą [75, 76].

Analizuojant mitochondrijų I komplekso struktūrą ir katalizines savybes, buvo nustatyta, kad šis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas yra aptinkamas ir dviejose būsenose: aktyvioje (A) ir neaktyvioje (D). Aktyvi komplekso būsena pasireiškia fiziologinių sąlygų metu, kai fermentas atlieka savo funkcijas, o neaktyvi – atsiradus substraktų (NADH ar kofermento Q) trūkumui, kai fermentas nebeatlieka savo funkcijų [77, 78]. Išemijos ir hipoksijos sąlygų metu yra pastebimas mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso aktyvios būsenos perėjimas į neaktyvią, kurios metu gali pasireikšti žemas fermentinis aktyvumas kol atsistato normalus deguonies lygis išemijos pažeistuose audiniuose. Siekiant atstatyti aktyvią pirmojo komplekso būseną išemijos ir hipoksijos sąlygų metu pažeistuose organuose ir audiniuose pirmiausiai atstatoma deguonies koncentracija, kurios atstatymui taikoma reperfuzija ar reoksigenacija [77], tačiau mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso aktyvumas gali būti sumažinamas ir nepatiriant oksidacinio streso. Naujausių tyrimų duomenimis, buvo nustatyta, kad azoto oksidas pasižymi apsauginiu poveikiu patologinių sąlygų metu, kai yra sumažinamas pirmojo komplekso aktyvumas [79, 80, 81, 82], bet nepatiriamas oksidacinis stresas. Taip pat ištirta, kad organų ir audinių pažeidimai gali būti sukelti ne tik esant deguonies trūkumui, bet ir atsiradus staigiam deguonies kiekio padidėjimui reperfuzijos sąlygų metu, kai paskatinama aktyvių deguonies junginių gamyba, kurią lemia padidėjęs membranos potencialas išemijos sąlygų metu [83]. Išemijos metu skatinama atgalinė elektronų pernaša (RET), oksiduojant mitochondrijų kvėpavimo grandinės substraktus [84, 85, 86], todėl susiformuoja didesni superoksido kiekiai, kurie dar labiau padidėja reperfuzijos sąlygų metu, inicijuodami antrinius radikalų sukeltus pažeidimus [87, 88, 89, 90]. Tyrimų metu naudojant gyvūnų smegenų nuopjovas in vitro ir gyvūnų smegenų išemijos modelius in vivo buvo nustatyta, kad mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso slopinimas mažina aktyvių deguonies junginių susidarymą. Remiantis mokslinėje literatūroje pateiktais duomenimis, mokslininkai mano,

(20)

kad mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso slopinimas gali būti pritaikytas ligų diagnostikoje ir gydyme.

1.4.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso svarba išemijos sąlygų metu

Ūminio išeminio galvos smegenų insulto metu sutrikus kraujotakai pastebimi įvairūs funkciniai ir struktūriniai mitochondrijų pakitimai, kurių metu sutrikdoma ATP gamyba, energetinių substraktų oksidacija ir aktyvuojami ląstelių žūties mechanizmai. Atliktų tyrimų duomenimis, nustatyta, kad išemijos sąlygų metu ATP kiekis žiurkės smegenų žievės ir hipokampo mitochondrijose sumažėja 85 procentais per pirmas 15 minučių [91], o po 30 minučių pastebimas ir mitochondrijų kvėpavimo greičio sumažėjimas 25–30 procentų [92]. Po 60 minučių išemijos smegenų mitochondrijų deguonies sunaudojimo greitis sumažėja iki 50 procentų, o po 90 – 120 minučių sukeliamas net 57–76 procentų slopinimas [93, 94], tai leidžia teigti, kad išemijos sąlygų metu stipriausiai paveikiamas ir pažeidžiamas pirmasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas. Remiantis mokslininkų atliktų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmo komplekso slopinimas gali turėti teigiamą poveikį palaikant ląstelių gyvybingumą, tačiau siekiant tai nustatyti būtini išsamesni tyrimai.

1.5. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso slopikliai ir jų veikimo mechanizmas 1.5.1. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso slopiklių klasės

Šiuo metu yra žinoma daugiau nei 60 skirtingų junginių grupių, slopinančių mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso aktyvumą sutrikdant elektronų pernašą tarp Fe-S centrų ir kofermento Q. Remiantis mitochondrijų pirmo komplekso slopiklių struktūra ir veikimo mechanizmu juos galima suskirstyti į tris pagrindines slopiklių klases: I, II ir III [95, 96, 97]. I klasės slopikliams priskiriami junginiai, savo struktūroje turintys hidroksilines grupes ir gebantys konkurenciškai slopinti kofermento Q jungimąsi prie mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso. Pagrindiniai šios klasės atstovai yra piericidinas A ir idebenonas. II klasės slopikliai stabilizuoja semichinoną, kuris slopina ubichinolio (KoQH2) susidarymą. Pagrindiniai šios klasės atstovai yra

rotenonas ir amitalis. III klasės slopikliai slopina membranos potencialą ir redukcijos – oksidacijos aktyvumą, taip sąlygodami neaktyvią protonų pernašą per mitochondrijų pirmąjį kompleksą [97]. Pagrindinis šios klasės atstovas – kapsaicinas. Visoms pirmo komplekso slopiklių klasėms yra būdinga skirtinga struktūra, tačiau toks pats veikimo mechanizmas, pasireiškiantis per kofermento Q redukciją, kurios metu šioms klasėms atstovaujantys junginiai prisijungia prie pirmo komplekso hidrofobinės srities. I ir II klasių atstovai yra nekonkurenciniai slopikliai, kadangi neveikia vieni kitų, todėl yra manoma, kad šių klasių slopikliai gali jungtis prie kelių komplekso sričių, taip sąlygoti pirmojo komplekso slopinimą [98]. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso slopikliai mažina komplekso fermentinį aktyvumą, todėl protonai nėra išmetami ir nesusidaro potencialas, būtinas oksidaciniam fosforilinimui ir ATP sintezei. Vykstant nepilnai elektronų pernašai per pirmąjį mitochondrijų kompleksą, sąlygojama ir nepilna deguonies redukcija, kuri lemia padidėjusią aktyvių deguonies junginių gamybą. Remiantis mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso slopiklių poveikiu aktyvių deguonies junginių susidarymui išskiriamos dvi slopiklių grupės: skatinantys arba apsaugantys nuo aktyvių deguonies junginių susidarymo. Junginiai,

(21)

slopikliai, apsaugantys nuo aktyvių deguonies junginių susidarymo, tiesiogiai užkerta kelią deguonies redukcijai ir elektronų atpalaidavimui, taip slopindami aktyvių deguonies junginių susidarymą [99]. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmojo komplekso slopiklių panaudojimas patologinių ligų diagnostikoje ir gydyme yra intensyviai tiriamas, tačiau dėl skirtingų veikimo mechanizmų sunkiai pritaikomas.

1.5.2. Biguanidai ir jų veikimo mechanizmai

Biguanidų grupės dariniai naudojami antro tipo cukrinio diabeto gydyme, kurių struktūros pagrindą sudaro dvi guanidino molekulės, o farmakologinį poveikį nulemia šoninės alkilinės grandinės struktūriniai skirtumai [100]. Pagrindiniais biguanidų grupės atstovais laikomi metformino hidrochlorido ir fenformino hidrochlorido junginiai, pasižymintys mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmo komplekso slopinimu [101, 102]. Esant energijos resursų trūkumui kepenyse aktyvuojama nuo AMP priklausoma baltymų kinazė (AMPK) ir slopinama adenilatciklazė, kuri sąlygoja gliukozės kiekio sumažėjimą kraujyje ir padidėjusį jautrumą insulinui [103, 104, 105]. Remiantis atliktų tyrimų duomenimis, nustatyta, kad fenformino hidrochloridas stipriau sąveikauja su mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmu kompleksu nei metformino hidrochloridas. Šis mitochondrijų kvėpavimo grandinės pirmo komplekso slopinimas jaučio ir pelės širdies mitochondrijose gali pasireikšti dėl fenformino hidrochlorido hidrofobinių savybių ir lengvesnės pernašos į mitochondrijų užpildą [104]. Taip pat nustatyta, kad esant didesnėms fenformino hidrochlorido koncentracijoms pasireiškia ne tik pirmojo, bet ir antrojo bei ketvirtojo mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų slopinimas, o dėl sukeliamos pieno rūgšties acidozės šio vaistinio preparato vartojimas tapo griežtai kontroliuojamas [106]. Tiek metformino hidrochloridas, tiek fenformino hidrochloridas tiesioginės elektronų pernašos metu slopina ubichinono redukciją, kurios metu mitochondrijų kvėpavimo grandinėje inicijuojamas aktyvių deguonies junginių susidarymas [107]. Remiantis naujausių tyrimų duomenimis nustatyta, kad išemijos ir reperfuzijos sąlygų metu metformino hidrochloridas pasižymėjo apsauginiu poveikiu, sumažindamas apoptozinę kardiomiocitų ląstelių žūtį, oksidacinį stresą, sukeltą deguonies trūkumo, ir atgalinę elektronų pernašą, kuri paskatina aktyvių deguonies junginių susidarymą [108, 109, 110]. Taip pat pastebėtas ir apsauginis metformino hidrochlorido poveikis tiriant žmogaus endotelio ir burnos epitelio vėžines ląsteles [119, 120]. Taigi, atlikti tyrimai atskleidžia biguanido darinių potencialą patologinių procesų prevencijoje, tačiau siekiant nustatyti šių junginių veikimo mechanizmą būtina ištirti junginių poveikį smegenų ląstelėms.

(22)

2. Medžiagos ir tyrimų metodai

Tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijoje, atsižvelgiant į Europos Sąjungoje ir Lietuvos Respublikoje galiojančius teisės aktus, reglamentuojančius geros laboratorinės praktikos (GLP) taisykles darbui su laboratoriniais gyvūnais (Valstybinės Veterinarijos tarnybos leidimas atlikti laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr.0006).

Tyrimo metu buvo naudojami 7–9 parų amžiaus Wistar veislės žiurkių naujagimiai, veisti ir laikyti standartinėmis laboratorinėmis sąlygomis Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos vivariume. Žiurkės smegenėlių mišrios neuronų–glijos kultūros išskyrimas buvo atliekamas leidimą dirbti su gyvūnais turinčio specialisto dr. Pauliaus Čižo pagalba.

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo metu buvo naudojamos žiurkės smegenėlių mišri neuronų–glijos kultūra, išskirta iš 7–9 parų amžiaus Wistar veislės žiurkių naujagimių. Eksperimentiniai modeliai buvo taikomi mišriai 4-ių parų žiurkės smegenėlių neuronų–glijos kultūrai.

2.2. Reagentai, medžiagos ir aparatūra 2.2.1. Reagentai ir medžiagos

 1 proc. penicilino-streptomicino tirpalas ((10000 VV / ml penicilino ir 10000 µg / ml streptomicino) Gibco, Jungtinės Amerikos Valstijos);

 2-deoksi-D-gliukozė (2-DG, ≥ 98 proc. (GC), Sigma-Aldrich, Kinija);  96 proc. etanolis (Stumbras, Lietuva);

 arklio serumas (Gibco, Naujoji Zelandija);

 bisbenzimido H 33343 trihidrochloridas (Hoechst 33343, ≥ 97 proc. (HPLC)), Sigma-Aldrich, Šveicarija);

 buferinis fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 ((PBS), Gibco, Jungtinė Karalystė);

 DMEM (1X) + GlutaMAXTM_{-I ((Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė)}

Gibco, Jungtinė Karalystė);

 fenformino hidrochloridas (Sigma-Aldrich, Kinija);  fetalinis jaučio serumas (FBS, Gibco, Brazilija);  gliukozė (Gibco, Jungtinė Karalystė);

 kalio chloridas (≥ 99,5 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija);  metformino hidrochloridas (Sigma-Aldrich, Kinija);  poli-L-lizinas (Cultrex, Jungtinės Amerikos Valstijos);

 propido jodidas (≥ 95 proc. (HPLC), Sigma-Aldrich, Jungtinės Amerikos Valstijos);  tripano mėlio tirpalas ((TM), Fluka, Jungtinė Karalystė);

 verseno tirpalas ((1:5000) (Gibco)). 2.2.2. Aparatūra

(23)

 laminaras (Herasafe KS 12, Thermo Scientific). 2.3. Terpės

2.3.1. Ląstelių kultūros augimo terpė

Naudota Dulbeccʹo modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM (1X) + GlutaMAXTM-I), papildyta 5 proc. arklio serumo, 5 proc. fetalinio jaučio serumo (FBS), 13 mM gliukozės, 20 mM kalio chlorido ir penicilino-streptomicino tirpalo. Paruošta terpė buvo filtruojama pro sterilų 40 µm poros diametro tinklelį ir naudojama tyrimo metu arba saugoma 4 ºC temperatūroje.

2.3.2. Ląstelių kultūros išskyrimo terpė

Naudojamas iki 4 ºC temperatūros buferinis fosfatinis druskų tirpalas (PBS), papildytas 13 mM gliukozės ir penicilino-streptomicino tirpalo. Paruošta terpė buvo filtruojama pro sterilų 40 µm poros diametro tinklelį ir naudojama tyrimo metu arba saugoma 4 ºC temperatūroje.

2.4. Ląstelių kultūros

2.4.1. Žiurkės smegenėlių mišrios neuronų kultūros paruošimas

Tyrimo metu buvo naudojami Wistar veislės žiurkių 7–9 parų amžiaus naujagimiai. Žiurkių naujagimiai buvo užmigdomi CO2 dujomis, o po to dekapituojami. Ties galvos apatinės dalies viduriu

buvo įkerpamas viršutinis odos sluoksnis ir kerpama viena kryptimi išilgai galvos viduriu. Pašalinus viršutinį galvos odos sluoksnį prakerpama viršutinė kaukolės dalis. Kaukolė buvo atveriama, o pakauškaulio ir momenkaulio kaulai nuimami. Galvos smegenys išimamos iš kaukolės ir dedamos į Petri lėkštelę su atšaldyta iki 4 ºC temperatūros ląstelių kultūros išskyrimo terpe. Chirurginiu būdu atskiriama galvos smegenyse esanti smegenėlių zona, kuri perkeliama į kitą Petri lėkštelę su joje esančiu PBS tirpalu. Pašalinamos smegenėlių paviršiuje esančios kraujagyslės ir smegenėlės perkeliamos į kitą Petri lėkštelę su joje esančiu PBS tirpalu. Petri lėkštelėje esančios smegenėlės skalpeliu susmulkinamos į mažesnius segmentus, o smegenėlių segmentai perkeliami, sterilia 5 ml pipete į mėgintuvėlį su 5 ml Verseno tirpalu (1:5000), pašildytu iki 37 ºC temperatūros. Smegenėlių segmentai laikomi inkubatoriuje (HERAcell 150i), 37 ºC temperatūroje, 5 min. kas 1 min. judinant segmentų mišinį. Po inkubacijos smegenėlių segmentų mišinys 30-imt kartų resuspenduojamas sterilia 2 mm diametro pipete ir 30 kartų – 1 mm diametro Pastero pipete. Gautas trituratas perpilamas į sterilų 50 ml tūrio mėgintuvėlį, kuris centrifuguojamas 270×g 5 min. centrifugoje (Eppendorf Centrifuge 5702 R), atšaldytoje iki 4 ºC temperatūros. Gautas supernatantas pašalinamas, o nuosėdos užpilamos 5 ml, iki 37 ºC temperatūros pašildyta ląstelių kultūros auginimo terpe. Tirpalas yra švelniai sumaišomas jį trituruojant, o ląstelių suspensija filtruojama pro sterilų, 40 µm poros diametro tinklelį. Mišrios neuronų kultūros išskyrimo ir paruošimo darbai atliekami sterilioje aplinkoje – laminare (Herasafe KS 12), naudojant sterilius instrumentus ir terpes.

2.4.2. Ląstelių kiekio ir gyvybingumo nustatymas

Ląstelių kiekiui ir gyvybingumui nustatyti buvo naudojamas hemocitometras ir tripano mėlio dažai. Į sterilų 1,5 ml mėgintuvėlį buvo perkeliama 20 µl ląstelių suspensijos ir 20 µl TM. Mišinys buvo sumaišomas jį pipetuojant ir perkeliamas ant hemocitometro kameros, padengtos dengiamuoju stikleliu. Mėlynai nenusidažiusios ląstelės skaičiuojamos pagal instrukciją, pateiktą su hemocitometru: suskaičiuojamos ląstelės, esančios keturiuose kvadratuose, jos sumuojamos ir

(24)

dauginamos iš 4-ių (ląstelių skaičius skaičiuojamas 16-oje kvadratų) ir iš 2-ų (skiedimų skaičius) bei iš 5000-ių (vieno kvadrato tūrio dalis mililitre). Gautas skaičius – gyvų ląstelių kiekis viename mililitre. Ląstelių kiekio ir gyvybingumo nustatymo darbai buvo atliekami sterilioje aplinkoje – laminare (Herasafe KS 12), naudojant sterilius instrumentus ir reagentus.

2.4.3. Ląstelių sėjimas

Ląstelių sėjimui paruošiamos 24-ių šulinėlių lėkštelės. Šulinėliai papildomi 400 µl poli-L-lizino ir vandens mišiniu (1:10, 1 dalis – poli-L-lizino ir 10 dalių – vandens). Po 50 minučių poli-L-lizino ir vandens mišinys yra pašalinamas, o šulinėliai papildomi buferiniu fosfatiniu druskų tirpalu, pH 7,4 (PBS). PBS tirpalas yra pašalinamas ir ši procedūra pakartojama du kartus. Prieš ląstelių sėjimą PBS tirpalas yra visiškai pašalinamas iš šulinėlių, o ląstelės sėjamos 237 500 ląstelių/cm2_{tankiu. Ląstelės}

auginamos inkubatoriuje (HERAcell 150i) 37 ºC temperatūroje atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2 dujomis. Po 4-ių parų ląstelių kultūra yra tinkama tolimesniems tyrimams.

Ląstelių sėjimo darbai buvo atliekami sterilioje aplinkoje, naudojant sterilius instrumentus ir terpes. 2.5. Eksperimentiniai modeliai

2.5.1. Eksperimentinis neuronų kultūros normoksijos modelis

Naudojama žiurkės smegenėlių mišri 4-ių parų neuronų kultūra, pasėta 24-ių šulinėlių lėkštelėse. Mišri neuronų-glijos kultūra buvo papildyta iki 37 ºC temperatūros 10 mM fenformino hidrochlorido arba 10 Mm, 100 mM metformino hidrochlorido tirpalu (galutinės koncentracijos šulinėliuose pateiktos 1 lentelėje) ir 24 valandas laikoma inkubatoriuje (HERAcell 150i) 37 ºC temperatūroje. Po 24 valandų mišri neuronų-glijos kultūra fotografuojama invertuotu fluorescenciniu mikroskopu (Olympus IX73) ir analizuojama QCapture programa.

1 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 24 val.

normoksija.

Vaistinis preparatas Koncentracija (µM)

Fenformino hidrochloridas 25; 100; 250; 500.

Metformino hidrochloridas 100; 250; 500; 1000; 2000; 3000; 4000; 5000.

2.5.2. Eksperimentinis neuronų kultūros hipoksijos modelis

Naudojama žiurkės smegenėlių mišri 4-ių parų neuronų kultūra, pasėta 24-ių šulinėlių lėkštelėse. Mišri neuronų-glijos kultūra buvo papildyta iki 37 ºC temperatūros 10 mM fenformino hidrochlorido ir 1 M 2-deoksi-D-gliukozės (2-DG) arba 100 mM metformino hidrochlorido ir 1 M 2-DG tirpalu (galutinės koncentracijos šulinėliuose pateiktos 2 lentelėje). 24-ių šulinėlių lėkštelės 24 valandas laikomos hipoksijos kameroje 37 ºC temperatūroje, papildytoje 93 proc. N2 dujų, 5 proc. CO2 dujų ir

2 proc. O2 dujų mišinio. Po 24 valandų mišri neuronų-glijos kultūra fotografuojama invertuotu

(25)

2 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 24 val. hipoksija.

Fenformino hidrochloridas Metformino hidrochloridas

Koncentracija Koncentracija

Vaistinis preparatas (µM) 2-deoksi-D-gliukozė (mM) Vaistinis preparatas (mM) 2-deoksi-D-gliukozė (mM)

100 10 1 10

250 10 2 10

250 - 3 10

- 10 3 -

- - - 10

2.5.3. Eksperimentinis neuronų kultūros preinkubacijos-hipoksijos modelis

Naudojama žiurkės smegenėlių mišri 4-ių parų neuronų kultūra, pasėta 24-ių šulinėlių lėkštelėse. Mišri neuronų-glijos kultūra buvo papildyta iki 37 ºC temperatūros 10 mM fenformino hidrochlorido ir 1 M 2-deoksi-D-gliukozės (2-DG) arba 100 mM metformino hidrochlorido ir 1 M 2-DG tirpalu (galutinės koncentracijos šulinėliuose pateiktos 3 lentelėje). 24-ių šulinėlių lėkštelės laikomos inkubatoriuje (HERAcell 150i) 37 ºC temperatūroje atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2 dujomis, ir po 1 valandos perkeliamos į hipoksijos kamerą, kur yra laikomos 37 ºC

temperatūroje, papildytoje 93 proc. N2 dujų, 5 proc. CO2 dujų ir 2 proc. O2 dujų mišiniu 24-ių šulinėlių

lėkštelės 24 valandas laikomos hipoksijos kameroje 37 ºC temperatūroje, papildytoje 93 proc. N2

dujų, 5 proc. CO2 dujų ir 2 proc. O2 dujų mišiniu. Po 24 valandų mišri neuronų-glijos kultūra

fotografuojama invertuotu fluorescenciniu mikroskopu (Olympus IX73) ir analizuojama QCapture programa.

3 lentelė. Galutinės menformino hidrochlorido ir metformino hidrochlorido koncentracijos, 24 val. hipoksija

su 1 val. preinkubacija.

100 10 2 10

250 10 3 10

- 10 - 10

2.5.4. Eksperimentinis neuronų kultūros preinkubacijos-hipoksijos-reoksigenacijos modelis Naudojama žiurkės smegenėlių mišri, 4-ių parų, neuronų kultūra, pasėta 24-ių šulinėlių lėkštelėse. Mišri neuronų-glijos kultūra buvo papildyta iki 37 ºC temperatūros 10 Mm fenformino hidrochlorido ir 1 M 2-deoksi-D-gliukozės (2-DG) arba 100 mM metformino hidrochlorido ir 1 M 2-DG tirpalu (galutinės koncentracijos šulinėliuose pateiktos 4 lentelėje). 24-ių šulinėlių lėkštelės yra laikomos inkubatoriuje (HERAcell 150i) 37 ºC temperatūroje, atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2 dujomis. Po 1 valandos lėkštelės perkeliamos į hipoksijos kamerą ir laikomos 37 ºC

temperatūroje, papildytoje 93 proc. N2 dujų, 5 proc. CO2 dujų ir 2 proc. O2 dujų mišiniu. Po 24

valandų lėkštelės perkeliamos į inkubatorių ir po 6 valandų inkubacijos mišri neuronų-glijos kultūra fotografuojama invertuotu fluorescenciniu mikroskopu (Olympus IX73) ir analizuojama QCapture programa.

(26)

preinkubacija, 24 val. hipoksija ir 6 val. reoksigenacija.

100 10 2 10

250 10 3 10

- 10 - 10

2.5.5. Žiurkės smegenėlių mišrios neuronų kultūros terpių keitimo modelis

Naudojama žiurkės smegenėlių mišri 4-ių parų neuronų kultūra, pasėta 24-ių šulinėlių lėkštelėse. Iš 24-ių šulinėlių lėkštelių apatinių šulinėlių pašalinama mišri neuronų-glijos kultūros terpė, kuri saugoma 4 ºC temperatūroje. Višutinių šulinėlių mišri neuronų-glijos kultūros terpė papildoma iki 37 ºC temperatūros 10 mM fenformino hidrochlorido ir 1 M 2-deoksi-D-gliukozės (2-DG) arba 100 mM metformino hidrochlorido ir 1 M 2-DG tirpalu (galutinės koncentracijos šulinėliuose pateiktos 5 lentelėje). 24-ių šulinėlių lėkštelės yra laikomos inkubatoriuje (HERAcell 150i) 37 ºC temperatūroje, atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2 dujomis. Po 1 valandos lėkštelės

perkeliamos į hipoksijos kamerą ir laikomos 37 ºC temperatūroje, papildytoje 93 proc. N2 dujų, 5

proc. CO2 dujų ir 2 proc. O2 dujų mišiniu. Po 24 valandų šulinėlių pašalinama mišrios neuronų

kultūros terpė, kuri pakeičiama apatiniuose šulinėliuose buvusia, iki 37 ºC temperatūros pašildyta, ląstelių kultūros terpe. Lėkštelės laikomos inkubatoriuje (HERAcell 150i) 37 ºC temperatūroje, atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2 dujomis ir po 6 valandų mišri neuronų-glijos

kultūra fotografuojama invertuotu fluorescenciniu mikroskopu (Olympus IX73) bei analizuojama

QCapture programa.

preinkubacija, 24 val. hipoksija ir 6 val. reoksigenacija, terpių keitimas.

250 10 3 10

250 - 3 -

- 10 - 10

2.6. Ląstelių žūties pobūdžio nustatymas

24-ių šulinėlių lėkštelės buvo papildomos 0,01 µM bisbenzimido H33343 trihidrochlorido (Hoechst 33343) vandeniniu tirpalu ir 0,01 µM propido jodido vandeniniu tirpalu. Ląstelės fotografuojamos invertuotu fluorescenciniu mikroskopu (Olympus IX73), naudojant 20× didinimo objektyvą, gauti vaizdai fiksuojami pasinaudojant QCapture programą. Rankiniu būdu apskaičiuojama procentinė apoptozinių ir nekrozinių ląstelių dalis nuo bendro ląstelių skaičiaus. Vaizdai analizuojami ir interpretuojami pasinaudojant ImageJ programa. Bisbenzimido H33343 trihidrochlorido (Hoechst 33343) dažai fluorescensuoja mėlynai ir leidžia identifikuoti gyvas ir apoptotines neuronų ląsteles, o propido jodido dažai fluorescensuoja raudonai ir leidžia identifikuoti nekrotines neuronų (3 pav.).

(27)

3 pav. Bisbenzimido H33343 trihidrochlorido (Hoechst 33343) ir propido jodido dažų fluorescencija.

Pateikta mišrios neuronų-glijos kultūros kontrolinė grupė laikyta 24 val. normoksijos sąlygomis.

2.7. Statistinė duomenų analizė

Eksperimentinių duomenų, mažiausiai trijų nepriklausomų atvejų, vidurkiai pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Duomenys statistiškai palyginti tarpusavyje pagal dviejų (ir daugiau) nepriklausomų imčių kiekybinių kintamųjų vidutines reikšmes, kurioms pateikti buvo naudota vienfaktorinė dispersinė analizė (ANOVA), paremta Tjukio kriterijumi (visos grupės palygintos tarpusavyje). Skirtumai tarp eksperimentinių duomenų vidurkių buvo laikomi statistiškai patikimais, jei reikšmingumo lygmuo p < 0,05. Statistinė analizė atlikta naudojant SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc., JAV) ir SPSS statistinį paketą.