LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJAMEDICINOS FAKULTETAS
FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS
Dovydas Bartkus
Losartanas hipoksinėmis sąlygomis skatina chondrocitų hipertrofiją
Magistro baigiamasis darbas Vientisųjų studijų programa – medicina
Darbo mokslinis vadovas: Doc. dr. Mantas Malinauskas
2
1.
TURINYS
2. SANTRAUKA ... 4 3. SUMMARY ... 5 4. PADĖKA ... 6 5. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 6 6. SANTRUMPOS ... 7 7. SĄVOKOS ... 8 8. ĮVADAS... 99. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
10.1 Hialininės kremzlės struktūra ... 11
10.2 Kremzlės pokyčiai uždegiminių sąnario būklių metu ... 12
10.3 Hipoksijos poveikis chondrocitams ... 13
10.4 Vietinio poveikio RAS sistema hialininėje kremzlėje ... 14
10.5 AngII receptorių blokatorius losartanas ... 15
11. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 17
11.1 Chondrocitų išskyrimas ... 17
11.2 Ląstelių kultivavimas ... 18
11.3 Ląstelių skaičiavimas ... 19
11.4 Ląstelių šaldymas. ... 20
11.5 Eksperimento modelis ... 21
11.5.1 Chondrocitų išsėjimo tankio parinkimas ... 21
11.5.2 Ląstelių gyvybingumo vertinimas su tripano mėliu ... 21
11.5.3 Ląstelių gyvybingumo vertinimas su kalceinu ir etidžio homodimeru-1 fluoresenciniu metodu ... 22
11.5.4 Hipoksinių sąlygų sukėlimas su kobalto (II) chloridu ... 23
3
11.5.6 Losartano poveikis kobalto (II) chlorido sukeltai hipoksijai ... 24
11.5.7 Ląstelių lizavimas viduląstelinių baltymų išskyrimui... 25
11.5.8 Mėginių tyrimas imunofermentiniu metodu... 26
11.5.9 Proteinų ekspresijos įvertinimas Bradfordo metodu ... 27
11.5.10 HIF1-α ekspresijos įvertinimas imunofermentinės analizės metodu [30] ... 27
11.5.11 Kol X ekspresijos įvertinimas imunofermentinės analizės metodu [31] ... 28
11.5.12 Statistinė analizė ... 29
12. REZULTATAI ... 30
12.1 Ląstelių išsėjimo tankio įtaka proliferacijai ir gyvybingumui ... 30
12.1.1 Gyvybingumo vertinimas Tripano mėliu ... 30
12.1.2 Gyvybingumo vertinimas kalceinu ir etidžio homodimeru-1 ... 31
12.2 Kobalto (II) chlorido sukeltos hipoksijos įtaka ląstelių gyvybingumui ... 33
12.3 Losartano poveikio įtaka ląstelių gyvybingumui ... 34
12.4 Losartano poveikis CoCl2 veikiamų chondrocitų gyvybingumui ... 35
12.5 Losartano poveikis CoCl2 veikiamų chondrocitų HIF1-α ekspresijai... 40
12.6 Losartano poveikis CoCl2 veikiamų chondrocitų Kol X ekspresijai ... 42
13. REZULTATŲ APTARIMAS ... 45
14. IŠVADOS ... 47
4
2. SANTRAUKA
Autorius: Dovydas Bartkus
Darbo pavadinimas: Losartanas hipoksinėmis sąlygomis skatina chondrocitų hipertrofiją
Darbo tikslas: ištirti losartano poveikį kremzlės hipertrofijai, auginant žmogaus kelio sąnario kremzlės chondrocitų monosluoksnį hipoksinėmis sąlygomis.
Uždaviniai: nustatyti teisingą chondrocitų išsėjimo tankį ir tinkamas CoCl2 ir losartano koncentracijas,
naudojamas sekančiuose tyrimo etapuose. Ištirti 10-9, 10-6, 10-4 M CoCl2 poveikį chondrocitų hipoksijos
sukelto faktoriaus 1 – α (HIF1-α), kolageno X (Kol X) ekspresijai ir ląstelių gyvybingumui, kartu naudojant arba kitu atveju nenaudojant 10-7 M losartano tirpalą.
Metodai: naudoti žmogaus kelio sąnario kremzlės chondrocitai. Tinkamas išsėjimo tankis įvertintas ištyrus 1000, 2000, 5000 ląst./0,32 cm2 tankiu išsėtų chondrocitų gyvybingumą 0,4% tripano mėliu,
kalceinu ir EthD-1 po 1 ir 10 dienų. CoCl2 poveikis įvertintas ištyrus ląstelių gyvybingumą veikiant 10 -4 - 10-12 M tirpalais po 1 ir 10 dienų. Analogiškai įvertintas losartano poveikis. Toliau tirta CoCl
2 10-9,
10-6, 10-4 M įtaka, naudojant ir kitu atveju nenaudojant 10-7 M losartano tirpalą. Vertinta įtaka ląstelių
gyvybingumui (kalceino ir EthD-1 metodas), HIF1-α ekspresijai po 1 ir 10 dienų ir įtaką Kol X ekspresijai po 1, 6, 10 dienų įvertintą ELISA.
Rezultatai: Tiriant chondrocitus in vitro, geriausiai proliferavo 5000 ląst./0,32 cm2 išsėtos ląstelės. Atsižvelgiant į ląstelių gyvybingumą, atrinktos 10-9, 10-6, 10-4 M CoCl
2 koncentracijos ir 10-7 M
losartano. Stebėta tendencija, jog losartanu paveiktos ląsteles ekspresavo mažiau HIF1-α viso tyrimo metu. Kol X ekspresija po 2 dienų buvo mažesnė grupėse paveiktose losartanu, po 6 dienų – didesnė grupėse veiktose losartanu, po 9 dienų – grupėse, paveiktose 10-4, 10-6 M CoCl
2 ir losartanu buvo
mažesnė. Dažant ląsteles kalceinu ir EthD-1, po 1 dienos nuo tyrimo pradžios visose tiriamosiose grupėse paveiktose losartanu gautas reikšmingai didesnis ląstelių skaičiaus. Po 10 dienų lyginant C10-4 ir LC10-C10-4 grupes, gavusioje losartano tirpalo, ląstelių buvo daugiau, kitose grupėse reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolės arba buvo mažiau.
Išvados: losartanas geriausiai slopina HIF1-α ekspresiją chondrocituose kai CoCl2 koncentracija - 10-4
5
3. SUMMARY
Author: Dovydas Bartkus
Title: Losartan Induces Chondrocyte Hypertrophy under Hypoxic Conditions
Aim of the study: to evaluate losartan induced chondrocyte hypertrophy, by cultivating human knee chondrocytes in a monolayer cell culture under hypoxic conditions.
Objectives: to determine an optimal density for cultivating chondrocytes and the appropriate concentrations of CoCl2 and losartan to be used in the study. To investigate the effect of 10-9, 10-6, 10-4
M CoCl2 on chondrocyte hypoxia-induced factor 1 – α (HIF1-α), collagen X (Col X) expression and cell
viability with or without the use of losartan 10-7 M.
Methods: the study used human knee cartilage chondrocytes. Adequate chondrocyte density was assessed by evaluating the viability of cells cultivated at 1000, 2000, 5000 cells/0,32 cm2 densities using
0,4% trypan blue, calcein and EthD-1 stains after 1 and 10 days of cultivation. The effect of CoCl2 was
tested by evaluating viability of chondrocytes treated with 10-4 – 10-12 M solutions after 1 and 10 days. Similarly, the effect of losartan was evaluated. The effect of CoCl2 10-9, 10-6, 10-4 M was further
investigated with and without the use of 10-7 M losartan solution by examining the effect on cell viability
(calcein and EthD-1 method), HIF1-α expression after 1 and 10 days and the effect on Col X expression after 1, 6, 10 days using ELISA.
Results: The best chondrocyte cultivating density is 5000 cells/0,32 cm2. Based on cell viability concentrations of 10-9, 10-6, 10-4 M CoCl2 and 10-7 M losartan were selected for further study. Losartan
treated cells expressed less HIF1-α throughout the study. After 2 days, Col X expression was lower in all losartan treated groups, after 6 days it was higher in all losartan treated groups, after 10 days 10-4, 10
-6 M CoCl
2 groups treated with losartan expressed less Col X. After evaluating stained cells with calcein
and EthD-1 on day 1 resulted in significantly higher cell count in groups treated with losartan. After 10 days the only comparison between groups C10-4 and LC10-4 resulted in a significantly higher cell count, while other groups did not.
Conclusion: losartan suppresses HIF1-α expression the most in chondrocytes treated with CoCl2 10-4 M
solution. Meanwhile Col X expression was the highest in chondrocytes treated with losartan and CoCl2
6
4. PADĖKA
Dėkoju baigiamojo magistro darbo vadovui doc. dr. Mantui Malinauskui už suteiktą galimybę atlikti praktinį tiriamąjį darbą mokslinėje laboratorijoje, už visokeriopą pagalbą ir patarimus rengiant šį darbą. Be to esu dėkingas doc. dr. Linai Jankauskaitei už suteiktas pastabas.
5. INTERESŲ KONFLIKTAS
7
6. SANTRUMPOS
AKF – angiotenziną konvertuojantis fermentas Ang – angiotenzinas
AngI – angiotenzinas I AngII – angiotenzinas II
ARB – angiotenzino II receptorių blokatorius AT1R – angiotenzino II 1 tipo receptorius AT2R – angiotenzino II 2 tipo receptorius ECM – ekstraceliulinis matriksas
EthD-1 – etidžio homodimeras 1 PCM – periceliulinis matriksas HIF – hipoksijos sukeltas faktorius
HIF1-α – Hipoksijos sukeltas faktorus 1 – α HIF2-α – Hipoksijos sukeltas faktorus 2 – α IL – interleukinas
Kol II – II tipo kolagenas Kol X – X tipo kolagenas OA – osteoartritas
RA – reumatoidinis artritas
RAS – renino-angiotenzino sistema TGF – navikų nekrozės faktorius
8
7. SĄVOKOS
Anoksija – deguonies nebuvimas ląstelėje, audinyje. Artritas – sąnario uždegimas.
Chondrocitas – kremzlės audinio ląstelė. Chondrogeninis – kremzlinės kilmės.
Hipoksija – sumažėjęs deguonies lygis ląstelėje ar audinyje, nepasiekęs anoksijos. Osteogeninis – kaulinės kilmės.
9
8. ĮVADAS
Osteoartritas (OA) – dažniausiai diagnozuojama, lėtinė, degeneracinė sąnarių liga, nuo kurios kenčia apie 250-300 milijonų žmonių pasaulyje [1,2]. Šios būklės metu pažeidžiama sąnarinį paviršių sudaranti kremzlė, kas sąlygoja sąnario, jo priklausinių (sinovijaus, sąnarinės kapsulės ir raiščių) funkcijos sutrikimą ir gyvenimo kokybės suprastėjimą [3].
Buvo manyta, jog OA yra sukeltas su amžiumi susijusio sąnarinės kremzlės nusidėvėjimo, sąlygoto sąnariui per individo gyvenimą pakartotinai atliekant savo funkciją. Tačiau naujausiais duomenimis šios būklės priežastis yra daugiafaktorinė, apimanti mechaninius, uždegiminius ir metabolinius veiksnius [1,2,4]. Vienas iš pagrindinių faktorių skatinantis OA progresavimą yra uždegiminis ligos komponentas ir jo metu sukeltas deguonies kiekio sumažėjimas audinyje – hipoksija. Nors kremzlę sudarančios ląstelės, chondrocitai, turi prisitaikymus išgyventi hipoksinėmis sąlygomis dėl audinio kraujotakos ypatybių, artrito metu vykstantys pokyčiai sutrikdo homeostazę audinyje [2,3]. Pasikeitęs požiūris į OA kilmę suteikia galimybių rasti mechanizmą, kurį aktyvuoja hipoksinės sąlygos, ir jį blokuoti. Taip sustabdyti tolimesnį sąnarinės kremzlės irimą.
Potencialus taikinys yra renino – angiotenzino sistema (RAS). Įrodyta, jog chondrocitai ekspresuoja RAS sistemos komponentus: reniną, angiotenziną konvertuojantį fermentą (AKF), angiotenziną II (AngII), angiotenzino II – 1 ir 2 tipo receptorius (ATR1 ir ATR2) [5]. Taip pat studijomis parodyta, jog šios sistemos blokavimas palengvina OA ir kitų sąnarių uždegiminių ligų, pvz. reumatoidinio artrito (RA), progresavimą [5-7]. Nustatyta, kad AngII 1 tipo receptorių slopinimas Olmesartanu chondrocitų monosluoksnyje sumažino chondrocitų hipertrofijos žymens – kolageno X sintezę [8].
Paskelbtoje literatūroje didžiausias dėmesys yra skiriamas tiesioginiam Ang II receptorių slopinimo efektui hialininės kremzlės formavimuisi. Tačiau nėra duomenų aiškinančių AngII receptorių slopinimo efekto hipoksijos lygiui kremzlėje, kas manoma turėtų poveikį chondrocitų proliferacijos ir diferenciacijos procesams. Sąsajos tarp hipoksijos ir AngII pagrindimas, atskleistų RAS vaidmenį reguliuojant intraląstelinių baltymų ekspresiją, tokių kaip HIF1-α ar HIF2-α, žinomų kaip reguliuojančių ląstelių homeostatinius procesus hipoksijos sąlygomis. Todėl šiame tyrime bandėme nustatyti Ang II 1 tipo receptoriaus slopinimo poveikį žmogaus chondrocitų HIF1-α ir kolageno X ekspresijai.
10
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: ištirti losartano poveikį kremzlės hipertrofijai, auginant žmogaus kelio sąnario kremzlės chondrocitų monosluoksnį hipoksinėmis sąlygomis.
Hipotezė: losartanas skatina nuo AngII priklausomą chondrocitų hipertrofiją hipoksinėmis sąlygomis.
Uždaviniai:
1. Nustatyti teisingą chondrocitų išsėjimo tankį ir tinkamas CoCl2 ir losartano koncentracijas, kurios
bus naudojamos sekančiame tyrimo etape.
2. Ištirti CoCl2 poveikį chondrocitų HIF1-α ekspresijai, kartu naudojant arba kitu atveju
nenaudojant losartaną.
3. Ištirti CoCl2 poveikį chondrocitų kolageno X ekspresijai, kartu naudojant arba kitu atveju
nenaudojant losartaną.
4. Ištirti CoCl2 poveikį chondrocitų gyvybingumui, kartu naudojant arba kitu atveju nenaudojant
losartaną.
11
10. LITERATŪROS APŽVALGA
10.1 Hialininės kremzlės struktūra
Kremzlė – mezoderminės kilmės specializuotas jungiamojo audinio tipas [9]. Iš visų kremzlės audinio potipių hialininė kremzlė organizme yra dažniausia [3,9,10]. Ji atlieka laikino skeleto rolę embriogenezės metu, kol yra palaipsniui pakeičiama kauliniu audiniu [9,10]. Nors suaugusio individo organizme hialininė kremzlė aptinkama šonkaulių lankuose, kvėpavimo takų organų (pvz. trachėjos) sienelėse, tačiau pagrindinė hialininės kremzlės funkcija - suteikti lygų, suteptą, mažos trinties paviršių sąnario judesio metu ir perduoti mechaninį krūvį po sąnarine kremzle esančiam kauliniam audiniui [10].
Šio vaidmens užtikrinimui kremzlei yra būdinga labai organizuota audinio struktūra [10]. Išskiriamos keturios zonos: paviršinė, vidurinė (pareinamoji), gilioji (radialinė), kalcifikuota zona. Jos viena nuo kitos skiriasi vienintelių kremzlę sudarančių ląstelių – chondrocitų – fenotipu, ekstraceliuliniu matrikso (ECM) struktūra [10,11].
ECM sudaro dvi makromolekulių grupės: kolageniniai baltymai ir nekolageniniai. Pagrindinė makromolekulė ECM yra II tipo kolagenas (Kol II), jis sudaro >80 – 95% viso kolageno [3,9-12]. Nors kiti kolageno tipai (I, IV, V, VI, IX ir XI) sudaro tik mažąją audinio ECM dalį, jie padeda palaikyti Kol II suformuotą skaidulų tinklą ir atlaikyti kremzlei mechaninius krūvius [9-11]. X tipo kolagenas (Kol X) sveikoje suaugusio žmogaus kremzlėje yra aptinkamas kalcifikuotame kremzlės sluoksnyje. Jį sintezuoja tik ten esantys hipertrofavę chondrocitai [10,12]. Didžiausią dalį tarp nekolageninių baltymų ECM sudaro proteoglikanai, tarp kurių dažniausias agrekanas (iki 90% proteoglikanų). Proteoglikanai, kartu veikdami su kolageno skaidulų tinklu užtikrina kremzlės biomechanines savybes [9-12].
Pasiskirstę po kremzlę, chondrocitai sudaro iki 1-5% kremzlės tūrio [9-12]. Šių ląstelių pirmtakai – chondroblastai, kurie turi gerai išvystytus šiurkščiuosius endoplazminius tinklus ir Goldžio apartus, sąnario vystymosi metu atsako už ECM sintezę [9,13]. Chondroblastams atlikus savo funkciją, jie pasidalija ir diferencijuoja į chondrocitus, kurie nepasižymi mitotiniu aktyvumu. Šios ląstelės suaugusio organizmo sąnarinėje kremzlėje lieka atsakingos už ECM pažaidų taisymą [3,9,11]. Taip pat kremzlinis audinys ypatingas tuo, jog neturi kraujagyslių, limfagyslių ir inervacijos [9,10,12]. Chondrocitų mityba kremzlėje priklauso nuo difuzijos būdu gaunamų medžiagų iš gretimų audinių [9,11,12]. Pagrindinis šaltinis – sinovijaus skystis, kurį gamina sąnario sinovijų sudarančios ląstelės. Tai kraujo plazmos ultrafiltratas, sudarytas iš vandens ir maisto medžiagų: gliukozės, elektrolitų ir kt. kuris
12 taip pat atneša chondrocitų išgyvenimui būtino deguonies [12]. Chondrocitai egzistuoja žemo deguonies lygio aplinkoje (hipoksijoje) ir viduląsteliniai veiksniai tokie kaip hipoksijos indukuotas faktorius HIF yra būtini palaikyti homeostazę kremzlėje ir užtikrinti ląstelių gyvybingumą. Šių faktorių visuma nulemia, jog chondrocitai negali atkurti didelių sąnarinės kremzlės defektų ir net ilgainiui per individo gyvenimą netenka savybės atkurti mažas hialininės kremzlės ydas [3].
10.2 Kremzlės pokyčiai uždegiminių sąnario būklių metu
Uždegiminių sąnarių ligų metu, tokių kaip OA ir RA, kremzlė patiria didelius struktūrinius pokyčius, nulemtus sutrikusio chondrocitų metabolizmo [2,3,9]. Šis pokytis kyla suardžius chondrocitus supantį periceliulinį matriksą (PCM), kuris riboja chondrocitų ir ECM sąveiką. PCM defektas aktyvuoja mitotiškai neaktyvius chondrocitus ir sukelia jų nenormalią pro uždegiminių ir katabolinių faktorių ekspresiją. Tai lemia kremzlės ECM pažeidimą ir ligos progresavimą [10].
Iš pradžių, OA metu kremzlės ląstelės demonstruoja padidėjusį sintetinį aktyvumą, traktuojamą kaip bandymą atkurti normalią hialininės kremzlės struktūrą [3,14,15]. Studijos parodė padidėjusią Kol II ir proteoglikanų ekspresiją mRNR ir baltymų sintezės lygyje. Taip pat pastebėta, kad metabolinis pokytis ankstyvųjų OA stadijų metu įvyksta ne tik pažeistame sąnariniame paviršiuje – paviršiniame kremzlės sluoksnyje, bet ir gilesniuose sluoksniuose [9]. Tačiau, šie procesai sustoja ir yra nuslopinami disreguliuotos ląstelės veiklos, dėl gausybės faktorių: PCM pažeidimo, ECM irimo produktų, biomechaninio krūvio persiskirstymo sąnaryje, neadekvataus chondrocitų paviršinių receptoriaus sąveikos, sutrikusio citokinų ir augimo faktorių pasiskirstymo ECM ir pačių chondrocitų gaminamų baltymų. Dėl šių veiksnių chondrocitai netenka savo fenotipo ir normalios reguliuojamos genų ekspresijos [15]. Iš pradžių, jie pradeda sintezuoti daugybę ECM ardančių fermentų, kaip metaloproteinzes, agrekanazes ir kt. Šie baltymai sveikoje kremzlėje atsako už normalią kremzlės struktūros remodeliaciją. OA metu jų pagrindinis taikinys didžiausią ECM dalį sudarantis proteinas Kol II ir proteoglikanas agrekanas [9,10,15]. Jų irimo produktams iš pažeidimo židinių patekus į sinovijaus skystį aktyvuojamas uždegiminis atsakas visoje sąnario kremzlėje, ląstelės gamina prožudegimines medžiagas: interleukiną-1β (IL-1β) ir navikų nekrozės faktorių alfą (TNF-α). Šios skatina kitų prouždegiminių citokinų (IL-6, IL-8, IL-17, IL-18) sintezę [10,14].
Pažengusio OA metu aptinkami su chondrocitų hipertrofija ir dediferenciaciją susiję genų ekspresijos produktai, tokie kaip HIF, Kol X, kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF),
13 metaloproteinazė 13. Pirmiausia šie produktai aptinkami kremzlės giliausiuose sluoksniuose, kur aprūpinimas deguonimi yra prasčiausias [2,3,15,16]. Taip pat pastebima padidėjusi ląstelių žūtis, kuri manoma yra sukelta chondrocitų programuotos žūties – apoptozės. Šis procesas OA metu yra prilyginimas kaulų endochondrinei osifikacijai, kuomet būsimojo kaulo karkasą sudaro greitai besidalijančios ląstelės, chondrocitų pirmtakai. Giliausiai būsimajame kaule esančios, į chondrocitus panašios ląstelės, dėl maisto medžiagų ir deguonies stygiaus dalis vykdo apoptozę arba kitą procesą – autofagiją, taip palieka ertmes besimineralizuojančiame kaule įaugti būtinoms kraujagyslėms [16]. Kita dalis ląstelių hipertrofuoja, diferencijuoja į kaulines ląsteles ir skatina aplinkinio ECM mineralizavimą kalcio druskomis [16,17]. Visi šie pokyčiai skatina kalcifikuotos kremzlės zonos plėtimąsį, sąnario biomechaninių savybių netekimą ir ligos progresavimą [2,15].
10.3 Hipoksijos poveikis chondrocitams
Dėl padidėjusio chondrocitų katabolinio aktyvumo OA metu, vykstančio uždegiminio proceso ir organizmo nesugebėjimo kompensuoti šiuos procesus, sąnaryje sutrinka kremzlės ląstelių aprūpinimas deguonimi [15,18]. Mokslininkų grupės yra patvirtinusios hipotezę, jog uždegiminiame sąnaryje yra hipoksinės sąlygos. Jos aktyvuoja pagrindinio ląstelės deguonies pusiausvyrą valdantį veiksnį HIF. Jis pritaiko kremzlės ląsteles prie sumažėjusio deguonies kiekio, pakeisdamas ląstelių metabolizmą ir leidžia išgyventi mažai deguonies turinčioje aplinkoje [18]. Yra 2 HIF-α tipai: HIF-1α ir HIF-2α, jie hipoksijos sąlygomis kremzlėje turi skirtingas funkcijas [19].
HIF-1α ekspresija į deguonies koncentracijos pokyčius ląstelėje reguliuojama netiesiogiai per nuo deguonies priklausomas prolilhidroksilazes 1-3 ir asparagininę hidroksilazę. Šie fermentai inhibuoja HIF-1α ekspresiją. Hipoksinėmis sąlygomis hidroksilazių aktyvumas yra slopinamas, ir HIF-1α subvienetai pernešami į ląstelės branduolį, kur kartu su HIF-1β ir kitais kofaktoriais prisijungia prie specifinių DNR sekų ir taip reguliuoja ląstelės atsaką į sumažėjusį deguonies kiekį [18,19]. OA pradžioje padidėjęs HIF-1α kiekis reguliuoja SOX9 geno ekspresija, kuris skatina chondrogenezę. Taip pat didėja Kol II ir agrekano genų ekspresiją, kas skaitina ECM sintezę dediferencijavusiuose chondrocituose. Be šio veikimo, HIF-1α adaptuoja ląstelę prie hipoksinių sąlygų, efektyvindamas anaerboinę glikolizę ir leisdamas užtikrinti adekvatų ATP lygį ląstelėje, slopinti katabolinių fermentų, kurie ardo ECM sintezę. Taipogi slopinama ląstelių proliferacija ir kaspazių bei autofagijos fermetų veikla, kas apsaugo ląstelę nuo išankstinės mirties [19].
14 Priešingo veikimo yra HIF-2α. Jo veikla, kaip ir HIF-1α, reguliuojama nuo deguonies koncentracijos priklausomų fermentų hidroksilazių, labiausiai prolilhidroksilazės 2 ir hipoksijos metu seka panašiu veikimo mechanizmu, kol prisitvirtina prie ląstelės branduolyje esančių specifinių DNR sekų promotorių, skatindamas šių genų ekspresiją. Vienas iš HIF-2α ekspresijos rezultatų – aktyvuojama endochondrinė osifikacija kremzliniame audinyje. Be to ląstelėje padidėja apoptozės ir autofaginių fermentų aktyvumas ir VEGF sintezė. Taip pat skatinama aktyvi ECM matrikso sintezė, tik skirtingai nuo HIF-1α aktyvuojamos ECM sintezės, pagrindinis produktas yra Kol X ir metaloproteinazės, kurios skaido Kol II. Šie pokyčiai prisideda prie OA progresavimo [19].
10.4 Vietinio poveikio RAS sistema hialininėje kremzlėje
Nuo pirmo renino identifikavimo 1898 metais, RAS sistema yra tyrinėjama intensyviai. Iš pradžių pastebėta, jog RAS yra sisteminė kardiovaskulinės homeostazės sistema. Tačiau dabar yra patvirtinta, jog RAS sistemos komponentai (reninas, AKF, Ang, AT1R ir AT2R) ekspresuojami lokaliai skirtinguose organizmo audiniuose, juose veikia nepriklausomai nuo sisteminės RAS poveikio ir kiekviename iš jų atlieka skirtingą funkciją [20]. RAS sistemos komponentai yra aptikti muskuloskeletinėje sistemoje, įskaitant ir sąnarinę kremzlę [5-7,20,21]. In vitro ir in vivo studijose pastebėta, kad įvairių šios sistemos veiksnių pusiausvyros pokyčiai įtakoja uždegiminių būklių metu vykstančius sąnarių kremzlės pakitimus [5-7,20-22].
Reninas – proteazė, kuri katalizuoja angiotensinogeno konvertavimą į AngI [5]. Vyraujanti nuomonė, jog renino lygiai uždegiminių sąnarių ligų metu organizme nuo sveikų individų reikšmingai nepakinta, tačiau yra aptinkama padidėjusi jo koncentracija sinoviumo gaminamame skystyje [5,7]. Gyvūninėse studijose parodyta, kad paveikus chondrocitus aliskirenu, medžiaga blokuojančia aktyvaus renino produkciją, krenta renino koncentracija. Be to reikšmingai sumažėja prouždegiminių citokinų (IL-1 ir TNF-α) lygiai ir kitų RAS sistemos komponentų koncentracijos [5].
AKF katalizuoja AngI virtimą į AngII ir yra vienas iš dažniausiai tyrinėjamų RAS komponentų kremzliniame audinyje [5]. Ne viena in vivo studija yra parodžiusi, jog panaudojus AKF inhibitorių kaptoprilį, sumažėja OA intensyvumas. Taip pat pastebėta, jog apsauginis poveikis sąnario kremzlei nuo tolimesnio uždegimo progresavimo nėra vienintelis. Kaptoprilio veikiamose chondrocitų grupėse, hipertrofiški chondrocitai dediferencijuoja atgal į ląsteles primenančias chondrocitus [5-7,22].
15 AngII svarbiausias RAS sistemos veiksnys. Jis be dalyvavimo sisteminėje RAS, veikia įvairiuose uždegiminiuose procesuose ir aktyvuodamas savo receptorius AT1R ir AT2R reguliuoja ląstelių proliferaciją ir apoptozę, stimuliuoja augimo faktorių sintezę. Iš AngII receptorių AT1R yra laikomas pagrindiniu ir specifiškiausiu AngII, o AT2R gali būti aktyvuojamas ne tik AngII, bet ir kitų angiotenzinų [5]. Manoma, jog būtent AT1R aktyvacija chondrocituose sukelia OA progresavimą, dėl chondrocitų dediferenciacijos, hipertrofijos ir angiogenezės aktyvacijos [5-7,21]. In vitro studijoje, veikiant chondrocitų kultūras AngII, rasta, jog grupėje paveiktoje AngII sumažėjo chondrocitų gyvybingumas, sumažėja proteoglikanų, agrekano, sintezė. Pratęsus studiją in vivo sąlygomis pastebėta, jog AngII injekcijos į sąnario ertmę sukėlė OA būdingus pradinius pokyčius – kremzlė neteko proteoglikanų, suiro griežta sąnarinės kremzlės struktūra, padidėjo chondrocitų žūvimas [6]. Šie aprašyti AngII efektai sąnarinei kremzlei silpnėja, kai studijose yra tiriamoji grupė, kurioje yra panaudota medžiaga, blokuojanti bent vieną RAS komponentą. Daugiausiai dėmesio literatūroje be AKF inhibitorių skiriama ARB, tokiems kaip losartanas [5-7,20-21].
10.5 AngII receptorių blokatorius losartanas
Losartanas – nuo 1990 metų pirmasis visuomenei prieinamas, ne baltyminis specifinis AT1R antagonistas, skirtas slopinti RAS. Veiklioji medžiaga yra gaunama modifikavus imidazolo-5-acetatinės rūgšties derivatus, sudarant losartano kalio druską [23].
Pagrinde šis ARB blokatorius vartojamas arterinio kraujo spaudimo korekcijai ir širdies funkcijos nepakankamumo kontrolei. Dažniausiai paskiriamas tiems pacientams, kurie netoleruoja AKF inhibitorių. Rečiau šis vaistas naudojamas insulto profilaktikai, esant kairiojo širdies skilvelio hipertrofijai, ir diabetinės nefropatijos gydyme. Taip pat atliktos studijos išeičių po persirgto miokardo infarkto gerinimui [24].
Patekęs į organizmą losartanas yra greitai absorbuojamas iš virškinamojo trakto, maksimalią koncentraciją pasiekia per 1-2 val. nuo dozės. Jis yra metabolizuojamas citohromo peroksidazių (CYP) 450 sistemos kepenyse į tarpinį junginį EXP3179, kuris paverčiamas aktyviuoju metabolitu EXP3174 (14% pradinės losartano dozės). Pagrindiniai CYP 450 fermentai dalyvaujantys šiuose procesuose 3A4, 2C9, 2C10. Susidaręs aktyvus metabolitas pasižymi nuo 10 iki 40 kartų stipresniu efektu, negu losartano kalio druska [23,24]. Tačiau tiek pačio losartano, tiek jo aktyvus metabolito EXP3174, inhibicinė koncentracija, kuomet AngII poveikis sumažėja perpus (IC50) yra nM lygyje. Losartano ir jo aktyvaus
16 metabolito EXR3174 pusperiodžiai yra 1,5-2,5 val. ir 3-9 val., atitinkamai [24]. Losartanas nepakitęs ir kaip aktyvus metabolitas iš organizmo yra šalinamas pro inkstus, ir išmatomis su tulžimi [23,24].
17
11. TYRIMO METODIKA IR METODAI
11.1 Chondrocitų išskyrimas
Tyrime naudoti chondrocitai, išskirti iš žmogaus kelio sąnario kremzlės. Hialininės kremzlės bioptatai, buvo paimami iš pacientų artroskopinės kelio sąnario operacijos metu. Bioetikos leidimas darbui su žmogaus audiniais buvo gautas Nr. P1-BE-2-22/2016.
Iš operacinės, kurioje buvo paimta medžiaga, sąnarinės kremzlės gabaliukai pergabenti specialiai prieš tai laboratorijoje paruoštoje mitybinėje terpėje (MT), kuri turi visų reikalingų medžiagų palaikyti chondrocitų gyvybingumą iki ląstelių išskyrimo ir kultivavimo. MT paruošta naudojant DMEM (angl. Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium; Gibco, JAV), praturtinus 10% galvijų vaisiaus serumu (FBS) (angl. Fetal Bovine Serum; Gibco, JAV). Kremzlės transportavimui naudota 10% MT buvo laikoma 2-4oC temperatūroje prieš transportavimą ir jo metu.
Atgabenta hialininė kremzlė laminare, sterilių įrankių pagalba, mechaniškai atskiriama nuo pašalinių audinių ir susmulkinama į mažesnius gabalėlius. Jie toliau buvo apdoroti naudojant fermento proteazės tirpalą ir inkubuoti 1 val. 37 oC temperatūroje drėkiname inkubatoriuje5% CO
2 atmosferos
sąlygomis. Paskui kremzlė perkeliama į kolagenzės tirpalą ir paliekama 16 val. inkubatoriuje (1 pav.). Fermentų suvirškinta kremzlės neutralizuojama MT ir centrifuguojama. Nucentrifuguotos ląstelės yra skaičiuojamos - įvertinamas jų gyvybingumas - suskaičiuojamos gyvos ląstelės.
Po kremzlės išskyrimo gyvos ląstelės perkeliamos į 25 cm2 flakoną, skirtą auginti ląstelių
kultūroms, su 4 mL 37oC mitybinės terpės. Ant flakono užrašomas išskyrimo rezultatas – nulinio pasažo
ląstelės (P0). Po išskyrimo ląstelės mikroskopuojamos ir inkubuojamos tolimesniam augimui monosluoksnyje (t=37oC, 5% CO2).
18
1 pav. Chondrocitų migravimas. Stebimi chondrocitai (A), atsiskiriantys nuo mechaniškai
susmulkintos ir fermentų paveiktos kremzlės bioptato (B).
11.2 Ląstelių kultivavimas
Išskirtos ląstelės auga adherentiškai, monosluoksniu ir buvo toliau kultivuojamos. Kas 72 val. iš flakono nutraukiama ir pakeičiama 37oC temperatūros MT, ląsteles praplaunant su tokiu pačiu kiekiu
fosfatinio buferio (PBS), kurio sudėtyje yra kalcio ir magnio druskų. Ląstelės po kiekvieno MT pakeitimo buvo mikroskopuojamos, ir vertinamas jų tankis.
Tankiui flakone pasiekus 80-90%, ląstelės buvo retinamos. Jo metu nutraukiama MT, ir ląstelės praplaunamos tokiu pačiu kiekiu PBS, neturinčio kalcio ir magnio druskų. Atlikus praplovimą, ant ląstelių užpilamas toks pat kiekis, kiek buvo MT flakone, tripsino tirpalo (TrypLE Express; Gibco; JAV) ir inkubuojama 8 min. 37oC temperatūroje. Chondrogeninių ląstelių atsiskyrimas nuo flakono dugno vertinamas šviesiniu mikroskopu (2 pav.). Gauta ląstelių suspensija yra perkeliama į sterilų mėgintuvėlį, kur tripsino tirpalas yra nukenksminamas tokiu pat kiekiu MT. Po to mėgintuvėlis, su jo turiniu, yra centrifuguojami 300 G greičiu 10 min. 37oC temperatūroje. Pašalinus supernatantą, ant nusėdusių ląstelių užpilama 1 mL MT, švelniai išmaišoma, ir iš gautos suspensijos apskaičiuojamas ląstelių skaičius. Ląstelės, priklausomai nuo tankio, yra arba perkeliamos į 75-182,5 cm2 flakoną (1 cm2 =
5000-B A
19 10000 ląstelių), su atitinkamu kiekiu MT, kad padengtų flakono dugną ir inkubuojamos, arba yra šaldomos naudojimui ateityje. Atliktuose eksperimentuos naudotos P1-P4 pasažų ląstelės.
2 pav. Nuo flakono dugno atsiskyrusios ląstelės. Šviesiniu mikroskopu matomos plaukiojančios,
ląstelės.
11.3 Ląstelių skaičiavimas
Retinimo procedūros metu, iš gautos MT ir ląstelių suspensijos nutraukiama 100 µL mišinio ir perkeliama į atskirą mėgintuvėlį. Į šį mėgintuvėlį, užlašinama 400 µL 0,4% tripano mėlio. Mišinys sumaišomas, nutraukiama 10 µL. Šiuo nauju ląstelių ir tripano mėlio mišiniu yra užpildoma Neubauerio kamera. Pasinaudojant šviesiniu mikroskopu, yra vertinamas ląstelių skaičius ir gyvybingumas (3 pav.). Suskaičiuojamos visos ląstelės kampiniuose kameros kvadrantuose. Neįskaičiuojamos ląstelės, kurios liečia arba yra už kvadrantų ribų. Tai atliekamas per 3-5 min. nuo sumaišymo su tripano mėlio tirpalu. Ilgesnis inkubavimo laikotarpis lemia ląstelių mirtį ir iškreiptus skaičiavimo rezultatus [24].
Metodas paremtas, jog gyvos ląstelės turi vientisas plazmines membranas, kas neleidžia įvairioms medžiagoms, įskaitant ir naudojamam dažui – tripano mėliui, patekti į ląstelę. Todėl gyvos ląstelės nenusidažo. Negyvos ląstelės, nepaisant ląstelės mirties mechanizmo, vientisų membranų neturi ir negali sustabdyti tripano mėlio patekimo – nusidažo mėlynai [25].
20
3 pav. Ląstelių skaičiavimas Neurbauerio kameroje. A – Neurbauerio kameros schema, kurios pilka
spalva pažymėtų kvadrantų ribose skaičiuojamos ląstelės. B – mikroskopinis Neurbauerio kameros vaizdas vertinant ląstelių gyvybingumą: nenusidažiusios ląstelės – gyvos (apvesta punktyrinė linija),
nusidažiusios mėlynai - negyvos (apvesta ištisinė linija) [25].
Pagal nenusidažiusių ir nusidažiusių ląstelių skaičių apskaičiuojama gyvų ir negyvų ląstelių dalis. Ląstelių koncentracijai suspensijoje apskaičiuoti naudojama formulė [24]:
𝐿𝐾 =𝐿𝑆 × 10 000 𝐾𝑆 × 𝑆𝑆 =
𝐿𝑆 × 10 000 4 × 𝑆𝑆
LK – ląstelių koncentracija (ląstelės/ml) , LS – ląstelių skaičius visuose Neurbauerio kameros kvadrantuose (vnt.), KS – suskaičiuotų kvadrantų skaičius Neurbauerio kameroje (visada buvo skaičiuojami visi 4 kvadrantai), SS – ląstelių suspensijos ir 0,4% tripano mėlio skiedimo santykis.
11.4 Ląstelių šaldymas.
Suskaičiavus ląsteles, ir nusprendus jas šaldyti, pasiruošiamas atitinkamas kiekis šaldymo medijos (1 mln. šaldomų ląstelių = 1 mL šaldymo medijos). Ji susideda iš 90% FBS ir 10% dimetilsulfoksido, kuris neleidžia užšaldytose ląstelėse susidaryti ledo kristalams, galintiems pažeisti ląsteles. Pakartotinai centrifuguojama ląstelių suspensija 300 G greičiu 10 min. 4oC temperatūroje.
Nutraukiamas supernatantas ir užpilama šaldymo medija. Mišinys atsargiai išmaišomas ir perkeliamas į
21 šaldymui skirtą mėgintuvėlį. Šis mėgintuvėlis įdedamas į specialią talpyklą ir perkeliamas į -80oC
šaldiklį.
11.5 Eksperimento modelis
11.5.1 Chondrocitų išsėjimo tankio parinkimas
Siekiant, kad natūralus ląstelių augimas ir proliferacija, turėtų kuo mažesnę įtaką galutinio eksperimento, kurio metu simuliuojamos OA primenančios hipoksinės sąlygos ir AngII AT1R blokavimo poveikis, buvo renkamas tinkamas ląstelių išsėjimo tankis. Jam parinkti, buvo išsėti chondrocitai, trimis skirtingais tankiais 96-ių šulinėlių plokštelėje (n=3): 1000 ląst./šulinėlyje (1000 ląstelių / 0,32cm2), 2000 ląst./šulinėlyje (2000 ląstelių / 0,32cm2) ir 5000 ląst./šulinėlyje (5000 ląstelių
/0,32cm2). Ląstelės augintos drėkinamame 37oC temperatūros, 5% CO2 inkubatoriuje. Po 1 d. ir 10 d.
nuo išsėjimo vertintas ląstelių skaičius ir gyvybingumas. Tai atlikta naudojant dvejus metodus: dažant ląsteles tripano mėliu, kitas - imunuofluoresenciniu metodu su kalceinu ir etidžio homodimeru-1 (EthD-1) (L3224 LIVE/DEATH Viability/Cytotoxicity Kit, ThermoFisher Scientific, JAV).
11.5.2 Ląstelių gyvybingumo vertinimas su tripano mėliu
Pirmuoju metodu, išsėtoms kremzlinėms ląstelėms 1 d. ir 10 d. laiko taškuose, buvo nutraukta MT ir ląstelės praplautos 100 µL PBS be kalcio ir magnio. Nutraukus PBS, užpilta 100 µL tripsino tirpalo ir inkubuota 8 min (37 oC, 5% CO2). Tripsinas inaktyvuojamas 100 µL MT. Gauta kiekvieno
šulinėlio ląstelių suspensija, dažoma atskirai, naudojant 0,4% Tripano mėlio tirpalą, santykiu 1:4. Skaičiuojama gyvų ir negyvų ląstelių dalis, kiekvieno išsėjimo tankio šulinėlyje1.
1 Žiūrėti „11.3 Ląstelių skaičiavimas“
22
11.5.3 Ląstelių gyvybingumo vertinimas su kalceinu ir etidžio
homodimeru-1 fluoresenciniu metodu
Šis metodas pagrįstas kalceino ir EthD-1 sąveika su intraląstelinėmis molekulėmis. Nefluoresuojančio kalceino pirmtakas, kalceino acetoksimetilesteris (kalceinas-AM), geba būti perneštas per gyvos ląstelės plazminę membraną. Kalceiną-AM skaido viduląstelinės esterazės, kurios nuo jo atskelią acetoksimetil grupę. Šios reakcijos dėka gaunama stipriai žaliai fluoresuojanti kalceino molekulė, kuri negali būti pernešta iš ląstelės lauk (4 pav.). EthD-1 dažo negyvas ląsteles. Jos neturi vientisos plazminės membranos, kuri sustabdytų šios medžiagos patekimą į ląstelės vidų. EthD-1 molekulės ląstelės branduolyje jungiasi su DNR, įsiterpdamos tarp azotinių bazių porų. Susidariusio EthD-1 ir DNR junginio fluoresencinės savybės padidėja 40 kartų, kurias stebime, kaip stipriai raudonai fluoresuojančius negyvų ląstelių branduolius (4 pav.) [26].
Prieš dažymą, pagal gamintojo rekomendacijas, paruošti kalceino ir EthD-1 tirpalai. Atskiruose mėgintuvėliuose 1 µL kalceino-AM ir 5 µL EthD-1 atskiedžiama iki 1 mL, naudojant PBS. Mišiniai atidedami į šalį. Dažant chondrocitus, nutraukiama MT ir ląstelės praplaunamos 100 µL PBS, turinčiu kalcio ir magnio druskų. Prieš pat dažymą, kalceino ir EthD-1 tirpalai sumaišomi ir į kiekvieną šulinėlį įlašinama 100 µL dažų mišinio. Toliau ląstelės, su užlašintais dažais, yra inkubuojamos 30 min (37 oC,
5% CO2). Po inkubavimo yra nutraukiami dažai, ląstelės du kartus praplaunamos 100 µL PBS su kalciu
ir magniu. Į šulinėlius įlašinama 100 µL DMEM ir imunofluoresencijos būdu mikroskopuojama. Kalceino floresencijos sužadinimo bangos ilgis – 495 nm, o emisijos – 520 nm. EthD-1 fluoresencijos ir sužadinimo bangos ilgis >600 nm. Todėl, mikroskopuojant reikalingi skirtingi filtrai norint aptikti abiejų molekulių fluoresenciją. Kalceino fluoresencija gyvose ląstelėse aptinkama nustačius FITC filtrą mikroskope, o EthD-1 – TRITC filtrą. Mikroskopuojant 400x didinimu, skaičiuotos gyvos ir negyvos ląstelės trijuose nepriklausomuose regėjimo laukuose.
23
4 pav. Ląstelių gyvybingumo vertinimas su kalceinu-AM ir EthD-1. A – kalceinu (žaliai) nusidažiusi
gyvas ląstelė. B – EthD-1 (raudonai) nusidažęs negyvos ląstelės branduolys.
11.5.4 Hipoksinių sąlygų sukėlimas su kobalto (II) chloridu
Imituoti OA metu pažeistame sąnaryje susidariusias hipoksines sąlygas ir sukelti chondrocitų hipertorfiją, buvo naudojamas kobalto (II) chloridas, 97% (CoCl2) (Honeywell Research Chemicals,
JAV) sukelti cheminę hipoksiją. Jis ląstelėse stabilizuoja mažos deguonies koncentracijos sąlygomis vykstančią HIF1-α ir HIF2-α baltymų transkripciją normooksijos sąlygomis, nereikalaujant specialios laboratorinės įrangos. Priimta teorija, jog Co2+ pakeičia Fe2+ joną normooksijos metu HIF skaidančiuose
fermentuose prolilhidroksilazėse. Šis efektas proporcingas CoCl2 koncentracijai mišinyje.
Buvo atrinktos efektyvios CoCl2 koncentracijos, kurios tolimesnių eksperimentų metu naudotos
simuliuoti hipoksijai. 96-ių šulinėlių plokštelėje išsėti chondrocitai – 5000 ląst./0,32 cm2 (n=3). Pabaigus išsėjimą, ląstelės paveiktos prieš eksperimentą pagamintais, išpilstytais ir -80 oC temperatūroje laikomais
CoCl2 ir DMEM tirpalais. Šių tirpalų galutinės koncentracijos šulinėlyje buvo nuo 100 µM iki 0,001 nM
(10-4 – 10-12 M) CoCl
2. Eksperimento metu, kas 48 val., buvo nutraukiama ir pakeičiama ląstelių MT ir
B
24 įlašinama atitinkamos koncentracijos CoCl2 tirpalo. Ląstelės iš viso augintos 10 dienų. Paskutinę dieną
vertinta jų proliferacija ir gyvybingumas tripano mėlio metodu2.
11.5.5 Losartano įtaka chondrocitams
Buvo atliktas eksperimentas, įvertinti vieno losartano įtaką chondrocitų proliferacijai ir gyvybingumui. Šio eksperimento metu 96-ių šulinėlių plokštelėje išsėti chondrocitai – 5000 ląst./šulinėlyje (n=3). Po išsėjimo į kiekvieną šulinėlį įlašintas iš anksto pagamintas ir -20 oC
temperatūroje laikomas losartano ir DMEM tirpalas. Losartano galutinė koncentracija šulinėlyje buvo nuo 100 µM iki 0,001 nM (10-4 – 10-12 M). Eksperimento metu, kaip ir su CoCl2 koncentracijos
nustatymu, kas 48 val. nutraukiama ir pakeičiama MT ir įlašinamas losartano tirpalas, pasiekti norimą koncentraciją šulinėlyje. Ląstelės iš viso augintos 10 dienų. Paskutinę dieną vertinta jų proliferacija ir gyvybingumas tripano mėlio metodu3.
11.5.6 Losartano poveikis kobalto (II) chlorido sukeltai hipoksijai
Galutiniame eksperimente naudotos, praeitų tyrimų metu atrinktos, CoCl2 ir losartano tirpalų
koncentracijos. Prieš eksperimentą, CoCl2 milteliai ištirpinti naudojant DMEM. Gautas CoCl2 1,29
mg/mL (10-2 M) tirpalas skiestas DMEM, kol gauti tirpalai, kuriuos įlašinus į šulinėlius, susidarys galutinės 1,29 x 10-2 mg/mL (10-4 M), 1,29 x 10-4 mg/mL (10-6 M) ir 1,29 x 10-7 mg/mL (10-9 M) CoCl
2
tirpalų koncentracijos. Šie tirpalai išpilstyti į atskirus mėgintuvėlius, i, ir užšaldyti -80 oC temperatūroje.
Losartano milteliai buvo ištirpinti DMEM, pagamintas losartano 4,3 mg/mL (10-2 M) tirpalas.
Eksperimente naudojamai koncentracijai – 10-7 M pasigaminti, pirminis tirpalas buvo toliau skiedžiamas DMEM. Šis tirpalas, kurio koncentracija 10-7 M išpilstytas į atskirus mėgintuvėlius, ir laikytas -20 oC
temperatūroje.
2 Žiūrėti „11.5.2 Ląstelių gyvybingumo vertinimas su tripano mėliu“ 3 Žiūrėti „11.5.2 Ląstelių gyvybingumo vertinimas su tripano mėliu“
25 Chondrocitai išsėti 5000 ląstelių/šulinėlyje (5000 ląstelių/0,32cm2) tankiu į ląstelių
kultivavimui tinkamas 96-ių šulinėlių plokšteles (n=3), prieš tai suskirsčius į tiriamąsias grupes. Kontrolinė grupė, kuri auginta 10 % MT. Grupės veiktos tik CoCl2 tirpalais: C10-4 – veikta 10-4 M
CoCl2 tirpalu, C10-6 – veikta 10-6 M CoCl2 tirpalu, C10-9 – veikta 10-9 M CoCl2 tirpalu. Grupės veiktos
CoCl2 ir losartano tirpalais: LC10-4 – veikta 10-4 M CoCl2 ir 10-7 M tirpalais, LC10-6 – veikta 10-6 M
CoCl2 ir 10-7 M tirpalais, LC10-9 – veikta 10-9 M CoCl2 ir 10-7 M tirpalais. Dalis ląstelių po 1 dienos yra
lizuojamos HIF1-α išskyrimui ir vertinimui imunofermentiniu metodu, bei proliferacijos ir gyvybingumo vertinimas kalceino ir EthD-1 metodu. Likusios ląstelės auginamos toliau. Kas 48 val. atliekamas atrankinis ląstelių gyvybingumo vertinimas šviesiniu mikroskopu. Laminare nutraukiama ir pakeičiama kiekvieno šulinėlio MT įlašinant atitinkamos koncentracijos CoCl2 ir losartano tirpalų.
Nutraukta MT užšaldoma -80 oC, kuri bus panaudota chondrocitų hipertrofijos žymens (Kol X)
kiekybiniam vertinimui imunofermentiniu metodu. Po 10 parų ląstelės yra lizuojamos HIF1-α išskyrimui ir vertinimui imunofermentiniu metodu, atliekamas proliferacijos ir gyvybingumo vertinimas kalceino ir EthD-1 metodu.
11.5.7 Ląstelių lizavimas viduląstelinių baltymų išskyrimui
Prieš pradedant ląstelių lizavimą baltymų išskyrimui pasigaminamas proteazių inhibitoriaus (PMSF) (angl. Phenylmethylsulfonyl fluoride) tirpalas. Pasisveriama 174,2 mg PMSF kristalų, kurie ištirpinami 10 mL etanolio. Gautas 100 mM tirpalas išpilstomas po 500 µL į atskirus mėgintuvėlius ir laikomas -20 oC temperatūroje. Panaudojamas prieš kiekvieną lizavimą.
Lizavimo metu, nuo ląstelių nutraukiama mitybinė terpė. Ląstelės kartą praplaunamos 100 µL PBS, be kalcio ir magnio druskų. Nutraukus PBS, užlašinama 100 µL tripsino tirpalo ir inkubuojama 8 min 37 oC, 5% CO2. Ląstelės perkeliamos į sterilius mėgintuvėlius, kur tripsinui nukenksminti, į
kiekvieną iš jų įlašinama 100 µL MT. Paskaičiuojamas ląstelių skaičius kiekvienoje tiriamojoje grupėje4.
Po to mėgintuvėliai su ląstelių suspensija yra centrifuguojami 2500G greičiu 5 min. Nucentrifugavus ląsteles, yra nutraukiamas supernatantas. Mėgintuvėliai du kartus atsargiai praplaunami PBS ir vėl pakartotinai nucentrifuguojami 2500G greičiu 5 min. Nucentrifugavus, nutraukiamas supernatantas.
4 Žiūrėti „11.3 Ląstelių skaičiavimas“
26 Pagal suskaičiuotą ląstelių kiekį pasiruošiamas atitinkamas RIPA buferio (PierceTM RIPA
Buffer, Thermofisher Scientific, JAV) ir prieš tai pagaminto PMSF tirpalas. 100 µL tirpalo panaudojama 1 µL PMSF. Sumaišytas tirpalas padedamas ant ledo. Į mėgintuvėlius, nuo kurių buvo nutrauktas supernatantas, lašinamas RIPA ir PMSF tirpalas. 50000 ląstelių pilama 100 µL RIPA. Mėgintuvėliai dedami ant ledo 15 min, jeigu šiuo laikotarpiu matomos nuosėdos ant mėgintuvėlio dugno, jos yra suspenduojamos ir vėl dedamos ant ledo. Po šio laikotarpio mėgintuvėliai yra centrifuguojami paskutinį kartą 14000G greičiu 15 min 4 oC temperatūroje. Gautas supernatantas nutraukiamas ir perkeliamas į
kitus mėgintuvėlius, kurie yra užšaldomi -80 oC temperatūroje iki ištyrimo imunofermentiniu metodu.
11.5.8 Mėginių tyrimas imunofermentiniu metodu
ELISA (angl. enzyme – linked imunosorbent assays) kiekybinis imunofermentinės analizės metodas, naudojantis antigeno (Ag) ir antikūnio (Ak) sąveiką, aptikti įvairias molekules biologiniuose mėginiuose. Šis metodas pasižymi tuo, kad dėl didelio Ag ir Ak sąveikos specifiškumo, gali būti aptinkamos natūraliai mažų koncentracijų molekulės, tokios kaip peptidai, hormonai ir kt. Įprastai šis tyrimo metodas atliekamas 96-ių šulinėlių plokštelėje, kurios kiekviename šulinėlyje yra tiriamas skirtingas mėginys. Taip pat tarp mėginių yra gamintojo paruošti teigiamos ir neigiamos kontrolinės grupės serumai.
Tyrimo metu Ag ar Ak yra užfiksuojami ant šulinėlio dugno specifiniu Ak ar Ag. Po tam tikro inkubacijos laikotarpio, nurodyto ELISA rinkinio gamintojo protokole, plokštelė plaunama, kad pašalintų nesusietus Ak ar Ag. Toliau remiantis sąveikos specifiškumu fiksuojami antriniai Ak, kurie yra žymėti tokiais fermentais, kaip peroksidazė ar šarminė fosfatazė. Po inkubacinio laikotarpio, kartojamas plokštelės praplovimas, kurio metu pašalinami nesurišti antriniai Ak. Sekančiame žingsnyje į šulinėlius įlašinamas atitinkamas, prie Ak fiksuoto fermento, susbstratas. Šio substrato skaidymo produktas, yra spalvinis junginys. Objektyviai įvertinti spalvos intensyvumą, naudojamas spektrofotometras, atitinkamame šviesos bangos ilgyje. Pagal gautą spalvos intensyvumą, galima nustatyti pradinį ieškomos molekulės kiekį [28].
27
11.5.9 Proteinų ekspresijos įvertinimas Bradfordo metodu
Norint nustatyti eksperimento metu bendrą tiriamo mėginio baltymų ekspresiją prieš imunoferentinę analizę buvo taikytas Bradfordo metodas. Šis metodas pagrįstas 95 % etanolio tirpale esančio dažo Coomasie mėlio G250 jungimusi su baltymais. Dažas specifiškiausiai jungiasi prie arginilo grupių baltymo molekulėje, bet ne prie laisvų aminorūgščių. Spalvinės reakcijos intensyvumas tyrimo metu buvo vertintas Multiskan GO 1.00.40 (Thermo Fisher Scientific) plokštelių skaitytuvu, esant 595 nm šviesos bangos ilgiui. [29].
11.5.10 HIF1-α ekspresijos įvertinimas imunofermentinės analizės metodu
HIF1-α ekspresijos tyrimas atliktas naudojant HIF-1A ELISA rinkinį (serijos numeris MAN0014317, Invitrogen™, Bender MedSystems GmbH, Austrija) pagal gamintojo pateiktą protokolą [30].
1. Atliekami serijiniai skiedimai standartinių mėginių paruošimui ir standartinės kreivės kalibracijai.
5 pav. Standartinių mėginių paruošimas HIF1-α ELISA tyrimui [30].
2. 50 µL tiriamųjų mėginių ir standartinių tirpalų yra supipetuojama į ELISA tyrimui skirtos 96 šulinėlių plokštelės šulinėlį. Plokštelė uždengiama ir inkubuojama kambario temperatūroje 120 min, švelniai purtant.
28 4. Į kiekvieną iš tiriamųjų šulinėlių yra įlašinama 50 µL Ak tirpalo. 96 šulinėlių plokštelė uždengiama ir inkubuojama kambario temperatūroje 60 min, švelniai purtant.
5. Po 60 min inkubacijos, šulinėliai praplaunami tris kartus specialiai paruoštu plovimo tirpalu.
6. Į kiekvieną iš tiriamųjų šulinėlių yra įlašinama 50 µL HRP-Streptavidin tirpalo. 96 šulinėlių plokštelė uždengiama ir inkubuojama kambario temperatūroje 30 min, švelniai purtant.
7. Po 30 min inkubacijos, šulinėliai praplaunami penkis kartus specialiai paruoštu tirpalu.
8. Į kiekvieną iš tiriamųjų šulinėlių yra įlašinama 100 µL TMB Substrato. Plokštelė uždengiama ir paskutinį kartą inkubuojama tamsoje kambario temperatūroje 30 min, švelniai purtant. Reakcija sustabdyta po inkubacijos į šulinėlius įlašinus 100 µL „stop“ tirpalo.
9. Stebėtos spalvinės reakcijos intensyvumas išmatuotas Multiskan GO 1.00.40 (Thermo Fisher Scientific) plokštelių skaitytuvu, 450 nm šviesos bangos ilgiu.
10. Atlikta duomenų analizė.
11.5.11 Kol X ekspresijos įvertinimas imunofermentinės analizės metodu
Kol X ekspresijos tyrimas atliktas naudojant Human COL10A1ELISA rinkinį (serijos numeris EH1637, Wuhan Fine Biotech Co., Kinija) pagal gamintojo pateiktą protokolą [31].
1. Atliekami serijiniai skiedimai standartinių mėginių paruošimui ir standartinės kreivės kalibracijai.
29 2. 100 µL tiriamųjų mėginių ir standartinių tirpalų yra supipetuojama į ELISA tyrimui skirtos 96 šulinėlių plokštelės šulinėlį. Plokštelė uždengiama ir inkubuojama t = 37 oC, 90 min.
3. Po 90 min inkubacijos, šulinėliai dukart praplaunami specialiai paruoštu plovimo tirpalu.
4. Į kiekvieną iš tiriamųjų šulinėlių yra įlašinama 100 µL Ak tirpalo. 96 šulinėlių plokštelė uždengiama ir inkubuojama t = 37 oC, 60 min.
5. Po 60 min inkubacijos, šulinėliai praplaunami tris kartus specialiai paruoštu plovimo tirpalu.
6. Į kiekvieną iš tiriamųjų šulinėlių yra įlašinama 100 µL HRP-Streptavidin tirpalo. 96 šulinėlių plokštelė uždengiama ir inkubuojama t = 37 oC, 30 min.
7. Po 30 min inkubacijos, šulinėliai praplaunami penkis kartus specialiai paruoštu tirpalu.
8. Į kiekvieną iš tiriamųjų šulinėlių yra įlašinama 90 µL TMB Substrato. Plokštelė uždengiama ir paskutinį kartą inkubuojama tamsoje t = 37 oC, 20 min. Reakcija sustabdyta po inkubacijos į šulinėlius
įlašinus 50 µL „stop“ tirpalo.
9. Stebėtos spalvinės reakcijos intensyvumas išmatuotas Multiskan GO 1.00.40 (Thermo Fisher Scientific) plokštelių skaitytuvu, 450 nm šviesos bangos ilgiu.
10. Atlikta duomenų analizė.
11.5.12 Statistinė analizė
Statistine gautų duomenų analizę atlikta naudojant MS Excel 2016 (Microsoft Co., JAV) ir GraphPad Prism 9.1.0 (GraphPad Software, JAV) duomenų analizės paketais. Kiekybiniai rodikliai aprašyti pateikiant vidurkį, standartinę paklaidą. Dėl mažų tyrimo imčių, kiekybiniai kintamieji netenkino normaliojo skirstinio sąlygų. Reikšmės tarp dviejų nepriklausomų imčių lygintos taikant vienfaktorinės dispersinės analizės (ANOVA) Kruskal-Walllis, bei Mann-Whitney kriterijus. Skirtumas tarp tiriamųjų grupių laikytas statistiškai reikšmingu, jei gauta p reikšmė buvo mažesnė už α = 0,05.
30
12. REZULTATAI
12.1 Ląstelių išsėjimo tankio įtaka proliferacijai ir gyvybingumui
12.1.1 Gyvybingumo vertinimas Tripano mėliu
Atlikus ląstelių gyvybingumo vertinimą Tripano mėliu (kiekviena tiriamoji grupė turėjo po tris šulinėlius), nustatyta, jog chondrocitai per 10 dienų nuo tyrimo pradžios proliferavo išsėti 1000, 2000, 5000 ląstelių/mL tankiais (7 pav.). Stebėtas greičiausias ląstelių skaičiaus augimas išsėjus chondrocitus 5000 ląstelių/mL tankiu. Vertinant kremzlės ląstelių gyvybingumą tarp geriausiai proliferavusių išsėjimo tankio grupių (2000 ir 5000 ląst./0,32 cm2), nebuvo gautas statistiškai reikšmingas skirtumas (p = 0,07,
kai α = 0,05).
31
12.1.2 Gyvybingumo vertinimas kalceinu ir etidžio homodimeru-1
Praeito tyrimo rezultatams patvirtinti pakartotas eksperimentas tokiomis pačiomis sąlygomis, tik dažyta Kalceinu-AM ir EthD-1. Gautuose fluoresencijos vaizduose (8 pav.) įvertintas gyvų ląstelių skaičius nusidažęs Kalceinu (žaliai) ir negyvų ląstelių skaičius – EthD-1 (raudonai).
1 2 3
A
B
32 D
E
F
8 pav. Chondrocitų proliferacija ir gyvybingumas: A – 1000 ląst./0,32 cm2 išsėtos ląstelės po 1
dienos nuo išsėjimo; B - 2000 ląst./0,32 cm2 išsėtos ląstelės po 1 dienos. nuo išsėjimo; C - 5000 ląst./0,32 cm2 išsėtos ląstelės po 1 dienos nuo išsėjimo; D - 1000 ląst./0,32 cm2 išsėtos ląstelės po 10
dienų nuo išsėjimo; E - 2000 ląst./0,32 cm2 išsėtos ląstelės po 10 dienų nuo išsėjimo; F - 5000
ląst./0,32 cm2 išsėtos ląstelės po 10 dienų nuo išsėjimo.
Atliekant ląstelių gyvybingumo vertinimą Kalceinu ir EthD-1 (kiekvienai tiriamajai grupei paskirta po tris šulinėlius ir buvo mikroskopuojami trys regėjimo laukai šulinėlyje) nustatyta, jog chondrocitai per 10 dienų nuo tyrimo pradžios proliferavo išsėti visuose tankiuose (1000, 2000, 5000 ląstelių/mL tankiais), kaip ir praeito tyrimo metu (9 pav.). Vertinant chondrocitų gyvybingumą tarp geriausiai proliferavusių išsėjimo tankio grupių (2000 ir 5000 ląst./0,32 cm2 ), nebuvo gautas statistiškai reikšmingas skirtumas (p = 0,06, kai α = 0,05). Negavus p < 0,05 tarp 2000 ir 5000 ląstelių/mL grupių visuose tolimesniuose tyrimuose naudotas geriausiai proliferavusių ląstelių išsėjimo tankis - 5000 ląstelių/mL.
33
9 pav. Išsėjimo tankio įtaka chondrocitų gyvybingumui ir proliferacijai – Kalceino ir EthD-1 metodas
12.2 Kobalto (II) chlorido sukeltos hipoksijos įtaka ląstelių gyvybingumui
Tyrimo metu mažinant CoCl2 tirpalo koncentraciją stebėta ląstelių gyvybingumo didėjimo
tendencija (10 pav.). Atsižvelgiant į ląstelių gyvybingumą, lyginant su kontrole, mažiausia koncentracija kuria veikiant chondrocitus, gautas ląstelių gyvybingumo skirtumas tarp kontrolės ir tiriamosios grupės yra statistiškai reikšmingas (p = 0,04, kai α = 0,05). Pasirinktos tiriamosios koncentracijos hipoksijai sukelti tolimesnių tyrimų metu 10-4, 10-6 ir 10-9 M CoCl
34
10 pav. Chondrocitų gyvybingumo nustatymas 0,4% tripano mėliu po 10 dienų veikiant chondrocitus
CoCl2. Kontrolinės grupės gyvybingumas – 91,84 %.
12.3 Losartano poveikio įtaka ląstelių gyvybingumui
Tyrimo metu stebėta tendencija, jog mažėjant losartano tirpalų koncentracijai didėja ląstelių gyvybingumas (11 pav.). Remiantis kitomis studijomis, kurių metu ląstelės buvo veiktos losartanu ir šio eksperimento gautais duomenimis, atrinkta koncentracija turinti mažiausią poveikį chondrocitų gyvybingumui - 10-7 M [32].
35
11 pav. Chondrocitų gyvybingumo nustatymas 0,4% tripano mėliu po 10 dienų veikiant chondrocitus
losartanu. Kontrolinės grupės gyvybingumas – 91,67 %.
12.4 Losartano poveikis CoCl
2veikiamų chondrocitų gyvybingumui
Naudojant Kalceino ir EthD-1 dažymo metodiką, vertintas losartano poveikis chondrocitų gyvybingumui hipoksijos sąlygomis. Gyvų ir negyvų ląstelių skaičius fluoresencijos vaizduose skaičiuotas po 1 ir 10 dienų (12 ir 13 pav. atitinkamai) nuo chondrocitų išsėjimo.
1 2 3
36 B C D E F
37 G
12 pav. Losartano poveikis chondrocitų proliferacijai ir gyvybingumui hipoksijos sąlygomis po 1 dienos nuo išsėjimo: A – Ląstelės veiktos 10-4 M koncentracijos CoCl
2 tirpalu; B – Ląstelės veiktos
10-6 M koncentracijos CoCl2 tirpalu; C – Ląstelės veiktos 10-9 M koncentracijos CoCl2 tirpalu; D –
Ląstelės veiktos 10-4 M koncentracijos CoCl
2 ir 10-7 M losartano tirpalu; E – Ląstelės veiktos 10-6 M
koncentracijos CoCl2 ir 10-7 M losartano tirpalu; F – Ląstelės veiktos 10-9 M koncentracijos CoCl2 ir
10-7 M losartano tirpalu; G – Ląstelės augintos 10% MT.
1 2 3
A
B
38 D
E
F
G
13 pav. Losartano poveikis chondrocitų proliferacijai ir gyvybingumui hipoksijos sąlygomis po 10 dienų nuo išsėjimo: A – Ląstelės veiktos 10-4 M koncentracijos CoCl
2 tirpalu; B – Ląstelės veiktos 10 -6 M koncentracijos CoCl
2 tirpalu; C – Ląstelės veiktos 10-9 M koncentracijos CoCl2 tirpalu; D –
Ląstelės veiktos 10-4 M koncentracijos CoCl
2 ir 10-7 M losartano tirpalu; E – Ląstelės veiktos 10-6 M
koncentracijos CoCl2 ir 10-7 M losartano tirpalu; F – Ląstelės veiktos 10-9 M koncentracijos CoCl2 ir
10-7 M losartano tirpalu; G – Ląstelės augintos 10% MT.
Vertinant ląstelių skaičių ir gyvybingumą po 1 dienos (T1) po išsėjimo, stebėta, jog visose losartanu paveiktose tiriamosiose grupėse gyvų ląstelių skaičius yra reikšmingai didesnis, nei grupės,
39 veiktos tos pačios koncentracijos CoCl2 tirpalu, kuri neveikiama AT1R blokatoriumi bei kontrolinėje
grupėje, kuri auginta 10% MT (14 pav.). Tiriamųjų grupių (C10-4 ir LC10-4, C10-6 ir LC10-6, C10-9 ir LC10-9) p reikšmės atitinkamai p = 0,001, p = 0,002, p = 0,005, kai α = 0,05.
14 pav. Losartano poveikis chondrocitų proliferacijai ir gyvybingumui hipoksijos sąlygomis po 1 dienos (T1) nuo išsėjimo. C10-4 - CoCl2 10-4 M koncentracija; C10-6 - CoCl2 10-6 M koncentracija;
C10-9 - CoCl2 10-9 M koncentracija; LC10-4 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-4 M koncentracijos;
LC10-6 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-6 M koncentracijos; LC10-9 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-9 M
koncentracijos; kontrolė – auginta 10% MT
Įvertinus ląstelių skaičių po 10 dienų (T10) nuo išsėjimo (15 pav.), stebėta, jog tarp tiriamųjų grupių C10-4 ir LC10-4 bei C10-6 ir LC10-6 yra reikšmingas ląstelių skaičiaus skirtumas, p reikšmės abiejuose grupėse p = 0,001. Skirtingai tik, lyginant C10-4 ir LC10-4 grupes, losartanu paveiktame grupėje – ląstelių skaičius buvo didesnis, kitaip, nei C10-6 ir LC10-6, kur ląstelių paveiktų losartanu buvo mažiau. Tarp C10-9 ir LC10-9 tiriamųjų grupių, nėra reikšmingo ląstelių skaičiaus skirtumo. Vertinant ląstelių gyvybingumą po 1 dienos (14 pav.) ir 10 dienų (15 pav.) C10-4 ir LC10-4 grupių ląstelės proliferavo mažiausiai.
40
15 pav. Losartano poveikis chondrocitų proliferacijai ir gyvybingumui hipoksijos sąlygomis po 10 dienų (T10) nuo išsėjimo. C10-4 - CoCl2 10-4 M koncentracija; C10-6 - CoCl2 10-6 M koncentracija;
C10-9 - CoCl2 10-9 M koncentracija; LC10-4 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-4 M koncentracijos;
LC10-6 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-6 M koncentracijos; LC10-9 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-9 M
koncentracijos; kontrolė – auginta 10% MT
12.5 Losartano poveikis CoCl
2veikiamų chondrocitų HIF1-α ekspresijai
Vertinant HIF1-α ekspresiją po 1 dienos (T1) (16 pav.) nuo tyrimo pradžios tarp tiriamųjų grupių, mažiausia ekspresija stebėta toje grupėje, kurioje veiktos kremzlės ląstelės 10-4 M CoCl
2 ir 10-7
M losartano tirpalais (LC10-4 T1), lyginant su grupe, kur ląstelės veiktos tik 10-4 M CoCl
2 tirpalu
41
16 pav. Chondrocitų HIF1-α ekspresija po 1 dienos (T1) išsėjimo tarp skirtingų tiriamųjų grupių (n=4). C10-4 - CoCl2 10-4 M koncentracija; C10-6 - CoCl2 10-6 M koncentracija; C10-9 - CoCl2 10-9 M
koncentracija; LC10-4 – losartano 10-7 M ir CoCl
2 10-4 M koncentracijos; LC10-6 – losartano 10-7 M ir
CoCl2 10-6 M koncentracijos; LC10-9 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-9 M koncentracijos; Kontrolė –
auginta 10% MT
Vertinant HIF1-α ekspresiją po 10 dienų (T10) (17 pav.) nuo tyrimo pradžios tarp tiriamųjų grupių, mažiausia ekspresija stebėta visose grupėse, kurios be CoCl2 veiktos losartano tirpalais.
C10 -4 T 10 C10 -6 T 10 C10 -9 T 10 LC10 -4 T 10 LC10 -6 T 10 LC10 -9 T 10 Kon trol ė 0 500 1000 1500 H IF 1 -a lf a , p g /m l
17 pav. Chondrocitų HIF1-α ekspresija 10 dienų (T10) po išsėjimo tarp skirtingų tiriamųjų grupių (n=4). C10-4 - CoCl2 10-4 M koncentracija; C10-6 - CoCl2 10-6 M koncentracija; C10-9 - CoCl2 10-9 M
koncentracija; LC10-4 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-4 M koncentracijos; LC10-6 – losartano 10-7 M ir
CoCl2 10-6 M koncentracijos; LC10-9 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-9 M koncentracijos; Kontrolė –
auginta 10% MT C10 -4 T 1 C10 -6 T 1 C10 -9 T 1 LC 10-4 T1 LC 10-6 T1 LC 10-9 T1 Kon trol ė 0 100 200 300 400 500 H IF 1 -a lf a , p g /m l
42
12.6 Losartano poveikis CoCl
2veikiamų chondrocitų Kol X ekspresijai
Vertinant chondrocitų hipertrofijos žymens (Kol X) raišką, po 2 dienų (T2) nuo tyrimo pradžios buvo lyginamos tiriamosios grupės, veiktos tik atitinkamos koncentracijos CoCl2 tirpalu su veiktomis
CoCl2 bei losartano tirpalais (18 pav.). Lyginant visas tiriamąsias grupes (C10-4 ir LC10-4, C10-6 ir
LC10-6, C10-9 ir LC10-9) paveiktose losartanu stebima statistiškai reikšminga Kol X ekspresija, apskaičiuotos p reikšmės p = 0,009, p = 0,01, p = 0,009, kai α = 0,05.
18 pav. Chondrocitų Kolageno X ekspresija 2 dienų (T2) nuo išsėjimo tarp skirtingų tiriamųjų grupių (tiriamosios grupės n=4, kontrolinė grupė n = 3): C10-4 - CoCl2 10-4 M koncentracija; C10-6
- CoCl2 10-6 M koncentracija; C10-9 - CoCl2 10-9 M koncentracija; LC10-4 – losartano 10-7 M ir CoCl2
10-4 M koncentracijos; LC10-6 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-6 M koncentracijos; LC10-9 – losartano
10-7 M ir CoCl
2 10-9 M koncentracijos; Control – auginta 10% MT
Auginant ląsteles toliau ir įvertintus Kol X raišką po 6 dienų (T6) nuo tyrimo pradžios tarp tų pačių tiriamųjų grupių, rezultatai pakito statistiškai reikšmingai (19 pav.). Lyginant Kol X ekspresijos rezultatus visose tiriamosiose grupėse (C10-4 ir LC10-4, C10-6 ir LC10-6, C10-9 ir LC10-9) Kol X ekspresija stebėta didesnė grupėse, paveiktose losartanu, p reikšmės tarp visų tiriamųjų grupių, tokios pat p = 0,01, kai α = 0,05.
43
19 pav. Chondrocitų Kolageno X ekspresija 6 dienų (T6) nuo išsėjimo tarp skirtingų tiriamųjų grupių (tiriamosios grupės n=4, kontrolinė grupė n = 2): C10-4 - CoCl2 10-4 M koncentracija; C10-6
- CoCl2 10-6 M koncentracija; C10-9 - CoCl2 10-9 M koncentracija; LC10-4 – losartano 10-7 M ir CoCl2
10-4 M koncentracijos; LC10-6 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-6 M koncentracijos; LC10-9 – losartano
10-7 M ir CoCl
2 10-9 M koncentracijos; Control – auginta 10% MT
Paskutinis tirtas Kol X ekspresijos taškas buvo po 10 dienų (T10) nuo ląstelių išsodinimo (20 pav). Lyginant Kol X koncentracijas tarp tiriamųjų grupių (C10-4 ir LC10-4, C10-6 ir LC10-6, C10-9 ir LC10-9), reikšmingi rezultatai gauti lyginant visas tiriamąsias grupes, p reikšmės atitinkamai p = 0,03 p = 0,001 ir p = 0,001, kai α = 0,05. Lyginant C10-4 ir LC10-4 ir C10-6 ir LC10-6 grupes stebime, jog paveikta chondrocitų grupės losartanu ekspresavo mažiau Kol X. Priešingi rezultatai stebimi lyginant C10-9 ir LC10-9 grupes – grupė paveikta losartanu ekspresavo daugiau Kol X.
44
20 pav. Chondrocitų Kolageno X ekspresija 10 dienų (T10) nuo išsėjimo tarp skirtingų tiriamųjų grupių (tiriamosios grupės n=4, kontrolinė grupė n = 3): C10-4 - CoCl2 10-4 M koncentracija; C10-6
- CoCl2 10-6 M koncentracija; C10-9 - CoCl2 10-9 M koncentracija; LC10-4 – losartano 10-7 M ir CoCl2
10-4 M koncentracijos; LC10-6 – losartano 10-7 M ir CoCl2 10-6 M koncentracijos; LC10-9 – losartano
10-7 M ir CoCl
45
13. REZULTATŲ APTARIMAS
Šio tyrimo metu in vitro modelyje, auginant kremzlės ląstelių, chondrocitų, monosluoksnį, nagrinėjome, koks yra AT1R blokavimo poveikis chondrocitų hipertrofijai, imituojant sąnario uždegimo metu susidariusias hipoksijos sąlygas. Yra studijų teigiančių jog AT1R blokatorių, tokių kaip losartanas, panaudojimas sukelia chondrocitų hipertrofiją ir diferenciaciją į kaulinį audinį [8,33]. Tačiau yra studijų teigiančių priešingai, jog RAS komponentų blokavimas (įskaitant ir AT1R) sukelia apsauginį kremzlės poveikį [5-7,20,21].
Pirmiausia lyginant didžiausioje, 10-4 M, CoCl
2 koncentracijoje augintą grupę su grupe, auginta
tokios pačios CoCl2 koncentracijos tirpale, gavusioje 10-7 M losartano, tyrimo pradžioje stebima
tendencija, jog losartanu paveiktoji grupė ekspresavo mažiau HIF1-α, dėl to galime įtarti, jog ląstelės patyrė mažesnę hipoksiją. Geresnis aprūpinimas deguonimi losartanu paveiktose ląstelėse sąlygojo jų proliferaciją, nei tose, kurios veiktos 10-4 M CoCl
2. Taip pat, dėl mažesnės patirtos hipoksijos ekspresavo
mažesnį kiekį Kol X. Vertinant šių ląstelių Kol X ekspresiją dinamikoje, po 6 dienų nuo tyrimo pradžios, stebima padidėjusi Kol X ekspresija. Lyginant su dinamikoje mažėjančia HIF1-α ekspresija tyrimo metu šioje tiriamojoje grupėje, negalime teigti, jog Kol X ekspresijos padidėjimas yra susijęs su hipoksija. Kartu stebima bendra tendencija, jog visos losartanu paveiktos grupės, ekspresavo didesnį kiekį Kol X. Šioje vietoje praverstų antras chondrocitų hipertrofijos žymuo, kurį galėtume lyginti su Kol X dinamika. Tokį kaip Kol II, kuris normos sąlygomis ekspresuojamas sveikame kremzliniame audinyje. Simuliuojant hipoksiją aptiktume atvirkščiai proporcingą ryšį tiriant kartu su Kol X – didėjant hipertrofijos žymens kiekiui, mažėtų Kol II kiekis. Kitas variantas yra naudoti specifiškesnį kremzlės ląstelių hipertrofijos žymenį, nei Kol X, tokį kuris yra susijęs hialininės kremzlės audinio remodeliaciją į kaulinį audinį uždegimo metu – tirti metaloproteinazes, ardančias ECM [15]. Tyrimo pabaigoje, po 10 dienų, stebima tendencija, jog losartanu paveikta ląstelių grupė ekspresuoja mažesnį kiekį HIF1-α ir stebimas ryšys su mažesne Kol X ekspresija.
Toliau žvelgiant į vidutinėms hipoksijos sąlygoms skirtą sukelti 10-6 M CoCl
2 koncentracijoje
augintas ląsteles ir lyginant jas su ląstelėmis veiktomis 10-7 M losartano, stebime, jog tyrimo pradžioje
nėra reikšmingo skirtumo tarp grupių ekspresuojamo HIF1-α koncentracijų. Tačiau nors ir negalime teigti, pagal HIF1-α kiekį, jog yra skirtumas tarp tiriamųjų grupių, remiantis Kol X ekspresija ir ląstelių gyvybingumu – šis skirtumas yra. Losartanu paveiktoji tiriamoji grupė reikšmingai mažiau ekspresuoja Kol X ir ląstelių skaičius yra didesnis. Vertinant Kol X kiekį dinamikoje, stebime tą patį, kaip ir su 10-4
M CoCl2 tiriamąja grupe, jog grupėje paveiktoje losartanu išauga Kol X ekspresija. Tyrimo pabaigoje,
