FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
ŠARŪNAS VAIDELIS
LEKTINŲ, IŠSKIRTŲ IŠ PHASEOLUS VULGARIS L.,
ANTIOKSIDACINIO/PROOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
IR ĮTAKOS GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ GYVYBINGUMUI
ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Arūnas Savickas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
LEKTINŲ, IŠSKIRTŲ IŠ PHASEOLUS VULGARIS L.,
ANTIOKSIDACINIO/PROOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
IR ĮTAKOS GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ GYVYBINGUMUI
ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Arūnas Savickas
Recenzentas Darbą atliko
Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė Magistrantas
Šarūnas Vaidelis
Turinys
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 SANTRUMPOS ... 9 1. ĮVADAS ... 10 2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12 2.1. Lektinai... 122.2. Reaktyvios deguonies formos, jų poveikis vėžinėms ląstelėms ... 15
2.2.1. Reaktyvių deguonies formų panaudojimas vėžinių ligų gydymui ... 17
2.2.2. Reaktyvių deguonies formų įtaka vėžio vystymuisi ... 17
2.2.3. Antioksidantai maiste ... 18
2.3. Vėžys ... 18
2.3.1. Ląstelės mirties mechanizmai ... 20
2.3.2. Glioblastoma ... 22
3. Tyrimų metodika ir medžiagos ... 23
3.1. Medžiagos ... 23
3.2. Ekstraląstelinių laisvųjų radikalų matavimas ... 23
3.3. Ląstelių sėjimo metodika ... 23
3.4. Ląstelių tankio nustatymas ... 24
3.5. Ląstelių gyvybingumo tyrimai ... 25
3.5.1. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu ... 25
3.5.2. Neuronų žūties įvertinimas fluorescencinės mikroskopijos metodu ... 25
3.6. Viduląstelinių ROS kiekio įvertinimas ... 26
3.7. Statistinė analizė ... 26
4. Rezultatai ir jų aptarimas ... 27
4.1. Vandenilio peroksido kiekio matavimai ... 27
4.3. Glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumo pokyčiai ... 30
4.4. Viduląstelinio RS kiekio pokyčiai C6 ląstelėse ... 31
4.5. Neuronų žūties įvertinimas fluorescencinės mikroskopijos metodu ... 33
4.5. Rezultatų aptarimas ... 37
5. Išvados ... 39
SANTRAUKA
Šarūno Vaidelio magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. Arūnas Savickas
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas:
LEKTINŲ, IŠSKIRTŲ IŠ PHASEOLUS VULGARIS L., ANTIOKSIDACINIO/PROOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS IR ĮTAKOS GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ GYVYBINGUMUI
ĮVERTINIMAS
Tyrimo metodai:
Ląstelių sėjimo metodika; ląstelių tankio nustatymas; ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu; neuronų žūties įvertinimas fluorescencinės mikroskopijos metodu; viduląstelinių RS kiekio
įvertinimas; ekstraląstelinių RS kiekio įvertinimas; statistinė analizė.
Tyrimo tikslas:
Ištirti įvairių koncentracijų lektinų, išskirtų iš Phaseolus vulgaris L., antioksidacinį/ prooksidacinį poveikį ir įtaką C6 ląstelių gyvybingumui.
Tyrimo uždaviniai:
1. Atlikti literatūros duomenų analizę apie lektinų, išskirtų iš Phaseolus vulgaris L., biologinį poveikį; 2. Nustatyti įvairių koncentracijų lektinų, išskirtų iš Phaseolus vulgaris L.,
antioksidacinį/prooksidacinį aktyvumą;
3. Nustatyti įvairių koncentracijų lektinų poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui.
Tyrimų rezultatai:
1. Buvo matuojami vandenilio peroksido pokyčiai esant 1 - 10 µg lektino koncentracijoms ir nustatyta, kad skirtingų koncentracijų lektinas neveikia neutralizuojančiai vandenilio peroksido kiekio.
2. Atlikti vandenilio peroksido matavimai DMEM terpėje su 1 - 10 µg lektino koncentracijoms parodė, kad lektinas, priklausomai nuo jo koncentracijos, negeneruoja laisvųjų radikalų.
3. Buvo matuojamas glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumas su MTT po 24 valandų ir nustatyta, kad didėjant lektino koncentracijai ląstelių gyvybingumas sparčiai mažėjo: 5 µg koncentracijos lektinas gyvybingumą sumažino beveik 2 kartus (iki 57,2111.16%), o 10 µg koncentracijos lektinas ląstelių gyvybingumą sumažino beveik 13 kartų (iki 7,571.25%).
4. Tiriant viduląstelinių RS generaciją C6 ląstelėse, paveikus jas 1 - 10 µg koncentracijos lektinu, buvo nustatyta, kad didėjant lektino koncentracijai, viduląstelinių laisvųjų radikalų kiekis taip pat didėja.
5. Fluorescencinės mikroskopijos metodu buvo nustatyta, kad lektinai sukelia glioblastomos ląstelių apoptozę ir nekrozę.
Išvados:
1. Lektinas, išskirtas iš Phaseolus vulgaris L, naudotas įvairiomis (1 - 10 µg) koncentracijomis, nekeitė vandenilio peroksido koncentracijos ląstelių augimo terpėje. Taigi jis nepasižymi vandenilio peroksidą neutralizuojančiu ir jo generaciją skatinančiu poveikiu.
2. Viduląstelinių laisvųjų radikalų gamyba C6 ląstelėse, paveikus jas skirtingų (1 - 10 µg)
koncentracijų lektinu, padidėjo statistiškai reikšmingai (apie 1,3 karto). Taigi lektinai, priklausomai nuo koncentracijos, skatina viduląstelinių radikalų generaciją glioblastomos C6 ląstelėse.
3. C6 ląstelių kultūros gyvybingumas, paveikus ją 1 - 10 µg koncentracijos Phaseolus vulgaris L. lektinu po 24 h, sumažėjo nuo 7 iki 93 procentų. Taigi lektinai, priklausomai nuo koncentracijos, mažina glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumą.
SUMMARY
Šarūno Vaidelio master's thesis/ supervisor prof. Arūnas Savickas
Lithuanian University of Health sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. – Kaunas.
Title of work:
STUDY OF ANTIOXIDATIVE/PROOXIDATIVE ACTIVITY OF LECTINS, ISOLATED FROM PHASEOLUS VULGARIS L., AND ASSESSMENT OF INFLUENCE ON VIABILITY OF GLIOBLASTOMA CELLS
Methods:
The cell cultivation method; measurement of cell density; determination of cell viability with MTT assay; assessment of neuronal death with fluorescent microscopy; measurement of intracellular RS; measurement of extracellular RS; statistical analysis.
The aim of research:
To investigate antioxidative/prooxidative effects of different concentrations of the lectin, isolated from Phaseolus vulgaris L., and influence on the viability of the C6 cells.
Goals of the study:
1. To perform an analysis of the literature on the biological effects of lectin, isolated from Phaseolus vulgaris L.;
2. To determine antioxidative/prooxidative activity of different concentrations of the lectin, isolated from Phaseolus vulgaris L.;
3. To determine effect on viability of the C6 cell culture using different concentrations.
Results:
1. Concentrations of hydrogen peroxide were measured with 1 - 10 µg concentrations of lectin and it was found, that different concentrations of lectin did not neutralize hydrogen peroxide.
2. Measurements of hydrogen peroxide in DMEM medium with 1-10 mg concentrations of lectin showed, that the lectin, depending on it's concentration, did not generate free radicals.
3. Viability of cells was measured in C6 glioblastoma cells with MTT after 24 hours and it was found, that when concentration of lectin increased, viability of cells rapidly decreased: 5 µg concentration of lectin reduced the viability of almost 2 times ( up to 57.21% ± 11.16% ) and at 10 µg concentration of lectin viability of cells decreased almost 13 times (up to 7.57% ± 1.25% ) .
4. Study of intracellular RS generation in C6 cells, after exposure with 1 - 10 µg concentrations of lectin showed, that, when concentration of lectin increased, the concentration of intracellular RS also increased.
5. Fluorescence microscopy showed that lectins can induce apoptosis and necrosis in glioblastoma cells.
Conclusions:
1. Lectin, isolated from Phaseolus vulgaris L, that was used in various (1 - 10 µg) concentrations did not change the concentration of hydrogen peroxide in medium of the cell culture. So lectin neither has a hydrogen peroxide generation neutralizing nor stimulating effects.
2. Production of intracellular free radicals in C6 cells, after exposure with different (1 - 10 µg) concentrations of lectin, significantly increased (about 1,3 times). Thus, lectin, depending on its concentration, stimulates generation of intracellular free radicals in C6 glioblastoma cells.
3. Viability of C6 cell culture, after exposure with 1 - 10 µg concentrations of Phaseolus vulgaris L. lectin, after 24 h decreased from 7 to 93 percent. Thus, lectin, depending on its concentration, reduces viability of C6 glioblastoma cells.
SANTRUMPOS
EDTA - etilendiamintetraacto rūgštis
DCFH - DA - redukuotas 2',7' - dichlorofluoresceino diacetatas DCFH - redukuotas 2',7' - dichlorofluoresceinas
DCF - dichlorofluoresceinas RF - reaktyviosios formos
RDF - reaktyviosios deguonies formos
RS (angl. reactive species) - reaktyvios formos
NAD(P)H - redukuotas nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas
DMEM (angl. Dulbecco‘s modified eagle‘s medium) - ląstelių auginimo terpė PBS (angl. Phosphate buffered saline) – fosfatinis buferis
FBS (angl. Fetal bovine serum) – fetalinis veršelio serumas DNR - deoksiribonukleorūgštis
HIF - 1α (angl. Hypoxia-inducible factor 1-alpha) - hipoksijos sužadinamas faktorius 1-alfa NAD⁺ - oksiduotas nikotinamido adenino dinukleotidas
TNFR2 (angl. Tumor necrosis factor receptor 2) - tumoro nekrozės faktoriaus receptorius 2 NO (angl. nitrogen monoxide) - azoto monoksidas
1. ĮVADAS
Onkologinės ligos yra vienos pavojingiausių ir kasmet nusineša milijonus žmonių gyvybių. Vėžys yra liga, sukelta greito ir nekontroliuojamo ląstelių dalijimosi. Onkologinių ligų gydymas yra labai
sudėtingas todėl, kad nėra specifinių vaistų ir kitų gydymo būdų, kurie pilnai išgydytų vėžį. Didžioji dauguma vaistų, naudojamų onkologinių ligų gydyme, tik prislopina vėžinių ląstelių dauginimąsi, bet tuo pačiu metu neigiamai veikia ir sveikas ląsteles. Neretai pražudo pats gydymas, o ne vėžys. Todėl yra didelis poreikis naujoms priešvėžinėms priemonėms tirti.
Vėžį sukelti gali daugelis vidinių ir išorinių veiksnių, tokių kaip genetika, rūkymas, radiacija, mityba. Vienas iš veiksnių yra laisvieji radikalai arba reaktyviosios deguonies formos. Be onkologinių
susirgimų, laisvieji radikalai taip pat gali sukelti ir daugelį kitų ligų: širdies ir kraujagyslių,
neurodegeneracines ir t.t. Nors mažais kiekiais laisvieji radikalai yra naudingi organizmui ir dalyvauja kai kuriuose biologiniuose procesuose, dideli laisvųjų radikalų kiekiai yra žalingi, nes pažeidžia baltymus, lipidus bei DNR. Laisvuosius radikalus gali neutralizuoti pati žmogaus organizmo antioksidacinė sistema arba antioksidantai [2]. Antioksidantinių medžiagų daugiausia galima rasti augaluose.
Laisvieji radikalai taip pat gali ir neigiamai veikti vėžinių ląstelių augimą, sutrikdant jų gyvybės ciklą ir sukeliant apoptozę. Didžioji dauguma nechirurginių vėžio gydymo metodų yra paremta laisvųjų radikalų generacija.
Vienos iš labiausiai paplitusių centrinės nervų sistemos vėžio formų yra gliomos, kurių pati agresyviausia yra glioblastoma [25].
Vis didesnį susidomėjimą onkologinių ligų gydyme kelia ne tik nauji chemoterapiniai ar biologiniai preparatai, bet ir augalinės medžiagos. Viena iš augalinių medžiagų grupių, kuri pasižymi
priešvėžinėmis savybėmis, yra lektinai.
Lektinai yra neimuninės kilmės baltymai, kurie dalyvauja daugelyje gyvybinių procesų [44]. Dėl plataus biologinio poveikio spektro lektinai yra pakankamai intensyviai tyrinėjama augalinių medžiagų grupė. Lektinai vėžines ląsteles gali veikti per keletą mechanizmų - apoptozę, autofagiją ar
agliutinaciją. Tyrimui buvo pasirinktas Phaseolus vulgaris L. lektinas.
Darbo aktualumas ir naujumas:
Yra atlikta nepakankamai tyrimų apie lektinų poveikį vėžinėms ląstelėms, todėl buvo pasirinktas pupelės lektinas ir tirtas jo poveikis glioblastomos ląstelėms.
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
• ištirti įvairių koncentracijų lektinų, išskirtų iš Phaseolus vulgaris L., antioksidacinį/ prooksidacinį poveikį ir jų įtaką C6 ląstelių gyvybingumui.
Darbo uždaviniai:
• atlikti literatūros duomenų analizę apie lektinų, išskirtų iš Phaseolus vulgaris L., biologinį poveikį;
• nustatyti įvairių koncentracijų lektinų, išskirtų iš Phaseolus vulgaris L., antioksidacinį/prooksidacinį aktyvumą;
• nustatyti įvairių koncentracijų lektinų poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui.
Darbo praktinė reikšmė:
Tyrimo rezultatai buvo pritaikyti projekte „Naujų augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius imunomoduliatorius ir citostatikus“ (LSMU Farmacijos fakultetas; Vaistų technologijos katedra).
Darbas galėtų būti tęsiamas naudojant lektinus, gautus iš kitų šaltinių; naudojant skirtingas jų koncentracijas; naudojant skirtingas vėžinių ląstelių kultūras.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Lektinai
Lektinai yra neimuninės kilmės baltymų grupė, kuri gali specifiškai atpažinti ir prisijungti prie angliavandenilių, nekeičiant jų struktūros [44]. Lektinai jungiasi prie tam tikrų angliavandenilių panašiai kaip fermentas su substratu arba antigenas su antikūniu [15]. Kadangi lektinai dalyvauja daugelyje gyvybinių procesų, jie gali būti daug kur aptinkami. Lektinai gali būti randami
mikroorganizmuose, gyvūnuose ir augaluose. Kol kas yra identifikuota tik nedidelė dalis visų lektinų, kurie egzistuoja natūralioje formoje.
Lektinai gali būti augalinės ir gyvūninės kilmės. Lektinai gali būti natūraliai randami gamtoje arba gaunami dirbtiniu būdu. Lektinai yra aptinkami labai nedideliais kiekiais įvairių gyvūnų
organizmuose, daugiausia - jūriniuose gyvūnuose. Kaip atskira grupė gali būti išskirti grybų lektinai (pavyzdžiui, ūmėdėje arba plaušabudėje esantys lektinai). Tačiau didžiausia grupę sudaro augalų lektinai. Lektinai gali būti randami įvairiose augalo dalyse: šakniagumbiuose, šaknyse, sėklose [24]. Terminas „lektinas” pirmą kartą buvo paminėtas 1954 metais William C. Boyd'o iš Bostono
universiteto, norint apibūdinti augalinės kilmės agliutininus, kurie buvo specifiški kraujo grupei. Žodis „lektinas” yra kilęs iš lotynų kalbos veiksmažodžio legere būtojo laiko dalyvio, reiškiančio išrinkti, susirinkti ar skaityti. Vėliau paaiškėjo, kad baltymai, gaunami iš kitų neaugalinių šaltinių, taip pat gali jungtis prie angliavandenių, ir terminas „lektinas” įgavo gerokai platesnę reikšmę. Tačiau lektinų funkcijos buvo pastebėtos anksčiau negu jie buvo identifikuoti kaip atskira baltymų grupė. Tuo laikotarpiu autoriai tvirtino, kad jų darbe yra aprašytas pirmasis žinduolių kilmės lektinas. Dar prieš 1860 metus, mokslininkas S. Weir Mitchell pastebėjo, kad kai kurie gyvačių nuodai turi savybę
sušokdinti į gabalus (agliutinuoti) raudonąsias kraujo ląsteles. Vėliau tame pačiame amžiuje, Hermann Stillmark'as pristatė medicinos daktaro disertaciją tuometinėje Estijoje, kurioje apibūdino ricinos, labai toksiško baltymo, išskirto iš Ricinus communis sėklų, agliutinuojančias savybes [32]. Du svarbūs atradimai, kurie išryškino lektinų svarbą, buvo padaryti 1960 metų pradžioje. Pirmasis buvo padarytas mokslininko Peter C. Nowell'o (1960 m.) Pensilvanijos universitete, Filadelfijoje. Jis atrado, kad pupelės lektinas (Phaseolus vulgaris), dar žinomas kaip fitohemagliutininas, yra mitogeniškas - tai reiškia, kad jis geba sukelti apoptozę limfocituose. Šis atradimas turėjo svarbią reikšmę imunologijoje. Po trumpo laiko tarpo buvo atrasta ir keletas kitų lektinų, kurie taip pat pasižymėjo mitogeniniu
aktyvumu. Svarbesnis buvo konkanavalino A atradimas, kuris taip pat pasižymėjo mitogeniniu aktyvumu, bet, skirtingai nuo fitohemagliutinino, jo aktyvumas galėjo būti nuslopintas mažų koncentracijų monosacharidų, kaip, pavyzdžiui, manozės. Šis atradimas padėjo įrodyti, kad
mitogeninė stimuliacija yra lektinų jungimosi prie cukrų limfocitų paviršiuje rezultatas ir prisidėjo prie ląstelės paviršiaus cukrų biologinio vaidmens tyrimų. Antras atradimas buvo padarytas Joseph C. Aub'o Masačiusetso ligoninėje Bostone. Jis atrado, kad kviečio gemalo agliutininas turi savybę agliutinuoti piktybines ląsteles. Po to sekė Max M. Burger'o iš Prinstono universiteto ir Leo Sachs'o bei Michael Inbar'o iš Veizmano instituto pranešimai apie konkanavaliną A, kuris pasižymėjo tomis pačiomis savybėmis [36].
Lektinai gali būti klasifikuojami atsižvelgiant į jų arba struktūrines arba funkcines savybes. Iki dabar yra atrasta daugybė gyvūnų lektinų struktūrinių šeimų.
Viena iš pagrindinių lektinų savybių yra jų gebėjimas jungtis prie specifinių sacharidų vietų. Paprastai lektinai yra tetramerai, sudaryti iš keturių beveik identiškų subvienetų [37]. Tai būdinga ir raudonųjų daržinių pupelių, Phaseolus vulgaris, lektinams. Jis yra sudarytas iš dviejų skirtingų subvienetų, nekovalentiškai sujungtų į penkis skirtingų formų tetramerus. Kadangi subvienetai turi skirtingą specifiškumą ląstelių paviršiaus receptoriams, kiekvienas derinys turi savitą funkciją.
Lektinų struktūriniai tyrimai prasidėjo 1970 metais, nustačius konkanavalino A kristalinę struktūrą. Pradinis progresas buvo lėtas ir jis užtruko iki 1989 metų. Pirmoji gyvūnų lektino struktūra -
galektinas - buvo nustatyta tik 1993 metais. Nuo tada buvo ištirtos daugelio gyvūnų lektinų struktūros - tiek jų laisvose formose, tiek kompleksuose su angliavandeniais [28]. Skirtingos lektinų struktūros pavaizduotos 2.1. paveiksle.
Paprastai lektinai yra klasifikuojami į keturias grupes, priklausomai prie ko jie jungiasi:
1. Gliukozės/manozės;
2. Galaktozės ir N-acetil-D-galaktozamino; 3. L-fukozės;
2.1 paveikslas. Skirtingų lektinų struktūros. A eilutėje matomi lektinų, gautų iš skirtingų šaltinių, monomerai, kurie turi bendrą liekaną. B eilutėje matomos lektinų ketvirtinės struktūros variacijos: pilkos sferos vaizduoja metalų jonus [36]
Lektinai pasižymi įvairiomis biologinėmis funkcijomis, svarbiomis gyvybiniams procesams. Endogeniniai lektinai dalyvauja daugelyje procesų, tokių kaip ląstelės atpažinimas, ląstelės-ekstraląstelinės matricos sąveika, lytinių ląstelių apvaisinimas, embriono vystymasis, ląstelių augimas, ląstelių dalijimasis, ląstelių adhezija ir migracija, apoptozė, imunomoduliacija ir uždegiminiai
procesai, homeostazė ir kt. [15].
Vienas iš svarbiausių lektinų sukeliamų efektų yra agliutinacija - procesas, kai tam tikri objektai, pavyzdžiui ląstelės, sulimpa į gabalus. Agliutinacija gali būti veikiama išorinių veiksnių, tokių kaip temperatūra ir kt.
Kai kurie lektinai, kaip manoma, atlieka apsigynimo funkcijas šeimininko organizme. Pavyzdžiui, augalų lektinai gali turėti insekdicidinį aktyvumą. [44].
Dar viena kai kurių lektinų savybė yra limfocitų mitogeninė stimuliacija. Labiausiai mitogeniški lektinai, tokie kaip konkanavalinas A ir fitohemagliutininas, stimuliuoja tik nuo užkrūčio liaukos
priklausomus limfocitus (T-ląsteles). Skirtingai nuo antigenų, kurie stimuliuoja tik 0,1% ar mažiau viso kiekio limfocitų, mitogeniniai lektinai stimuliuoja net apie 80% jiems jautrių ląstelių [40].
Mitogeninė stimuliacija įvyksta, kai lektinai prisijungia prie ląstelės paviršiaus cukrų [35]. Lektinai yra baltymai, kurie pasižymi ypatingu atsparumu proteolitiniams fermentams, kurie yra virškinimo trakte. Augalų lektinų stabilumas skrandyje buvo tirtas naudojant konkanavaliną A, fitohemagliutininą ir kviečio gemalo agliutininą. Buvo vykdyta keletas eksperimentų su žmonėmis, kurie valgė maistą, kuriame gausu lektinų kaip, pavyzdžiui, pomidorus ir raudonąsias pupeles. Lektinai atlaikė žarnų trakto rūgštingumą bei proteolitinių fermentų poveikį ir cirkuliacinę sistemą pasiekė reikšmingas lektinų kiekis su nesusilpnėjusia hemagliutinacija ir imunologiniu aktyvumu. Lektinai taip pat yra atsparūs daugeliui bakterijų, randamų žarnyno mikrofloroje. Tiriant virškinamąjį traktą buvo nustatyta, kad dauguma lektinų tikriausiai jungiasi prie angliavandenių epitelinėse ląstelėse. Ryškiausias
jungimasis yra plonajame žarnyne, bet jis vyksta visoje virškinimo sistemoje. Tai gali padaryti žalą maistinių medžiagų absorbcijai per žarnų sienelę dėl pasikeitusio žarnų pralaidumo. Maisto lektinai trukdo normaliam maisto absorbcijos procesui jiems sąveikaujant su gaurelių hidrolazėmis, kurios dalyvauja baltymų ir angliavandenių virškinime [44].
Daugiausia lektinų yra randama ankštiniuose augaluose, kurie yra svarbus maisto šaltinis tiek
žmonėms, tiek gyvūnams. Pupelių sėklose bendras baltymų kiekis siekia apie 17 - 23%, iš kurių 2,4 - 5% yra fitohemagliutininas.
Be ankštinių augalų, lektinai yra taip pat randami ir kituose augaluose, kurie yra naudojami maistui, kurių didžioji dalis yra vartojami žali, kaip vaisiai ar daržovės. Sojų pupelės kaupia 34% baltymų, iš kurių 0,8% yra lektinas. Žirniuose (Pisum sativum) lektinas sudaro 0,6% bendro baltymų kiekio (24 - 25%) [40].
Lektinai gali būti naudojami vėžinių ligų gydymui. Viena iš labiausiai ištirtų lektinų šeimų yra pupelės lektinai, kurie gali specifiškai jungtis prie vėžinių ląstelių paviršiaus. Vienas iš pupelės lektinų - konkanavalinas A - gali sukelti apoptozę tam tikros rūšies vėžinėse ląstelėse (melanomos ir kt.). Yra ir daugiau lektinų, kurie gali sukelti apoptozę kaip, pavyzdžiui, Polygonatum cyrtonema lektinas [8]. Polygonatum cyrtonema lektinas vėžinių ląstelių žūti gali sukelti ir per autofagiją [40].
2.2. Reaktyvios deguonies formos, jų poveikis vėžinėms ląstelėms
Laisvieji radikalai gali būti apibūdinti kaip bet kuri molekulių rūšis, gebanti egzistuoti nepriklausomai ir turi nesuporuotą elektroną. Būtent nesuporuotas elektronas ir nulemia laisvųjų radikalų savybes. Didžioji dalis laisvųjų radikalų yra nestabilūs ir labai reaktyvūs. Jie gali atiduoti elektroną molekulėms arba priimti iš jų elektroną, dėl ko jie gali elgtis kaip oksidantai arba
vandenilio peroksidas, superoksido anijono radikalas, singletinis deguonis, hipochloritas, azoto oksido radikalai ir peroksinitrito radikalas. Jie visi yra labai reaktyvūs ir gali ląstelių branduolyje ir ląstelių membranose pažeisti biologiškai svarbias molekules, tokias kaip DNR, baltymai, lipidai,
angliavandeniai, taip sukeldami ląstelių pažaidą. Laisvieji radikalai gali susidaryti normalių
metabolinių procesų metu, vystančių žmogaus organizme arba esant įvairiems išoriniams veiksniams, tokiems kaip rentgeno spinduliai, ozonas, rūkymas, oro teršalai, pramoninės cheminės medžiagos. Taip pat laisvieji radikalai nuolat susidaro ląstelėse vykstant tiek fermentinėms, tiek nefermentinėms reakcijoms. Manoma, kad oksidacinis stresas nulemia didžiąją dalį uždegiminių ligų, tokių kaip artritas, vaskulitas, glomerulonefritas ir kt. [26].
Reaktyvios deguonies formos (RDF) yra molekulių grupė, kuri susidaro ląstelėse kvėpavimo metu. Jos gali susidaryti ir augaluose fotosintezės metu. Reaktyvios deguonies formos ląstelėse susidaro mitochondrijose, chloroplastuose ir peroksisomose [6]. Reaktyvios deguonies formos, kurios paprastai susideda iš superoksido anijono radikalo (O₂˙⁻), singletinio deguonies, vandenilio peroksido (H₂O₂) ir labai reaktyvaus hidroksilo radikalo, dažniausiai yra matomos kaip ląstelėms, audiniams ir organizmams žalingų molekulės [39]. Normaliomis sąlygomis reaktyvios deguonies formos yra naudingos organizmui. Reaktyvios deguonies formos elgiasi kaip antriniai pernešėjai ląstelių signalizacijoje ir yra svarbios įvairiems biologiniams procesams, kurie vyksta normaliose ląstelėse, tokiems kaip proliferacija, uždegiminiai procesai ir imuninis atsakas, [38, 12]. Tačiau bet koks nukrypimas oksidacijos - redukcijos balanse gali sąlygoti įvairias žmogaus ligas, įskaitant vėžinius susirgimus [29]. Ląstelės turi mechanizmus, padedančius apsisaugoti nuo laisvųjų radikalų, tame tarpe ir reaktyviųjų deguonies formų, poveikio bei moduliuoti laisvųjų radikalų inicijuojamus
nepageidaujamo poveikio ląstelei efektus. Neutralizuojant laisvuosius radikalus dalyvauja pirminiai (superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė) bei antriniai (glutationo reduktazė,
glutationo S-transferazė, gliukozės 6-fosfato dehidrogenazė) antioksidaciniai fermentai [2]. Ląstelėse taip pat vyksta nefermentiniai procesai, t. y. reakcijos su laisvųjų radikalų „gaudikliais“, pavyzdžiui, vitaminais A, C, E, ubichinonais, karotinais. Taip pat svarbūs antioksidacinės sistemos komponentai yra ir merkapto grupę turintys peptidai (pvz., glutationas) bei kai kurie baltymai (pvz., šiluminio šoko sistemos baltymai) [1].
Jei antioksidacinės sistemos nepajėgia kovoti su reaktyviomis deguonies formomis, laisvųjų radikalų sukeltos grandininės reakcijos sutrikdo organizmo veiklą. Ši būsena vadinama „oksidaciniu stresu“. Jis prasideda dėl daugybės priežasčių, tokių kaip, pavyzdžiui, kvėpavimo grandinės inhibavimas;
pereinamųjų metalų (pvz., geležies jonų) koncentracijos padidėjimas; antioksidacinių vitaminų stoka. Oksidacinį stresą gali sąlygoti ir Fentono reakcija. Jos metu, esant kintamo valentingumo metalų jonams (pavyzdžiui, geležies arba vario), padidėja laisvųjų radikalų gamyba.
Geležies (arba vario) jonas atiduoda elektroną, ko pasekoje pasigamina labai toksiškas hidroksilo radikalas. Todėl geležies perteklius organizme gali sąlygoti įvairių ligų, pavyzdžiui,
neurodegeneracinių arba vėžinių, vystymąsi [17]. Oksidacinis stresas yra viena iš priežasčių, kodėl normalios ląstelės virsta piktybinėmis. Tačiau auglio audinyje selektyviai sukeltas oksidacinis stresas gali naikinti vėžines ląsteles arba slopinti jų augimą.
Ląstelinis oksidacinis stresas, oksidacijos - redukcijos padėties disbalansas gali sąlygoti RDF, kurios nėra detoksikuojamos ląstelinių antioksidantinių medžiagų, padidėjimą. RDF gali padaugėti ir kitų ligų metu, pavyzdžiui, išemijos atveju. Taigi, kaip yra žinoma, RDF, kai jų yra labai didelė koncentracija, gali pažeisti ląstelės baltymus, lipidus ir DNR sukeliant degeneratyvinius ar net mirtinus sužalojimus ląstelėse, kurie yra siejami su daugeliu žmonių ligų, įskaitant vėžį, širdies bei kraujagyslių ir
neurodegenerayvines ligas.
Paprastai RDF padaugėja vėžinėse ląstelėse dėl tam tikrų genų, sukeliančių piktybines mutacijas, aktyvacijos, santykinai sutrikusio kraujo aprūpinimo ar kitų pakitimų [27, 38].
2.2.1. Reaktyvių deguonies formų panaudojimas vėžinių ligų gydymui
Dėl savo anksčiau minėtų savybių RDF gali būti panaudojamos onkologinių ligų gydyme. Dauguma nechirurginių vėžio gydymo metodų, įskaitant chemoterapiją, radioterapiją ir fotodinaminę terapiją, indukuoja RDF produkciją dėl jų dalyvavimo ląstelės mirties paleidimo mechanizme. Dėl to RDF taip pat žudo vėžines ląsteles. Vėžinių ligų gydymui yra siūlomos abi pro- ir antioksidantinės terapijos [38]. RDF padidėjimas vėžinėse ląstelėse gali sutrikdyti jų ciklą, pagreitinti senėjimą ir net sukelti apoptozę [26]. Tokiu veikimo mechanizmu pasižymi daugelis chemoterapinių vaistų, tokių kaip doksorubicinas, cisplatina, etopozidas. Manoma, kad apoptozė įvyksta dėl padidėjusio
oksidacinio streso mitochondrijose, dėl ko išsiskiria citochromas C, vėliau yra aktyvuojamos kaspazės ir įvyksta ląstelės mirtis. RDF generaciją gali indukuoti ir mirties receptoriai, tokie kaip tumoro nekrozės faktoriaus (TNF) receptorius I, kuris ją sukelia per mitochondrijas, ko pasekoje yra
aktyvuojamos kaspazės ir sukeliama ląstelės mirtis [37]. Vėžinės ląstelės žūties pobūdis priklauso ir nuo laisvųjų radikalų indukuojamo oksidacinio streso lygio. Pavyzdžiui, esant mažoms vandenilio peroksido koncentracijoms indukuojama apoptozė, o esant didelėms vandenilio peroksido
koncentracijoms - nekrozė [1].
Nors ir laisvieji radikalai tokiu būdu neigiamai veikia vėžines ląsteles, jie taip pat žaloja ir sveikas ląsteles.
2.2.2. Reaktyvių deguonies formų įtaka vėžio vystymuisi
Tačiau RDF gali ir skatinti vėžio vystymąsi. Pavyzdžiui, maži vandenilio peroksido ir superoksido kiekiai stimuliuoja ląstelių proliferaciją daugelyje vėžio tipų [37].
RDF prisideda prie vėžio iniciacijos, skatinimo ir progresijos [39]. Vėžinėse ląstelėse RDF generacija yra gerokai padidėjusi, lyginant su nevėžinėmis ląstelėmis. Vienas svarbiausių veiksnių, lemiantis piktybinių navikų vystymąsi, yra RDF žalojantis poveikis DNR. RDF gali pažeisti DNR ir sukelti mutacijas, dėl ko gali prasidėti piktybinės ląstelių transformacijos. Labiausiai DNR žaloja hidroksilo radikalai. Oksidacinė DNR pažaida gali būti reikalinga, bet nepakankama vėžio vystymuisi [37]. RDF taip pat gali padėti vėžinėms ląstelėms metastazuoti. Tam, kad vėžinės ląstelės galėtų normaliai dalintis ir plisti, joms yra reikalingas geras aprūpinimas krauju. Todėl auglyje išsivysto atskiras kraujagyslių tinklas. RDF skatina šių kraujagyslių angiogenezę, veikdamos tam tikrus baltymus (pvz., HIF-1α) ir indukuodamos faktorių, atsakingų už angiogenezę, gamybą [34]. Taigi reaktyviosios deguonies formos gali ir skatinti, ir slopinti vėžio vystymąsi.
2.2.3. Antioksidantai maiste
Vienas iš svarbiausių antioksidantinės terapijos būdų yra maistas. Maistas, kuriame gausu antioksidantų, jau ilgą laiką buvo rekomenduojamas vėžinių susirgimų prevencijai ir profilaktikai. Netinkamas maistas gali sąlygoti laisvųjų radikalų gamybą, o tuo pačiu - ir vėžio vystymąsi. Geriausi tokio maisto pavyzdžiai yra alkoholis ir kepta mėsa. Todėl geriau yra vartoti labiau antioksidantinėmis savybėmis pasižymintį vaistą. Nemažai antioksidantų yra įvairiuose vaisiuose bei daržovėse, arbatoje (ypač žaliojoje) ir kt. Vieni iš pagrindinių antioksidantų yra vitaminas A, C bei E. Prie natūralių antioksidantų taip pat yra priskiriamas selenas ir karotenoidai. Antioksidantų yra ir įvairiose maisto papilduose, tačiau jų poveikis nėra toks pat, kaip antioksidantų, esančių žaliose vaisiuose ir daržovėse. Labai daug antioksidantų yra pupelėse ir mėlynėse. Dar viena antioksidantinėmis savybėmis
pasižyminti medžiaga yra resveratrolis (trans-3,4',5-trihidroksistilbenas). Tai yra fenolinis
antioksidantas, kurio daugiausiai randama vynuogėse. Resveratrolis ir kiti augalų polifenoliai gali aktyvuoti specifinius baltymus sirtuinus, tokius kaip SIRT1. Sirtuinai - tai nuo NAD⁺ priklausomų baltymų deacetilazių šeima, kuri gali padidinti DNR stabilumą [38]. Taigi maistas yra labai svarbus veiksnys vėžinių susirgimų profilaktikai, nes vėžio yra lengviau išvengti negu jį gydyti.
2.3. Vėžys
Vėžys yra sutrikęs, nenormalus ląstelių augimas, sukeltas įvairių pakitimų genų ekspresijoje, kas sąlygoja sutrikusią pusiausvyrą tarp ląstelių dalijimosi ir ląstelių mirties. To pasekoje atsiranda piktybinės ląstelės, kurios gali prasiskverbti į kitus audinius ir metastazuoti į tolimiausias organizmo vietas. Vėžį galima apibūdinti kaip ligų kompleksą, kurio vystymasis priklauso nuo daugelio
mechanizmų [29]. Jis pasireiškia tik aukštesniuosiuose daugialąsteliniuose organizmuose [31]. Nors vėžys gali atrodyti kaip daugelis skirtingų ligų su savitomis savybėmis, tačiau molekuliniame lygyje
visos vėžio formos turi daug bendrų dalykų. Tikslus vėžio mechanizmas dar nėra visiškai aiškus. Vėžys gali išsivystyti bet kurioje organų sistemoje. Egzistuoja įvairių teorijų apie onkologinių ligų kilmę. Oficialiojoje medicinoje labiausiai priimta manyti, kad vėžys kyla dėl pakitusios genų ekspresijos. Šiuos pakitimus gali sukelti keletas mechanizmų. Jų bendra savybė yra ta, kad jie visi veikia į DNR ir ją pažeidžia. Nors vėžys vis dar yra laikomas mirtina liga, jau yra sukurta nemažai gydymo metodų, kurie jei ir nepagydo, tai padeda kontroliuoti piktybinių ląstelių dauginimąsi ir ženkliai prailgina gyvenimo trukmę. Tačiau svarbiausia yra ankstyva diagnostika, nes kuo greičiau piktybinis auglys yra aptinkamas, tuo gydymas yra lengvesnis ir efektyvesnis. Dažniausiai
pavojingiausias yra ne pats auglys, bet metastazės. Apie 90% visų mirčių nuo vėžio sukelia metastazės, kurių mechanizmas dar nėra suprastas. Vėžinės ląstelės pereina į aplinkinius audinius, patenka į limfmazgius ir kraujo sistemą, kuriomis yra išnešiojamos po visą organizmą ir pradeda vystytis kitose audiniuose [4, 10].
Vėžys yra viena iš pagrindinių mirties priežasčių visame pasaulyje. Tai labiau išsivysčiusių valstybių liga. Ekonomiškai išsivysčiusiuose valstybėse vėžys yra antroji pagal dažnumą mirties priežastis po širdies ir kraujagyslių ligų. Tarp vyrų labiausiai paplitęs yra plaučių ir prostatos vėžys, o tarp moterų - krūtinės vėžys. Didžiausias mirtingumas yra nuo plaučių vėžio [13]. Vėžio vystymąsi įtakoti gali įvairūs veiksniai. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis 2012 metais pasaulyje buvo užfiksuota daugiau kaip 14 milijonų naujų vėžio atvejų ir daugiau kaip 8 millijonai mirčių [42].
Ekonomiškai labiau išsivysčiusiuose šalyse naujų vėžio atvejų yra užfiksuojama mažiau negu silpniau išsivysčiusiuose šalyse ir mirtingumas ekonomiškai stipresnėse valstybėse taip pat yra mažesnis. Taip yra dėl geresnių gyvenimo sąlygų, labiau išvystytos ankstyvosios diagnostikos, pažangesnių gydymo metodų.
Lietuvoje vėžys taip pat yra labai aktuali problema. Lietuvoje 2012 metais buvo diagnozuota 251,9 vėžio atvejų 100 tūkstančių gyventojų [41]. Lietuva pagal vėžio statistiką pirmauja Europoje. Taip gali būti dėl įvairių priežasčių: rūkymas, nesveika mityba, fizinio aktyvumo stoka, profilaktinis sveikatos nesitikrinimas pas gydytojus, dėl ko pastebimos vėlesnės vėžio stadijos ir pasveikimo galimybės mažėja. Tačiau Lietuvoje vis labiau populiarėja ankstyvos diagnostikos programos (pavyzdžiui, krūties vėžio moterims ir prostatos vėžio vyrams). Tai turėtų pagerinti statistikos rezultatus.
Vėžio vystymąsi gali įtakoti įvairūs veiksniai. Vieni iš pagrindinių yra rūkymas, cheminės medžiagos, radiacija, UV spinduliuotė (odos vėžys), genetiniai defektai ir kt. Apibendrinant galima sakyti, kad tai, kas pažeidžia DNR, gali sukelti onkologines ligas.
Egzistuoja daugybė cheminių medžiagų, kurios gali sukelti vėžį. Šios medžiagos vadinamos kancerogenais. Viena iš labiausiai paplitusių tokių medžiagų yra tabakas, kuris dažniausiai sukelia plaučių vėžį. Tabakas sukelia nuo 20% iki 30% visų mirčių nuo vėžio ir apie 87% mirčių nuo plaučių
vėžio. Rūkantiems vyrams rizika susirgti plaučių vėžiu yra 23 kartus, o moterims 17 kartų didesnė negu nerūkantiems. Kaip kancerogenas gali veikti ir etilo alkoholis. Prie onkologinių ligų vystymosi gali prisidėti ir aplinkos tarša bei kitos cheminės medžiagos, tokios kaip įvairūs metalai, nitratai, pesticidai ir net vaistai [5].
Be cheminių medžiagų, vėžinius procesus gali įtakoti ir įvairių tipų spinduliuotė. Labiausiai
paplitusios ir didžiausią pažaidą žmogaus DNR daro dvi spinduliuotės rūšys - rentgeno spinduliai ir ultravioletinė (UV) spinduliuotė. UV spinduliai dažniausiai sukelia odos vėžį.
Onkologinių ligų vystymuisi įtakos gali turėti ir paveldimumas. Jeigu šeimoje ar giminėje yra sergančiųjų vėžiu, tai susirgti kam nors iš artimųjų ratų rizika padidėja.
Vėžį gali sukelti ir įvairūs mikroorganizmai, kaip bakterijos ar virusai. Pavyzdžiui, hepatito C virusas yra siejamas su kepenų vėžiu; H. pylori infekcija su skrandžio vėžiu [11].
Vėžio diagnostika kiekvienais metais vis tobulėja. Onkologinių ligų nustatymui gali būti naudojami įvairūs žymenys, diagnostinė aparatūra, kaip ultragarsas, kompiuterinė tomografija, magnetinis rezonansas, pozitronų emisijos tomografas (PET) ir kt.
Vėžinių ligų gydymui oficialiojoje medicinoje dažniausiai yra taikomi trys pagrindiniai gydymo būdai: gydymais vaistais (chemoterapiniais arba imunoterapiniais); spindulinė terapija ir chirurginis
gydymais. Tačiau vis labiau didėja susidomėjimais gydymu augaliniais preparatais - fitoterapija. Beveik visi chemoterapiniai vaistai veikia citotoksiškai ir pažeidžia ne tik vėžines, bet ir sveikas ląsteles. Labiausiai yra pažeidžiamos greitai besidalijančios ląstelės - plaukų folikulų, skrandžio, odos ir kaulų čiulpų. To pasekoje kyla įvairūs nepageidaujami reiškiniai kaip plaukų slinkimas, pykinimas, vėmimas ir kt. Dažnai netgi yra manoma, kad chemoterapija labiau kenkia negu padeda. Tai tik dar labiau skatina ieškoti alternatyvų, tarp kurių yra ir lektinai.
2.3.1. Ląstelės mirties mechanizmai
Ląstelei pasiekus gyvybė ciklo pabaigą ją ištinka mirtis. Ląstelės mirties mechanizmai dažniausiai būna trijų tipų: apoptozė (I tipo), autofagija (II tipo) ir nekrozė (III tipo).
Apoptozė dar kitaip gali būti vadinama programuota ląstelės mirtimi. Pusiausvyra tarp ląstelės dalijimosi ir ląstelės mirties yra labiausiai svarbi organizmo vystymuisi ir jo funkcijų palaikymui. Jeigu ši pusiausvyra sutrinka, tai gali sąlygoti įvairius patologinius procesus, tokius kaip sutrikusi embriogenezė, neurodegeneracinės ligos ar vėžio vystymasis. Dėl to pusiausvyra tarp ląstelės gyvybės ir mirties yra griežtai kontroliuojama ir klaidingi elementai yra efektyviai pašalinami [7]. Apoptozės metu gali būti stebimi trys pagrindiniai biocheminiai pakitimai: 1) kaspazių aktyvacija; 2) DNR ir
baltymų žuvimas; 3) membranų pakitimai ir fagocitinių ląstelių atpažinimas. Į vėžį galima žiūrėti kaip į sėkmingų genetinių pakitimų rezultatą, kurių metu normali ląstelė virsta piktybine [22, 43].
Yra du pagrindiniai apoptozės keliai: išorinis ir vidinis. Išorinis kelias yra inicijuojamas vykstant sąveikai tarp specifinių ligandų ir paviršiaus receptorių, tokių kaip, pavyzdžiui, naviko nekrozės faktoriaus (TNF) receptorius 1 (TNFR1), TNF receptorius 2 (TNFR2) [33]. Vidinis kelias yra
aktyvuojamas įvairių dirgiklių, tokių kaip, pavyzdžiui, DNR pažaida, hipoksija, ląstelės atsiskyrimas, citotoksiniai vaistai, kurie veikia ląstelės viduje. Atsparumas apoptozei yra vėžiui būdingas požymis. Yra keletas mechanizmų, kurių dėka vėžinės ląstelės išvengia apoptozės: 1) sutrikęs balansas tarp proapoptotinių ir antiapoptotinių baltymų; 2) sumažėjusi kaspazės funkcija; 3) sumažėjusi mirties receptorių signalizacija. Pagrindiniai baltymai, atsakingi už proapoptotinį ir antiapoptotinį veikimą, yra Bcl - 2 šeima. Jie randasi mitochondrijos viršutinėje membranoje. Padidėjusi antiapoptotinių baltymų ekspresija arba sumažėjusi proapoptotinių baltymų ekspresija, arba abiejų kombinacija, gali sąlygoti apoptozės sutrikimą. Sutrikęs balansas tarp Bcl - 2 šeimos baltymų yra svarbus veiksnys ir glioblastomos vystymuisi. Dar vienas baltymas, dalyvaujantis apoptozės procese, yra p53, arba dar kitaip vadinamas tumoro baltymas 53. Defektai p53 baltyme yra susiję su daugiau kaip 50 procentų visų onkologinių susirgimų. Taip pat yra apoptozės proteinų inhibitoriai. Sutrikusi jų ekspresija yra stebima daugelyje vėžinių susirgimų (pavyzdžiui, kasos vėžinėse ląstelėse sutrikusi šių baltymų ekspresija taip pat atsakinga ir už atsparumą chemoterapijai).
Apoptozėje viena svarbiausių vaidmenų atlieka kaspazės, todėl sumažėjęs jų kiekis arba sutrikusi jų funkcija gali sąlygoti apoptozės sumažėjimą ir vėžinių ląstelių vystymąsį.
Apoptozės procese svarbūs yra ir mirties receptoriai bei jų ligandai. Jie dalyvauja išoriniame apoptozės kelyje. Šie receptoriai turi vadinamąją „mirties sritį“, kuri gali būti sužadinama „mirties signalu“. Anomalijos mirties receptoriuose gali sukelti išorinio apoptozinio kelio išnykimą. Todėl vėžinių ligų gydymas dažnai būna susijęs su apoptozės reguliacija (pavyzdžiui, vaistai, kurie veikia Bcl - 2 šeimos arba p53 baltymus) [43].
Kitas ląstelės mirties mechanizmas yra autofagija. Autofagija yra ląstelinis atsakas į stresą arba badavimą, kurio metu ląsteliniai baltymai, organelės ir citoplazmą yra praryjami, suvirškinami ir perdirbami tam, kad būtų palaikomas ląstelės metabolizmas. Vėžinėse ląstelėse autofagija užtikrina jų ilgesnį gyvavimo periodą, esant metaboliniam stresui [30].
Dar vienas ląstelės mirties mechanizmas yra nekrozė. Nors kokie veiksniai sukelia nekrozę dar nėra visiškai aišku, manoma, kad ji įvyksta dėl tam tikrų pakitimų mitochondrijose, dažniausiai dėl reaktyvių deguonies formų produkcijos [21]. Nekrozė nuo apoptozės skiriasi tuo, kad nekrozės metu ląstelės staigiai praranda membraninius potencialus. Negebėjimas išlaikyti šių elektrocheminių potencialų sąlygoja citoplazmos išsipūtimą, plazminės membranos plyšimą ir citolizę [45].
2.3.2. Glioblastoma
Viena iš labiausiai paplitusių centrinės nervų sistemos (CNS) piktybinių navikų yra glioma. O pati agresyviausia ir dažniausiai pasitaikanti glioma yra glioblastoma (lot. Glioblastoma multiforme) [25]. Glioblastoma yra kilusi iš astrocitų - CNS ląstelių [12]. Glioblastoma gali būti pirminė ir antrinė - išsivysčiusi iš kitų, žemesnės stadijos gliomų. Vyrai glioblastoma serga dažniau negu moterys. Šis piktybinis auglys dažniau pasitaiko vyresnio amžiaus žmonėms [3]. Didžioji dalis glioblastoma
sergančių pacientų (apie 87 proc.) yra 55 - 87 metų amžiaus. Vidutinis pacientų, turinčių glioblastomą, gyvenimo trukmės vidurkis yra 12 mėnesių. Tik 3 - 5% pacientų išgyvena ilgiau kaip 3 metus. Nors tikslios glioblastomos atsiradimo priežastys yra nežinomos, yra išskiriami įvairūs faktoriai, kurie gali sąlygoti šio auglio vystymąsi: elektromagnetinis laukas, jonizuojanti spinduliuotė, mityba, infekcijos ir kt. [21]. Glioblastoma gali pasireikšti įvairiais neurologiniais simptomais: pykinimu, vėmimu, galvos svaigimu ar net traukuliais. Glioblastomos kaip ir daugelio kitų smegenų piktybinių auglių gydymas yra sudėtingas. Pirmiausia taip yra dėl kraujo - smegenų barjero, kuris saugo smegenis nuo įvairių žalojančių veiksnių, tokių kaip cheminės medžiagos, infekcijos ir kt. Dėl šio barjero į smegenis negali patekti daugelis chemoterapinių preparatų. Pagrindinis vaistinis preparatas naudojamas glioblastomos gydymui yra temozolomidas, kuris gali būti derinamas kartu su spinduline terapija [14]. Komplikuotas glioblastomos gydymas verčia ieškoti vis naujų metodų, kurie būtų labiau efektyvesni.
I II
2.2 paveikslas. Mikroskopinis glioblastomos (Glioblastoma multiforme) vaizdas. Pirmoje ir antroje nuotraukose matomas histologinis glioblastomos pjūvis. Antros nuotraukos kairėje pusėje matoma nekrozinė sritis (NE), o dešinėje antros nuotraukos pusėje matoma kraujagyslių proliferacijos sritis (VP) [19, 46].
3. Tyrimų metodika ir medžiagos
3.1. Medžiagos
1. Lektinas, išskirtas iš Phaseolus vulgaris L.(Sigma-Aldrich) 2. Krienų peroksidazė (HPR) (Sigma-Aldrich)
3. Amplex Red (Sigma-Aldrich)
4. Ląstelių auginimo terpė (DMEM) (Sigma-Aldrich) 5. Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich) 6. Fosfatinis druskos buferis (PBS) (Sigma-Aldrich)
7. Sudėtinis antibiotikų tirpalas (Penicilino – streptomicino tirpalas) (Sigma-Aldrich) 8. Tripano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich)
9. Propidžio jodidas (C27H34I2N4) (Sigma-Aldrich)
10. Izolektino dažai (Sigma-Aldrich)
11. Bisbenzimido dažai (Hoechst 33342) (Sigma-Aldrich)
3.2. Ekstraląstelinių laisvųjų radikalų matavimas
Eksperimentams buvo naudojamas šviežiai paruoštas pupelių lektino tirpalas (1mg/ml).
Tyrimui reikalingas DMEM terpės kiekis išpilstytas į 96 šulinėlių juodas plokšteles plokščiu dugnu (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Taip pat į šulinėlius buvo dėtas skirtingas (1μg, 5 μg ir 10 μg) tiriamo lektino tirpalo kiekis. Į kontrolinius šulinėlius lektino tirpalas nedėtas. Matavimai buvo atlikti iš karto po reagentų sudėjimo ir po 30, 60, 90 ir 120 min. inkubacijos. Prieš pat matavimą į šulinėlius pridėta Ampliflu raudonojo (AmplexRed) (5 μM) ir krienų peroksidazės (2 U/ml). Šio metodo esmė - krienų peroksidazė katalizuoja vandenilio peroksido redukciją iki vandens ir AmplexRed, reaguodamas su vandeniu, virsta fluorescuojančiu rezorufinu. Matuota fluorescencija fluorimetru Ascent Fluoroskan (Thermo Fisher Scientific, Inc.), sužadinimo bangos ilgis 544 nm, emisijos - 590 nm.
3.3. Ląstelių sėjimo metodika
Bandymui buvo naudota ląstelių kultūra C6, gauta iš pelių smegenų auglio Glioblastoma multiforme. Kaip ląstelių auginimo terpė buvo naudojamas DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium; Sigma Aldrich, D5796) su gliutamatu. Į terpę pridedama antibiotiko Penicilino/Streptomicino tirpalo (10000 IU/ml – 10000 µg/ml) (Sigma, P0781) tam, kad nesidaugintų mikroorganizmai. Ląstelės buvo
laikomos termostate, 37 ⁰C temperatūroje, 5 proc. CO₂.
Ląstelių atskyrimui buvo naudojamas 0,25% tripsino/EDTA tirpalas (Sigma, T4049). Tripsinas yra fermentas, kuris suardo tarpląstelines jungtis. Tripsinas buvo inhibuojamas FBS (fetal bovine serum)
tirpalu. Prieš atliekant bandymą ląstelės buvo nupurtomos nuo ląstelių auginimo flakonų. Atšokusios ląstelės buvo centrifuguojamos kambario temperatūroje 5 minutes 350 apsisukimų per minutę greičiu (centrifuga Eppendorf).
3.4. Ląstelių tankio nustatymas
Ląstelių kiekiui įvertinti buvo naudojamas tripano mėlis. Jeigu ląstelių membranos yra pažeistos, tripano mėlis praeina pro jas ir nudažo ląsteles mėlyna spalva. Pro sveikų ląstelių membranas tripano mėlis nepraeina. Taip žuvusios ląstelės yra atskiriamos nuo gyvų. Ląstelių skaičiavimui yra
naudojamas hemocitometras. 20 µl tripano mėlio yra sumaišoma su tokiu pačiu tūriu ląstelių suspensijos.
3.4 paveikslas. Hemocitometro kamera. Visa kamera yra padalinta į devynis 1.0 mm x 1.0 mm kvadratus, atskirtus vienas nuo kito trigubomis linijomis. Kiekvienas kvadratas yra 1 mm² ploto. Stebima pro šviesinį mikroskopą ir skaičiuojamas ląstelių skaičius keturiose langeliuose, kur susikerta dvi trigubos linijos. Mėlynai nusidažiusios ląstelės yra neskaičiuojamos, nes yra žuvusios.
Ląstelių skaičius 1 mililitre yra apskaičiuojamas pagal formulę: n = (a + b + c + d)*4*2*5000, kur:
n - ląstelių skaičius/ml;
a, b, c, d - langeliai, kuriose skaičiuojamas ląstelių skaičius; 5000 = c - konstanta;
2 - skiedimų skaičius.
3.5. Ląstelių gyvybingumo tyrimai
3.5.1. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu
Šis metodas yra pagrįstas spalvine reakcija, kai geltonos spalvos 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas, arba MTT, redukuojasi į netirpų, violetinės spalvos formazaną. Tetrazolo redukcija vyksta dėl nuo NAD(P)H priklausomų oksidoreduktazių.
Nuo ląstelių, kurios augo lėkštelėje 24h, buvo nupilta DMEM terpė ir tada ląstelės buvo praplautos fosfatiniu druskos buferiu (PBS). Pašalinus buferį į ląsteles buvo įdėta 180 µl HBSS kartu su 20 µl 5 mg/ml MTT dažu, ištirpintu PBS. Ląstelės buvo inkubuotos 37 °C temperatūroje 2 valandas. Tada dažas buvo pašalintas ir susiformavę kristalai ištirpinti 100 µl 0,2% DMSO tirpale. Lėkštelė buvo laikoma 15 minučių tamsoje. Absorbcija buvo matuota prie 570 nm bangos ilgio ir standartinio bangos ilgio 620 nm. Matavimai buvo atlikti spektrofotometru.
3.5.1 paveikslas. MTT virtimas formazanu. Veikiamas mitochondrinės reduktazės geltonos spalvos MTT yra redukuojamas į violetinės spalvos formazaną.
3.5.2. Neuronų žūties įvertinimas fluorescencinės mikroskopijos metodu
Pokyčiai buvo vertinami fluorescencinės mikroskopijos metodu. Tyrimui atlikti buvo naudotas
fluorescencinis mikroskopas OLYMPUS IX71S1F-3 (Japonija). Į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta po 1 µl propidžio jodido dažų, po 4 μl bisbenzimido dažų. Ląstelės, kurių branduoliai buvo homogeniški ir švytėjo mėlyna spalva, buvo vertinamos kaip sveikos ir gyvybingos. Ląstelių branduoliai, kurie buvo nudažyti propidžio jodido dažu ir švytintys rausvai buvo vertinami kaip nekrotiniai, o ląstelės, kurios buvo paveiktos Hoechst 33342 dažu, švytėjo ryškiai žydra spalva ir buvo vertinamos kaip apoptotinės.
3.6. Viduląstelinių ROS kiekio įvertinimas
Laisvųjų radikalų gamyba buvo matuota su nefluorescenciniu 2', 7' - dichlorofluoresceino diacetatu (DCFH - DA). Jis patenka į ląsteles ir yra deacetilinamas nespecifinių esterazių į nefluorescuojantį 2', 7' - dichlorofluoresceiną (DCFH), kuris oksiduojančių medžiagų poveikyje yra oksiduojamas į labai fluorescuojantį junginį - dichlorofluoresceiną, kuris gali būti nustatomas fluorescencinės analizės metodu. Fluorescencijos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas viduląstelinių laisvųjų radikalų kiekiui.
Buvo išsėta po 30.000 ląstelių į šulinėlius ir laikoma parą (24 h). Tada jos buvo praplautos PBS ir inkubuojamos su DCFH - DA (10 µmol/l) 37 °C temperatūroje 30 minučių tamsoje. Matavimai buvo atlikti fluorimetru: sužadinimo bangos ilgis - 485 nm, emisijos bangos ilgis - 538 nm.
3.7. Statistinė analizė
Rezultatai pateikiami, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Statistinei analizei buvo atliktas ANOVA testas su Tukey post-testu naudojant SigmaPlot 9.0 versiją Windows OS (Systat Software Inc.). Skirtumas tarp dviejų reikšmių, kai P<0,05 buvo priimamas, kaip statistiškai reikšmingas.
4. Rezultatai ir jų aptarimas
Vandenilio peroksidas yra vienas pagrindinių laisvųjų radikalų, kuris yra generuojamas ląstelėse normos ir ypač patologijos atvejais.
4.1. Vandenilio peroksido kiekio matavimai
4.1.1 pav. Vandenilio peroksido kalibracinė kreivė.
Iš pradžių vandenilio peroksido kalibracinei kreivei sudaryti buvo matuota 5 - 180 µM vandenilio peroksido koncentracijos. Peroksido tirpalas buvo gaminamas 3% vandenilio peroksido tirpalo (Sigma-Aldrich). Matavimui buvo naudojamos fluorimetrinės plokštelės, kurių šulinėlių tūris yra po 200 µl. Į šulinėlį buvo dedamas apskaičiuotas terpės kiekis, skirtingos koncentracijos vandenilio peroksido tirpalo, Amplex Red bei HPR tirpalų. Lėkštelės buvo dedamos į fluorimetrą ir matuojamos. Kiekvieno bandinio tirta po n = 3 - 5 pakartotinius mėginius. Iš gautų rezultatų brėžiamas vandenilio peroksido kalibracinis grafikas (4.1.1 pav.).
kontrolė 1 mikrogramas 5 mikrogramai 10 mikrogramų Vanden ilio perok sido koncentrac ija, µM 0 20 40 60 80 100 120 140 160
4.1.2 pav. Lektino įtaka vandenilio peroksido kiekiui.
Tyrimo metu buvo bandoma nustatyti, ar skirtingų koncentracijų lektinas neutralizuoja vandenilio peroksidą. 1; 5 ir 10 mikrogramų lektino tirpalai buvo lyginami su kontrole. Duomenys pateikti 4.1.2 pav. Statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo pastebėta. Tai reiškia, kad įvairių koncentracijų lektinas neveikia neutralizuojančiai vandenilio peroksido kiekio.
Gomez su bendraautoriais tyrė makrofagų aktyvumą upėtakių periferiniame krayjyje matuojant reaktyviųjų deguonies formų (RDF) ir azoto monoksido (NO) gamybą paveikus juos
fitohemagliutininu (PHA) ir bakterijų lipopolisacharidu (po 10 µg/ml). RDF ir NO aktyvumai buvo matuojami po 1, 24 ir 48 valandų. Rezultatai parodė, kad lyginant eksperimentines grupes su kontrole, nei fitohemagliutininas, nei lipopolisacharidas reikšmingai nesumažino RDF ir NO gamybos net ir po 48 valandų [16].
4.2. Vandenilio peroksido matavimas DMEM auginimo terpėje
4.2 pav. Lektino poveikis laisvųjų radikalų gamybai.
Buvo vertinamas skirtingų koncentracijų - 1; 5 ir 10 mikrogramų - lektino poveikis laisvųjų radikalų generacijai ląstelių augimo terpėje. Gauti duomenys buvo lyginami su kontrole. Buvo matuojamas fluorescencijos intensyvumas. Duomenys pateikti 4.2 pav. Ląstelėse yra medžiagų kaip, pavyzdžiui, kintamo valentingumo metalo jonai, kurie gali oksiduoti biologines medžiagas ir tokiu būdu skatinti laisvųjų radikalų generaciją. 4 pav. matyti, kad skirtingų koncentracijų lektinas pats neskatino laisvųjų radikalų gamybos. Net ir praėjus parai (24 h) statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo pastebėta. Taigi galima daryti išvadą, kad lektinai neturi įtakos laisvųjų radikalų gamybai net ir didesnėmis
koncentracijomis. Laikas, h 0 5 10 15 20 25 30 V an de ni lio pe roksido kon cen tracija , µ M 0 5 10 15 20 25 30 35 kontrolė 1 mikrogramas 5 mikrogramai 10 mikrogramų
4.3. Glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumo pokyčiai
kontrolė 1 mikrogramas 5 mikrogramai 10 mikrogramų
Gy vy bing ų ląs telių sk aič ius , proc . 0 20 40 60 80 100 120 * * * p 0.05 lyginant su kontrole
4.3 pav. Ląstelių gyvybingumo tyrimas.
Kitoje tyrimo dalyje buvo bandoma nustatyti, ar lektinas mažina C6 ląstelių kultūros gyvybingumą. Duomenys pateikti 4.3 pav. 1; 5 ir 10 mikrogramų lektino koncentracijos buvo
lyginamos su kontrole. Buvo matuojamas C6 ląstelių gyvybingumas po 24 valandų. Paveikus ląsteles 1 mikrogramo koncentracijos lektinu, po 24 valandų gyvybingų liko 93,94%6.48% ląstelių. Paveikus 5 mikrogramų koncentracijos lektinu po 24 valandų gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo beveik 2 kartus (57,21%11.16% gyvybingų vėžinių ląstelių). O paveikus ląsteles 10 mikrogramų
koncentracijos lektinu po 24 valandų gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo apie 13 kartų (7,57%1.25% gyvybingų vėžinių ląstelių). Taigi, galima daryti išvadą, kad didėjant lektino koncentracijai ląstelių gyvybingumas sparčiai mažėja.
Hassan su bendraautoriais tyrė skirtingos koncentracijos žemės riešuto lektino citotoksinį poveikį trims skirtingoms ląstelių kultūroms: HeLa, HaCat ir Hep2. HeLa ir Hep2 yra vėžinės ląstelių kultūros, o HaCat - normali žmogaus ląstelių kultūra. Gyvybingumui nustatyti naudotas MTT testas.
Grafikas parodo kaip kinta visų trijų ląstelių kultūrų gyvybingumas, paveikus jas žemės riešuto agliutininu. Buvo imtos 7 skirtingos lektino koncentracijos ir lyginamos su kontrole. Didėjant lektino koncentracijai visų ląstelių kultūrų gyvybingumas mažėja, bet lektinas stipriau veikia vėžinių ląstelių kultūrų - HeLa ir Hep2 - gyvybingumą, kai tuo tarpu normalios žmogaus ląstelių kultūros - HaCat - gyvybingumas mažėja lėčiau ir tam reikalingos didesnės lektino koncentracijos lyginant su vėžinėmis ląstelių kultūromis [18].
Taigi šie ir mūsų tyrimai parodė, kad skirtingų koncentracijų lektinai daro įtaką vėžinių ląstelių gyvybingumui.
4.4. Viduląstelinio RS kiekio pokyčiai C6 ląstelėse
P 0.05 lyginant su kontrole Laikas, min. 0 20 40 60 80 100 120 140
Fluori
m
et
riniai v
ienet
ai
0 1 2 3 4 5 6 7 8 kontrolė 1 mikrogramas 5 mikrogramai 10 mikrogramai * * * * *4.4 pav. Viduląstelinių laisvųjų deguonies radikalų kiekio pokytis.
Buvo tiriamas viduląstelinio RF kiekio pokyčiai C6 kulrtūros ląstelėse. Imti penki laiko intervalai: iš pradžių (0 minučių); po 30 minučių; po 60 minučių; po 90 minučių ir po 120 minučių. Trys skirtingos lektino koncentracijos - 1; 5 ir 10 mikrogramų - buvo lyginamos su kontrole. Duomenys pateikti 4.4 pav. 1 mikrogramo koncentracijos lektinas visuose laiko intervaluose
statistiškai reikšmingai nepadidino viduląstelinio RF kiekio C6 ląstelėse. 5 mikrogramų koncentracijos lektinas iš pradžių nedidino viduląstelinio RF kiekio, bet jau po 30 minučių jis, lyginant su kontrole, statistiškai reikšmingai padidino RF kiekį C6 ląstelėse. Po 60, 90 ir 120 minučių 5 mikrogramų koncentracijos lektinas taip pat didino viduląstelinį RS kiekį ląstelėse. 10 mikrogramų koncentracijos lektinas visuose laiko intervaluose didino viduląstelinį RS kiekį C6 ląstelėse. Taigi mūsų tyrimas rodo, kad skirtingos lektino koncentracijos veikia RS pokyčius ląstelėse ir didėjant koncentracijai, didėja viduląstelinių RF koncentracija ląstelėse.
Carvalho su bendraautoriais tyrė lektino ArtinM, gauto iš Artocarpus heterophyllus (stambiojo duonmedžio), poveikį žmogaus mieloidinės leukemijos ląstelėms. Vienas iš tyrimo tikslų buvo nustatyti, kaip lektinas ArtinM veikia laisvųjų deguonies radikalų generaciją. Buvo pasirinkta NB4 ląstelių linija.
Laisvųjų radikalų gamyba buvo nustatyta matuojant DCFH - DA oksidacinį virtimą į DCH fluorospektrofotometru.
ArtinM lektino paveiktos NB4 ląstelės generavo didelį (2 kartus didesnį lyginant su kontrole) viduląstelinių laisvųjų radikalų kiekį, panašų į arseno trioksido - teigiamos kontrolės, generuojamą ROS kiekį. Tuo tarpu papildomai glutationu (viduląsteliniu antioksidantu) paveiktose ląstelėse nenustatytas reikšmingas viduląstelinių laisvųjų radikalų kiekis. Papildomai α - tokoferoliu (vitaminu E) paveiktose ląstelėse nustatytas laisvųjų radikalų kiekis artimas kiekiui ląstelių, paveiktų ArtinM lektinu [9].
Mokslininkai Won - Ho Kim, Won Bong Park ir kt. tyrė korėjietiško amalo lektino poveikį
hepatokarcinomos ląstelėms. Vienas iš tyrimo tikslų buvo išsiaiškinti, ar paprastojo amalo agliutininas (VCA), išskirtas iš korėjietiško amalo, sukelia apoptozę vėžinėse ląstelėse. Tyrimui buvo pasirinktos Hep3B ląstelės, kurios buvo veikiamos skirtingomis VCA dozėmis skirtingais laiko intervalais ir rezultatai buvo lyginami su kontrole. Ląstelės buvo inkubuojamos 12 valandų su VCA esant arba nesat antioksidantui N - acetilcisteinui. Po 30 minučių inkubacijos su DCFH - DA (5 µM) buvo matuojamas viduląstelinės fluorescencijos intensyvumas RS kiekiui nustatyti. Buvo nustatyta, kad VCA sukelia
žymiai didesnę RS produkciją Hep3B ląstelėse, lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis (46,62% kontrolinėse ląstelėse ir 73,38% Hep3B ląstelėse) [20].
Taigi šių mokslininkų ir mūsų tyrimai parodė, kad lektinai skatina viduląstelinių laisvųjų radikalų gamybą.
4.5. Neuronų žūties įvertinimas fluorescencinės mikroskopijos metodu
Buvo siekiama ištirti, kaip lektinai veikia glioblastomos ląsteles. Tyrimui naudotas fluorescencinės mikroskopijos metodas. Duomenys pateikti 4.5 pav.
4.5 pav. Lektino paveiktos glioblastomos ląstelės. Ląstelės tirtos šviesiniu mikroskopu.
Hoechst 33342 dažas gali pereiti per membraną ir paveikti DNR. Juo paveiktos ląstelės švytėjo ryškiai žydra spalva ir buvo vertinamos kaip apoptotinės. Propidžio jodido dažas taip pat gali paveikti DNR, bet negali pereiti membranos. Šiuo dažu paveiktos ląstelės švytėjo rausvai ir buvo vertinamos kaip nekrotinės. Ląstelės (neuronai), kurių branduoliai buvo homogeniški ir švytėjo mėlyna spalva, buvo vertinamos kaip sveikos ir gyvybingos.4.5.1. Kontrolinis (be lektino) bandinys - be fluorescencijos. Nuotraukoje nestebima jokių pakitimų, ląstelės yra sveikos.
4.5.2. Kontrolinis (be lektino) bandinys - su fluorescencija. Nuotraukoje yra matomos sveikos ląstelės. Nestebima nei nekrozės, nei apoptozės požymių.
4.5.3. Bandinys su lektinu (1 pavyzdys) - be fluorescencijos. Nuotraukoje galima stebėti daug apoptotinių ląstelių (balta spalva).
4.5.4. Bandinys su lektinu (1 pavyzdys) - su fluorescencija. Paveikus ląsteles lektinu, nuotraukoje galima matyti daug ryškiai žydros spalvos ląstelių, kurios yra vertinamos kaip apoptotinės.
4.5.5. Bandinys su lektinu (2 pavyzdys) - be fluorescencijos. Nuotraukoje yra stebima ląstelių žūtis (baltos spalvos ląstelės).
4.5.6. Bandinys su lektinu (2 pavyzdys) - su fluorescencija. Nuotraukoje yra stebima ryški apoptozė (ryškiai žydros spalvos ląstelės) ir šiek tiek stebima nekrozė (rusvos spalvos ląstelės).
4.5.7. Bandinys su lektinu (3 pavyzdys) - be fluorescencijos. Nuotraukoje galima stebėti žuvusias ląsteles, kurios sukimba.
4.5.8. Bandinys su lektinu (3 pavyzdys) - su fluorescencija. Nuotraukoje yra matomos tiek apoptotinės (ryškiai žydros spalvos), tiek nekrotinės (rusvos spalvos) ląstelės.
Taigi paveikus glioblastomos ląsteles lektinu buvo sukelta tiek jų apoptozė, tiek nekrozė.
4.5. Rezultatų aptarimas
1. Naudojant skirtingos koncentracijos (1 - 10 µg) lektiną, išskirtą iš Phaseolus vulgaris L., buvo nustatyta, kad lektinas, nepriklausomai nuo savo koncentracijos, neveikia neutralizuojančiai vandenilio peroksido kiekio. Tyrimas buvo palygintas su užsienio mokslininkų tyrimu, kuriame buvo tiriama žemės riešuto lektino įtaka laisvųjų deguonies radikalų gamybai. Tyrimo metu nebuvo nustatyta reikšmingo lektino poveikio šiems radikalams.
2. Tiriant skirtingos koncentracijos (1 - 10 µg) lektino poveikį RF kiekiui ląstelių auginimo terpėje nebuvo pastebėta reikšmingo skirtumo tarp lektino ir kontrolės. Taigi lektinas nedarė įtakos RF generacijai DMEM terpėje.
3. Glioblastomos ląstelių gyvybingumas, paveikus jas 1 - 10 µg koncentracijų pupelės lektinu, sparčiai mažėjo, priklausomai nuo lektino koncentracijos. Esant 5 µg koncentracijos lektinui, ląstelių
gyvybingumas sumažėjo beveik 2 kartus (iki 57,21%), o paveikus 10 µg koncentracijos lektinu, ląstelių gyvybingumas sumažėjo beveik 13 kartų (iki 7,57%). Duomenys buvo palyginti su užsienio mokslininkų atliktu tyrimu, kuriame buvo tiriamas žemės riešuto lektino poveikis vėžinių ir normalios
žmogaus ląstelių kultūros gyvybingumui. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad vėžinių ląstelių kultūrų gyvybingumas, didėjant lektino koncentracijai (nuo 1,5 µg iki 100 µg), mažėjo žymiai sparčiau lyginant su normalia žmogaus ląstelių kultūra.
4. Viduląstelinių laisvųjų radikalų generacija C6 ląstelėse, paveikus jas 1 - 10 µg koncentracijų lektinu, didėjo, priklausomai nuo lektino koncentracijos. 5 µg ir 10 µg koncentracijų lektinai
statistiškai reikšmingai padidino viduląstelinių RF kiekį - apie 1,3 karto. Duomenys buvo palyginti su kitų autorių duomenimis. Buvo tiriama ArtinM lektino įtaka viduląstelinių laisvųjų deguonies radikalų generacijai mieloidinės leukemijos ląstelėse ir nustatyta, kad ArtinM lektinas daugiau kaip 2 kartus lyginant su kontrole) padidino viduląstelinių RDF kiekį.
5. Fluorescencinės mikroskopijos metodu buvo nustatyta, kad lektinai žudo glioblastomos ląsteles sukeldami jų apoptozę bei nekrozę.
5. Išvados
1. Lektinas, išskirtas iš Phaseolus vulgaris L, naudotas įvairiomis (1 - 10 µg) koncentracijomis, nekeitė vandenilio peroksido koncentracijos ląstelių augimo terpėje. Taigi jis nepasižymi vandenilio peroksidą neutralizuojančiu ir jo generaciją skatinančiu poveikiu.
2. Viduląstelinių laisvųjų radikalų gamyba C6 ląstelėse, paveikus jas skirtingų (1 - 10 µg)
koncentracijų lektinu, padidėjo statistiškai reikšmingai (apie 1,3 karto). Taigi lektinai, priklausomai nuo koncentracijos, skatina viduląstelinių radikalų generaciją glioblastomos C6 ląstelėse.
3. C6 ląstelių kultūros gyvybingumas, paveikus ją 1 - 10 µg koncentracijos Phaseolus vulgaris lektinu po 24 h, sumažėjo nuo 7 iki 93 procentų. Taigi lektinai, priklausomai nuo koncentracijos, mažina glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumą.
4. Phaseolus vulgaris lektinas žudo glioblastomos ląsteles, sukeldamas jų apoptozę.
5. Taigi, norint gauti tikslesnius rezultatus, reikėtų toliau tęsti tyrimus su lektinais ir jų poveikiu vėžinėms ląstelėms. Tyrimams galėtų būti naudojami skirtingi lektinai ir jų koncentracijos bei skirtingos vėžinių ląstelių kultūros. Tyrimo metu gauti rezultatai galėtų būti naudojami kartu su kitų tyrėjų gautais rezultatais, pavyzdžiui, konferencijose.
Literatūros sąrašas
1. Didžiapetrienė J., Uleckienė S., Griciūtė L., Valuckas K., Atkočius V., Kadziauskas J. Antioksidantai onkologijoje. Nauda ir vartojimo rizika. Monografija. Vilnius: Lietuvos mokslų akademija; 2004; p. 19-23.
2. Praškevičius A., Ivanovienė L., Stasiūnienė N., Burneckienė J., Rodovičius H., Lukoševičius L., Kondratas D. Biochemija. Kaunas: KMU leidykla; 2003; p. 274-76
3. Adamson C., Kanu, O. O., Mehta, A. I., Di C., Lin N., Mattox, A. K. & Bigner, D. D.
„Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going“. 2009: 1061-1083.
4. Aktipis C., Randolph M. Nesse. „Evolutionary foundations for cancer biology“. Evolutionary applications 2013; 6(1): 144-159.
5. Anand P., Kunnumakara, A. B., Sundaram C., Harikumar, K. B., Tharakan, S. T., Lai, O. S., ... & Aggarwal, B. B. „Cancer is a preventable disease that requires major lifestyle changes“.
Pharmaceutical research 2008; 25(9): 2097-2116.
6. Apel, Klaus, Heribert Hirt. „Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction“. Annu. Rev. Plant Biol. 2004; 55: 373-399.
7. Bröker, L. E., Kruyt, F. A. & Giaccone G. „Cell death independent of caspases: a review“. Clinical Cancer Research 2005; 11(9): 3155-3162.
8. Bao, J. K., Bian, H. J. & Liu B. „Plant lectins: potential antineoplastic drugs from bench to clinic“. Cancer Letters 2010; 287(1): 1-12.
9. Carvalho, F. C., Soares, S. G., Tamarozzi, M. B., Rego, E. M. & Roque-Barreira, M. C. „The recognition of N-glycans by the lectin ArtinM mediates cell death of a human myeloid leukemia cell line“. PloS one 2011; 6(11): e27892.
10. Chaffer, Christine L., Robert A. Weinberg. „A perspective on cancer cell metastasis“. Science 2011; 331(6024): 1559-1564.
biology 2009; 8(7): 67.
12. Facchino, Sabrina, Mohamed Abdouh, Gilbert Bernier. „Brain cancer stem cells: Current status on glioblastoma multiforme“. Cancers 2011; 3(2): 1777-1797.
13. Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin DM, Forman D., Bray F. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2013.
14. Fialho Arsenio M., Prabhakar S., Sunil M. & Sidharth M. „Glioblastoma multiforme: novel therapeutic approaches“. ISRN neurology 2012; 2012: 10.
15. Ghazarian, Haike, Brian Idoni, Steven B. Oppenheimer. „A glycobiology review: carbohydrates, lectins and implications in cancer therapeutics“. Acta histochemica 2011; 113(3): 236-247 [cituota 2013.11.12]. Prieiga per internetą: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3027850. 16. Gomez, Leonardo A., Raul Cortes, Carlos T. Smith. „Effect of PHA and LPS on the Activity of Nonspecific Cytotoxic Cells and Macrophages of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)“ [cituota 2014.04.30]. Prieiga per internetą: http://www.scielo.cl/pdf/gayana/v77n1/art07.pdf
17. Halliwell, Barry, Matthew Whiteman. „Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean?“ British journal of
pharmacology 2004; 142.2:231-255.
18. Hassan, Md Khurshidul. „Isolation and characterization of peanut (Arachis hypogaea) lectin and study of its anti-cancer properties“ [cituota 2014.04.30] . Prieiga per internetą:
http://ethesis.nitrkl.ac.in/5175/1/411LS2047.pdf
19. Juliette Siegfried. „An Overview of Astrocytoma“ [cituota 2014.01.05]. Prieiga per internetą: http://www.brain-surgery.com/an-overview-of-astrocytoma.
20. Kim, W. H., Park, W. B., Gao B. & Jung, M. H. „Critical role of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential in Korean mistletoe lectin-induced apoptosis in human hepatocarcinoma cells“. Molecular pharmacology 2004; 66(6): 1383-1396.
21. Krex D., Klink B., Hartmann C. von Deimling, A., Pietsch T., Simon M., ... & Schackert G. „Long-term survival with glioblastoma multiforme“. Brain 2007; 130(10): 2596-2606.
22. Kroemer G., Galluzzi L., Vandenabeele P., Abrams J., Alnemri, E. S., Baehrecke, E. H., ... & Melino G. „Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell
Death 2009“. [cituota 2013.05.01]. Prieiga per internetą:
http://www.nature.com/cdd/journal/v16/n1/full/cdd2008150a.html
23. Kumar, K. K., Chandra, K. L., Sumanthi J., Reddy, G. S., Shekar, P. C. & Reddy B. „Biological role of lectins: A review“. Journal of Orofacial Sciences 2012; 4(1): 20.
24. Lam, Sze Kwan, Tzi Bun Ng. „Lectins: production and practical applications“. [cituota 2013.04.20]. Prieiga per internetą: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3016214 25. Lim, S. K., Llaguno, S. R. A., McKay, R. M. & Parada L. F. „Glioblastoma multiforme: a perspective on recent findings in human cancer and mouse models“. BMB reports 2011; 44(3): 158. 26. Liou, Geou-Yarh, Peter Storz. „Reactive oxygen species in cancer“. Free radical research 2010; 44(5): 479-496.
27. Lobo V., Patil A., Phatak A. & Chandra N. „Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health“. Pharmacognosy reviews 2010; 4(8): 118.
28. Loris, Remy. „Principles of structures of animal and plant lectins“. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects 2002; 1572(2): 198-208.
29. Ma, Qiang. „Advances in Mechanisms of Anti-oxidation“. Discovery medicine 2014; 17(93): 121-130.
30. Mathew, Robin, Vassiliki Karantza-Wadsworth, Eileen White. „Role of autophagy in cancer“. Nature Reviews Cancer 2007; 7(12): 961-967.
31. Meng X., Zhong J., Liu S., Murray M. & Gonzalez-Angulo A. M. „A new hypothesis for the cancer mechanism“. Cancer and Metastasis Reviews 2012; 31(1-2): 247-268.
32. Nilsson C. L. (Ed.). „Lectins: Analytical Technologies: Analytical Technologies“. Elsevier; 2011; p . 1-10.
33. Reuter S., Eifes S., Dicato M., Aggarwal B. B. & Diederich M. „Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells“. Biochemical
pharmacology 2008; 76(11): 1340-1351.
34. Reuter S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M. & Aggarwal, B. B. „Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked?“ Free Radical Biology and Medicine 2010; 49(11): 1603-1616. 35. Rosenfeld, Simon, Izet Kapetanovic. „Systems biology and cancer prevention: all options on the
