1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
PAULIUS BALČIŪNAS
I KVĖPAVIMO GRANDINĖS KOMPLEKSO SLOPIKLIŲ VAIDMUO APSAUGANT SMEGENŲ LĄSTELES NUO IŠEMIJOS SUKELTOS ŽŪTIES
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: dr. Kristina Škėmienė Konsultantė prof. dr. Vilmantė Borutaitė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 PADĖKA ... 6 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 7ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 7
SANTRUMPOS ... 8
SĄVOKOS ... 9
ĮVADAS ... 10
1. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 12
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
2.1 Smegenų išemija ... 13
2.2 Insulto patofiziologija ... 13
2.3 Smegenų struktūra ... 14
2.4 Metforminas ir fenforminas ... 15
2.5 Organotipinės pjūvių kultūros ... 17
3. TYRIMO METODIKA ... 19
3.1 Tyrimų pobūdis... 19
3.2 Eksperimentinis modelis... 19
3.3 Hipoksijos sukėlimas ... 20
3.4 Reoksigenacija ... 20
3.5 Ląstelių gyvybingumo nustatymas CGC ir smegenų nuopjovų kultūrose ... 21
3.6 LDH aktyvumo augimo terpėje nustatymas ... 21
3.7 Pro – uždegiminių veiksnių (NO) nustatymas ląstelių augimo terpėje ... 21
3.8 Vaizdų analizavimas ... 22
3.9 Statistinė analizė ... 22
4. DARBO REZULTATAI ... 23
4.1 Fenformino ir metformino poveikis CGC kultūrai ... 23
4.2 Fenformino ir metformino poveikis organotipinių pjūvių kultūroms. ... 25
4.2.1 Fenformino ir metformino poveikis organotipinių pjūvių kultūrų neuronų gyvybingumui ... 25
4.2.2 Fenformino ir metformino poveikis LDH kitimui išemijos ir reoksigenacijos metu. ... 28
4.2.3 Fenformino ir metformino poveikis mikroglijos ląstelių tankiui smegenų pjūvių kultūrose. ... 29
3 5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33 6. IŠVADOS ... 35 8. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 36
4
SANTRAUKA
Paulius Balčiūnas
I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių vaidmuo apsaugant smegenų ląsteles nuo išemijos sukeltos ląstelių žūties
Tyrimo tikslas: Ištirti apsauginį I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį išemijos sukeltai ląstelių žūčiai.
Uždaviniai: . 1. Nustatyti I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį mišriai neuronų-glijos kultūrai. 2. Nustatyti I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį apsaugant smegenis nuo išemijos sukeltos neuronų žūties organotipinių smegenų pjūvių kultūrose. 3. Nustatyti I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį organotipinėms smegenų pjūvių kultūroms po
išemijos/reoksigenacijos.
Metodika: CGC kultūros naudotos nustatyti didžiausią neuronų žūties nesukeliančią fenformino ir metformino koncentraciją. Rezultatai vertinti fluorescencinės mikroskopijos būdu, nustatyta didžiausia neuronų nekrozės nesukėlusi fenformino ir metformino koncentracija. Smegenų nuopjovų kultūros paruoštos iš 5-7 dienų Wistar veislės žiurkių galvos smegenų pusrutulių. Pridėjus fenformino ar metformino simuliuotos hipoksija/reoksigenacija. Rezultatai vertinti fluorescencinės mikroskopijos būdu, augimo terpėje matuotas NO ir LDH kiekis. Atlikta gautų duomenų analizė. Statistiškai reikšmingi grezultatai laikyti kai p<0,05.
Rezultatai: Įvertinus fenformino ir metformino poveikį CGC kultūrai nustatyta didžiausia ląstelių žūties nesukėlusi fenformino koncentracija - 0,25mM ir metformino koncentracija – 0,5mM.. Fenforminas organotipinėse pjūvių kultūrose apsaugojo neuronus nuo išemijos sukeltos žūties po hipoksijos terpėje su 2DG ir po hipoksijos/reoksigenacijos. Metformino apsauginis poveikis pasireiškė po hipoksijos/reoksigenacijos terpėje esant 2DG. Fenforminas apsaugojo nuo LDH išsiskyrimo po hipoksijos terpėje su 2DG. Nustatyta, kad fenforminas padidino mikroglijos tankį terpėje be 2DG po hipoksijos. NO pokyčių nebuvo.
Išvados: Fenforminas (0,25mM) apsaugojo neuronus nuo hipoksijos ir nuo hipoksijos/reoksigenacijos sukeltos neuronų žūties, o metforminas apsaugo tik nuo hipoksijos/reoksigenacijos. Fenforminas padidino mikroglijos tankį po hipoksijos bei apsaugojo nuo LDH išsiskyrimo.
5
SUMMARY
Paulius Balčiūnas
Protective effect of respiratory chain complex I inhibitors on brain cells from ischemia-induced cell death
Aim of the research: To investigate the protective effect of respiratory chain complex I inhibitors on ischemia-induced cell death.
Objectives: 1. To identify the effect of respiratory chain complex I inhibitors on mixed neuronal-glial cell culture. 2. To investigate the protective effect of respiratory chain complex I inhibitors on
ischemia-induced neuronal cell death in Organotypic brain slice cultures. 3. To investigate the protective effect of respiratory chain complex I inhibitors on organotypic brain slice cultures under ischemia/reperfusion.
Methods: In the study CGC cultures were used to determine maximum non-lethal phenformin and metformin concentration to neurons. Results were obtained by fluorescence microscopy; maximum non-lethal concentrations to neurons were determined. Organotypic brain slice cultures were prepared from cerebral hemispheres of 5-7-day old Wistar rats. Phenformin and metformin were added to the cell culture medium, hypoxia/reperfusion conditions were simulated. Results were evaluated by fluorescence microscopy, NO, and LDH concentrations in cell culture medium were measured.
Statistical analysis was performed, A value of p < 0.05 was considered a statistically significant result. Results: Our results have shown that maximum non-lethal concentration to neurons of phenformin is 0.25mM and of metformin – 0.5mM. Phenformin (0.25mM) in organotypic brain slice cultures protected neurons from ischemia-induced cell death during hypoxia with 2DG in the culture medium, and during hypoxia/reoxygenation. Metformin (0.5mM) protected neurons during
hypoxia/reoxygenation with 2DG. Phenformin protected from releasing of LDH in the culture medium during hypoxia with 2DG. Results have shown that phenformin increased microglia density during hypoxia without 2DG. There was no effect on NO concentration.
Conclusions: Phenformin (0,25mM) protected neurons from hypoxia and hypoxia/reoxygenation-induced cell death. Metformin protected neurons only from hypoxia/reoxygenation. Phenformin increased microglia density during hypoxia and protected from releasing of LDH.
6
PADĖKA
Noriu padėkoti magistro darbo vadovei dr. Kristinai Škėmienei už pagalbą ir rūpestį atliekant eksperimentus bei ruošiant darbą. Taip pat dėkoju Neuromokslų instituto biochemijos prof. dr. Vilmantei Borutaitei, už suteiktą galimybę atlikti magistrinį darbą Neuromokslų institute.
7
INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Pritarimo registracijos nr. BEC-MF-361.8
SANTRUMPOS
2DG – 2-deoksigliukozės
AMP - adenozino 5'-monofosfatas
AMPK -5’adenozino monofosfato aktyvuojamą proteinkinazė ATP - adenozino 5'-trifosfatas;
CGC - Mišri žiurkės smegenėlių neuronų–glijos ląstelių kultūra DNR- Deoksiribonukleorūgštis
ICAM-1 – intraląstelinė adhezijos molekulė LDH - laktatdehidrogenazė
MNPP - nespecifinio laidumo pora NF-KB - Branduolio faktorius kappa B NMDA - N-metil-D- aspartato receptoriai NO – azoto oksidas
rtPA -rekombinantinis audinių plazminogeno aktyvatorius s.f.v. - santykiniai fluorescencijos vienetai
9
SĄVOKOS
Anabolinis procesas – ląstelių medžiagų apykaitos procesas, kurio metu iš smulkesnių molekulių formuojamos stambesnės.
Katabolinis procesas – ląstelių medžiagų apykaitos procesas, kurio metu stambesnės molekulės skaidomas į smulkesnes.
Neurovaskulinis vienetas – funkcinis smegenų vienetas, kurį sudaro: smulkių kraujagyslių endotelis, astrocitai, pericitai, neuronai ir ekstraląstelinis matriksas.
Kraujagyslės okliuzija – kraujagyslės spindžio obstrukcija, dažniausiai sukeliama embolo ar trombo.
Reperfuzija – kraujotakos atstatymas po buvusio jos nutrūkimo.
Tromboembolija – kraujagyslėje susiformavusio krešulio atitrūkimas, kuris sukelia kitos kraujagyslės spindžio obstrukciją.
10
ĮVADAS
Insultas – viena dažniausių mirties ir neįgalumo priežasčių pasaulyje. Skaičiuojama, kad kasmet pasaulyje registruojama apie 13 milijonų naujų insulto atvejų [1]. Lietuvoje 2019 metų duomenimis tarp darbingo amžiaus žmonių insultas yra 6 pagal dažnumą mirties priežastis [2]. Šiuo metu dėl medicinos pažangos padidėjus išgyvenamumui po insulto, svarbi problema tampa insulto liekamieji reiškiniai, neigiamai paveikiantys gyvenimo kokybę [3]. Kita opi problema – limituotos insulto gydymo galimybės. Šiuo metu patvirtintas ir plačiai naudojamas medikamentinis kraujotaką atstatantis gydymas sergant išeminiu insultu – rekombinantinis audinių plazminogeno aktyvatorius, kurio skyrimo laiko intervalas tik 4,5 val. nuo simptomų pradžios. Mokslininkai iš Portugalijos nustatė, kad laiku atvykusių ir gydymą šiuo medikamentu gavusių pacientų dalis sudarė tik 6% visų išeminiu insultu susirgusių pacientų [4]. Įvertinus insulto keliamus padarinius iškyla poreikis toliau nagrinėti galimybes ne tik, kiek įmanoma sumažinti mirčių nuo insulto skaičių, bet ir sumažinti liekamuosius reiškinius turinčius, skaudžių pasekmių individo sveikatai. Šiam tikslui nuolat ieškoma naujų gydymo metodų, kurių viena iš krypčių – medikamentų pasižyminčių neuroprotekciniu poveikių paieška. Nors atlikus daugelį studijų su įvairiomis neuroprotekcinėmis savybėmis pasižyminčiomis medžiagomis teigiamas klinikinis efektas stebėtas tik keliuose tyrimuose, neuroprotekcija insulto atveju išlieka daug žadanti gydymo dalis [5].
Vienas iš plačiai vartojamų medikamentų, sulaukęs dėmesio kaip neuroprotekcinių savybių turintis medikamentas – I kvėpavimo grandinės komplekso mitochondrijose slopiklis metforminas. Tiriant pacientus sergančius cukriniu diabetu ir vartojančius metforminą buvo pastebėtas mažesnis insultų skaičius lyginant su pacientais kurie nevartojo metformino [6]. Taip pat pastebėtas metforminą vartojusių pacientų ir patyrusių insultą neurologinių pažeidimų sumažėjimas ir pagėrinėjusi pacientų pasveikimo prognozė [7]. Atlikti in vivo tyrimai su graužikais parodė, kad metforminas pasižymi neuroprotekcinėmis savybėmis mažindamas pažeidimą per kelis molekulinius mechanizmus [8], tuo tarpu apie metformino poveikį pačiam smegenų audiniui insulto metu pakankamai duomenų nėra.
Įvertinus atliktus tyrimus ir tyrimų trūkumą, nagrinėjant metformino poveikį neuronams ir kitoms smegenų audinio ląstelėms kyla poreikis ištirti metformino poveikį smegenų audinio ląstelėms, pasitelkiant labiausiai smegenų struktūrą atspindinčius modelius. Vienas iš metodų pasižymintis smegenų struktūrą ir ląstelių tarpusavio ryšius išsaugančiomis savybėmis – organotipinės smegenų pjūvių kultūros. Šis metodas mokslininkų naudotas tiriant neuronų vystymosi modelį, regeneraciją, patologines būkles – insultą, Alzheimerio ligą [9].
Šiuo tyrimu bus siekiama ištirti I kvėpavimo komplekso slopiklių apsauginį poveikį smegenų ląstelės simuliuojant insulto sukeliamą išemiją smegenų ląstelėmis, naudojant organotipinių smegenų
11 pjūvių kultūrų modelį. Tyrimui bus naudojami I kvėpavimo komplekso slopikliai – metforminas ir fenforminas.
12
1. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Ištirti apsauginį I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį išemijos sukeltai ląstelių žūčiai Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį mišriai neuronų-glijos kultūrai 2. Nustatyti I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį apsaugant smegenis nuo išemijos sukeltos neuronų žūties organotipinių smegenų pjūvių kultūrose
3. Nustatyti I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį organotipinėms smegenų pjūvių kultūroms po išemijos/reoksigenacijos.
13
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1 Smegenų išemija
Insultas - vienas svarbiausių sveikatos problemas sukeliančių veiksnių, pasaulyje užimantis antrąją vietą tarp dažniausių mirties priežasčių [10]. Vidutiniškai 80% visų insultų yra išeminės kilmės dėl tromboembolinės okliuzijos smegenų arterijose. Sutrikus kraujotakai dėl okliuzijos kraujagyslės maitinamoje zonoje pasireiškia deguonies ir energijos trūkumas, kurį lydi besiformuojantys reaktyvaus deguonies junginiai, glutomato išsiskyrimas, viduląstelinio kalcio kaupimasis bei prasidedantis
uždegiminis procesas. Dėl šių išemijos sukeltų reakcijų vyksta negrįžtamas smegenų audinio pažeidimas – nekrozė [11-12].
Išeminė penumbra – plotas išeminėje smegenų audinio zonoje, kuris supa nekrozės zoną. Nustatyta, kad penumbros zonoje aprūpinimas krauju insulto metu siekia iki 35% aprūpinimo esant fiziologinėms sąlygoms. Sumažėjus aprūpinimui neuronai išlieka gyvybingi, bet yra kritiškai
pažeidžiami tolimesnių patologinių procesų, todėl pritaikius tinkamą gydymą šią zoną galima išsaugoti nuo negrįžtamo neuronų pažeidimo [13].
Šiuo metu išskiriamos dvi pagrindinės gydymo kryptys – neuroprotekcija ir reperfuzija. Reperfuzijai naudojami trombolitiniai medikamentai arba mechaninės priemonės pašalinti trombą ir atstatyti okliuzavusių kraujagyslių spindžius. Vienintelis medikamentinis maisto ir vaistų
administracijos (Food and Drugs administration) patvirtintas gydymas šiuo metu – rtPA, kuris pagerina klinikines insulto išeitis. Šis gydymas galimas tik apie 5% pacientų dėl savo siauro 4,5 h terapinio lango, todėl naujo gydymo strategijos itin aktualios [12].
2.2 Insulto patofiziologija
Pagrindiniai išemijos metu smegenų pažeidimą sukeliantys mechanizmai– glutomato
toksiškumas, patologinis mitochondrijų atsakas, susidarantys laisvieji radikalai, baltymų struktūros ir uždegiminiai pokyčiai [14]. Nors šie veiksniai sukelia smegenų ląstelių žūti, bet taip pat žinoma, kad dalyvauja ir smegenų audinio atsistatyme po pažeidimo [15].
Galvos smegenų išemijos metu pasireiškia gliukozės ir deguonies trūkumas, kuris lemia jonų transporto ir joninės homeostazės sutrikimą. Tai yra pagrindiniai ankstyvieji sutrikimai ląstelėje [14,16], dėl kurių pasireiškia perteklinė neurono depoliarizacija, išsiskiria per didelis kiekis
jaudinamųjų neurotransmiterių – aminorūgšties glutomato, sumažėja neurotransmiterių reabsorbcija iš tarpląstelinio tarpo. Šis procesai lemia N-metil-D- aspartato receptorių (NMDA) aktyvaciją, kyla glutomato toksiškumo sukelta apoptozė [14,17].
14 Dėl greito kalcio judėjimo į mitochondriją ir glutomato toksiškumo pasireiškia mitochondrijų disfunkcija, atsiveria mitochondrijų nespecifinio laidumo poros (MNPP) , išskiriamas citochromas C [18], kuris lemia nuo kaspazių priklausomą ląstelės apoptozę [14-19].
Pagrindiniai laisvųjų radikalų šaltiniai smegenų išemijos metu – sutrikęs mitochondrijų metabolizmas, elektronų nutekėjimas mitochondrijų transporto metu, smegenų išemijos sukeltas uždegiminis atsakas. Susidarę laisvieji radikalai sukelia mikrovaskulines okliuzijas, patenka į smegenų audinio ląsteles ir reaguoja su ląstelių viduje esančiomis molekulėmis, sukelia riebalų peroksidaciją, baltymų oksidaciją, pažeidžia deoksiribonukleorūgštį (DNR). Taip pat tiesiogiai pažeidžiama ląstelės plazminė ir mitochondrijų membranos. Peroksiduotų riebalų produktai toksiškai veikia neuronus, pažeistos membranos nebeatlieka transportinės funkcijos ir tai lemia neuronų apoptozę. [20].
Šiuolaikiniai tyrimai su graužikais parodė, kad reaktyvių deguonies junginių susidarymas ne tik sukelia pažeidimus smegenų išemijos fazėje, bet taip pat ir dalyvauja neurologinės funkcijos
atsistatyme gijimo fazėje [21]. Tyrimuose nustatyta, kad reaktyvūs deguonies junginiai pasižymi ne tik citotoksinėmis savybėmis, bet ir yra atpažįstami kaip signalinės molekulės angiogenezės procese, todėl šie junginiai pasižymi apsauginėmis nuo audinio pažeidimo savybėmis, reguliuoja ir kontroliuoja naujai susidariusių kraujagyslių stabilumą [22].
2.3 Smegenų struktūra
Neuronai sudaro didelę dalį ląstelių galvos smegenyse. Tyrimais nustatyta, kad žmogaus smegenyse neuronų vidutiniškai yra 86.1 ± 8.1 milijardų, o ne neuroninių ląstelių 84.6 ± 9,8 milijardo [23]. Pagrindinė neuronų funkcija – impulso perdavimas generuojant veikimo potencialą. Pirmasis neurono biofizikinis modelis buvo pristatytas Hodgkin ir Huxley dar 1952 metais. Tyrimais nustatyta, kad neuronai generuoja tiek motorinius ritmus, tiek nereguliariu ritmu pasižymintį aktyvumą galvos smegenų žievėje [24]. Dėl savo funkcijos – impulsų generavimo – neuronams riekia daug energijos, yra labai jautrūs gliukozės ir adenozino 5'-trifosfato (ATP) trūkumui, todėl jie yra pirmosios ląstelės, kurios žūsta sutrikusios kraujotakos zonoje [25-26].
Glija sudaro apie pusę visų centrinės nervų sistemos ląstelių. Gliją sudaro radialinė glija, astrocitai, oligodendrocitai ir mikroglija. Žinoma, kad šios glijos ląstelės reguliuoja nervų sistemos susiformavimą, sinapsių susidarymą, kitų smegenų ląstelių funkciją [27].
Astrocitai – didžiausią dalį glijos sudarančios ląstelės centrinėje nervų sistemoje [28]. Astrocitų funkcija labai plati: palaiko smegenų architektūrinę struktūrą, sudaro kraujo-smegenų barjerą, užtikrina neuronų metabolizmą, stabilizuoja ląstelių tarpusavio komunikaciją, apsaugo nuo oksidacinio streso [29].
In vitro tyrimais nustatyta, kad išeminio insulto metu astrocitai yra atsparesni deguonies ir
15 kuris gali padidinti išemijos sukeltą pažeidimo plotą bet tuo pačiu pasireiškia ir neuroprotekciniu poveikiu sustabdant pažeidimo plitimą. Astrocitai taip pat dalyvauja angiogenezėje, neurogenezėje, sinapsių susidaryme ir aksonų remodeliavime po išeminio insulto. [28].
Kitos daug mokslinių tyrimų sulaukiančios glijos ląstelės – mikroglija. Tai smegenų audinyje esančios imuninės ląstelės, dalyvaujančios ne tik imuniniame atsake bet formuojant neuronų ryšius smegenyse. Mikroglija atlieka svarbų vaidmenį sinapsių susidaryme, sinapsių funkcijoje, smegenų laidų sistemoje. Tyrimai su graužikais parodė, kad mikroglija veikia neuronų sinapses per CX3CR1 transmembraninį glikoproteiną, kuris sąveikauja su CX3CL1, transmembraniniu glikoproteinu esančiu ant neurono paviršiaus. Tyrime nustatyta, kad esant CX3CR1-CX3L1 sąveikos trūkumui sutrinka sinapsių brendimas ir genėjimas hipokampe [31]. Kitame tyrime su graužikais parodyta, kad mikroglija atlieka sinapsių genėjimą - šalina mažiau aktyvias sinapses klasikiniu komplemento kaskados aktyvavimo keliu [32].
Kita mikroglijos funkcija – žuvusių neuronų fagocitozė. In vivo tyrimo metu nustatyta kad mikroglija migruoja į pažeidimo sritį smegenyse, atpažįsta apoptozės būdu žūstančias ląsteles ir pašalina jas fagocitozės būdu [33]. Smegenų išemija sukelia uždegimą, kuris yra vienas pagrindinių patofiziologinių elementų. Jam prasidėjus pirmiausia aktyvuojama mikroglija. Vėliau pažeidimo vietą infiltruoja imuninės ląstelės. Tyrimais nustatyta, kad mikroglijos ląstelės ir infiltruojantys makrofagai pašalina žuvusias ląsteles ir audinių detritą, susidariusį dėl išemijos žuvus audiniams [33-34].
2.4 Metforminas ir fenforminas
Metforminas ir fenforminas kilę iš natūraliai gaunamos medžiagos galegino, kuris išskiriamas iš augalo Ožiarūtčio (lot. Galega). Galeginas yra per daug toksiška vartojimui, todėl sukruti mažiau toksiški sintetiniai derivatai – metforminas ir fenforminas. Metforminas ypatingas tuo, kad yra kilęs iš farmakologinį poveikį turinčio vaistinio augalo, o ne sukurtas kaip medžiaga veikianti konkretų taikinį. Todėl metforminas įtvirtintas klinikinėje praktikoje, kaip saugus ir efektyvus vaistas, dar prieš detalius veikimo mechanizmo tyrimus [35].
a. Galeginas b. Metforminas c. Fenforminas
16 Metforminą sudaro dvi guanido funkcinės grupės sujungtos per bendrą azoto molekule.
Fenforminas savo struktūroje turi papildomą alkilinę grandinę. [36]. Pagrindinis metformino veikimo mechanizmas – I komplekso slopinimas kvėpavimo grandinėje mitochondrijose. I komplekso veiklos sutrikdymas stabdo ATP gamybą mitochondrijose [37,38]. Studijos parodė, kad 5’adenozino
monofosfato aktyvuojama proteinkinazė (AMPK) pagal AMP/ATP koncentraciją reguliuoja ląstelių ir viso kūno energijos balansą [37]. Padidėjus AMP/ATP santykiui ląstelės, AMPK ATP naudojančius anabolinius procesus pakeičia ATP produkuojančiais kataboliniais procesais, kurių metu
stimuliuojamas gliukozės sunaudojimas, riebalų rūgčių oksidacija, slopinama gliukozės produkcija kepenyse [37,38].
Tyrimai parodė, kad metforminas ir fenforminas efektyviausiai mitochondrijų kvėpavimą inhibuoja per I kvėpavimo kompleksą, bet fenforminas yra 10 kartų efektyvesnis. Taip pat fenforminas,
skirtingai negu metforminas, inhibuoja ir II bei IV kvėpavimo kompleksą [39]. Nors metforminas pasižymi mažesniu efektyvumu, jis yra saugesnis klinikinėje praktikoje. Fenformino naudojimas buvo sustabdytas dėl didėlės rizikos išsivystyti laktatinei acidozei [40].
Pastebėta, kad metforminas be gliukozės kiekį mažinančio poveikio sergantiems sergant cukriniu diabetu, pasižymi neuroprotekcinėmis savybėmis. Ištirta, kad išemijos metu padidėja intraląstelinės adhezijos molekulės-1 (ICAM-1) ekspresija kraujagyslių endotelio ląstelėse. Ši molekulė lemia neutrofilų prisijungimą, todėl skatina smegenų audinio infiltracija neutrofilais. Šis procesas yra vienas svarbių iš faktorių, lemiančių pažeidimo progresavimą [41]. Tyrime su graužikais nustatyta, kad metforminas aktyvuodamas AMPK sumažina ICAM-1 ekspresiją, taip mažindamas neutrofilų infiltraciją į pažeistą smegenų audinį [42].
Kitų tyrimų su žiurkėmis duomenys rodo, kad metforminas tiesiogiai veikia uždegimą slopindamas brauduolio faktorių kappa B (NF-KB). Šis faktorius išemijos metu skatina uždegiminių citokinų – TNF – α, interliaukinų (IL)-1β, IL6 produkciją, todėl tyrime parodyta, kad NF-KB slopinimas metforminu, prieš tyrime sukeltą smegenų išemiją, sumažino uždegimą ir taip pagerino klinikines smegenų išemijos išeitis [43].
Neuroprotekcinis poveikis pastebėtas eksperimentuose žiurkėmis tiriant antioksidacinių fermentų kiekį. Nustatyta, kad metforminas mažina laisvųjų radikalų susidarymą išemijos ir ypač reperfuzijos sąlygomis [44]. Kitame tyrime parodyta, kad metforminas degimą sumažino uždegimą, kuris buvo sukeltas žiurkėms suleidus karagenino – sumažėjo edema, oksidacinio streso markeriai, uždegiminiai markeriai – mieloperoksidazė ir nitratas [45].
Tyrimuose pastebėta, kad metforminas pasižymi kardioprotekciniu poveikiu. Atliktame tyrime su žiurkėmis, sukėlus miokardo išemiją su reperfuzija, metforminas aktyvavo AMPK, padidino endotelio azoto monoksido fosforilinimą ir sumažino miokardo pažeidimo išplitimą [46]. Kitame tyrime su
17
Ossabaw miniswine kiaulėmis nustatyta, kad metforminas, esant lėtinei išemijai miokarde, reikšmingai
padidina ląstelių išgyvenamumą didinančių baltymų - ERK, NFκB, pENOS, P38 kiekį ir sumažina apoptozę lemiančių baltymų FOXO3 ir caspase3 kiekį, todėl sumažėja apoptotinių ląstelių skaičius miokarde [47].
Atliktuose tyrimuose pastebėta, kad metforminas pasižymi ir priešvėžiniu poveikiu [48]. Nustatyta, kad I kvėpavimo komplekso ir elektronų pernašos grandinės slopinimas vėžinių ir priešvėžinių ląstelių mitochondrijose lemia AMPK aktyvaciją, kuri inhibuoja mTOR kelią, todėl sumažėja ląstelių
proliferacija ir įvyksta ląstelių apoptozė – sustoja ląstelės gyvenimo ciklas.[49]. Kitas tyrimas su genetiškai modifikuotomis žiurkėmis parodė metformino slopinantį poveikį kasos vėžinių ląstelių susidarymui – metforminas slopino lėtinio pankreatito sukeltą navikinių ląstelių formavimąsi [50]. 2.5 Organotipinės pjūvių kultūros
Organotipinės pjūvių kultūros – in vitro ląstelių kultūros tyrimo modelis pristatytas Gähwiler (Gähwiler and Hefti, 1984; Gähwiler et al., 1997), modifikuotas ir optimizuotas Stoppini ir kiti (1991). Šis tyrimo metodas suteikia galimybę tyrinėti ląstelinius bei molekulinius procesus, smegenų funkciją trijų dimensijų sistemoje išsaugant smegenų architektūrą [51].
Ląstelės pjūvių kultūrose išsaugo artimą tarpusavio kontaktą, kuris leidžia išlaikyti ląstelių tarpusavio reguliacijos, transporto, difuzijos funkcijas, taip pat išlaikomos ląstelių sinapsės. Kitas pjūvių kultūrų privalumas – tiriamame smegenų audinyje ne tik išsaugomos būdingos ląstelės – neuronai, astrocitai, mikroglija, bet ir jų tarpusavio jungtys, sudėtinga neuronų – glijos sąveika [52]. Galimybė išsaugoti audinio charakteristiką atvėrė galimybes naujiems tyrimams. Organotipinės hipokampo kultūros panaudotos neurovaskulinio vieneto tyrimams esant epilepsijai [53], taip pat tiriant medikamentus veikiančius ar apsaugančius neurovaskulinį vienetą [54].
Kitas organotipinių smegenų pjūvių kultūrų privalumas – efektyvumas, kuris yra ypač svarbus tiriant medikamentų poveikį smegenų audiniui. Metodas leidžia vienu metu atilikti daug eksperimentų išvengiant individualaus smegenų audinio įtakos tyrimui, dėl galimybės gauti daug pjūvių iš vienų smegenų [55]. Tyrimais parodyta, kad pelių smegenų pjūvių kultūros yra tinkamos tirti angiogenezę, vaskuliarizaciją ir kraujagyslių atsistatymo galimybes [56]. Naudojant organotipinius smegenų žievės pjūvius parodytas L tipo kalcio kanalų blokatorių – nimodipino ir nifedipino angiogenezinis poveikis [57].
Vienas iš pagrindinių smegenų pjūvių trukumų – sunkiai paruošiami suaugusių ir senstančių gyvūnų pjūviai [58]. Taip pat, nors ir išsaugoma smegenų architektūrą, dėl neišvengiamo neuronų kelių nuraukimo ruošiant pjūvius pasireiškia pokyčiai neuronų tarpusavio ryšiuose ir sinapsių
18 pjaustymo, inkubacijos ir nuopjovos storio. Šie veiksniai gali iškreipti rezultatus dėl pjaustant
19
3. TYRIMO METODIKA
3.1 Tyrimų pobūdis.
Pirmame tyrimo etape, tyrime naudojant mišrias žiurkės smegenėlių neuronų–glijos ląstelių kultūras (CGC), nustatytos I mitochondrijų komplekso slopiklių – fenformino ir metformino
koncentracijos, kurios nesukelia neuronų žūties. Nustatytos didžiausios neuronų žūties nesukeliančios koncentracijos vėliau naudotos tiriant jų apsauginį poveikį smegenų pjūvių kultūrų ląstelėms išemijos su reoksigenacija sąlygomis.
Moksliniame darbe buvo tiriamas I mitochondrijų komplekso slopiklių biguanidų fenformino ir metformino apsauginis poveikis žiurkių smegenų ląstelėms simuliuotos išemijos metu. Tyrimai atlikti naudojant organotipines smegenų pjūvių kultūras (smegenų nuopjovų kultūros), kurios buvo
auginamos 7 dienas. Praėjus auginimo laikotarpiui, į smegenų nuopjovų kultūras įdėtos medžiagos - fenforminas arba metforminas, tuomet 24 valandas imituotos smegenų išemijos sąlygos, po išemijos ląsteles 24 h. inkubuotos ląstelių augimo inkubatoriuje normoksijos sąlygomis siekiant sukurti
reoksigenacijos modelį. Organotipinių pjūvių kultūrose esančių ląstelių gyvybingumas bei mikroglijos tankio pokyčiai vertinti fluorescencinės mikroskopijos metodu. Smegenų nuopjovų kultūrų auginimo terpėse po išemijos buvo nustatomas pro-uždegiminio veiksnio – azoto oksido (NO) kiekis, matuota ląstelių nekrozės intensyvumą rodančio fermento laktatdehidrogenazės (LDH) koncentracija.
Magistro darbo metu eksperimentams buvo naudojami 5-7 dienų žiurkių smegenų pusrutuliai. Darbai su gyvūnais buvo vykdomi remiantis LR bandomųjų gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimais darbui su laboratoriniais gyvūnais Nr. G2-106 (2019 04 29). Magistro darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijoje
3.2 Eksperimentinis modelis 3.2.1 CGC kultūros
Tyrime naudota laboratorijos darbuotojų išskirta mišri neuronų – glijos kultūra paruošta iš 5-7 parų amžiaus Wistar veislės žiurkių smegenėlių. CGC kultūra buvo sėjama į ląstelių auginimo
lėkšteles. Pridedamos medžiagos: fenforminas koncentracijomis 0,05mM, 0,1mM, 0,25mM, 0,5mM, 1mM, 2mM arba metforminas koncentracijomis 0,1mM, 0,25mM, 0,5mM, 1mM, 2mM, 3mM. Auginimo lėkštelės su CGC kultūra ir metforminu arba fenforminu inkubuotos 24 valandas ląstelių auginimo inkubatoriuje 37°C temperatūroje. Po inkubacijos ląstelės dažytos propidžio jodidu (negyvas ląsteles nudažo raudonai), Hoechst 33342 dažais (gyvas ląsteles nudažo mėlyna spalva, o apoptotines šviesiai mėlyna spalva). Kultūrose fluorescencinės mikroskopijos būdu įvertintas gyvų ląstelių ir negyvų ląstelių santykis regėjimo lauke.
20 3.2.2 Organotipinių smegenų pjūvių auginimas.
Smegenų nuopjovos buvo ruošiamos iš 5-7 dienų Wistar veislės žiurkių galvos smegenų. Žiurkių smegenų pusrutuliai buvo pjaustomi 300nm storio pjūviais naudojant šaldomąjį vibrotomą (Vibrotome 1000 plus, Sectioning System, JAV). Pjaustoma minimaliu greičiu ir maksimalia
amplitude 4 °C temperatūroje. Smegenų audinio pjūviai buvo perkeliami ant ląstelių kultūrų auginimo membranų, kurios patalpintos į lėkšteles su auginimo terpe. Lėkštelės su pjūviais augintos ląstelių auginimo inkubatoriuje 37°C temperatūroje 7 dienas, kas antra dieną keičiant pusę buvusios terpės.
Horse serum (HS, +4 °C) 12%
Fetal Bovine Serum (FBS 4 °C) 12% Penicilin/Streptomicin 10000/10 mg/ml 4 °C 10v/10mg/ml HEPES 25mM DMEM (1x) + Glutamax -1 500 µl, +4°C
1 Lentelė. Auginimo terpės sudėtis: 50ml
3.3 Hipoksijos sukėlimas
Po 7 dienų auginimo, prieš sukeliant hipoksiją, smegenų nuopjovų kultūrų terpė pakeista į terpę be HEPES (buferio naudoto palaikyti terpėje pH). Lėkštelės su pjūviais išskirtos į 2 grupes – pirma: į terpę pridėta 10mM 2-deoksigliukozės (2DG), antra – į terpę nepridėta papildomų medžiagų. Į abi grupes įdėta fenformino 0,25mM arba metformino 0,5mM. Hipoksijai sukelti smegenų nuopjovų kultūrose buvo simuliuojama audinio išemija - ląsteles 24 h inkubuojant hipoksinėje kameroje (37°C, 2% deguonies konc.). Po 23 valandų 30 minučių išemijos kameroje smegenų nuopjovos buvo dažomos ir dar 30 minučių inkubuojamos hipoksinėje kameroje. Kontrolinė grupė su ir be 2DG 24 valandas buvo inkubuojama ląstelių augimo inkubatoriuje.
3.4 Reoksigenacija
Po 24 h inkubacijos hipoksijos kameroje buvo simuliuotos reoksigenacijos sąlygos smegenų nuopjovų kultūras 24 h patalpinant į ląstelių auginimo inkubatorių 37°C temperatūroje, normoksijos sąlygomis. Ląstelių auginimo terpė be HEPES ir su arba be 2DG pakeista terpė į įprastą tyrime
21 naudotą seserinę (terpė, kiuri buvo nuimta nuo pjūvių prieš išemiją ir laikoma šaldytuve, nes šviežioje auginimo terpėje nėra ląstelių išskirtų augimo faktorių).
3.5 Ląstelių gyvybingumo nustatymas CGC ir smegenų nuopjovų kultūrose
CGC ir smegenų nuopjovų kultūrų gyvybingumas buvo vertinamas fluorencencinės
mikroskopijos metodu, naudojant fluorescencinius dažus. Negyvos ląstelės buvo dažomos propidžio jodidu (PJ 1 μM) kuris nepereidamas pro gyvų ląstelių membranas nudažo raudonai tik negyvas
ląsteles. Gyvos ląstelės buvo dažomos Hoechst 33342 (3 μM) dažais, kurie pereidami pro gyvų ląstelių membranas ląsteles nudažė mėlyna spalva, o apoptotines šviesiai mėlyna spalva. Mikroglijos ląstelės buvo dažomos Izolektino (IB4, 7ng/ml) dažais, kurie mikroglijos ląsteles nudažo žaliai. Ląstelės su imunofluorescentiniais dažais buvo inkubuojamos 30 min ląstelių auginimo inkubatoriuje.
Fotografuota fluorescenciniu mikroskopu (OLYMPUS IX71S1F-3)
CGC kultūros dažytos propidžio jodidu ir Hoechst 33342 dažais, fotografuoti ir vertinti 5 atsitiktiniai regėjimo laukeliai kiekviename šulinėlyje. Smegenų nuopjovos dažytos propidžio jodidu, Hoechst 33342 ir izolektino dažais Vaizdai gauti patalpinus smegenų nuopjovas ant tiriamojo stiklelio pridengus dengiamuoju stikleliu ir fotografuojant atsitiktiniuose 13 laukelių.
3.6 LDH aktyvumo augimo terpėje nustatymas
LDH aktyvumas augimo terpėje po smegenų nuopjovų inkubacijos išemijos kameroje
nustatytas siekiant įvertinti smegenų audinio nekrozę. Inkubacijos terpės mėginiai paimti po išemijos, centrifuguoti 10000k/min 20min. Į mėginį įdėta TRIS buferio ( TRIS hydrochlorid C4N11NO3HCL, H2O) ir TRIS piruvato pH 7,5 (TRIS hydrochlorid, Na piruvate, H2O). LDH aktyvumas vertintas pagal NADH oksidacijos greitį spektrofotometru esant 340nm bangos ilgiui, apskaičiuotas
NADH/min/g pjūvio svorio.
3.7 Pro – uždegiminių veiksnių (NO) nustatymas ląstelių augimo terpėje
NO kiekis smegenų nuopjovų kultūrų auginimo terpėje matuojamas spektrofotometriškai. Mėginiai paimti iš auginimo terpių, centrifuguoti 10000k/min 20min. NO kiekio nustatymui naudotas Greiss reagent rinkinys (Invitrogen) remiantis gamintojo pateiktomis rinkinio naudojimosi
instrukcijomis. NO kiekis mėginiuose nustatytas esant 548nm bangos ilgiui ir išreikštas μM NO gramui audinio. Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis neuronai neišskiria NO, todėl siekiant tiksliau pavaizduoti rezultatus iš hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos grupių rezultatų buvo atimtas
22 3.8 Vaizdų analizavimas
Kultūrų vaizdų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas ImagePro Express 6,3 ir ImageJ programas
3.9 Statistinė analizė
Eksperimentų metu rezultatai buvo analizuojami SigmaPlot 14.0 versija Systat Software Inc. JAV). Tyrimų rezultatai pateikti kaip vidurkiai (M). Duomenų patikimumas įvertintas pagal Stjudento t testą. Skirtumai laikyti statistiškai reikšmingais, jeigu reikšmingumo lygmuo mažesnis nei 0,05. Eksperimentų rezultatai pateikti kaip vidurkiai su standartine paklaida.
23
4. DARBO REZULTATAI
I kvėpavimo grandinės kompleksas mitochondrijose - vienas svarbiausių komponentų mitochondrijų kvėpavime ir energijos metabolizme ląstelėje. Įvairias tyrimais parodyta, kad I kvėpavimo grandinės kompleksas yra jautriausias fermentas išemijos ir išemijos/reperfuzijos
sukeliamiems pažeidimams [61]. Tiriant šio fermento reakciją į hipoksijos sąlygas studijose su pelėmis pastebėta, kad I kvėpavimo grandinės kompleksas lemia patologinę reaktyvių deguonies junginių produkciją, sukeliančia mitochondrijų pažeidimą po reperfuzijos. Tyrimai taip pat parodė, kad slopinant I mitochondrijų kvėpavimo kompleksą pasireiškė apsauginis poveikis smegenims nuo išemijos su reperfuzija sukelto pažeidimo [62], todėl I kvėpavimo grandinės komplekso slopikliai, galėtų pasižymėti neuroprotekcinėmis savybėmis.
Vienas iš dažniausiai klinikinėje praktikoje sutinkamų I mitochondrijų komplekso slopiklių -metforminas. Atliktuose tyrimuose pastebėta, kad metforminas pasižymi neuroprotekcinėmis savybėmis padidindamas neuronų išgyvenamumą po smegenų išemijos [63]. Taip pat parodyta, kad metforminas pasižymi ir skatinančiu poveikiu oligodendrocitų regeneracijai ir mielino atsistatymui graužikų smegenyse po išemijos. Tiriant graužikus po išemijos buvo pastebėta sumažėjęs pažeidimas erdvinio mokymosi ir judėjimo funkcijoms grupėse, kurioms buvo skirtas metforminas [64].
Mokslinėje literatūroje daugėjant įrodymų apie I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių
neuroprotekcinį poveikį, darbe buvo siekiama ištirti jų apsauginį poveikį smegenų organotipinių pjūvių kultūrų ląstelėms išemijos metu. Darbe buvo pasirinkti I kvėpavimo grandinės komplekso slopikliai: plačiai naudojamas medikamentas antro tipo cukriniam diabetui gydyti – metforminas, ir dėl savo toksiškų savybių klinikinėje praktikoje nebenaudojamas, bet pasižymintis stipresniu I kvėpavimo grandinės komplekso slopinančiu poveikiu – fenforminas.
Atliekant darbą pirmiausia buvo įvertintas Fenformino ir metformino poveikis CGC ląstelių gyvybingumui įprastomis sąlygomis. Taip buvo nustatytos didžiausios ląstelių nekrozės nesukeliančios koncentracijos, toliau naudojamos tiriant smegenų nuopjovų kultūras. Smegenų nuopjovose ląstelių gyvybingumas, mikroglijos tankis ir LDH, NO kiekis buvo vertintas po 24 valandų išemijos ir 24 valandų išemijos su 24 valandų reoksigenacija.
4.1 Fenformino ir metformino poveikis CGC kultūrai
Fenformino poveikis CGC kultūromis tirtas su 6 skirtingomis fenformino koncentracijomis (0,05mM, 0,1mM, 0,25mM, 0,5mM, 1mM, 2mM) ir kontroline grupe be fenformino. Eksperimento metu vertintas gyvybingų, apoptozės ir nekrozės būdu žuvusių ląstelių skaičius regėjimo lauke, kuris buvo išreikštas tarpusavio ląstelių santykiu procentine dalimi. Atliktų eksperimentų analizė parodė, kad fenformino koncentracijos 0,05mM, 0,1mM ir 0,25mM nesukėlė nekrozės CGC kultūroje (1 pav.).
24 Nekrotizavusių ląstelių procentinė dalis visoje CGC kultūroje buvo atitinkamai – 5,5%, 2,5%, 9,5%. Kontrolinėje grupėje – 3,75%. Vertinant eksperimentus su 0,5mM, 1mM ir 2mM fenformino
koncentracijomis, matyti, kad fenforminas ženkliai padidino nekrozės būdu žuvusių ląstelių kiekį lyginant su kontroline grupe CGC kultūroje: 0,5mM - 41,5%, 1mM - 62 %, 2mM - 63 % (1 pav.).
1 pav. Fenformino poveikis smegenų CGC kultūros gyvybingumui. n=2-4
Vertinant fenformino poveikį apoptozės būdu žuvusių ląstelių kiekiui CGC kultūrose,
statistiškai reikšmingo skirtumo tarp koncentracijų nepastebėta– apoptotinių ląstelių skaičius svyravo tarp 0,5% ir 2,5%. Kontrolinė grupė – 0,5% apoptozės būdu žuvusių neuronų (1 pav.).
Remiantis tyrimo rezultatais nustatyta, kad fenformino koncentracijos 0,5nM, 1mM ir 2mM sukelia neuronų žūtį nekrozės būdu CGC kultūroje, o fenformino koncentracijos 0,05mM, 0,1mM, 0,25mM neuronų nekrozės nesukelia, todėl įvertinus rezultatus, tolimesniems bandymams su smegenų nuopjovų kultūromis pasirinkta didžiausia neuronų nekrozės nesukėlusi 0,25mM fenformino
koncentracija.
Metformino poveikis CGC ląstelėmis tirtas su naudojant 6 skirtingas metformino koncentracijas - 0,1mM, 0,25mM, 0,5mM, 1mM, 2mM, 3mM, taip pat kontrolinę grupę be metformino. Eksperimento metu vertintas gyvybingų, apoptozės ir nekrozės būtu žuvusių ląstelių skaičius regėjimo lauke, išreikštas procentine dalimi. Tyrimo rezultatai parodė, kad metformino koncentracijos 0,1 mM, 0,25mM ir 0,5mM nesukėlė nekrozės CGC kultūroje (2 pav.). Nekrotizavusių ląstelių kiekis naudojant šias koncentracijas lyginant su kontroline grupe be metformino, statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Nekrotizavusių ląstelių procentinė dalis: 0,1 mM - 6 %, 0,25mM - 6,3%, 0,5mM –-6,6%. Kontrolinėje grupėje – 3,75%. Vertinant tyrimus su metformino koncentracijomis
25 1mM, 2mM ir 3mM stebimas nekrozės būdu žuvusių neuronų procentinės dalies padidėjimas, 1mM - 33.67 %, 2mM - 61,67proc, 3mM - 58% (2 pav.).
2 pav. Metformino poveikis smegenų CGC kultūros gyvybingumui. n=3-4
Vertinant metformino poveikį apoptozės būdu žuvusių ląstelių kiekiui CGC kultūrose, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp koncentracijų nepastebėta– apoptotinių ląstelių skaičius svyravo tarp 0,33% ir 1,67%. Kontrolinė grupė – 0,5% apoptozės būdu žuvusių neuronų (2 pav.).
Vertinant tyrimo rezultatus, matoma, kad metformino koncentracijos 1mM, 2mM, 3mM sukelia neuronų žūtį nekrozės būdu CGC kultūroje. Nustatyta, kad didžiausia neuronų žūties nesukelianti metformino koncentracija yra 0,5mM. Todėl įvertinus rezultatus, tolimesniems bandymams su smegenų nuopjovų kultūromis pasirinkta 0,5mM metformino koncentracija. 4.2 Fenformino ir metformino poveikis organotipinių pjūvių kultūroms.
Siekiant ištirti fenformino ir metformino poveikį ląstelių gyvybingumui 24 valandų išemijos ir išemijos su 24 valandų reoksigenacija metu smegenų audinyje, buvo naudotos smegenų nuopjovų kultūros iš 5-7 dienų amžiaus abiejų lyčių Wistar veislės žiurkių jauniklių galvos smegenų. Išemijos sąlygos simuliuotos pjūvių kultūras inkubuojant hipoksijos kameroje su arba be 2DG. Reoksigenuota ląstelių auginimo inkubatoriuje. Pjūviai dažyti ir vertinti fluorescencinės mikroskopijos būdu.
4.2.1 Fenformino ir metformino poveikis organotipinių pjūvių kultūrų neuronų gyvybingumui Įvertinas ląstelių gyvybingumas smegenų pjūvių kultūrose po hipoksijos be fenformino ir metformino. Nustatyta, kad po 24 valandų hipoksijos kultūrose, lyginant su kontroline grupe, terpėje esant 2DG nekrotizavusių ląstelių kiekis padidėjo 4,3 karto (11.76 ± 2.3 ir 2.21 ± 1 atitinkamai), terpėje be 2DG reikšmingo pokyčio nebuvo (3 pav.). Vertinant hipoksijos/reoksigenacijos įtaką
26 smegenų pjūvių kultūrų gyvybingumui pastebėtas nekrotizavusių ląstelių kiekio padidėjimas lyginat su kontroline grupe: terpėje esant 2DG – 6,33 karto (16.18 ± 2.1 ir 2.21 ± 1 atitinkamai) ir terpėje be 2DG – 3,63 karto (12.8 ± 0,2 ir 2,8 ± 4 atitinkamai) (3 pav.).
Rezultatai tiriant fenformino apsauginį poveikį smegenų pjūvių kultūroms hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos sąlygomis parodė fenformino apsauginį poveikį: terpėje su 2DG,
nekrotizavusių ląstelių kiekis sumažėjo 53,9% lyginant su hipoksijos grupe be fenformino (5,42 ± 2,2 ir 11.76 ± 2,3 atitinkamai), be 2DG – reikšmingas apsauginis poveikis nepasireiškė (3 pav.).
Hipoksijos/reoksigenacijos sąlygomis fenforminas terpėje su 2DG nekrotizavusių ląstelių kiekį sumažino 55,6% lyginant su hipoksija/reoksigenacija be fenformino (7.2 ± 2.2 ir 16.18 ± 2.1 atitinkamai), be 2DG – 61,8% (4.9 ± 0,5 ir 12.8±0,2 atitinkamai) (3 pav.).
3 pav. Fenformino poveikis smegenų nuopjovų kultūroms. (propidžio jodido fluorescencija – nekrozės
intensyvumas nuopjovų kultūrose)
*- statistiškai patikimas skirtumas lyginant su kontroline grupe @ -statistiškai patikimas skirtumas lyginant su hipoksija & - statistiškai patikimas skirtumas lyginant su kontrole
# - statiškai patikimas skirtumas lyginant su hipoksija ir reoksigenacija p< 0,05, n=2-6
27 4 pav. Pavyzdinės nuotraukos vaizduojančios apsauginį fenformino poveikį smegenų nuopjovų
kultūroms. A – hipoksija su 2DG, B- hipoksija su 2DG ir fenforminu, C – hipoksija/reoksigenacija su 2DG, D – hipoksija/reoksigenacija su 2DG ir fenforminu
Tiriant metformino apsauginį poveikį smegenų pjūvių kultūroms hipoksijos ir
hipoksijos/reoksigenacijos metu nustatyta, kad hipoksijos sąlygomis reikšmingo apsauginio poveikio nebuvo. Hipoksijos/reoksigenacijos sąlygomis metforminas nekrotizavusių ląstelių kiekį terpėje esant 2DG sumažino 58,77% hipoksija/reoksigenacija be metformino (6,67 ± 1,2 ir 16,18 ± 2,1 atitinkamai), terpėje be 2DG – reikšmingas pokytis nepastebėtas. (5 pav.)
5 pav. Metformino poveikis smegenų nuopjovų kultūroms. (propidžio jodido fluorescencija – nekrozės
28 *- statistiškai patikimas skirtumas lyginant su kontroline grupe
# -statistiškai patikimas skirtumas lyginant su hipoksija
$- statiškai patikimas skirtumas lyginant su hipoksija ir reoksigenacija p< 0,05, n=3-6
6 pav. Pavyzdinės nuotraukos vaizduojančios apsauginį metformino poveikį smegenų nuopjovų
kultūroms. A – hipoksija su 2DG, B- hipoksija su 2DG ir metforminu, C – hipoksija/reoksigenacija su 2DG, D – hipoksija/reoksigenacija su 2DG ir metforminu
4.2.2 Fenformino ir metformino poveikis LDH kitimui išemijos ir reoksigenacijos metu. Laktato dehidrogenazė (LDH) – ląstelės citoplazmoje esantis fermentas, randamas beveik visuose audiniuose, iš ląstelės į terpę patenkantis žūstant ląstelei. Tyrimuose su smegenų pjūvių kultūromis LDH koncentracija naudojama kaip ląstelės nekrozinės žūties matmuo [65]. Tiriant LDH kitimą hipoksijos metu, įvertintas LDH pokytis po hipoksijos lyginant su kontroline grupe. Siekiant įvertinti nekrozinės ląstelių žūties intensyvumą po 24 h hipoksijos smegenų pjūvių kultūrose, buvo matuojamas auginimo terpėje esančio LDH kiekis išreikštas mU/L mg nuopjovos svorio. Nustatyta, kad hipoksijos sąlygomis LDH kiekis smegenų pjūvių kultūrose terpėje esant 2DG padidėjo 81,82% lyginant su kontroline grupe (0.2 ± 0,03 ir 0.11 ± 0.01 atitinkamai), terpėje be 2DG reikšmingo pokyčio nebuvo (7 pav. A ir B).
Tiriant fenformino įtaką LDH kiekiui augimo terpėje hipoksijos sąlygomis, pastebėtas apsauginis fenformino poveikis: terpėje su 2DG LDH kiekis sumažėjo 50% lyginant su hipoksijos grupe be fenformino (0.1 ± 0.01 ir 0.2 ± 0.03 atitinkamai). Terpėje be 2DG reikšmingų LDH kiekio
29 pokyčių nebuvo (6 pav. A). Metformino apsauginis poveikis nuo LDH išsiskyrimo po hipoksijos terpėje esant ir nesant 2DG nenustatytas (7 pav. B).
7 pav. Fenformino ir metformino poveikis LDH kiekiui augimo terpėse po hipoksijos. @- statistiškai patikimas skirtumas lyginant su kontroline grupe
# -statistiškai patikimas skirtumas lyginant su hipoksija P<0,05 n=2
4.2.3 Fenformino ir metformino poveikis mikroglijos ląstelių tankiui smegenų pjūvių kultūrose. Mikroglijos ląstelės – pagrindinės imuninę funkciją atliekančios smegenų ląstelės centrinėje nervų sistemoje [66]. Yra duomenų, mikroglijos atsakas į uždegimą ar infekciją yra susijęs su blogesne prognoze sergant centrinės nervų sistemos ligomis, bet taip yra įrodymų, kad specifinės mikroglijos reakcijos pasižymi neuroprotekcinėmis savybėmis. Eksperimentuose su graužikais nustatyta, kad selektyviai pašalinus mikrogliją smegenų infarkto zona padidėja 60% [67]. Siekiant įvertinti, kokią įtaką mikroglijos ląstelių tankiui smegenų pjūvių kultūrose turėjo neuroprotekcinėmis savybėmis pasižymintys fenforminas ir metforminas, organotipinės pjūvių kultūros buvo tirtos panaudojant izolektino fluorescenciją. Įvertina hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos įtaka mikroglijos ląstelių tankui. Nustatyta, kad hipoksijos sąlygomis mikroglijos tankis lyginant su kontroline grupe nepadidėja. Po hipoksijos/reoksigenacijos, lyginant su hipoksija mikroglijos tankis taip pat reikšmingai nepadidėjo (7 pav.).
Vertinant fenformino poveikį mikroglijos ląstelių tankiui smegenų nuopjovų kultūrose po hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos, nustatyta, kad fenforminas mikroglijos ląstelių kiekį terpėje be 2DG padidino 97,77% lyginant su hipoksija be fenformino (2.11 ± 0.24 ir 4.18 ± 0.26 atitinkamai), terpėje su 2DG mikroglijos tankio pokyčių nepastebėta. Po hipoksijos/reoksigenacijos su fenforminu mikroglijos tankio pokyčiai nepasireiškė (8 pav.).
30 8 pav. Fenformino poveikis mikroglijos tankiui po hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos. (izolektino
fluorescencijos intensyvumas – mikroglijos tankis nuopjovų kultūrose)
*- statistiškai patikimas skirtumas lyginant su hipoksija p<0,05,n=1-4
9 pav. Pavyzdinės nuotraukos vaizduojančios fenformino poveikį mikroglijos tankiui po hipoksijos
terpėje be 2DG (Izolektino fluorescencija) A – hipoksija be 2DG B- hipoksija be 2DG su fenforminu
Tiriant metformino poveikį mikroglijos tankiui smegenų pjūvių kultūrose hipoksijos ir hipoksijos su reoksigenacija sąlygomis nustatyta, kad metforminas neturi reikšmingo poveikio mikroglijos ląstelių tankiui. (10 pav.)
31 10. pav. Fenformino poveikis mikroglijos tankiui po hipoksijos ir hipoksijos su išemija. (izolektino
fluorescencijos intensyvumas – mikroglijos tankis nuopjovų kultūrose)
4.2.4 Fenformino ir metformino poveikis NO kiekiui smegenų pjūvių kultūrose.
Yra žinoma, kad vienas iš svarbių veiksnių sukeliančių smegenų audinio pažeidimą išemijos metu yra NO, išskiriamas azoto oksido sintazės, kuri indukuojama aktyvuotų
neutrofilų infiltruojančių smegenų audinį po pažeidimo. NO lemia neuronų žūtį ir yra susijęs su infarkto zonos apimties augimu [68]. Moksliniais tyrimais su graužikais nustatyta, kad
padidėjęs NO susidarymas graužikų smegenyse išeminio pažeidimo metu inhibuoja fermento akonitazės aktyvumą, todėl ląstelėse kaupiasi geležis, intensyvėja hidroksilo radikalų (•
OH) susidarymas, inicijuojama neuronų žūtis [65]. Siekiant ištirti fenformino ir metformino
apsauginį poveikį graužikų smegenų ląstelėms, buvo tirtas fenformino ir metformino poveikis NO kiekiui. NO kiekis buvo matuotas smegenų pjūvių kultūros augimo terpėje po išemijos ir išemijos su reoksigenacija ir išreikštas µM/g smegenų audiniui. Pirmiausia buvo įvertintas NO pokytis lyginant hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos grupes. Rezultatai parodė, kad NO kiekis lyginant terpėse po hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos reikšmingai nesiskyrė. (11 pav. A ir B) Tiriant fenformino ir metformino poveikį NO kiekiui nustatyta, kad fenforminas ir metforminas neturėjo poveikio NO susidarymui smegenų pjūvių kultūrų terpėse po hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos. (11 pav. A ir B)
32 11 pav. Fenformino (A) ir metformino (B) poveikis NO koncentracijai nuopjovų auginimo terpėje po
išemijos ir išemijos su reoksigenacija.
33
5. REZULTATŲ APTARIMAS
Tyrimo metu nustatyta, kad mitochondrijų I kvėpavimo komplekso grandinės slopikliai fenforminas ir metforminas apsaugojo neuronus smegenų nuopjovų kultūrose nuo hipoksijos sukeltos ląstelių žūties. Tyrime pastebėta, kad fenforminas pasireiškia platesniu neuroprotekciniu poveikiu – neuronus apsaugojo 24h hipoksijos sąlygomis terpėje esant 2DG, bei hipoksijos/reoksigenacijos sąlygomis. Tuo tarpu metforminas pasižymėjo neuroprotekciniu poveikiu tik po 24h hipoksijos terpėje esant 2DG. Šie rezultatai siejasi su tyrimais, kuriuose nustatyta kad fenforminas I kvėpavimo
kompleksą mitochondrijose slopina 10 kartų stipriau [39]. Atlikto tyrimo metu pastebėtas
neuroprotekcinis I kvėpavimo komplekso grandinės slopikių fenformino ir metformino poveikis siejasi ir su kitų tyrėjų rezultatais. Atliktuose in vivo tyrimuose su graužikais pastebėta, kad metforminas pasižymi neuroprotekcinėmis savybėmis padidindamas neuronų išgyvenamumą po smegenų išemijos [63]. Kituose tyrimuose su graužikais pastebėtas metformino neuroprotekcinis poveikis sietas su neuronų apoptozės ir uždegiminio proceso slopinimu graužikų smegenyse. Šio eksperimento rezultatai parodė, kad metforminas išemijos sukelto infarkto tūrį žiurkių smegenyse lyginant su kontroline grupe be metformino sumažino nuo 48.12 ± 14.79 % iki 12.07± 3.40 % [69]. Kitame tyrime su žiurkėmis gauti panašūs rezultatai – metforminas skirtas 7 dienas prieš sukeltą insultą reikšmingai sumažino smegenų infarkto tūrį – nuo 56.95 ± 5.24 % kontrolinėje grupėje iki 22.93 ± 7.95 % grupėje su
metforminu [72]. Nors neuroprotekcinis metformino poveikis parodytas in vivo tyrimais su graužikais, trūksta tyrimų, kuriuose būtų ištirtas metformino poveikis smegenų ląstelėms. Taip pat, šiuo metu atlikti tyrimai su I kvėpavimo komplekso grandinės inhibitoriais apsiriboja tyrimais su metforminu, todėl įvertinus šio tyrimo rezultatus, kurie parodė neuroprotekcinį fenformino poveikį, būtų tikslinga detaliau – taikant in vitro ir in vivo tyrimo modelius ištirti fenformino neuroprotekcinį poveikį.
Siekiant išsiaiškinti metformino apsauginio poveikio mechanizmą atlikti tyrimai tyrimai orientuoti į metformino poveikį insulto patogeneziniams mechanizmams. Tyrėjai nustatė. kad
metforminas slopino oksidacinį stresą žiurkių smegenyse po išemijos ir išemijos/reoksigenacijos [44]. Taip aiškinamas galimas metformino apsauginis mechanizmas, nes yra žinoma, kad insulto metu vienas iš svarbių patogenezinių mechanizmų – laisvųjų radikalų susidarymas. Kitame tyrime su žiurkėmis nustatyta, kad metforminas padidino susidariusių laktatų kiekį po insulto, tai galėtų reikšti, kad metformino apsauginis poveikis galėtų pasireikšti neuronuose suaktyvėjus anaerobiniam
kvėpavimui dėl AMPK aktyvacijos kurią sukelia I kvėpavimo komplekso slopikliai [71].
Mūsų tyrime buvo tirta fenformino ir metformino įtaka NO išsiskyrimui, kuris yra vienas iš smegenų audinio pažeidimą insulto metu sukeliančių veiksnių. Nors tyrimo metu reikšmingo NO pokyčio nepastebėta, kitų tyrėjų in vivo tyrimo su žiurkėmis duomenimis metforminas sumažino NO
34 išsiskyrimą smegenyse po išemijos/reperfuzijos [63]. Nors mūsų tyrime NO pasirinkta vertinti kaip veiksnį, sukeliantį pažeidimus smegenų audinyje hipoksijos ir hipoksijos/reoksigenacijos sąlygomis, kitų tyrėjų atliktų tyrimų duomenimis, pašalinus NO sintazę žiurkėse (užkirtus kelią NO produkcijai) buvo prarastas ir apsauginis metformino poveikis [71].
Tyrimo metu parodytas fenformino poveikis mikroglijos tankiui po 24 val. hipoksijos be 2DG. Analogiškų tyrimų, tiriančių I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių įtaką mikroglijos tankiui nėra, todėl įvertinus žinomą mikroglijos svarbą insulto metu tikslinga atlikti daugiau tyrimų, siekiant nustatyti I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių poveikį mikroglija insulto metu.
Neuroprotekcinės I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklių savybės ląstelių gyvybingumą vertinant matuojant LDH išsiskyrimą kitų tyrėjų atlikti su metforminu. Eksperimentų rezultatai parodė – kad metforminas apsaugo nuo LDH išsiskyrimo hipoksijos sąlygomis [70]. Mūsų tyrimo rezultatai nekoreliavo su minėtu tyrimu – metforminas neapsaugojo nuo LDH išsiskyrimo hipoksijos metu, tačiau fenforminas pasižymėjo apsauginiu poveikiu poveikis hipoksijos sąlygomis terpėje su 2DG. Gauti rezultatai pagrindžia svarbą detaliau ištirti fenformino neuroprotekcines savybes.
35
6. IŠVADOS
1. Fenforminas sukelia neuronų žūtį CGC kultūrose 0,5mM ir didesnėmis koncentracijomis. Metforimas sukelia neuronų žūtį CGC kultūrose 1mM ir didesnėmis koncentracijomis. Mažesnėmis koncentracijomis fenformino ir metformino poveikis ląstelių gyvybingumui nepasireiškė. (p<0,05)
2. Fenforminas 0,5mM apsaugojo neuronus nuo žūties organotipinėse pjūvių kultūrose po hipoksijos (esant 2DG) ir nuo žūties po hipoksijos/reoksigenacijos. Metforminas 1mM apsaugojo neuronus nuo žūties organotipinėse pjūvių kultūrose po hipoksijos/reoksigenacijos.(p<0,05)
3. Fenforminas 0,5mM apsaugojo organotipines pjūvių kultūras nuo hipoksijos sukelto LDH padidėjimo (esant 2DG) ir padidino mikroglijos tankį po hipoksijos (be 2DG). Fenformino poveikis NO išsiskyrimui nepastebėtas. Metforminas 1mM poveikio LDH išsiskyrimui, mikroglijos tankiui ir NO išsiskyrimui neturėjo.(p<0,05)
36
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Higienos instituto Sveikatos informacijos centras Health Information Centre of Institute of Hygiene Mirties priežastys (išankstiniai duomenys) Causes of death (provisional data) 2019 http://hi.lt/uploads/pdf/padaliniai/MPR/Isankstiniai_mirties_priezasciu_duomenys_2019_m..pdf 2. Donkor ES. Stroke in the Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.
Stroke research and treatment. 2018;2018.
3. Brenner AB, Burke JF, Skolarus LE. Moving toward an understanding of disability in older US stroke survivors. Journal of aging and health. 2018;30(1):75-104.
4. Sobral S, Taveira I, Seixas R, Vicente AC, Duarte J, Goes AT, et al. Late hospital arrival for thrombolysis after stroke in southern Portugal: who is at risk? Journal of Stroke and
Cerebrovascular Diseases. 2019;28(4):900-5.
5. Rajah GB, Ding Y. Experimental neuroprotection in ischemic stroke: a concise review. Neurosurgical focus. 2017;42(4):E2.
6. Cheng Y-Y, Leu H-B, Chen T-J, Chen C-L, Kuo C-H, Lee S-D, et al. Metformin-inclusive therapy reduces the risk of stroke in patients with diabetes: a 4-year follow-up study. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 2014;23(2):e99-e105.
7. Mima Y, Kuwashiro T, Yasaka M, Tsurusaki Y, Nakamura A, Wakugawa Y, et al. Impact of metformin on the severity and outcomes of acute ischemic stroke in patients with type 2 diabetes mellitus. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 2016;25(2):436-46.
8. Arbeláez-Quintero I, Palacios M. To use or not to use metformin in cerebral ischemia: a review of the application of metformin in stroke rodents. Stroke research and treatment. 2017;2017.
9. Mewes A, Franke H, Singer D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice—a model for tauopathy studies. PloS one. 2012;7(9).
10. Radu RA, Terecoasă EO, Băjenaru OA, Tiu C. Etiologic classification of ischemic stroke: Where do we stand? Clinical neurology and neurosurgery. 2017;159:93-106.
11. Durukan A, Tatlisumak T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and
Behavior. 2007 May 1;87(1):179-97.
12. Fluri F, Schuhmann MK, Kleinschnitz C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug design, development and therapy. 2015;9:3445.
13. Moskowitz MA, Lo EH, Iadecola C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 2010;67(2):181-98.
37 14. Azad TD, Veeravagu A, Steinberg GK. Neurorestoration after stroke. Neurosurgical focus.
2016;40(5):E2.
15. George PM, Steinberg GK. Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments. Neuron. 2015;87(2):297-309.
16. Hu H-J, Song M. Disrupted ionic homeostasis in ischemic stroke and new therapeutic targets. Journal of stroke and cerebrovascular diseases. 2017;26(12):2706-19.
17. Tehse J, Taghibiglou C. The overlooked aspect of excitotoxicity: Glutamate‐independent
excitotoxicity in traumatic brain injuries. European journal of neuroscience. 2019;49(9):1157-70. 18. Halestrap AP, Richardson AP. The mitochondrial permeability transition: a current perspective on
its identity and role in ischaemia/reperfusion injury. Journal of molecular and cellular cardiology. 2015;78:129-41.
19. Szydlowska K, Tymianski M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell calcium. 2010;47(2):122-9.
20. Radak D, Resanovic I, Isenovic ER. Link between oxidative stress and acute brain ischemia. Angiology. 2014;65(8):667-76.
21. Yang J, Qi J, Xiu B, Yang B, Niu C, Yang H. Reactive oxygen species play a biphasic role in brain ischemia. Journal of Investigative Surgery. 2019;32(2):97-102.
22. Yang J. The role of reactive oxygen species in angiogenesis and preventing tissue injury after brain ischemia. Microvascular research. 2019;123:62-7.
23. Herculano‐Houzel S. The glia/neuron ratio: how it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 2014;62(9):1377-91. 24. Stiefel KM, Ermentrout GB. Neurons as oscillators. Journal of neurophysiology.
2016;116(6):2950-60.
25. Choi DW, Rothman SM. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual review of neuroscience. 1990;13(1):171-82.
26. Paolicelli RC, Bolasco G, Pagani F, Maggi L, Scianni M, Panzanelli P, et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. science. 2011;333(6048):1456-8.
27. llen NJ, Lyons DA. Glia as architects of central nervous system formation and function. Science. 2018;362(6411):181-5.
28. Liu Z, Chopp M. Astrocytes, therapeutic targets for neuroprotection and neurorestoration in ischemic stroke. Progress in neurobiology. 2016;144:103-20.
29. Ransom BR, Ransom CB. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Astrocytes: Springer; 2012. p. 3-7.
38 30. Almeida A, Delgado‐Esteban M, Bolanos JP, Medina JM. Oxygen and glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurones but not in astrocytes in primary culture. Journal of neurochemistry. 2002;81(2):207-17.
31. Schafer DP, Lehrman EK, Kautzman AG, Koyama R, Mardinly AR, Yamasaki R, et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron.
2012;74(4):691-705.
32. Morsch M, Radford R, Lee A, Don EK, Badrock AP, Hall TE, et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 2015;9:321.
33. Iadecola C, Anrather J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 2011;17(7):796.
34. Schilling M, Besselmann M, Müller M, Strecker JK, Ringelstein EB, Kiefer R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Experimental neurology. 2005;196(2):290-7.
35. Rena G, Hardie DG, Pearson ER. The mechanisms of action of metformin. Diabetologia. 2017;60(9):1577-85.
36. Bridges HR, Jones AJ, Pollak MN, Hirst J. Effects of metformin and other biguanides on oxidative phosphorylation in mitochondria. Biochemical Journal. 2014;462(3):475-87.
37. An H, He L. Current understanding of metformin effect on the control of hyperglycemia in diabetes. J Endocrinol. 2016;228(3):R97-106.
38. Foretz M, Guigas B, Bertrand L, Pollak M, Viollet B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell metabolism. 2014;20(6):953-66.
39. Drahota Z, Palenickova E, Endlicher R, Milerova M, Brejchova J, Vosahlikova M, et al. Biguanides inhibit complex I, II and IV of rat liver mitochondria and modify their functional properties. Physiological Research. 2014;63(1).
40. Bailey CJ. Metformin: historical overview. Diabetologia. 2017;60(9):1566-76.
41. Strecker JK, Sevimli S, Schilling M, Klocke R, Nikol S, Schneider A, Schäbitz WR. Effects of G-CSF treatment on neutrophil mobilization and neurological outcome after transient focal ischemia. Experimental neurology. 2010 Mar 1;222(1):108-13.
42. Liu Y, Tang G, Li Y, Wang Y, Chen X, Gu X, Zhang Z, Wang Y, Yang GY. Metformin attenuates blood-brain barrier disruption in mice following middle cerebral artery occlusion. Journal of neuroinflammation. 2014 Dec;11(1):177.
39 43. Karimipour M, Zarghani SS, Milani MM, Soraya H. Pre-treatment with metformin in comparison
with post-treatment reduces cerebral ischemia reperfusion induced injuries in rats. Bulletin of Emergency & Trauma. 2018 Apr;6(2):115.
44. Abd-Elsameea AA, Moustaf AA, Mohamed AM. Modulation of the oxidative stress by metformin in the cerebrum of rats exposed to global cerebral ischemia and ischemia/reperfusion. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2014 Aug 1;18(16):2387-92.
45. Pandey A, Kumar VL. Protective effect of metformin against acute inflammation and oxidative stress in rat. Drug development research. 2016 Sep;77(6):278-84.
46. Shang F, Zhang J, Li Z, Zhang J, Yin Y, Wang Y, Marin TL, Gongol B, Xiao H, Zhang YY, Chen Z. Cardiovascular protective effect of metformin and telmisartan: reduction of PARP1 activity via the AMPK-PARP1 cascade. PLoS One. 2016;11(3).
47. Elmadhun NY, Sabe AA, Lassaletta AD, Chu LM, Sellke FW. Metformin mitigates apoptosis in ischemic myocardium. Journal of Surgical Research. 2014 Nov 1;192(1):50-8.
48. Heckman-Stoddard BM, DeCensi A, Sahasrabuddhe VV, Ford LG. Repurposing metformin for the prevention of cancer and cancer recurrence. Diabetologia. 2017 Sep 1;60(9):1639-47.
49. Han G, Gong H, Wang Y, Guo S, Liu K. AMPK/mTOR-mediated inhibition of survivin partly contributes to metformin-induced apoptosis in human gastric cancer cell. Cancer biology & therapy. 2015 Jan 2;16(1):77-87.
50. Chen K, Qian W, Jiang Z, Cheng L, Li J, Sun L, Zhou C, Gao L, Lei M, Yan B, Cao J. Metformin suppresses cancer initiation and progression in genetic mouse models of pancreatic cancer.
Molecular cancer. 2017 Dec 1;16(1):131.
51. Humpel C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 2015 Oct 1;305:86-98. 52. Magalhães DM, Pereira N, Rombo DM, Beltrão-Cavacas C, Sebastião AM, Valente CA. Ex vivo
model of epilepsy in organotypic slices—a new tool for drug screening. Journal of neuroinflammation. 2018 Dec;15(1):203.
53. Morin-Brureau M, De Bock F, Lerner-Natoli M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and barriers of the CNS. 2013 Dec 1;10(1):11.
54. Morin-Brureau M, Lebrun A, Rousset MC, Fagni L, Bockaert J, de Bock F, Lerner-Natoli M. Epileptiform activity induces vascular remodeling and zonula occludens 1 downregulation in organotypic hippocampal cultures: role of VEGF signaling pathways. Journal of Neuroscience. 2011 Jul 20;31(29):10677-88.
40 55. Kim H, Kim E, Park M, Lee E, Namkoong K. Organotypic hippocampal slice culture from the
adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 2013 Mar 5;41:36-43.
56. Hutter-Schmid B, Kniewallner KM, Humpel C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Frontiers in cell and developmental biology. 2015 Sep 2;3:52. 57. Daschil N, Kniewallner KM, Obermair GJ, Hutter-Paier B, Windisch M, Marksteiner J, Humpel C.
L-type calcium channel blockers and substance P induce angiogenesis of cortical vessels associated with beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of aging. 2015 Mar
1;36(3):1333-41.
58. Ting JT, Daigle TL, Chen Q, Feng G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. InPatch-Clamp Methods and Protocols 2014 (pp. 221-242). Humana Press, New York, NY.
59. Lossi L, Alasia S, Salio C, Merighi A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in neurobiology. 2009 Aug 1;88(4):221-45.
60. Brai E, Cogoni A, Greenfield SA. An alternative approach to study primary events in
neurodegeneration using ex vivo rat brain slices. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2018 Apr 11(134):e57507.
61. Galkin A. Brain Ischemia/Reperfusion Injury and Mitochondrial Complex I Damage. Biochemistry (Moscow). 2019 Nov 1;84(11):1411-23.
62. Niatsetskaya ZV, Sosunov SA, Matsiukevich D, Utkina-Sosunova IV, Ratner VI, Starkov AA, Ten VS. The oxygen free radicals originating from mitochondrial complex I contribute to oxidative brain injury following hypoxia–ischemia in neonatal mice. Journal of Neuroscience. 2012 Feb 29;32(9):3235-44.
63. Zeng J, Zhu L, Liu J, Zhu T, Xie Z, Sun X, Zhang H. Metformin Protects against Oxidative Stress Injury Induced by Ischemia/Reperfusion via Regulation of the lncRNA-H19/miR-148a-3p/Rock2 Axis. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019;2019.
64. Qi B, Hu L, Zhu L, Shang L, Sheng L, Wang X, Liu N, Wen N, Yu X, Wang Q, Yang Y. Metformin attenuates cognitive impairments in hypoxia–ischemia neonatal rats via improving remyelination. Cellular and molecular neurobiology. 2017 Oct 1;37(7):1269-78.
65. Lu Q, Harris VA, Rafikov R, Sun X, Kumar S, Black SM. Nitric oxide induces hypoxia ischemic injury in the neonatal brain via the disruption of neuronal iron metabolism. Redox biology. 2015 Dec 1;6:112-21.
66. Kettenmann H, Hanisch UK, Noda M, Verkhratsky A. Physiology of microglia. Physiological reviews. 2011 Apr;91(2):461-553.
41 67. Szalay G, Martinecz B, Lénárt N, Környei Z, Orsolits B, Judák L, Császár E, Fekete R, West BL,
Katona G, Rózsa B. Microglia protect against brain injury and their selective elimination
dysregulates neuronal network activity after stroke. Nature communications. 2016 May 3;7(1):1-3. 68. Nakamura K, Shichita T. Cellular and molecular mechanisms of sterile inflammation in ischaemic
stroke. The Journal of Biochemistry. 2019 Jun 1;165(6):459-64.
69. Fang M, Jiang H, Ye L, Cai C, Hu Y, Pan S, Li P, Xiao J, Lin Z. Metformin treatment after the hypoxia-ischemia attenuates brain injury in newborn rats. Oncotarget. 2017 Sep 26;8(43):75308. 70. Meng X, Chu G, Yang Z, Qiu P, Hu Y, Chen X, Peng W, Ye C, He FF, Zhang C. Metformin
protects neurons against oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-induced injury by down-regulating MAD2B. Cellular Physiology and Biochemistry. 2016;40(3-4):477-85.
71. Li J, Benashski SE, Venna VR, McCullough LD. Effects of metformin in experimental stroke. Stroke. 2010 Nov 1;41(11):2645-52.
72. Deng T, Zheng YR, Hou WW, Yuan Y, Shen Z, Wu XL, Chen Y, Zhang LS, Hu WW, Chen Z, Zhang XN. Pre-stroke metformin treatment is neuroprotective involving AMPK reduction. Neurochemical research. 2016 Oct 1;41(10):2719-27.
