FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMAS KRIAUŠIŲ (PYRUS COMMUNIS L.) VAISIUOSE IR JŲ EKSTRAKTŲ ANTIOKSIDANTINIO POVEIKIO ĮVERTINIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

ALMANTAS KLEVINSKAS

FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES

ĮVAIRAVIMAS KRIAUŠIŲ (PYRUS COMMUNIS L.) VAISIUOSE IR JŲ

EKSTRAKTŲ ANTIOKSIDANTINIO POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas: prof. dr. Vitalis Briedis Data

FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES

ĮVAIRAVIMAS KRIAUŠIŲ (PYRUS COMMUNIS L.) VAISIUOSE IR JŲ

EKSTRAKTŲ ANTIOKSIDANTINIO POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis Data

Recenzentė Darbą atliko

Lekt. Asta Kubilienė Magistrantas

Data Almantas Klevinskas

Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

1. SANTRUMPOS ... 7

2. ĮVADAS ... 8

3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10

4. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11

4.1. Kriaušių (Pyrus L.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir morfologiniai poţymiai ... 11

4.2. Kriaušių vegetatyvinių ir generatyvinių organų fitocheminės sudėties ir jų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimai ... 13

4.3. Kriaušių vaisių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai ... 15

4.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės analizės metodai... 17

4.4.1. Spektrofotometriniai analizės metodai ... 18

4.4.2. Chromatografiniai analizės metodai ... 20

4.4.3. Elektrocheminiai tyrimo metodai ... 21

4.5. Kriaušių vaisių biologiškai aktyvių junginių poveikis ... 22

4.6. Literatūros apţvalgos apibendrinimas ... 23

5. TYRIMO METODIKA ... 24

5.1. Tyrimo objektas ... 24

5.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ... 24

5.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ... 25

5.4. Tiriamųjų kriaušių vaisių ėminių ekstraktų paruošimas ... 25

5.5. Tyrimo metodai ... 25

5.6. Tyrimo duomenų analizė ... 30

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

6.1. Kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 31

6.2. Kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio įvertinimas UV-VIS spektrofotometriniu metodu ... 33

6.2.1. Kriaušių vaisių ėminių bendro fenolinių junginių kiekio įvertinimas UV-VIS spektrofotometriniu metodu ... 33

6.2.2. Kriaušių vaisių ėminių bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvertinimas UV-VIS spektrofotometriniu metodu ... 34

6.2.3. Kriaušių vaisių ėminių bendro flavonoidų kiekio įvertinimas UV-VIS

spektrofotometriniu metodu ... 35

6.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos vystymas ir validacija ... 36

6.4. Kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 38

6.5. Kriaušių vaisių ėminių ekstraktų antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo in vitro įvertinimas42 6.5.1. Kriaušių vaisių ėminių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo in vitro įvertinimas UV-VIS spektrofotometriniu ABTS metodu ... 42

6.5.2. Kriaušių vaisių ėminių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo in vitro įvertinimas UV-VIS spektrofotometriniu DPPH metodu ... 43

6.5.3. Kriaušių vaisių ėminių ekstraktų redukcinio aktyvumo in vitro įvertinimas UV-VIS spektrofotometriniu FRAP metodu ... 44

6.6. Fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių, flavonoidų kiekio ir ekstraktų antioksidantinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 45

6.7. Rezultatų apibendrinimas ... 46

7. IŠVADOS ... 47

8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 49

SANTRAUKA

A. Klevinsko magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. habil. dr. Valdimaras Janulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Pavadinimas: Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimas kriaušių (Pyrus

communis L.) vaisiuose ir jų ekstraktų antioksidantinio poveikio įvertinimas.

Raktiniai ţodţiai: Pyrus, kriaušės, fenoliniai junginiai, hidroksicinamono rūgšties dariniai, flavonoidai, spektrofotometrija, efektyvioji skysčių chromatografija, antioksidantinis aktyvumas. Tyrimo objektas ir metodai: Lietuvos klimato sąlygomis auginamų kriaušių veislių 'Patten', 'Concorde', 'Konferencinė', 'Grabova' vaisių ėminiai. Bendras fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekis nustatytas UV–VIS spektrofotometriniu analizės metodu. Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių sudėties analizė atlikta, taikant ESC metodą. Antioksidantinis aktyvumas in vitro nustatytas UV – VIS spektrofotometriniu analizės metodu.

Tyrimo tikslas: nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų kriaušių (Pyrus communis L.) veislių vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti kriaušių vaisių ėminių ekstraktų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą in vitro.

Tyrimo uţdaviniai: parinkti kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas. Nustatyti kriaušių veislių 'Patten', 'Concorde', 'Konferencinė', 'Grabova' vaisių ėminių bendrą fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekį, jo įvairavimą. Išvystyti ir validuoti ESC metodiką kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių sudėties tyrimams. Nustatyti kriaušių vaisių ėminių kokybinę ir kiekybinę fenolinių junginių sudėtį, jos įvairavimą. Nustatyti kriaušių vaisių ėminių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro ir įvertinti koreliacinius ryšius tarp kriaušių vaisių ėminiuose kaupiamo fenolinių junginių kiekio ir ekstraktų antioksidantinio aktyvumo in vitro.

Tyrimo rezultatai ir išvados: 'Grabova' kriaušių vaisių ėminiuose nustatytas didţiausias bendras fenolinių junginių (10,05 ± 0,17 mg GRE/g, p < 0,05) ir hidroksicinamono rūgšties darinių (5,98 ± 0,15 mg CRE/g, p < 0,05) kiekis. Didţiausias bendras flavonoidų kiekis (1,05 ± 0,02 mg RE/g, p < 0,05) nustatytas 'Concorde' kriaušių vaisių ėminiuose. ESC metodu identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti 8 fenoliniai junginiai. Stipriausias antiradikalinis aktyvumas, įvertintas ABTS metodu, nustatytas 'Concorde' kriaušių vaisių ėminių ekstraktuose (109,96 ± 3,82 µmol TE/g, p < 0,05), o DPPH metodu – 'Grabova' kriaušių vaisių ėminių ekstraktuose (40,38 ± 1,53 µmol TE/g, p < 0,05). Stipriausias redukcinis aktyvumas, įvertintas FRAP metodu nustatytas 'Grabova' kriaušių vaisių ėminių ekstraktuose (42,38 ± 0,96 µmol TE/g, p < 0,05). Stipriausias koreliacinis ryšys nustatytas tarp kriaušių vaisių ėminiuose kaupiamo bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio ir ekstraktų antiradikalinio aktyvumo in vitro, įvertinto DPPH metodu (0,976, p < 0,05).

SUMMARY

The title of the master thesis: Qualitative and quantitative composition variability of phenolic compounds in pear (Pyrus communis L.) fruits and evaluation of antioxidant activity of their extracts. Key words: Pyrus, pears, phenolic compounds, hidroxycinnamic acid derivatives, flavonoids, spectrophotometry, high performance liquid chromatography, antioxidant activity.

The object and methods of the research: the samples of fruits of pear cultivars 'Patten', 'Concorde', 'Conference', 'Grabova', which grow in Lithuanian climatic conditions. Total phenolic compounds amount, total hidroxycinnamic acid derivatives amount and total flavonoids amount were determined by UV – VIS spectrophotometric analysis method. The qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds was performed by HPLC method. The antioxidant activity in vitro was evaluated by UV – VIS spectrophotometric analysis method.

The aim of the research: to determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of fruits of pear cultivars, which grow in Lithuanian climatic conditions and to evaluate the antiradical and reductive activity in vitro of their extracts.

The objectives of the research: to choose the extraction conditions of phenolic compounds from the samples of pear fruits. To determine total phenolic compounds, total hidroxycinnamic acid derivatives and total flavonoids content variation in the samples of fruits of pear cultivars 'Patten', 'Concorde', 'Conference', 'Grabova'. To develop and validate HPLC methodology. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in samples of pear fruits. To determine the antioxidant activity in vitro of pear fruits extracts and to evaluate the correlation between the phenolic compounds content in the samples of pear fruits and the antioxidant activity in vitro of their extracts. The results and conclusions of the research: the highest amounts of total phenolic compounds (10,05 ± 0,17 mg GAE/g, p < 0,05) and total hidroxycinnamic acid derivatives (5,98 ± 0,15 mg CAE/g, p < 0,05) were determined in the samples of pear fruits of cultivar 'Grabova'. The highest amount of total flavonoids (1,05 ± 0,02 mg RE/g, p < 0,05) was determined in the samples of pear fruits of cultivar 'Concorde'. The eight phenolic compounds were identified and quantified by HPLC method. The strongest ABTS free radical binding activity was determined in extracts of the samples of pear fruits of cultivar 'Concorde' (109,96 ± 3,82 µmol TE/g, p < 0,05). The strongest DPPH free radical binding activity was determined in extracts of the samples of pear fruits of cultivar 'Grabova' (40,38 ± 1,53 µmol TE/g, p < 0,05). The strongest reductive activity was determined in extracts of the samples of pear fruits of cultivar 'Grabova' (42,38 ± 0,96 µmol TE/g, p < 0,05). The strongest correlation was determined between the total amount of hidroxycinnamic acid derivatives in the samples of pear fruits and their extracts antioxidant activity in vitro, which was measured by DPPH method (0,976, p < 0,05).

1. SANTRUMPOS

CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas (anglų k. CAE - chlorogenic acid equivalent);

CuPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Cupric ion reducing antioxidant

capacity);

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

FRAP – geleţies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Ferric reducing antioxidant

power);

GRE – galo rūgšties ekvivalentas (anglų k. GAE - gallic acid equivalent); IR – infraraudonoji spinduliuotė;

RE – rutino ekvivalentas; TE – trolokso ekvivalentas;

TPTZ – 2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazinas;

UESC – ultra efektyvioji skysčių chromatografija;

2. ĮVADAS

Ţmonės, plačiai vartodami augalus maistui, ilgainiui pastebėjo jų gydomąsias savybes ir pradėjo augalus naudoti įvairių ligų bei kitų sveikatos sutrikimų profilaktikai ir gydymui [12]. Pastaruoju metu, susidomėjimas vaistiniais augalais gerokai išaugo. Ištobulėjus analizės metodams, pasaulio mokslininkai atlieka vis daugiau augalinių ţaliavų fitocheminių tyrimų. Ypač domimasi fenolinius junginius kaupiančiomis augalinėmis ţaliavomis, nes moksliniais tyrimais įrodyta, jog fenoliniai junginiai apsaugo ţmogaus organizmo ląsteles nuo oksidacinio streso, sumaţina lėtinių ligų atsiradimo ir vystymosi riziką [28, 36, 44]. Nustatyta, kad fenoliniai junginiai pasiţymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu, lemiančiu įvairų biologinį poveikį. Jie pasiţymi uţdegimą, vėţį, alergiją slopinančiu poveikiu. Fenoliniai junginiai slopina patogeninių mikroorganizmų, virusų dauginimąsi ir vystymąsi, sulėtina organizmo senėjimo procesus, maţina maţo tankio lipoproteinų koncentraciją, apsaugo nuo cukrinio diabeto, širdies ir kraujagyslių bei neurodegeneracinių ligų atsiradimo [34, 36, 44]. Dėl šių prieţasčių aktyviai ieškoma potencialių vaistinių augalinių ţaliavų, kurias būtų galima pritaikyti medicinos praktikoje. Ypatingas dėmesys yra skiriamas ţmogaus maisto racione esantiems vaisiams ir darţovėms [36]. Siekiant pritaikyti potencialias vaistines augalines ţaliavas medicinos praktikoje, būtina atlikti fitocheminius tyrimus, patvirtinančius augalinės ţaliavos kokybę ir leidţiančius daryti išvadas apie jos panaudojimo perspektyvas medicinoje [4].

Kriaušės – vieni plačiausiai ţmogaus maistui vartojamų vaisių [12, 25, 52]. Istoriniuose šaltiniuose galima rasti informacijos, jog jau Senovės Graikijoje kriaušės buvo ţinomos ir gausiai auginamos [12]. Pačioje Europoje ir Azijoje kriaušių kultivavimas prasidėjo maţdaug prieš 2500 – 3000 m. [25, 64]. Šiuo metu, daugiausia kriaušių vaisių yra uţauginama Kinijoje, Europoje ir JAV [42]. 2012 m. duomenimis pasaulyje buvo uţauginta net 23,5 mln. tonų kriaušių vaisių, o Kinija uţėmė pirmąją vietą pasaulyje pagal išaugintą kriaušių vaisių kiekį [38, 72]. Komercine prasme kriaušės yra skirstomos į tris grupes – „europines“ (Pyrus communis L.), „kinines“ (Pyrus bretschneideri Rehd.) ir „japonines“ (Pyrus pyrifolia Burm.) [25, 64].

Kriaušių vaisiai vartojami švieţi arba dţiovinti, iš jų gaminami įvairūs produktai [3,5]. Pagal vartojimo maistui mastus kriaušių vaisiai uţima antrąją vietą ir nusileidţia tik obuoliams [1]. Mokslinės literatūros duomenimis, kriaušių vaisiai kaupia fenolinius junginius, kurie pasiţymi įvairiu biologiniu poveikiu [15, 45 – 47, 50]. Lietuvos klimato sąlygomis uţaugintų kriaušių vaisių fenolinių junginių sudėties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimų in vitro nėra atlikta ir mokslinių publikacijų nėra paskelbta, todėl tikslinga ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų kriaušių vaisių fenolinių junginių sudėtį ir jos įvairavimą, įvertinti iš kriaušių vaisių ėminių pagamintų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro, taikant spektrofotometrinius ir chromatografinius analizės metodus.

Atlikti tyrimai suteiktų naujos informacijos apie Lietuvos klimato sąlygomis auginamų kriaušių vaisių kokybinę ir kiekybinę fenolinių junginių sudėtį, jos įvairavimą bei iš kriaušių vaisių ėminių pagamintų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro. Atsiţvelgiant į fenolinių junginių kiekio įvairavimą ir įvertintą ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro, būtų galima daryti išvadas apie tolimesnių fitocheminių tyrimų būtinybę, siekiant įvertinti kriaušių vaisių, kaip vaistinės augalinės ţaliavos, panaudojimo perspektyvas medicinoje.

Darbo tikslas – nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų kriaušių (Pyrus communis L.) veislių 'Patten', 'Concorde', 'Konferencinė', 'Grabova' vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti kriaušių vaisių ėminių ekstraktų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą in

3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas: nustatyti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų kriaušių (Pyrus communis L.) veislių 'Patten', 'Concorde', 'Konferencinė', 'Grabova' vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti kriaušių vaisių ėminių ekstraktų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą in

vitro.

Darbo uţdaviniai:

1. Parinkti kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas.

2. Nustatyti kriaušių veislių 'Patten', 'Concorde', 'Konferencinė', 'Grabova' vaisių ėminių bendrą fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekį, jo įvairavimą, taikant UV – VIS spektrofotometrinį analizės metodą.

3. Išvystyti ir validuoti ESC metodiką kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimams.

4. Nustatyti kriaušių veislių 'Patten', 'Concorde', 'Konferencinė', 'Grabova' vaisių ėminių kokybinę ir kiekybinę fenolinių junginių sudėtį, jos įvairavimą, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą.

5. Nustatyti iš kriaušių veislių 'Patten', 'Concorde', 'Konferencinė', 'Grabova' vaisių ėminių pagamintų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro, taikant UV – VIS spektrofotometrinį analizės metodą. 6. Įvertinti kriaušių vaisių ėminių etanolinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo in vitro

priklausomybę nuo kriaušių vaisių ėminiuose nustatyto bendro fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekio.

4. LITERATŪROS APŢVALGA

4.1. Kriaušių (Pyrus L.) genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir

morfologiniai poţymiai

Karalystė: Augalai (Plantae);

Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta); Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida); Poklasis: Erškėčiaţiedţiai (Rosidae); Eilė: Erškėtiečiai (Rosales);

Šeima: Erškėtiniai (Rosaceae); Pošeimis: Obeliniai (Maloideae); Gentis: Kriaušės (Pyrus L.) [78].

Kriaušių (Pyrus L.) genties augalai priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai, obelinių (Maloideae) pošeimiui [16, 18, 79]. Kriaušių genčiai priskiriama apie 60 – 80 rūšių augalų, yra išvesta daugiau negu 5 tūkst. kriaušių veislių [1, 19].

Kriaušės daţniausiai auga vidutinio klimato platumų juostoje, mėgsta drėgną dirvoţemį ir dalinį pavėsį [16, 17]. Uţsienio mokslininkai, atlikę tyrimus, patvirtino, jog kriaušės yra kilusios iš dviejų regionų (Maţosios Azijos ir Vakarų Kinijos), iš kur jos sėkmingai paplito po kitus regionus: Europą, Aziją, Šiaurės ir Pietų Ameriką, Šiaurės Afriką, Okeaniją [19, 64, 72]. Istoriniuose šaltiniuose yra duomenų, jog Kinijoje kriaušės buvo pradėtos kultivuoti prieš 3 tūkst. metų, o Europoje jos jau buvo auginamos Senovės Graikijoje [25, 72]. Iš Senovės Graikijos kriaušės paplito po Senovės Romos imperiją, Vakarų Europą [12, 72]. XVII a. pirkliai kriaušes nugabeno ir į Šiaurės Ameriką [72].

Lietuvoje savaime auga arba yra auginamos trys kriaušių rūšys: paprastoji kriaušė (Pyrus

communis L.), usūrinė kriaušė (Pyrus ussuriensis Maxim.) ir miškinė kriaušė (Pyrus pyraster L.) [3].

Paprastoji kriaušė Lietuvoje yra auginama soduose, sodybose, pakelėse, sulaukėjusi pasitaiko pamiškėse, upių šlaituose, pakelėse, greta sodybų. Miškinė kriaušė Lietuvoje yra paplitusi vandens telkinių šlaituose, kalvose, auga pamiškėse, pakelėse [10].

Kriaušė – tai vidutinio aukščio, lapus numetantis vaismedis, galintis uţaugti iki 10 – 17 metrų aukščio (1 pav.) [12, 42]. Yra išvesta ir ţemaūgių veislių [1]. Šie vaismedţiai yra ilgaamţiai, gali gyvuoti net iki 300 m. [10]. Kriaušėms yra būdinga piramidės formos laja. Vaismedţių kamienas yra trumpas, šakos smailėjančios. Paprastosios kriaušės šakos yra nedygliuotos, o miškinės kriaušės – dygliuotos [6, 10]. Ir kamienas, ir šakos yra rausvai rudos spalvos. Tiek suaugusių kriaušių kamieno,

1 pav. Paprastosios kriaušės (Pyrus communis L.) vaismedis

tiek senesnių šakų ţievė turi įtrūkimų, yra gruoblėta. Jaunų medelių kamieno ir šakelių ţievė yra lygi, pilkai rudos spalvos [16].

Lapai yra paprasti, tamsiai ţalios spalvos. Lapo viršutinė pusė blizgi, o apatinė – ne. Jiems būdinga ovali, elipsės ar apvali forma (2 pav.). Jie yra išsidėstę priešiškai ir prisijungę prie šakelių ilgais lapkočiais. Lapų kraštas yra lygus arba smulkiai pjūkliškas [12, 16]. Lapo viršūnė gali būti trumpai nusmailėjusi arba buka [12]. Lapų gyslotumas yra plunksniškas. Lapų ilgis siekia 5 – 10 cm, o plotis – 3 – 5 cm [6].

Kriaušių ţiedai sutelkti į skydelio formos ţiedynus, nors gali būti ir pavienių ţiedų (2 pav.) [10]. Ţiedyno plotis siekia 5 – 7,5 cm. Ţiedyne daţniausiai būna 5 – 7 ryškiai baltos ar blyškiai rausvos spalvos dvilyčiai ţiedai, turintys 5 vainiklapius [12, 16]. Ţiedų plotis siekia 2,5 – 3,5 cm [42]. Ţiedų kuokelių dulkinės yra raudonos spalvos, liemenėliai nesuaugę [6]. Kriaušės ţydi balandţio – geguţės mėn [3,5].

Vaisius yra netikras obuolys, vadinamas kriauše (3 pav.) [3]. Vaisių dydis nevienodas. Pagal vaisių dydį jie yra

skirstomi į 6 grupes: labai smulkūs (masė iki 50 g), smulkesni uţ vidutinius (masė 51 – 75 g), vidutiniai (masė 76 – 125 g), stambesni uţ vidutinius (masė 126 – 175 g), stambūs (masė 176 – 225 g), labai stambūs (masė daugiau, kaip 225 g) [1]. Vaisiai yra atvirkščiai kūgiškos, atvirkščio kiaušinio, rečiau rutuliškos formos [3,6,12]. Vaisių viršūnėje matomos taurelės liekanos [3]. Vaisiai yra prisitvirtinę prie šakų 1,5 – 2 cm ilgio vaiskočiais. Vaisių paviršius gali būti lygus arba šiek tiek šiurkštus [3]. Daţniausiai vaisiai yra šviesiai ar tamsiai ţalios spalvos, tačiau, priklausomai nuo rūšies ir veislės, gali pasitaikyti ir geltonos, gelsvos ar rausvos spalvos

vaisių [3,5,12]. Daţnai ant vaisių paviršiaus yra rudų dėmelių [3]. Vaisiai yra 4 – 12 cm ilgio. Vaisių minkštimas yra baltos ar šviesiai gelsvos spalvos, kvapnus ir saldus (miškinės kriaušės daţniausiai aitrus) [10]. Vaisių minkštime yra akmeninių ląstelių – sklereidţių [3]. Vaisiuje yra 5 sėklalizdţiai [3]. Kiekviename sėklalizdyje daţniausiai yra dvi 6 – 10 mm ilgio, 3,8 – 5 mm pločio ir 2 – 4 mm storio tamsiai rudos sėklos, turinčios lygų, blizgantį ar matinį paviršių [3]. Sėklos yra kiaušinio formos, į viršų nusmailėjusios. Vaisiai daţniausiai prinoksta rugpjūčio – spalio mėn [3,5,11].

2 pav. Kriaušių lapai ir žiedai

4.2. Kriaušių vegetatyvinių ir generatyvinių organų fitocheminės sudėties ir jų

ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimai

Mokslinėje literatūroje aprašyta nemaţai kriaušių genties augalų fitocheminės sudėties tyrimų [14]. Atlikus kriaušių lapų, ţiedų ir vaisių fitocheminės sudėties tyrimus, nustatyta, kad vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių, lemiančių daugelį šių augalinių ţaliavų ekstraktų poveikių, yrafenoliniai junginiai [15, 45, 65]. Mokslinėje literatūroje yra paskelbta publikacijų, kuriose aprašyta kriaušių vaismedţių ţievės ir kriaušių sėklų fitocheminė sudėtis [38, 64].

Mokslinėje literatūroje duomenų apie kriaušių ţievės fitocheminę sudėtį pateikta nedaug, tačiau yra aprašyta keletas tyrimų apie kriaušių ţievės triterpeninių junginių įvairovę. Ţievėje nustatyti triterpeniniai saponinai: friedelinas, epifriedelanolis ir β – sitosterolis. [64].

Nustatyta, jog dţiovintų kriaušių sėklose yra nuo 16,5 proc. iki 31,5 proc. (v/v) riebalinio aliejaus, sočiųjų riebalų rūgščių (palmitino, oleino ir linoleno), organinių rūgščių, angliavandenių. Jose yra identifikuotas γ – tokoferolis, karotenoidai ir β – sitosterolis. Kriaušių sėklose nustatytos fenolinės rūgštys (kavos rūgštis ir jos dariniai – 0,352 mg/g) ir hidrochinono gliukozidas – arbutinas (0,924 mg/g). Moksliniais tyrimais nustatyta, jog kriaušių sėklose yra kaupiami flavonoidai: monomeriniai flavan-3-oliai (0,924 mg/g), polimeriniai flavan-3-oliai (7,4 mg/g), flavonoliai (kvercetino dariniai – 0,064 mg/g, izoramnetino dariniai – 0,095 mg/g) [38,45].

Kriaušių ţieduose identifikuotas β – sitosterolis ir triterpeninis junginys α – amirinas, kumarinai ir fenoliniai junginiai. Ţieduose nustatytos fenolinės rūgštys (chlorogeno), flavonolių glikozidai (kvercetino-3-O-β-D-gliukopiranozidas, kempferolio-3-O-β-D-(6„„-O-α-L-ramnopiranozil)-gliukopiranozidas, kvercetino-3-O-β-D-(6„„-O-α-L-ramnopiranozil)-kempferolio-3-O-β-D-(6„„-O-α-L-ramnopiranozil)-gliukopiranozidas, hidrochinonas ir jo gliukozidas – arbutinas [64, 65].

Mokslinėje literatūroje yra duomenų apie kriaušių lapų fitocheminę sudėtį [15]. Lapuose yra nustatytos rauginės medţiagos, angliavandeniai, organinės rūgštys, triterpeniniai junginiai (betulino rūgštis, ursolo rūgštis), askorbo rūgštis, fenoliniai junginiai. Nustatyta, jog dţiovintuose kriaušių lapuose kaupiasi pats didţiausias fenolinių junginių kiekis, kuris įvairuoja nuo 143,61 mg/g iki 200,46 mg/g [15]. Flavanolių glikozidų kiekis kriaušių lapuose kinta nuo 15,78 mg/g iki 38,51 mg/g, o flavan-3-olių – nuo 5,31 mg/g iki 10,83 mg/g [15]. Dţiovintuose kriaušių lapuose yra nustatytos fenolinės rūgštys (kavos rūgštis ir jos dariniai – 9,226 mg/g, p – kumaro rūgštis (nuo 0,86 mg/g iki 3,80 mg/g), ferulo rūgštis ir jos dariniai – 0,222 mg/g, chlorogeno rūgštis (nuo 26,47 mg/g iki 41,12 mg/g)), monomeriniai flavan-3-oliai ((+)-katechinas (nuo 0,52 mg/g iki 3,05 mg/g), (-)-epikatechinas (nuo 1,05 mg/g iki 2,68 mg/g)), flavonoliai (kempferolio dariniai – 11,146 mg/g, kvercetino dariniai – 9,069 mg/g, izoramnetino dariniai – 1,571 mg/g), flavonai (apigenino dariniai – 0,57 mg/g), hidrochinono

gliukozidas – arbutinas (nuo 38,95 mg/g iki 64,24 mg/g) [15]. Moksliniais tyrimais yra patvirtinta, jog fenolinių junginių kiekis yra didţiausias jaunuose lapeliuose ir vėliau nuosekliai maţėja [15].

Kriaušių vaisiai yra svarbi ţmogaus maisto raciono dalis, todėl pasaulio mokslininkai daugiausiai mokslinių publikacijų yra paskelbę apie kriaušių vaisių fitocheminę sudėtį [41, 47, 50, 70]. Nustatyta, jog švieţiuose kriaušių vaisiuose yra vandens (80,17 – 86,67 proc.), mikro ir makroelementų, angliavandenių (87,67 – 96,46 proc.) (fruktozės, gliukozės, sorbitolio), lipidų (2,14 – 3,39 proc.), pektinų (5 – 15 proc.), organinių rūgščių (obuolių, citrinų), triterpeninių junginių (betulino rūgšties, oleonolo rūgšties, ursolo rūgšties), askorbo rūgšties (0,028 – 0,043 mg/g), fenolinių junginių (0,291 – 0,389 mg/g) [17, 18, 42, 54]. Kriaušių vaisiuose yra identifikuotos fenolinės rūgštys, flavonoliai ir jų glikozidai, monomeriniai ir oligomeriniai flavan-3-oliai, antocianinai ir hidrochinono gliukozidas – arbutinas [45].

Kriaušių vaisių minkštimo ir luobelės fitocheminė sudėtis yra skirtinga [31, 50]. Daugiau angliavandenių nustatyta vaisiaus minkštime, o organinių rūgščių, triterpenoidų ir fenolinių junginių – luobelėje [45 – 47, 56, 57].

Tiriant švieţius kriaušių vaisius, nustatyta, jog bendras fenolinių junginių kiekis minkštime įvairuoja nuo 0,028 mg/g iki 2,910 mg/g, o luobelėje – nuo 1,235 mg/g iki 10,329 mg/g [35, 68]. Nustatyta, jog švieţiuose kriaušių vaisiuose bendras fenolinių junginių kiekis kinta nuo 2,441 mg/g iki 3,926 mg/g, o bendras flavonoidų kiekis – nuo 4,460 mg/g iki 6,095 mg/g [51, 68]. Flavan-3-olių kiekis kriaušių vaisių luobelėje įvairuoja nuo 0,014 mg/g iki 0,224 mg/g, o flavanolių – nuo 0,095 mg/g iki 0,559 mg/g [35]. Antocianinai nustatomi tik rausvo atspalvio kriaušių vaisių luobelėje. Jų kiekis įvairuoja nuo 0,012 mg/g iki 0,120 mg/g [35]. Askorbo rūgšties kiekis švieţių kriaušių vaisių minkštime kinta nuo 0,028 mg/g iki 0,297 mg/g, o luobelėje – nuo 0,116 mg/g iki 0,359 mg/g [35, 57]. Dţiovintų kriaušių vaisiuose bendras fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 1,09 mg/g iki 2,61 mg/g, o bendras flavonoidų kiekis – nuo 0,68 mg/g iki 1,77 mg/g [76]. Nustatyta, jog dţiovintų kriaušių vaisių minkštime bendras fenolinių junginių kiekis yra 2,342 mg/g, luobelėje – 9,176 mg/g [45]. Dţiovintuose kriaušių vaisiuose nustatyta kavos rūgštis ir jos dariniai (minkštime – 0,27 mg/g, luobelėje – 0,651 mg/g), kumaro rūgštis ir jos dariniai (minkštime – 0,004 mg/g, luobelėje – 0,041 mg/g), monomeriniai flavan-3-oliai (minkštime – 0,317 mg/g, luobelėje – 0,925 mg/g), polimeriniai flavan-3-oliai (minkštime – 1,381 mg/g, luobelėje – 3,528 mg/g), kempferolio dariniai (luobelėje – 2,278 mg/g), kvercetino dariniai (minkštime – 0,011 mg/g, luobelėje – 0,481 mg/g), izoramnetino dariniai (minkštime – 0,030 mg/g, luobelėje – 0,304 mg/g) [45].

Moksliniais tyrimais įrodyta, jog fenolinių junginių kiekio įvairavimą skirtinguose kriaušių vegetatyviniuose ir generatyviniuose organuose lemia kriaušių rūšis, veislė, klimatas, temperatūra, UV spinduliuotės stiprumas ir kitos augimo sąlygos [15, 28]. Dţiovinant kriaušių vaisius aukštoje temperatūroje (60 – 70 o

vaisių pagamintų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas in vitro yra iki 40 – 50 proc. maţesnis nei švieţių kriaušių vaisių ekstraktų [17, 39, 68].

Fenoliniai junginiai yra vieni iš svarbiausių antioksidantų [66]. Tiriant augalinių ţaliavų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, labai daţnai nustatomas ir jų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas in vitro [66, 68, 71]. Vertinant iš įvairių kriaušių vegetatyvinių ir generatyvinių organų pagamintų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą in vitro UV – VIS spektrofotometriniais FRAP ir DPPH metodais, nustatyta, jog iš kriaušių lapų pagaminti ekstraktai pasiţymi stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu in vitro (DPPH – 20,279 µmol TE/g, FRAP – 35,396 µmol TE/g) [45]. Iš kriaušių sėklų pagamintų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas in vitro yra kiek silpnesnis (DPPH – 16,327 µmol TE/g, FRAP – 22,241 µmol TE/g.) [45]. Iš atskirų kriaušių vaisių dalių pagamintų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas in vitro yra nevienodas. Iš kriaušių vaisių minkštimų pagamintų ekstraktų antiradikalinis aktyvumas, nustatytas DPPH metodu, yra 4,260 µmol TE/g, o redukcinis aktyvumas, nustatytas FRAP metodu – 8,472 µmol TE/g. Iš kriaušių vaisių luobelių pagamintų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas in vitro yra ţymiai stipresnis: antiradikalinis aktyvumas, nustatytas DPPH metodu, yra 12,101 µmol TE/g, o redukcinis aktyvumas, nustatytas FRAP metodu – 19,813 µmol TE/g [45].

4.3. Kriaušių vaisių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai

Biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija iš augalinių ţaliavų yra vienas svarbiausių fitocheminio tyrimo ţingsnių [28, 36, 44]. Tinkamai pasirinkta ekstrakcijos metodika leidţia išskirti didţiausią biologiškai aktyvių junginių kiekį ir objektyviai įvertinti augalinės ţaliavos kokybinę ir kiekybinę sudėtį [36].

Ekstrakcija skystais tirpikliais yra labiausiai paplitęs, paprastas, efektyvus ir lengvai pritaikomas ekstrakcijos būdas. Fenolinių junginių ekstrakcijai daţniausiai naudojamas acetonas, etilacetatas, metanolis, etanolis ir jų mišiniai su vandeniu [28]. Svarbu tai, jog nėra universalaus metodo, tinkančio ekstrahuoti fenolinius junginius iš skirtingų augalinių ţaliavų, todėl ekstrakcijos metodai yra modifikuojami, pritaikomi tam tikrai augalinei ţaliavai [36]. Labai svarbu pasirinkti tinkamą, ekstrahuojamiems fenoliniams junginiams giminingą tirpiklį, ekstrakcijos trukmę, temperatūrą, nes šie faktoriai lemia ekstrakcijos efektyvumą [28]. Ilgai ekstrahuojant fenolinius junginius aukštoje temperatūroje padidėja jų degradacijos galimybė, todėl svarbu optimizuoti ekstrakcijos metodiką, siekiant, kad šis procesas vyktų kuo trumpiau ir kuo ţemesnėje temperatūroje, nes taip taupomi ekonominiai kaštai [28].

Literatūroje aprašyta keletas kriaušių vaisių fenolinių junginių ekstrakcijos metodikų [51, 60, 69, 75]. Maceracija – paprastas, lengvai pritaikomas ekstrakcijos metodas, tačiau jis pasiţymi maţu efektyvumu, procesas trunka ilgai, todėl nėra ekonomiškas. Ekstrahuojant dideliais tirpiklio kiekiais maceracijos būdu, padidėja uţteršimo iš aplinkos galimybė, fenolinius junginius veikia oras, šviesa.

Indijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, jog geriausiai fenolinius junginius iš kriaušių vaisių ekstrahuoja etilacetatas ir etanolis. Šie tirpikliai ekstrahuoja 3 kartus didesnį fenolinių junginių kiekį negu vanduo ir net 6 kartus didesnį fenolinių junginių kiekį negu chloroformas [25]. Kinų mokslininkai taikė maceracijos metodą, norėdami išskirti fenolinius junginius iš švieţių susmulkintų kriaušių vaisių. Ekstrakcija buvo vykdoma 95 proc. etanoliu (1:8, m/v) 3 kartus po 2 valandas [51]. Indijos mokslininkai išskyrė fenolinius junginius iš dţiovintų kriaušių vaisių, juos ekstrahuodami metanoliu (1:4 m/v) 24 valandas [71].

Fenolinių junginių išskyrimui iš kriaušių vaisių daţniausiai naudojama ekstrakcija ultragarso pagalba (sonifikacija). Taikant šį metodą, nereikalinga labai sudėtinga aparatūra, metodas yra santykinai pigus, ekonomiškas, plačiai pritaikomas tiek laboratorijose, tiek pramonės įmonėse [28, 36]. Sonifikacija yra labai našus metodas, pagrįstas tuo, kad tirpikliu sklindančios ultragarso bangos sukelia kavitacijos reiškinį – oro burbuliukų susiformavimą ir greitą jų sproginėjimą. Burbuliukų sprogimas paţeidţia ląstelės sieneles, taip palengvindamas tirpiklio patekimą į ląstelės vidų, todėl greitėja ekstraktyvinių medţiagų tirpimas tirpiklyje, trumpėja ekstrakcijos laikas, maţėja fenolinių junginių suirimo rizika [28, 44].

Turkijos mokslininkai, išskirdami arbutiną iš įvairių kriaušių dalių, optimizavo ekstrakcijos ultragarso pagalba metodiką, taikydami paviršiaus – atsako (Box – Benkhen) dizainą. Šiam tikslui buvo pasirinkti 3 faktoriai: ekstrakcijos temperatūra 30 – 60 o

C, ekstrakcijos trukmė 20 – 60 min, metanolio koncentracija 25 – 75 proc. Ekstrakcija buvo vykdoma ultragarso vonelėje, pasirenkant 50 kHz ultragarso bangos daţnį. Atlikus gautuose ekstraktuose esančio arbutino kiekybinę analizę, buvo nustatyta, jog didţiausia ekstrakcijos išeiga pasiekiama, esant 44 oC temperatūrai, 49 proc. metanolio koncentracijai ir 39 min. ekstrakcijos trukmei [21].

Kinų mokslininkai išskyrė fenolinius junginius ultragarso bangų pagalba, atskirai ekstrahuodami kriaušių luobeles ir minkštimus metanolio ir vandens mišiniu (6:4). Ultragarso bangos daţnis 50 kHz, galia 120 W, ekstrakcijos trukmė 30 min, temperatūra 25 o

C [75].

Lenkų mokslininkai išskyrė fenolinius junginius iš kriaušių vaisių 30 proc. metanoliu (1:25 m/v), parūgštintu 1 proc. acto rūgštimi, pridedant 1 proc. askorbo rūgšties, kaip antioksidanto. Ekstrakcija vyko ultragarso vonelėje 20 min. Ultragarso bangos daţnis buvo 40 kHz, galia 300 W [47]. Ekstrahuojant fenolinius junginius iš kriaušių vaisių labai daţnai, kaip tirpiklis yra naudojamas metanolis, kuris yra sumaišytas su 1 proc. 2,6-di-tert-butyl-4-p-krezoliu (BHT), kuris apsaugo fenolinius junginius nuo oksidacijos [30].

Superkritinių skysčių ekstrakcija – vienas paţangiausių ekstrakcijos metodų, kurio esmė fenolinių junginių ekstrakcija suskystintomis dujomis, pavyzdţiui, anglies dioksidu. Siekiant padidinti anglies dioksido giminingumą fenoliniams junginiams, pridedama įvairių, poliariškumą didinančių medţiagų, pavyzdţiui, metanolio, etanolio. Taikant superkritinių skysčių ekstrakciją, gaunamas labai išgrynintas ekstraktas, nes suskystintame anglies diokside netirpsta chlorofilas ir kiti nepoliniai junginiai. Kitas šio metodo privalumas – labai sumaţinama fenolinių junginių oksidacijos ir skilimo galimybė. Trūkumas – reikalinga brangi aparatūra [36, 44].

Pietų Korėjos mokslininkai atliko kriaušių vaisių fenolinių junginių ekstrakcijos superkritiniais skysčiais metodikos optimizaciją, taikant paviršiaus – atsako dizainą. Pasirinkti 4 faktoriai: pagalbinio tirpiklio (metanolio ir etanolio) koncentracija 22 – 30 proc., slėgis 250 – 300 bar, ekstrakcijos temperatūra 32 – 60 o

C, ekstrakcijos laikas 90 – 150 min. Ekstrakcija vykdyta superkritinių skysčių kameroje, slėgis kontroliuotas mikrovoţtuvais. Kaip superkritinis skystis naudotos suskystintos anglies dioksido dujos. Atlikus ekstrakciją ir įvertinus bendrą fenolinių junginių kiekį gautuose ekstraktuose, nustatytos optimalios ekstrakcijos sąlygos: 26 proc. metanolio koncentracija, slėgis 275 bar, temperatūra 45 oC, o trukmė 45 min [48].

Ekstrakcijos mikrobangų pagalba metu, mikrobangų energija palengvina fenolinių junginių išsiskyrimą iš augalinės ţaliavos ir pagreitina jų ištirpimą tirpiklyje, nes mikrobangos skatina molekulių judėjimą ir dėl to tirpiklis įšyla. Galima išskirti keletą šio metodo privalumų: a) sutrumpinamas ekstrakcijos laikas; b) sunaudojama maţiau tirpiklių; c) didelė biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijos išeiga. Pagrindinis trūkumas – fenoliniai junginiai, turintys daug hidroksilo grupių jautrūs aukštai temperatūrai ir šio metodo negalima pritaikyti šių junginių ekstrakcijai [28, 36, 44, 67].

Kinijos mokslininkai atliko kriaušių vaisių fenolinių junginių ekstrakcijos mikrobangų pagalba metodikos optimizaciją, taikydami paviršiaus – atsako dizainą. Buvo pasirinkti 4 faktoriai: ekstrakcijos laikas 60 – 180 s, mikrobangų galia 320 – 640 W, etanolio koncentracija 40 – 60 proc. (v/v), tirpiklio – ţaliavos santykis 40 – 60 ml/g. Ekstrakcija vyko mikrobangas generuojančiame aparate, palaikant vienodą temperatūrą. Vertinant bendrą fenolinių junginių kiekį, nustatyta, jog optimalus ekstrakcijos laikas yra 124 s, mikrobangų galia 408 W, etanolio koncentracija 56 proc. (v/v), tirpiklio – ţaliavos santykis 45 ml/g [60].

4.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės analizės metodai

Augalinė ţaliava, naudojama medicinos praktikoje, turi atitikti jai keliamus reikalavimus. Atliekami augalinių ţaliavų fitocheminiai tyrimai, kurių metu yra nustatoma jų cheminė sudėtis ir

įvertinama kokybė. Kiekvieno fitocheminio tyrimo sėkmė labai priklauso nuo tinkamų analizės metodų pasirinkimo. Analizės metodai pasirenkami, atsiţvelgiant į iškeltą tyrimo tikslą, suformuotus uţdavinius, tyrimo objektą, kitas specifines tyrimo sąlygas, norimus gauti rezultatus, metodų trūkumus bei privalumus [4].

Mokslinėje literatūroje yra aprašyta labai daug fenolinių junginių analizės metodų, kuriuos galima sugrupuoti į 3 dideles grupes. Tai spektrofotometriniai, chromatografiniai ir elektrocheminiai tyrimo metodai [4]. Fenolinių junginių analizei daţniausiai yra taikomi spektrofotometriniai ir chromatografiniai analizės metodai, daug rečiau – elektrocheminiai analizės metodai [30].

4.4.1. Spektrofotometriniai analizės metodai

Spektrofotometriniai analizės metodai – vieni iš plačiausiai taikomų instrumentinės analizės metodų. Šių metodų esmė – tiriamosios medţiagos yra įvertinamos pagal tai, kaip jų dalelės (atomai, molekulės, branduoliai, elektronai ar jonai) geba absorbuoti arba išsklaidyti elektromagnetinę spinduliuotę. Šių analizės metodų pagalba galima tiriamuosius junginius identifikuoti, juos kiekybiškai įvertinti (UV ir regimosios šviesos spektrofotometrija ir kt.) ar net nustatyti jų struktūrą (IR – spektrofotometrija ir kt.) [4].

Fenolinių junginių tyrimuose spektrofotometriniai analizės metodai daţniausiai pritaikomi norint įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą atskirų fenolinių junginių grupių, tokių kaip fenolinės rūgštys, flavonoidai, proantocianidinai ir kt., kiekį [27, 53]. Spektrofotometriniai analizės metodai yra labai svarbūs tada, kai norima įvertinti fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą [73].

Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti daţniausiai taikomas spektrofotometrinis Folin – Ciocalteu metodas, kuris yra pagrįstas oksidacijos – redukcijos reakcija natrio karbonato aplinkoje. Šios reakcijos metu elektronai yra pernešami nuo fenolinių junginių ant fosfomolibdeno ir fosfovolframo rūgščių. Taip susiformuoja mėlynos spalvos kompleksas, kurio absorbcijos dydis yra matuojamas spektrofotometru, esant šviesos bangos ilgiui 760 – 765 nm [13, 27, 44, 55]. Šio metodo metu yra naudojamas specialus Folin – Ciocalteu reagentas. Kaip standartas daţniausiai yra naudojama galo rūgštis [23, 25, 27, 43]. Su šiuo reagentu reaguoja fenoliniai junginiai, askorbo rūgštis, angliavandeniai ir kitos augalinėje ţaliavoje esančios medţiagos, kurios pasiţymi oksidacinėmis – redukcinėmis savybėmis [27, 63, 73].

Fitocheminių fenolinių junginių tyrimų metu labai daţnai yra įvertinamas bendras flavonoidų kiekis augalinėje ţaliavoje [7, 73]. Daţniausiai bendram flavonoidų kiekiui nustatyti yra taikomas spektrofotometrinis metodas, paremtas flavonoidų reakcija su AlCl3 natrio acetato arba acto rūgšties

hidroksilo grupėmis. Dėl to susiformuoja geltonos spalvos kompleksas, kurio absorbcijos dydis yra matuojamas, esant 404 – 430 nm šviesos bangos ilgiui. Priklausomai nuo metodo modifikacijos ypatumų, matavimai gali būti atliekami praėjus 2 – 60 min nuo reakcijos pradţios, o naudojamo aliuminio chlorido tirpalo koncentracija gali būti 2 – 10 proc. (m/V) [59]. Šio metodo metu kaip standartas gali būti naudojamas rutinas, kvercetinas, kvercitrinas, (+)-katechinas. Šis metodas yra jautrus tik flavonoliams ir flavononams (liuteolinui) [59].

Mokslinėje literatūroje yra aprašyta kita šio spektrofotometrinio metodo modifikacija, kuomet į reakcijos mišinį be aliuminio chlorido dar yra pridedamas natrio nitritas bei natrio šarmas. Susiformuoja raudonos spalvos kompleksas, kurio absorbcijos dydis yra matuojamas po 5 – 10 min, esant 510 nm šviesos bangos ilgiui [25, 27, 49, 59]. Kaip standartas yra naudojamas katechinas [59]. Šis modifikuotas metodas yra jautrus flavan-3-oliams, rutinui, liuteolinui, fenolinėms rūgštims [59].

Reikia paţymėti, jog geriausiai su AlCl3 reaguoja flavonai (pvz. apigeninas, liuteolinas) ir

flavonoliai (pvz. rutinas, kvercetinas, kemferolis, kvercitrinas) [59]. Tuo tarpu, flavanonai (pvz. naringinas, hesperetinas) ir dihidroflavonoliai rūgštinėje aplinkoje geriausiai reaguoja su 2,4-dinitrofenilhidrazinu, suformuodami spalvotus junginius – fenilhidrazonus, kurių absorbcijos dydis matuojamas, esant 486 nm šviesos bangos ilgiui [24, 27, 59]. Kaip standartas yra naudojamas pinocembrinas [59].

Antioksidantiniam fenolinių junginių aktyvumui įvertinti yra sukurta daug spektrofotometrinių metodų, kuriuos būtų galima suskirstyti dvi grupes [9, 28]. Vieni antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai yra pagrįsti tuo, jog antioksidantai geba atiduoti elektronus ir taip surišti laisvuosius radikalus. Šiai metodų grupei priklauso DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas, ABTS laisvųjų radikalų – katijonų surišimo metodas, geleţies jonų redukcinės antioksidantinės – galios (FRAP) įvertinimo metodas, vario jonų redukcinės – antioksidantinės galios (CuPRAC) įvertinimo metodas [28]. Būtent paskutiniai keturi metodai yra patys populiariausi antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai [9].

UV – VIS spektrofotometrinis DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas. DPPH· (2,2- difenil-1-pikrilhidrazil) laisvasis radikalas pasiţymi dideliu stabilumu, nes turi delokalizuotą elektroną. Dėl to jis nesijungia su kitu DPPH· laisvuoju radikalu. Šio reagento tirpalas yra violetinės spalvos. Antioksidantas, kuris geba atiduoti vandenilio atomą, suformuoja molekulinį DPPH, todėl tirpalo spalva kinta į blankiai geltoną. Matuojant tirpalo absorbcijos dydţio pokytį, esant fiksuotam 515 – 528 nm šviesos bangos ilgiui, galima nustatyti antioksidantinį aktyvumą, nes antioksidanto kiekis yra proporcingas absorbcijos dydţio sumaţėjimui [9, 62, 63, 75].

UV – VIS spektrofotometrinis ABTS laisvųjų radikalų – katijonų surišimo metodas. Stabilus ABTS·+ radikalas – katijonas yra gaunamas, oksiduojant ABTS (2,2„-azino-bis-(3- etilbenztiazolino-6-sulfono rūgštį) kalio persulfatu arba mangano dioksidu. Gaunamas ţydros spalvos

tirpalas, kuris absorbuoja šviesos spinduliuotę, esant 743 nm bangos ilgiui. Kaip ir spektrofotometrinio DPPH metodo metu, antioksidantinis aktyvumas nustatomas matuojant absorbcijos dydţio pokytį [9, 62, 63].

UV – VIS spektrofotometrinis FRAP metodas. Metodas pagrįstas tuo, jog antioksidantas, atiduodamas elektronus, rūgštinėje terpėje geba redukuoti trivalentės geleţies – TPTZ (2,4,6-tri-(2- piridil)-1,3,5-triazino) kompleksą į dvivalentės geleţies – TPTZ kompleksą, kuris yra tamsiai mėlynos spalvos. Absorbcijos dydţio pokytis yra matuojamas spektrofotometru, esant 593 nm šviesos bangos ilgiui [9, 62, 63].

UV – VIS spektrofotometrinis CuPRAC metodas. CuPRAC reagentą sudaro lygiomis dalimis sumaišyti vario chlorido, neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino ir amonio acetato (pH = 7,0) tirpalai. Antioksidantas, gebantis atiduoti elektroną, redukuoja dvivalentį vario katijoną iki vienvalenčio, kuris su neokuproinu sudaro spalvotą kompleksą. Po 30 min spektrofotometru yra matuojamas absorbcijos dydis, esant 450 nm šviesos bangos ilgiui [9, 62, 63].

Kita antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodų grupė pagrįsta tuo, jog antioksidantai gali atiduoti vandenilio atomus, taip surišdami laisvuosius radikalus. Šiai metodų grupei priklauso deguonies radikalų surišimo talpa (ORAC), bendras radikalų surišimo antioksidantinis parametras (TRAP), tačiau jie yra daug rečiau taikomi praktikoje [28].Visų spektrofotometrinių antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų rezultatai daţniausiai yra išreiškiami trolokso, askorbo rūgšties ekvivalentais [9, 23].

4.4.2. Chromatografiniai analizės metodai

Atliekant augalinių ţaliavų ekstraktų tyrimus, chromatografiniai analizės metodai yra daţniausiai naudojami [4]. Vaistinių augalinių ţaliavų biologiškai aktyvių junginių analizei taikoma plonasluoknė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija ir dujų chromatografija. Pastarieji du metodai yra patys populiariausi [44].

Populiariausias ir pirmiausiai pasirenkamas chromatografinis fenolinių junginių analizės metodas yra efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Tai informatyvus, tikslus, patikimas, dideliu atrankumu pasiţymintis, lengvai modifikuojamas analizės metodas, kuris tinka rutininei vaistinių augalinių ţaliavų fenolinių junginių analizei [30]. Taikant šį metodą, galima išskirstyti atskirus fenolinius junginius, nes jų sulaikymo laikas kolonėlėje skiriasi ir yra būdingas tam tikram junginiui. ESC metodu fenolinius junginius galima identifikuoti, kiekybiškai įvertinti, analizuoti jų darinius, degradacijos produktus [4].

Daţniausiai yra taikoma atvirkštinių fazių efektyvioji skysčių chromatografija [28, 33, 37]. Šio metodo ypatumas – nejudančiosios fazės silikagelio silanolio grupės yra modifikuotos prie jų prijungiant oktano ar oktadekano grupes. Tokiu būdu yra pagerinamas chromatografinių smailių simetriškumas, tiriamieji junginiai geriau atsiskiria. Fenolinių junginių analizėje kaip eliuentai daţniausiai yra naudojami acetonitrilas, metanolis, vanduo. Mobili fazė gali būti parūgštinama acto, skruzdţių, fosforo rūgštimi, gali būti pridedama fosfatinio, citratinio buferių, norint palaikyti reikiamą pH. Analičių detekcijai daţniausiai naudojami fiksuoto bangos ilgo UV – VIS, fotodiodų matricos, UV – VIS fluorescenciniai detektoriai. Šiuo metu vienas paţangiausių detekcijos būdų yra masių spektrometrija ir įvairios jos modifikacijos, sujungiant su kitais detektoriais (pvz. diodų matricos detektorius veikiantis kartu su masiu spektrometru vienoje sistemoje) [28, 37, 40]. Naudojant UV – VIS detektorius, flavan-3-oliai ir hidrochinono dariniai yra identifikuojami esant 280 nm, fenolinės rūgštys – 320 nm, flavonai – 340 nm, o flavonolių glikozidai – 360 nm šviesos bangos ilgiui [74].

Ultra efektyvioji skysčių chromatografija (UESC) – vienas paţangiausių ir perspektyviausių chromatografinio skirstymo metodų [4, 73]. Metodas pasiţymi didesne skiriamąja geba, trumpesniu analizės laiku lyginant su efektyviąja skysčių chromatografija, sunaudojama maţiau tirpiklių [4]. Lenkų mokslininkai tyrė kriaušių vaisius, taikydami atvirkštinių fazių UESC metodą. Tyrimų metu kriaušių vaisiuose identifikuoti net 65 fenoliniai junginiai: 26 fenolinės rūgštys, 22 monomeriniai ir polimeriniai flavan-3-oliai, 15 flavonolių, 1 flavonas ir 1 hidrochinono darinys [46].

4.4.3. Elektrocheminiai tyrimo metodai

Populiariausias ir daţniausiai taikomas elektrocheminis fenolinių junginių analizės metodas – kapiliarinė elektroforezė [4]. Šis metodas pasiţymi didele skiriamąja geba, tinka maţo ir vidutinio molekulinio svorio polinių ir elektrochemiškai aktyvių fenolinių junginių išskirstymui. Analizė vykdoma greitai, efektyviai, sunaudojamas nedidelis kiekis tiriamojo objekto ir reagentų, tačiau šis metodas pasiţymi maţesniu jautrumu nei efektyvioji skysčių chromatografija. Kaip detektoriai daţniausiai naudojamas masių spektrometras, UV – VIS spektrofotometrija, elektrocheminiai detektoriai. Yra vystomi ir kiti elektrocheminiai tyrimo metodai: micelinė elektrokinetinė chromatografija, kapiliarinė elektrochromatografija, kapiliarinė zonų elektroforezė, ciklinė voltametrija, difuzinio pulsavimo voltametrija [29, 37].

4.5. Kriaušių vaisių biologiškai aktyvių junginių poveikis

Kriaušių vaisiuose kaupiamų antrinių metabolitų įvairovė yra didelė [44]. Biologiškai aktyvūs junginiai, nustatyti kriaušių vaisiuose, veikia įvairias ţmogaus organizmo sistemas [25, 64]. Kriaušių vaisiuose nustatyti fenoliniai junginiai, pasiţymintys stipriu antioksidantiniu poveikiu. Šio poveikio mechanizmas yra trejopas: 1) fenoliniai junginiai tiesiogiai suriša laisvuosius deguonies (ROS) ir azoto (RNS) radikalus; 2) slopina fermentų, atsakingų uţ laisvųjų radikalų sintezę, aktyvumą; 3) sustiprina biomolekulių antioksidantinę apsaugą nuo ţalingo laisvųjų radikalų poveikio [28].

Fenoliniai junginiai turi savitą struktūrą. Jiems būdinga delokalizuota aromatinė sistema su nesuporuotu elektronu ir fenolinė hidroksilo grupė, kurios vandenilio atomas yra lengvai atiduodamas. Fenoliniai junginiai laisviesiems radikalams gali atiduoti tiek nesuporuotą elektroną, tiek laisvąjį vandenilio atomą, todėl šie junginiai laisvuosius radikalus suriša pagal du pagrindinius mechanizmus, kurie gyvuosiuose organizmuose daţniausiai vyksta vienu metu [9, 28]. Šie mechanizmai dar yra vadinami vandenilio atomo perdavimo ir elektronų perdavimo reakcijomis [9]. Atiduodami vandenilio atomą, fenoliniai junginiai nutraukia grandininę laisvųjų radikalų reakciją (1) [28]:

POH + R∙ → RH + PO∙ (1)

Fenoliniai junginiai turi delokalizuotą aromatinę π elektronų sistemą, todėl reakcijos metu susidaręs naujas radikalas yra stabilus, nesukelia naujos grandininės reakcijos, išskirtinai reaguoja tik su kitais laisvaisiais radikalais, sudarydami netoksiškus ar maţai toksiškus junginius (2) [28, 61]:

PO∙ + R∙ → POR (2)

Fenoliniai junginiai, turintys dvi ir daugiau fenolinių hidroksilo grupių, geba surišti reaktyvius pereinamųjų metalų jonus (Cu+

, Fe2+), atsakingus uţ laisvųjų radikalų gamybą. Šie jonai, reaguodami su vandeniliu peroksidu, suformuoja laisvuosius hidroksilo radikalus, kurie yra labai ţalingi (Fentono lygtis) (3) [28]:

H2O2 + Cu+ (Fe2+) → Cu2+ (Fe3+) + OH + ∙OH- (3)

Fenoliniai junginiai apsaugo organizmo ląsteles nuo ţalingo laisvųjų radikalų poveikio, sumaţina širdies ir kraujagyslių, vėţio, autoimuninių ligų, diabeto, Alzheimerio ir kitų lėtinių ligų atsiradimo riziką. Kriaušių vaisiuose kaupiami fenoliniai junginiai pasiţymi uţdegimą, alergiją, patogeninius mikroorganizmus, virusus slopinančiu poveikiu, stabdo senėjimo procesus ţmogaus organizme [25, 51, 75].

Kriaušių vaisiuose yra nustatytas arbutinas, kuris pasiţymi šlapimo takus dezinfekuojančiu poveikiu, todėl kriaušių vaisių ekstraktus galima panaudoti gydant šlapimo takų infekcijas [64, 71, 72]. Kriaušių vaisiuose kaupiamos rauginės medţiagos ir flavonoidai pasiţymi ţaizdų gijimą skatinančiu poveikiu [25, 26]. Tai patvirtina ir atlikti tyrimai su ţiurkėmis, kurie parodė, jog kriaušių vaisių ekstraktas (200 mg/kg) pasiţymi ţaizdas gydančiu poveikiu, kuris prilygsta 5 proc. povidono tepalo

poveikiui [26]. Atlikti tyrimai su pelėmis parodė, jog kriaušių vaisių ekstraktas geba slopinti α – gliukozidazės aktyvumą, todėl tinka 2 tipo cukrinio diabeto gydymui [75]. Nustatyta, jog tokį antidiabetinį poveikį lemia kriaušių vaisiuose kaupiamos chlorogeno, vanilino, ferulo rūgštys ir rutinas [75].

Kriaušių vaisiai yra vertingas įvairių mineralinių medţiagų, ypač kalio, šaltinis [58]. Vaisiuose yra nemaţai skaidulinių medţiagų – ląstelienos, todėl yra aktyvinama ţarnyno motorinė veikla ir išvengiama vidurių uţkietėjimo [72].

4.6. Literatūros apţvalgos apibendrinimas

Mokslinėje literatūroje yra aprašyta daug kriaušių genties augalų fitocheminės sudėties tyrimų. Paskelbta mokslinių publikacijų apie kriaušių vaisiuose, sėklose, ţievėje, lapuose ir ţieduose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių įvairovę. Plačiausiai ištirta kriaušių vaisių fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis. Didţiausiais kiekiais kriaušių vaisiuose nustatyti šie fenoliniai junginiai: a) fenolinės rūgštys (kavos, chlorogeno); b) flavonolių glikozidai (kvercetino, kempferolio, izoramnetino dariniai); c) monomeriniai flavan-3-oliai ((+)-katechinas, (-)-epikatechinas); d) arbutinas. Kriaušių vaisių ėminių fenolinių junginių ekstrakcijai pasaulio mokslininkai daţniausiai taiko ekstrakcijos ultragarso pagalba metodą (sonifikaciją). Mokslinės literatūros duomenimis, atliekant kriaušių vaisių fitocheminius tyrimus, daţniausiai taikomi spektrofotometriniai ir chromatografiniai fenolinių junginių analizės metodai.

Panašių kriaušių vaisių fitocheminės sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų kriaušių vaisių fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį. Išanalizavus mokslinę literatūrą ir naujausius pasaulio mokslininkų tyrimų duomenis, nusprendėme augalinės ţaliavos – kriaušių vaisių fenolinių junginių ekstrakcijai taikyti sonifikacijos metodą, o jų kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui – UV – VIS spektrofotometrinį ir ESC metodus.

5. TYRIMO METODIKA

5.1. Tyrimo objektas

Tyrimo metu naudoti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų paprastųjų kriaušių (Pyrus

communis L.) veislių vaisių ėminiai, rinkti skirtinguose Lietuvos regionuose 2015 m. rugsėjo – spalio

mėn. (1 lentelė).

1 lentelė. Tiriamųjų objektų charakteristika

Eil.

Nr. Kriaušių veislė Dţiovinta/ Liofilizuota Koordinatės

1. 'Patten' Dţiovinta 54°40'47.4"N 22°48'45.5"E 2. 'Concorde' Dţiovinta 56°10'48.8"N 23°34'58.0"E 3. 'Grabova' Dţiovinta 54°48'51.1"N 24°25'49.2"E 4. 'Konferencinė' Liofilizuota 55°05'02.5"N 23°48'09.1"E

Kriaušių veislės 'Patten' vaisių ėminiai rinkti Gudkaimyje (Vilkaviškio raj.) esančiame sodų ūkyje, 'Concorde' – Kirnaičiuose (Joniškio raj.) esančiame privačiame sode, 'Grabova' – Ţieţmariuose (Kaišiadorių raj.) esančiame sodų ūkyje, 'Konferencinė' – Babtuose (Kauno raj.) esančiame Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir darţininkystės instituto eksperimentiniame sode.

5.2. Tyrimo metu naudoti reagentai

Visi tyrimo metu naudoti reagentai, standartai ir tirpikliai atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus ir buvo analitinio švarumo. Tyrimo metu naudotas: 96,3 proc. (v/v) etanolis (gamintojas AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuvos Respublika); Folin – Ciocalteu reagentas, 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinės rūgšties („Trolox“) standartas, galo rūgšties monohidrato standartas, chlorogeno rūgšties standartas, aliuminio chlorido heksahidratas, acto rūgštis, ABTS, vandenilio chlorido rūgštis (gamintojas „Sigma-Aldrich“, Steinheim, Vokietijos Federacinė Respublika); rutino standartas (gamintojas „Extrasynthese“, Genay, Prancūzijos Respublika); natrio hidroksidas (gamintojas „Chempur“, Lenkijos Respublika); heksametilentetraminas (gamintojas „Lachema“, Neratovice, Čekijos Respublika); natrio acetatas (gamintojas „Scharlau“, Ispanijos Karalystė); DPPH, natrio karbonatas, kalio persulfatas, TPTZ (gamintojas „Carl Roth, Karlsruhe“,

Vokietijos Federacinė Respublika); geleţies (III) chloridas heksahidratas (gamintojas „Vaseline-Fabrik Rhenania“, Bonn, Vokietijos Federacinė Respublika).

5.3. Tyrimo metu naudota aparatūra

Tyrimo metu kriaušių vaisių ėminiams susmulkinti buvo naudojamas elektrinis malūnėlis „Retsch 200“ („Retsch GmbH“, Vokietijos Federacinė Respublika). Susmulkintos augalinės ţaliavos ir reagentų svėrimui naudotos elektroninės analitinės svarstyklės „Sartorius CP64-0CE“ (Vokietijos Federacinė Respublika). Fenolinių junginių ekstrakcija iš kriaušių vaisių ėminių vykdyta ultragarso vonelėje „Bandelin Sanorex Digital 10P“ (Vokietijos Federacinė Respublika). Augalinės ţaliavos ekstraktų spektrofotometriniai tyrimai atlikti naudojant UV – VIS spektrofotometrą „M550“ (Jungtinė Karalystė), o kriaušių vaisių ėminių ekstraktų fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė – naudojant skysčių chomatografą „Waters 2695 Alliance“ su fotodiodų matricos detektoriumi„Waters 2998 PDA“.

5.4. Tiriamųjų kriaušių vaisių ėminių ekstraktų paruošimas

Analitinėmis svarstyklėmis tiksliai pasveriama 2,5 g susmulkintų kriaušių vaisių ėminių miltelių, kurie yra suberiami į plačiakaklius tamsaus stiklo buteliukus ir uţpilami 30 ml 70 proc. (v/v) etanoliu. Tada buteliukai sandariai uţsukami ir sudedami į ultragarso vonelę, kurioje esantis vanduo jau yra pašildytas iki 60 o

C temperatūros. Ekstrakcija vykdoma 15 min. Ultragarso bangų daţnis 80 kHz, o galia – 1130 W. Gauti ekstraktai yra filtruojami per stiklo filtrą, naudojant vakuuminį siurblį. Ant stiklo filtro esantis papildomas apsauginis popieriaus filtras praplaunamas 20 ml 70 proc. (v/v) etanoliu. Gautas filtratas yra perkeliamas į 50 ml matavimo kolbą ir skiedţiamas 70 proc. (v/v) etanoliu iki brūkšnio. Vėliau pagaminti ekstraktai yra išpilstomi į plačiakaklius tamsaus stiklo buteliukus ir saugomi šaldytuve. Prieš chromatografinę analizę ekstraktai yra papildomai filtruojami per 0,22 µm porų dydţio membraninius filtrus [7, 8].

5.5. Tyrimo metodai

Nuodţiūvio nustatymas. Tyrimo metu atliktas augalinės ţaliavos nuodţiūvio įvertinimas, remiantis Europos farmakopėjoje (9.0 leidimas, 2.2.32 straipsnis) nurodyta metodika [32]. Visi tyrimo rezultatai perskaičiuoti absoliučiai sausos ţaliavos masei.

UV – VIS spektrofotometrinis Folin – Ciocalteu metodas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti. Tiriamojo mėginio paruošimas: sausame mėgintuvėlyje sumaišoma 1 ml tiriamojo ekstrakto, 5 ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo. Lyginamasis

tirpalas ruošiamas tokiu pat būdu, tik vietoje 1 ml tiriamojo ekstrakto yra pilamas 1 ml 70 proc. (v/v) etanolis. Visi tiriamieji mėginiai yra 60 min laikomi kambario temperatūroje tamsioje vietoje. Po to spektrofotometru matuojamas 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui [8].

Kalibracinio grafiko sudarymui naudojamas galo rūgšties standartas. Galo rūgšties koncentracijų ribos: [0 – 0,05 mg/ml].

𝒚 = 𝟗, 𝟔𝟔𝟖𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟏𝟓𝟐; 𝑹𝟐_{= 𝟎, 𝟗𝟗𝟓𝟓}

Bendras fenolinių junginių kiekis absoliučiai sausoje ţaliavoje gali būti apskaičiuojamas pagal formulę :

𝑋 =𝑋1× 𝑉 𝑚

X – bendras fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgšties ekvivalentą (mg/g); X1 – bendras fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgšties ekvivalentą (mg/ml); V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – absoliučiai sausos ţaliavos masė (g).

UV – VIS spektrofotometrinis metodas bendram hidroksicinamono rūgšties darinių kiekiui nustatyti. Arnow reagento paruošimas: analitinėmis svarstyklėmis tiksliai pasveriama 10,0 g natrio molibdato, kuris yra ištirpinamas 80 ml išgrynintojo vandens 100 ml talpos matavimo kolboje. Gaunamas tirpalas A. Tuomet yra tiksliai atsveriama 10,0 g natrio nitrito, kuris ištirpinamas jau paruoštame tirpale A. Gaunamas tirpalas B, kuris yra praskiedţiamas išgrynintuoju vandeniu iki 100 ml.

Tiriamojo mėginio paruošimas: 5 ml talpos matavimo kolbutėje yra sumaišoma 0,5 ml tiriamojo ekstrakto ir 1 ml 0,5 mol/l vandenilio chlorido rūgšties, tada pridedama 1 ml Arnow reagento, 1 ml 8,5 proc. natrio šarmo tirpalo ir skiedţiama išgrynintuoju vandeniu iki 5 ml. Lyginamasis tirpalo paruošimas: 5 ml talpos matavimo kolbutėje sumaišoma 0,5 ml tiriamojo ekstrakto, 1 ml 0,5 mol/l vandenilio chlorido rūgšties ir 1 ml natrio šarmo tirpalo ir skiedţiama išgrynintuoju vandeniu iki 5 ml. Nedelsiant yra matuojamas 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui.

Kalibracinio grafiko sudarymui naudojamas chlorogeno rūgšties standartas. Chlorogeno rūgšties koncentracijų ribos: [0 – 1,0 mg/ml].

Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis absoliučiai sausoje ţaliavoje gali būti apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑋 =𝑋1× 𝑉 𝑚

X – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis pagal chlorogeno rūgšties ekvivalentą

(mg/g);

X1 – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis pagal chlorogeno rūgšties ekvivalentą (mg/ml);

V – pagaminto ekstrakto tūris (ml); m – absoliučiai sausos ţaliavos masė (g).

UV – VIS spektrofotometrinis metodas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti. Tiriamojo tirpalo paruošimas: sausame mėgintuvėlyje sumaišoma 1 ml tiriamojo ekstrakto, 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, tada pridedama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo ir 1,2 ml išgrynintojo vandens. Laukiama 30 min. Tada pilama 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir sumaišoma. Lyginamojo tirpalo paruošimas: sausame mėgintuvėlyje sumaišoma 1 ml tiriamojo ekstrakto, 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, pridedama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo ir 1,9 ml išgrynintojo vandens. Matuojamas 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis, esant 407 nm šviesos bangos ilgiui [7].

Kalibracinio grafiko sudarymui naudojamas rutino standartas. Rutino koncentracijų ribos: [0 – 0,25 mg/ml].

𝒚 = 𝟒, 𝟖𝟔𝟗𝟒𝒙 − 𝟎, 𝟎𝟏𝟔𝟏; 𝑹𝟐= 𝟎, 𝟗𝟗𝟗𝟔

Bendras flavonoidų kiekis absoliučiai sausoje ţaliavoje gali būti apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑋 =𝑋1× 𝑉 𝑚

X – bendras flavonoidų kiekis pagal rutino ekvivalentą (mg/g); X1 – bendras flavonoidų kiekis pagal rutino ekvivalentą (mg/ml); V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – absoliučiai sausos ţaliavos masė (g).

UV – VIS spektrofotometrinis ABTS katijonų - radikalų surišimo metodas ekstraktų antiradikaliniam aktyvumui in vitro nustatyti. Pirmiausia yra paruošiamas motininis 2 mmol/l koncentracijos ABTS tirpalas. Tam analitinėmis svarstyklėmis tiksliai pasveriama 0,0548 g ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgšties) miltelių, kurie tamsaus stiklo plačiakakliame buteliuke yra ištirpinami 50 ml išgrynintojo vandens. Tada į gautą tirpalą įdedamas tiksliai atsvertas kalio persulfato kiekis (0,0095 g). Suplakama ir paliekama tamsoje 16 val. Per šį laiko tarpą vyksta

oksidacijos – redukcijos reakcija tarp ABTS ir kalio persulfato ir gaunamas aktyvus ABTS katijonas – radikalas, kuris išlieka stabilus apie 2 paras, jei yra laikomas kambario temperatūroje tamsioje vietoje [2, 76].

Darbinio ABTS reagento paruošimas: motininis ABTS tirpalas yra skiedţiamas išgrynintuoju vandeniu tol, kol tirpalo absorbcijos dydis tampa 0,800, matuojant spektrofotometru ties 734 nm šviesos bangos ilgiu. Kaip lyginamasis tirpalas yra naudojamas išgrynintasis vanduo.

Tiriamojo tirpalo paruošimas: sausame mėgintuvėlyje yra sumaišoma 3 ml darbinio ABTS reagento ir 20 µl tiriamojo ekstrakto. Mišinys yra laikomas 1 val. tamsoje, kambario temperatūroje. Po to yra matuojamas absorbcijos pokytis, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas – išgrynintasis vanduo.

Kalibracinio grafiko sudarymui naudojamas trolokso standartas. Trolokso koncentracijų ribos: [0 – 2,0 mg/ml].

𝒚 = −𝟎, 𝟐𝟖𝟗𝟔𝒙 + 𝟎, 𝟕𝟖𝟓𝟗; 𝑹𝟐_{= 𝟎, 𝟗𝟖𝟗𝟓}

Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas in vitro µmol TE/g gali būti apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑋 =𝑋1× 𝑉 × 1000 𝑚 × 250,29

X1 – ekstraktų antiradikalinis aktyvumas in vitro pagal trolokso ekvivalentą (TE) (mg/ml);

V – pagaminto ekstrakto tūris (ml); m – absoliučiai sausos ţaliavos masė (g).

UV – VIS spektrofotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas ekstraktų antiradikaliniam aktyvumui in vitro nustatyti. Pirmiausia yra paruošiamas motininis 60 µmol/l koncentracijos motininis DPPH tirpalas. Tam atsveriama 0,0012 g DPPH miltelių, kurie yra ištirpinami 50 ml 96,3 proc. (v/v) etanolyje 50 ml matavimo kolboje. Darbinis DPPH tirpalas yra pagaminamas skiedţiant motininį DPPH tirpalą 96,3 proc. (v/v) etanoliu tol, kol absorbcijos dydis tampa 0,800, matuojant spektrofotometru ties 517 nm šviesos bangos ilgiu [76].

Tiriamojo tirpalo paruošimas: sausame mėgintuvėlyje yra sumaišoma 3 ml darbinio DPPH reagento ir 20 µl tiriamojo ekstrakto. Mišinys yra laikomas 30 min. tamsoje, kambario temperatūroje. Po to yra matuojamas absorbcijos pokytis, esant 517 nm šviesos bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas – 96,3 proc. (v/v) etanolis.

Kalibracinio grafiko sudarymui naudojamas trolokso standartas. Trolokso koncentracijų ribos: [0 – 1,0 mg/ml].

𝒚 = −𝟎, 𝟓𝟖𝟏𝟐𝒙 + 𝟎, 𝟖𝟐𝟏; 𝑹𝟐 = 𝟎, 𝟗𝟗𝟖𝟔

Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas in vitro µmol TE/g, gali būti apskaičiuojamas pagal formulę: