KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Giedrė Jarienė
Žmogaus augimo hormono kokybinio ir kiekybinio nustatymo
fluorescenciniais metodais galimybės
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, biologija (01 B)
Disertacija rengta 2001-2005 metais Kauno medicinos universitete Endokrinologijos institute
Mokslinis vadovas:
prof. habil. dr. Liudvikas Lašas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
Konsultantas:
TURINYS
1. ĮVADAS IR DARBO AKTUALUMAS... 6
1.1. Darbo tikslas... 8
1.2. Uždaviniai... 8
1.3. Ginamieji teiginiai... 8
1.4. Darbo reikšmė ir naujumas... 9
1.5. Darbo praktinė reikšmė... 9
2. TYRIMŲ IR LITERATŪROS APŽVALGA... 10
2.1. Tyrimų apžvalga... 10
2.2. Fluorescencijos, kaip liuminescencijos atmainos, reiškinio teoriniai pagrindai ir specifika... 13
2.3. Fluorescencijos poliarizacijos ir anizotropijos bendra charakteristika... 21
2.4. Fluorescencijos poliarizacijos imuninės analizės panaudojimo žmogaus augimo hormono imuniniam nustatymui galimybės... 25
2.5. Fluorescencijos rezonanso energijos perdavimo reiškinio panaudojimo imuninėje analizėje galimybės... 27
2.6. Fluorescencinių žymių bendra charakteristika ir ypatumai, lyginant su kitomis žymėmis... 30
2.7. Žmogaus augimo hormonas, jo izoformos... 37
3. MEDŽIAGOS IR METODAI... 40 3.1. Medžiagos... 40 3.1.1. Pagrindinės substancijos... 40 3.1.2. Žymekliai... 40 3.1.3. Žymėtos substancijos... 41 3.1.4. Kitos medžiagos... 41 3.2. Metodai... 42
3.2.1. Fluorescencijos metodai ir taikomieji darbai... 42
3.2.2. Chromatografiniai metodai... 44
3.2.3. Kiti substancijų charakterizavimo metodai... 44
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 46
4.2. Fluorescencijos rezonanso energijos perdavimo registravimo
panaudojimas žmogaus augimo hormono ir antikūno prieš jį sąveikai in vitro
tirti... 52
4.2.1. Fluorescencijos spektro pokyčiai nesant specifinės antikūno atpažinimo-surišimo sąveikos... 55
4.2.2. Fluorescencijos spektro pokyčiai vykstant specifinei antikūno atpažinimo-surišimo sąveikai su hormonu... 57
4.3. Monomerinės ir oligomerinių žmogaus augimo hormono formų tyrimai fluorescencijos anizotropijos įvertinimo būdu... 59
4.3.1. Tirtų žymėtų žmogaus augimo hormono molekulinių formų mišinių kiekybinės sudėties nustatymo galimybės, įvertinant mišinio suminę fluorescencijos anizotropijos reikšmę... 61
4.4. Fluorescenciškai žymėto žmogaus augimo hormono panaudojimas išsiskyrimo iš sintetinių aplinkų kiekybiniam įvertinimui ir valdomam žmogaus augimo hormono išsiskyrimui tirti... 63
4.5. Žmogaus augimo hormono adsorbcijos prie įvairių paviršių įvertinimas naudojant fluorescencijos poliarizacijos matavimo metodą... 68
5. IŠVADOS... 72
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 73
7. PUBLIKACIJOS DISERTACINIO DARBO TEMA... 80
Santrumpos
([Ru(bpy)2(phen-ITC)]2+) – rutenio kompleksinis junginys
Bis-(bipiridin)-5-(izotiocianatfenantrolin)-Ru(PF6-)2
AF – Alexa Fluor 660
AF-žAH –Alexa Fluor 660 žymekliu žymėtas žAH AF-žAH-IG – AF-žAH imobilizavęs gelis
Ag - antigenas AK – antikūnas
ELISA – fermentu žymėto imunosorbento analizė FITC – fluoresceino izotiocianatas
FITC-AK – FITC žymėtas antikūnas
FPIA – fluorescencijos poliarizacijos imuninė analizė FRET – fluorescencijos rezonanso perdavimo reiškinys IFA – imunofunkcinė analizė
IG – imobilizavimo gelis
IRMA – imunoradiometrinė analizė P – poliarizacija
PMI – N-(3-Pyreno)maleimidas
PMI-žAH – žAH žymėtas N-(3-Pyreno)maleimidu
PVPPB – poli(N-vinil-2-pirolidono) ir fenilboro rūgšties kopolimeras r – anizotropija
RIA – radioimuninė analizė RITC – rodamino B izotiocianatas
RITC-žAH – žymėtas RITC žymekliu žmogaus augimo hormonas RRA – radioreceptorinis metodas
1. Įvadas ir darbo aktualumas
Pastaraisiais metais ypatingai sparčiai augo susidomėjimas proteomika, t.y. baltymų nustatymo, jų identifikavimo, savybių bei fiziologinio vaidmens tyrimais.
Žmogaus augimo hormonas (žAH) – baltymas, pasižymintis plačia molekulinių formų (izoformų) įvairove. Tarp šių molekulinių formų yra nemažai skirtumų. Vienas iš skirtumų, būdingų nemažai molekulinių formų daliai – hormono izoformos dėl skirtingo agregacijos laipsnio skiriasi savo dydžiu. Ištyrinėtos šio hormono molekulinės formos pasižymi skirtingomis fiziologinėmis ir antigeninėmis savybėmis. Tiriant, kaip imuninis aktyvumas atspindi biologinį aktyvumą, nustatyta, jog standartiniai imunologiniai tyrimai neduoda informacijos apie hormono (skirtingų žAH izoformų) ir receptoriaus sąveiką. Deja, kol kas nėra jokios imunologinės sistemos, galinčios atpažinti visas ar bent didesnę dalį iš žinomų izoformų, taip pat nėra atskirų sistemų, galinčių specifiškai atpažinti atskiras izoformas po vieną. Tokia situacija neleidžia sukurti veikmingo įprastiniais imunologiniais metodais besiremiančio modelio, kurį galima būtų tobulinti, atsižvelgiant į klinikinius šio hormono kiekybinio nustatymo reikalavimus. Tai apsunkina tiek kiekybinius žmogaus augimo hormono rutininių nustatymų vertinimą (atsiranda sąlyginumų, vertinant skirtingomis imunologinėmis priemonėmis gautas reikšmes), tiek fundamentalius atskirų jo izoformų tyrimus.
Žmogaus augimo hormono kiekio nustatymas serume yra nepakeičiamas įrankis nustatant žAH sekrecijos sutrikimus, tiek trūkumą, tiek perteklių. Tačiau šiuo metu įsivyravę monokloninius antikūnus naudojantys metodai dar labiau paryškino nustatomų žAH kiekių neatitikimus klinikiniams simptomams bei skirtingų žAH formų biologinio ir antigeninio aktyvumo skirtumų pasireiškimą.
nenaudotas žmogaus augimo hormono nustatymui. Rutininiam fluorescencijos metodų taikymui būtinas techninis tyrimo laboratorijų perginklavimas, kurio pagrindimui svarbus fluorescencinių metodų platesnio panaudojimo galimybių parodymas.
Fluorescencijos poliarizacijos (arba išvestinio dydžio – anizotropijos) matavimo metodo galimybė, leidžianti spręsti apie molekulės dydį, derinyje su fluorescencijos metodais, padedančiais kiekybiškai įvertinti dviejų baltymų - antigeno ir jį atpažįstančio antikūno - sąveikos mąstus, gali padėti sukurti veiksmingas imunologines šio hormono izoformų įvertinimo priemones. Teorinis tokio kiekybinio ir kokybinio nustatymo principas yra įmanomas, nes išmatuojama suminė fluorescencijos anizotropija išreiškiama kaip atskirų komponentų anizotropijų suma, įvertinant kiekvienos iš jų dalį fluorescuojančių komponentų mišinyje.
Labai paranki yra atvirkštinė priklausomybė tarp žAH izoformų molekulių dydžio ir biologinio aktyvumo (augant molekulių dydžiui, šis aktyvumas mažėja). Ši priklausomybė gali būti sėkmingai panaudojama, koreguojant fluorescenciškai išmatuojamojo žAH kiekį. Atliekant poliarizuotos fluorescencijos matavimus, didesnės molekulės, besisukančios lėčiau už mažesnes, per statmenai poliarizuotą filtrą duos mažesnį emisijos įnašą į išmatuojamąjį fluorescencijos stiprį negu mažesnės molekulės. Tai leistų skirtingo dydžio žAH izoformų bendrą nustatomąjį kiekį transformuoti į sąlyginį kiekį, artimesnį biologiniam aktyvumui.
Tam, kad pagrįsti galimybes tolimesniems taikomiesiems darbams bei praktiniam tokio nustatymo būdo įgyvendinimui, buvo reikalinga ši studija, parodanti atskirų
1.1. Darbo tikslas
Nustatyti žmogaus augimo hormono kiekybinio ir kokybinio charakterizavimo fluorescenciniais metodais galimybes, įvertinti šių metodų taikymo galimybes šio hormono buferiniuose tirpaluose, imunologinėse sistemose bei sintetinėse aplinkose.
1.2. Uždaviniai
1. Išnagrinėti fluorescencijos reiškinio taikymo žmogaus augimo hormono nustatymui galimybes bei įvairių fluorescencijos metodų panaudojimo privalumus, jei įmanoma, lyginant su literatūroje aprašytais kitos prigimties žymes naudojančiais metodais.
Pasirinkti hormono nustatymui taikintinus fluorescencijos metodus bei imuninės analizės būdus.
2. Atsižvelgiant į pasirinktus fluorescencijos metodus bei imuninės analizės būdus, atlikti eksperimentus, parodančius tinkamo fluorescencijos žymeklio prijungimo prie hormono ar antikūno galimybę, fluorescencinių žymių donoro-akceptoriaus poros sąveiką, esant antikūno ir hormono specifiniam susijungimui.
3. Žmogaus augimo hormono nustatymas fluorescenciniais metodais buferiniuose tirpaluose, imunologinėse sistemose, sintetinėse aplinkose.
1.3. Ginamieji teiginiai
1. Fluorescencijos reiškinio taikymas žmogaus augimo hormono nustatymui galimas,
fluorescencijos metodai turi privalumų, lyginant su literatūroje aprašytais kitos prigimties žymes naudojančiais metodais. Skirtingo dydžio žmogaus augimo hormono molekulinių formų kiekybinis ir kokybinis nustatymas yra galimas, panaudojant šių formų skirtingą savaiminio sukimosi skystoje terpėje greitį, atitinkamo, pakankamai ilgo, fluorescencijos gyvavimo periodo fluorescencinę žymę bei fluorescencijos poliarizacijos reiškinį.
3. Žmogaus augimo hormono polimero ir monomero buferinių tirpalų fluorescencijos spektrai, ypač poliarizuoti, tinka charakterizuoti šias hormono formas vandeniniuose tirpaluose, neturinčiuose pašalinių fluoroforų.
4. Žmogaus augimo hormono, žymėto apibrėžtų fluorescencinių savybių žyme, nustatymas fluorescenciniais metodais galimas tiek imunologinėse sistemose, esant hormono ir antikūno sąveikai, tiek sintetinėse aplinkose - valdomo hormono išsiskyrimo tyrimuose bei hormonui adsorbuojantis prie paviršių.
1.4. Darbo reikšmė ir naujumas
Ištirtos originaliu būdu gautų žmogaus augimo hormono monomerinės ir polimerinės molekulinių formų fluorescencijos savybės, panaudojant triptofano likučio hormono molekulėje fluorescenciją.
Parodyta, jog skirtingų žmogaus augimo hormono formų skirtingą sukimosi greitį įmanoma įvertinti panaudojant atitinkamo, pakankamai ilgo fluorescencijos gyvavimo periodo fluorescencinę žymę bei fluorescencijos poliarizacijos reiškinį. Pasiūlytas naujas skirtingo dydžio žmogaus augimo hormono molekulinių formų kiekybinio ir kokybinio nustatymo būdas, panaudojant šių formų imuninio atpažinimo komplekso skirtingą
savaiminio sukimosi skystoje terpėje greitį. Šis būdas neturi analogų nei tarp šio hormono formų, nei tarp kitų baltyminių hormonų formų nustatymo metodų.
Nustatytos naujos fluorescenciškai žymėto žmogaus augimo hormono kiekybinio nustatymo įvairiose terpėse ir situacijose galimybės, panaudojant matomojo spektro ilgesniųjų bangų sužadinamą fluorescencinę žymę. Parodytos galimybės taip žymėtą hormoną panaudoti žmogaus augimo hormono imobilizavimo ir valdomo išsiskyrimo tyrimams in vitro.
1.5. Darbo praktinė reikšmė
2. Tyrimų ir literatūros apžvalga.
2.1. Tyrimų apžvalga.
Įvairios gyvūninės kilmės bei žmogaus baltymai – augimo hormonai, savo laiku įvardijami kaip nespecifiniai, o vėliau ir kaip pasižymintys rūšiniu specifiškumu buvo
tyrinėjami praktiškai visais baltymų molekules charakterizuoti tinkamais metodais, taip pat ir fluorescenciniais (Aloj, 1970; Levison, 1976). Fluorescenciniai tyrimai buvo atliekami, tiek su fluorescencine žyme žymėtais (Levison, 1976), tiek su nežymėtais hormonais,
pasinaudojant natūralių, jų struktūroje esančių fluorescuojančių aminorūgščių fluorescencija (Aloj, 1970). Fluorescenciniai metodai, besiremiantys fluorescencijos stiprio kitimo
nustatymu, fluorescencijos spektrometrijos bei fluorescencijos poliarizacijos technikomis gerai koreliavo su kitais tyrimų metodais, todėl pasižymėjo ne tik kaip operatyvūs, bet ir kaip patikimi augimo hormonų konformacijų ir sąveikos su kitomis molekulėmis ar dariniais charakterizavimo metodai.
Iki 1985 m., iki kol nebuvo sukurti biosintetiniai genoinžinerijos būdu gaminami žmogaus augimo hormono preparatai, vaistiniai žmogaus augimo hormono preparatai buvo gaminami iš žmonių lavonų hipofizių (Lašienė, 2003). Nuo to laiko, kai 1985 m. buvo parodyta, kad rekombinantinis (genoinžinerinis) žmogaus augimo hormonas molekulės konformacijų tyrimuose savo savybėmis praktiškai nesiskiria nuo natūralaus hipofizės
žmogaus augimo hormono monomerinės formos (Larhammara, 1985), beveik visuose su žAH problematika susijusiuose tyrimuose pradėjo dominuoti rekombinantinio žAH naudojimas. Kadangi rekombinantinio žAH molekulės konformacijų tyrimus (Larhammara, 1985) pagrindė detalūs triptofano fluorescencijos bei spektropoliarimetriniais metodais gauti rezultatai, tai lėmė fluorescencijos metodų taikymo orientavimąsi į pigesnio ir prieinamesnio rekombinantinio žAH naudojimą. Nors egzistuoja galimybė paruošti aukštesnio agregacijos laipsnio – dimerines šio hormono formas (Dienys, 2000), rekombinantinis žAH buvo tirtas daugiausia įprastinėje savo būklėje, t. y. 22 kDa monomero pavidalu. Kaip palyginamasis bandinys buvo naudojamas monomerinis hipofizės žAH. Fluorescenciniais metodais detaliau buvo tirtos tik monomerinės šio baltymo atmainos savybės.
Šiuo metu žAH kiekybiškai charakterizuoti galima šiais metodais (Lašienė, 2003): imuninės analizės (radioimuniniu (RIA), imunoradiometriniu (IRMA), imunofermentiniu (ELISA), fluorescencijos imunometriniu TR-FIA (Albertsson-Wikland, 1993),
Biologinis ir radioreceptorinis metodai dažniausiai naudojami tik specifiniuose moksliniuose tyrimuose.
Imuninės analizės metodais, kurie yra labiausiai priimtini rutininėje su
endokrinologija susijusioje klinikinėje analizėje, kol kas nepavyko kiekybiškai ir kokybiškai charakterizuoti žAH molekulinių formų dėl antikūnų, gebančių pakankamai specifiškai atpažinti skirtingas žAH formas nebuvimo (Popii, 2004).
Imunofunkcinės analizės metodai, kurie, nežiūrint į sudėtingumą (naudojami žAH atpažįstantys receptoriai arba prisijungiantis baltymas), galėtų taip pat kada nors tapti rutininiais, tegali užtikrinti tik kai kurių žAH formų, pavyzdžiui 20 kDa ir 22 kDa
monomerinio žAH, sėkmingą specifinį atpažinimą (Strasburger, 1999). Imuninės analizės metodu, pavyzdžiui, ELISA metodu, naudojant didesnio specifiškumo antikūnus galima nustatyti 20 kDa ir 22 kDa monomerinio žAH formas (Hashimoto, 1998; Tsushima, 1999), nes jau gauti monokloniniai antikūnai gana specifiškai atpažįstantys šias dvi žAH formas (Mellado, 1996). Todėl imunofunkcinės analizės metodus žAH formų nustatymui tikslinga taikyti tais atvejais, kai reikalingas didesnis šių formų nustatymo tikslumas bei specifiškumas. IFA metodo taikymas kitų žAH formų atžvilgiu turi ribotas perspektyvas, nes šiuo metodu gaunamas mutuotų žAH formų imunoreaktyvumas daug žemesnis negu nustatant imuninės analizės metodais (naudojant polikloninius antikūnus) (Moura, 2004).
Tačiau visi šiuo metu naudojami komerciniai imuninės analizės rinkiniai neatsižvelgia į žAH molekulinių formų įvairovę bandinyje (Moura, 2004).
Norint nustatyti kitokias nei 22 kDa žAH formas tenka naudotis specialiu 22 kDa atskyrimu imuninės ekstrakcijos būdu, taip pat netenkant galimybės nustatyti dimerinį žAH (Boguszewski, 1996). Taip nustatomos kitokios nei 22 kDa žAH formos taip pat nėra kiekybiškai charakterizuojamos kiekviena atskirai.
Net placentinė žAH, kuri nuo hipofizės 22 kDa žAH formos skiriasi trylikos aminorūgščių skirtinga padėtimi, bet nesiskiria dydžiu, ilgą laiką nebuvo nustatinėjama atskirai (buvo priskiriama prie “kitokių nei 22kDa” žAH formų). Ir tik neseniai, sukūrus pakankamai specifiškus antikūnus prieš šią formą, buvo sukurtas imunofluorimetrinis placentinės žAH formos nustatymo būdas (Wu, 2003). Daugiau kaip prieš dešimtmetį buvo gauti antikūnai, gana specifiškai atpažįstantys žAH fragmentą, sudarytą iš aminorūgščių nuo 44 iki 191, kurie buvo panaudoti RIA metodo šiems fragmentams kraujo serume nustatyti sukūrimui (Sinha, 1994). Toks nustatymas plataus panaudojimo neturi, nes kol kas trūksta fundamentalių šių fragmentų savybių tyrimų (Popii, 2004).
formas, netgi jas nustatinėjant po vieną ar grupėmis. Tai įneša daug nesutapimų, lyginant skirtingais metodais nustatytus bendruosius žAH kiekius, nes skirtingos žAH formos pasižymi skirtingu reaktyvumu imuninėse sistemose bei skirtingu biologiniu veikimu. Imunologiškai nustatyti žAH kiekiai gali skirtis net 2-3 kartus (Ebdrup, 1999). Šiek tiek mažesni nustatomų žAH kiekių skirtumai skirtingose laboratorijose buvo fiksuojami
polikloninių antikūnų naudojimo periodu (Reiter, 1988). Įsivyravus monokloninių antikūnų prieš žAH naudojimui, skirtingų žAH formų skirtingas atpažinimas dar labiau išryškėjo, kas padidino bendrojo žAH kiekio nustatymo skirtingais metodais rezultatų skirtumus (Seth, 1999). Nemažą įtaką nustatomoms žAH reikšmėms turi ir skirtingų metodų skirtingas inkubacijos su antikūnais laikas (Ebdrup, 1999). Tai ypač žymu, kai inkubacijos laikas labai trumpas, neleidžiantis pasiekti antigeno, antikūnų ir žAH prijungiančio baltymo lygsvaros sąlygų.
Kraujyje cirkuliuojančio žAH klinikiniam įvertinimui medikams vis dar reikalinga naudoti tam tikrus sąlyginumus bei bendru susitarimu priimtus principus (Lašienė, 2003; Popii, 2004).
Lietuva turi apibrėžtas žAH tyrimų tradicijas, taip pat ir tiriant žAH fluorescenciniais metodais. Tęsiant ir plėtojant žAH tyrimų darbus, siejamus su L.Lašo, savitu būdu išskyrusio žAH iš žmogaus hipofizės (Pankov, 1994) vardu, nuo 1996 m.(Kublickas, 1996)dalis tyrimų, kuruojamų R.Kublicko, buvo orientuoti į fluorescencinių metodų taikymo hipofizės hormonų-baltymų, visų pirma žAH, tyrinėjimus. Kai kurie tyrimai, kurie numatė galimybę ne tik kiekybiškai, bet ir kokybiškai įvertinti žAH formas, jau buvo skelbti (Kublickas, 1999b; Kublickas,1999c). Buvo pasirinktas skirtingo dydžio žAH molekulinių formų
charakterizavimas, naudojant ilgo (100 ns) fluorescencijos gyvavimo periodo žymę bei fluorescencijos poliarizacijos matavimą. Šis principas tinka ir kiekybinei fluorescencijos poliarizacijos imuninei analizei, kas parodyta kitame darbe (Kublickas, 1999a). Naudota žymė tuo metu buvo ilgiausio fluorescencijos gyvavimo periodo žymė iš komerciškai įsigyjamų ir tinkamų naudojamam metodui, nors turėjo eilę trūkumų. Ji buvo nepakankamai stabili bei, norint įvertinti žAH molekulines formas, reikalavo gana sudėtingos fluorescencijos matavimo aparatūros.
Praėjus daugiau kaip 30 metų nuo imunologinių metodų pritaikymo žAH nustatymo pradžios (Ebdrup, 1999), žAH kiekybinio ir kokybinio charakterizavimo biologiniuose skysčiuose problematika lieka atvira naujų principų ir metodų paieškai.
metodologines spragas, iki šiol neleidusias sukurti veiksmingų imunologinių žAH formų įvertinimo priemonių.
2.2. Fluorescencijos, kaip liuminescencijos atmainos, reiškinio teoriniai pagrindai ir specifika
Liuminescencinė analizė pagrįsta spinduliuotės, kurią skleidžia tiriamosios medžiagos sužadintosios molekulės, stiprio matavimu.
Kai kurie atomai ir molekulės turi savybę absorbuoti į juos krintančią energiją. Ši perteklinė atomų ir molekulių energija gali būti sunaudota medžiagos jonizacijai, įšilimui, fotocheminėms reakcijoms. Medžiagos atomų bei molekulių absorbuota energija kartais gali išsiskirti ir kaip šviesos energija. Liuminescencinė spinduliuotė vyksta visomis kryptimis, todėl vadinama izotopine.
Kadangi dalis energijos yra absorbuojama, tai perėjusios per medžiagą šviesos srauto stipris I bus mažesnis už krintančios šviesos stiprį I0 (I< I0).
Pagal dalelių sužadinimo pobūdį liuminescencija būna kelių rūšių (Lakowicz, 1999b). Jei medžiaga švyti absorbavusi ultravioletinę ir regimąją spinduliuotę, turime
fotoliuminescenciją; chemiliuminescencija – kai švytėjimą sukelia savitos cheminės reakcijos; rentgenoliuminescencija – tai švytėjimas absorbavus rentgeno spinduliuotę. Yra ir kitaip sužadinamos liuminescencijos rūšių, tokių kaip elektroliuminescencija ar jonizuojančių spindulių generuojama liuminescencija (Lakowicz, 1999b).
Pagal švytėjimo pobūdį fotoliuminescencija skirstoma į fluorescenciją (pašalinus sužadinimo šaltinį švytėjimas nutrūksta labai greitai, per 10-9 – 10-7 sekundės) ir
fosforescencija (pašalinus sužadinimo šaltinį medžiaga švyti ilgesnį laiką, 10-6 – 10-2
sekundės). Šie reiškiniai aiškinami nevienodu sužadintosios molekulės elektronų peršokimu vibraciniuose lygmenyse. Liuminescencija, vykstanti be multipletiškumo kitimų, visada vadinama fluorescencija (netgi specialiai prailginus švytėjimo laiką), įvykstant
multipletiškumų pakitimams – fosforescencija (Mickevičius. 1999).
Visos liuminescuojančios medžiagos vadinamos liuminoforais. Liuminoforai – tai junginiai, kietieji kūnai ir skysčiai, kurie sužadinti liuminescuoja. Pagal sužadinimo būdą ir švytėjimo pobūdį skiriami chemiliuminoforai, katodoliuminoforai, fluoroforai; pagal cheminę kilmę – organiniai ir neorganiniai liuminoforai (Mickevičius, 1999).
Dauguma organinių molekulių absorbuoja šviesą ir išspinduliuoja ją (liuminescuoja) artimojoje ultravioletinėje ir regimosios šviesos spektro dalyje. Šviesos absorbcija ir
išspinduliavimas šiuo atveju įvyksta dėl elektronų perėjimo vibraciniuose lygmenyse.
Aromatinių junginių molekulėse išskiriamos dviejų tipų molekulinės orbitalės: σ- ir π- tipo. σ orbitalės elektronai dalyvauja viengubos jungties sudaryme, o π – dvigubos.
Organinėse molekulėse su heteroatomais be σ- ir π- elektronų dar yra ir n- elektronų, kurie nedalyvauja cheminės jungties sudaryme ir tai yra nepadalintos elektronų poros. n- elektronams atitinkančios n- orbitalės pagal savo simetrijos savybes priklauso σ- tipui, bet skirtingai nuo paprastų delokalizuotų σ- orbitalių jos yra lokalizuotos heteroatomuose.
Įprasto būvio σ- ir π- tipo orbitalės, kurios dalyvauja patvarios cheminės jungties sudaryme, priklauso rišančioms orbitalėms. n- tipo orbitalės yra nerišančios, o aukštesnės energijos σ*- ir π*- tipo orbitalės yra skiriančios.
Molekulei sugeriant šviesos kvantą įvyksta elektronų perėjimas iš vienos iš
neužpildytų orbitalių σ-, π- arba n- tipo į laisvas σ*- arba π*- tipo orbitales. n → π* perėjimai įvyksta organiniuose junginiuose su heteroatomais, π → π* perėjimai būdingi visiems
nesotiems junginiams, o π → σ* ir σ → σ* perėjimai vyksta vakuuminėje ultravioletinių spindulių srityje. Dėl šių elektroninių perėjimų organinėse molekulėse susidaro tokie
elektroniniai būviai: π π*, σ σ*, n σ*, σ π*, π σ* ir n π*. Visi šie būviai charakterizuojami tam tikru multipletiškumu, kuris lygus N + 1, kur N - nesuporuotų elektronų skaičius. Singletu vadinamas toks multipletiškumas, kuris lygus 1, o tripletu – kai multipletiškumas lygus 3. Molekulėje skirtingus elektroninių būvių perėjimus lydi šviesos kvanto absorbcija arba išspinduliavimas. Šiuo atveju jie vadinami radiaciniais.
Jeigu vykstant elektroniniams perėjimams molekulėje, elektroninio sužadinimo energija visiškai arba iš dalies pereina į sistemos vibracinę energiją, tokie perėjimai vadinami nespinduliuojančios konversijos procesais.
Perėjimai, kai sužadinami daugiau negu vienas elektronas yra draudžiami. Be to, draudžiami perėjimai tarp skirtingų multipletiškumų vadinami interkombinaciniais.
Perėjimai, kai neįvyksta šviesos išspinduliavimas ir nepakinta multipletiškumas, vadinami vidine konversija. Perėjimai, kai neįvyksta šviesos išspinduliavimas, bet pakinta multipletiškumas, vadinami interkombinacine konversija.
Fluorescencijos juostą sąlygoja perėjimai tarp elektroninių būvių (pagrindinio ir pirminio sužadinto singletinio būvio). Juostos dažnai persidengia, bet fluorescencijos juosta yra aukštesnių bangų ilgių srityje ir paprastai veidrodiškai simetriška absorbcijos juostai.
išspinduliavimas. Todėl stebėti fosforescenciją galima tik tada, kai panaikinta neįvykstančios šviesos išspinduliavimo deaktyvacija, pvz. kietuose tirpaluose. Fosforescencijos intensyvumas didėja mažėjant temperatūrai. Fosforescencinių žymių taikymas labai ribotas (Lakowicz, 1999b).
Pagrindinės elektroninių perėjimų charakteristikos: radiacinio skilimo greičio konstanta Kr arba radiacinė gyvavimo trukmė τ = 1/ Kr – išspinduliavimo perėjimams,
konversijos procesų greičio konstantos Kk – perėjimams, kai neįvyksta šviesos
išspinduliavimas, o taip pat kvantinė liuminescencijos išeiga, kuri nustatoma taip: η = Kr / (Kr
+ Kk) (Mickevičius, 1999).
Pakaitai šoninėse grandinėse liuminescencijai įtakos neturi. Molekulėse su ilga konjuguota grandine yra dviejų tipų pakaitai: elektronų donoriniai ir elektronų akceptoriniai. Elektronų donoriniams pakaitams priklauso oksi-, amino ir kt. grupės su nepadalinta
elektronų pora. Elektronų akceptoriniams pakaitams priklauso elektronus pritraukiančios atomų grupės: nitro-, karbonilinė grupė.
Šių dviejų pakaitų tipai molekulėje turi įtakos molekulių jonizacijai. Elektronų donorinių oksi- grupių jonizacija šarminėje terpėje, liuminescencijos spektrą perstumia į ilgesnių bangų pusę, o elektronų donorinių amino grupių jonizacija rūgštinėje terpėje, priešingai, liuminescencijos spektrą perstumia į trumpesnių bangų pusę.
Didėjant anglies grandinei molekulėje liuminescencijos spektras persistumia į ilgesnių bangų pusę, o švytėjimo intensyvumas padidėja. Didėjant aromatinių ciklų skaičiui
molekulėje liuminescencijos spektras taip pat persistumia į ilgesnių bangų pusę ir padidėja švytėjimo intensyvumas.
Molekulėse su mažiausiu singletiniu būviu n π*- tipo fluorescencijos juostos nėra dėl didelės tikimybės šio būvio interkombinacinės konversijos. Interkombinacinės konversijos tikimybė priklauso nuo singletinių ir tripletinių n π*- ir π π*- lygių išsidėstymo.
Elektroninių būvių išsidėstymas ir multipletiškumas priklauso nuo molekulės sandaros ir kinta dėl skirtingų faktorių: grandinės ilgio, heteroatomų buvimo, sistemos komplanarumo, atomų cheminių jungčių eiliškumo, vandenilinės jungties.
Į molekules įvedant halogenus, sieros, seleno ir kt. atomus, padidėja spinų orbitalinė jungtis ir sumažėja fluorescencijos išeiga, padidėja fosforescencijos išeiga ir sumažėja jos gyvavimo trukmė.
Daugelio organinių junginių skysti tirpalai fluorescuoja, bet ne fosforescuoja dėl greito tripletinio sužadinimo išnykimo ir dėl perėjimų, kurių metu nevyksta energijos išsiskyrimas. Didelę įtaką skystų tirpalų liuminescencijai turi tirpikliai, dėl jų pakinta
pakinta ištirpusių medžiagų liuminescencinės savybės. Tai vyksta dėl skirtingų tirpiklių įtakos energijos perėjimams orbitalėse. Nepolinį tirpiklį pakeitus poliniu, padidėja n→π* perėjimo energija ir sumažėja π →π* perėjimo energija. Dėl to gali įvykti n π* ir π π* būvių inversija ir ištirpusių molekulių liuminescencijos pakitimai.
Daugelio organinių junginių kieti tirpalai fosforescuoja ir fluorescuoja. Fluorescencija intensyvesnė žemesnėse temperatūrose nei skystuose tirpaluose.
Organinių molekulių skystų ir kietų tirpalų liuminescencijos spektrai – tai plačios juostos (10-100 nm). Kai kurios organinės medžiagos inertiniuose tirpikliuose atšaldžius iki skysto azoto virimo temperatūros (77 K) ar žemesnės, gaunami siauri liuminescenciniai spektrai.
Kai kurių liuminescuojančių organinių medžiagų vandeniniai tirpalai neliuminescuoja net atšaldžius iki skysto azoto temperatūros. Prie šių vandeninių tirpalų pridėjus druskų ar kitų organinių medžiagų, žemesnėse temperatūrose atsiranda švytėjimas.
Tai galima paaiškinti tuo, kad užšaldyti vandeniniai tirpalai sudaro dviejų tipų chromoforus, kurie skiriasi savo fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Pirmo tipo
chromoforai – tai kristalinės struktūros chromoforai, kurie fluorescuoja didesnių bangų pusėje ir beveik nefosforescuoja. Antro tipo chromoforai beveik neliuminescuoja.
Į vandeninius tirpalus įvedant druskų priedus susidaro trečio tipo chromoforai, kurie pasižymi ir fluorescencija, ir fosforescencija. Pridedant į vandeninius organinių molekulių tirpalus neorganinių junginių priedus, liuminescenciniai spektrai išsiskaido. Organinių junginių struktūros įtaka liuminescencijai gali keistis ne tik nuo medžiagos agregatinio būvio ir tirpiklio, bet ir nuo tirpalo koncentracijos, jo klampos, temperatūros ir kt. faktorių.
Fotoliuminescencija matuojama dviejų tipų spektrometrais, tai yra prietaisais, kuriuose reikalingai spektro daliai išskirti naudojami šviesos filtrai arba monochromatoriai.
Atsižvelgiant į tai, koks fotoliuminescencijos vyksmas registruojamas, prietaisai su šviesos filtrais vadinami fluorimetrais arba fosforimetrais. Prietaisai, kuriuose naudojami
monochromatoriai, vadinami spektrofluorimetrais arba spektrofosforimetrais. Prietaisai su monochromatoriais yra universalesni ir pasižymi didesniu atrankamu.
fotoliuminescencinės spinduliuotės monochromatorių. Fotoliuminescencija registruojama fotodaugintuvais ir fotonų skaitikliais.
Fotoliuminescencija sužadinama ksenono, gyvsidabrio, volframo halogenidų lempomis, spinduliuojančiomis ultravioletinę ir regimąją šviesą, taip pat įvairiais lazeriais. Universalus šviesos šaltinis yra lankinės ksenono (Xe) didelio slėgio lempos. Joms būdingas didelis spinduliuotės srauto stipris 280-700 nm bangos ilgių intervale. Šiose lempose
elektromagnetinė spinduliuotė gaunama dėl elektronų rekombinacijos su jonizuotais ksenono atomais. Šie jonai susidaro elektriniame lauke susiduriant ksenono atomams su elektronais.
Ksenono lempos spinduliuotės stipris staigiai sumažėja, kai bangos ilgis pasidaro mažesnis kaip 280 nm.
Spektro sričiai išskirti naudojami prizminiai ir difrakciniai monochromatoriai arba prizminiai–gardeliniai prietaisai.
Monochromatoriai turi įėjimo ir išėjimo plyšius, kurių plotis gali būti keičiamas. Platesni plyšiai padidina signalo lygį ir kartu santykį signalas/triukšmai. Kai plyšiai siauresni, geriau išskiriamos spektro linijos, bet sumažėja šviesos stipris.
Norint sėkmingai taikyti fotoliuminescencinius metodus būtina gerai susipažinti su aparatūra ir sugebėti analizuoti eksperimento detales, nes fluorescencijai būdingas didelis analizinis jautrumas. Beveik visuomet galima gauti tam tikrų signalų, padidinus signalų stiprinimo koeficientą. Tačiau šie signalai gali būti gaunami ne tik dėl tiriamos medžiagos fluorescencijos, bet ir dėl tirpiklių fluorescencijos, į prietaisų vidų patenkančios šviesos, papildomo šviesos išsklaidymo dėl tirpalų drumstumo, Ramano sklaidos ir kt. Be to, analizės tikslumui turi įtakos monochromatorių ir fotodaugintuvų jautrumo priklausomybė nuo bangos ilgio. Fluorescencijos stiprio matavimui gali turėti įtakos spinduliuojamosios šviesos
poliarizacija ir anizotropija.
Fotoliuminescenciniai metodai plačiai taikomi įvairiuose cheminiuose,
biocheminiuose ir medicininiuose, aplinkos užterštumo tyrimuose, atpažįstant įvairius organinius ir neorganinius junginius bei nustatant jų kiekį.
fluorescuojančius chelatinius kompleksinius junginius su šiais elementais, bet labiausiai paplitę yra šie trys reagentai: oksinas, 2,2-dihidroksiazobenzenas ir dibenzoilmetanas. Deja, kai kurie iš šių chelatus sudarančių cheminių reagentų nėra saviti ir sudaro kompleksinius junginius su daugeliu neorganinių jonų. Todėl taip nustatant atsiranda didelių trukdžių. Norint jų išvengti, jonai iš anksto atskiriami ir tik po to tiriama fluorescenciniu būdu. Bet ir šiuo atveju fluorimetrinio nustatymo jautrumas yra pakankamai didelis, tad analizė tiksliai atliekama net ir nesant savitų požymių.
Fluorescencija būdinga organiniams junginiams. Dauguma organinių junginių, ypač įvairūs vaistiniai junginiai bei fiziologiškai aktyvios medžiagos, fluorescuoja tiesiogiai, kitos gali sudaryti liuminescuojančius kompleksinius junginius su kitomis organinėmis
medžiagomis.
Organiniai junginiai nefluorescuoja, jei atskiros molekulės dalys gali suktis viena kitos atžvilgiu.
Fluorescencija tuo stipresnė, kuo geriau organinis junginys absorbuoja ultravioletinę elektromagnetinę spinduliuotę (Mickevičius, 1999). Šią sąlygą atitinka alifatiniai, sotieji cikliniai junginiai ir policikliniai arenai, mažiau – arenai su heteroatomais. Donoriniai pakaitai fluorescenciją stiprina, akceptoriniai – silpnina.
Fluorescenciją stiprina -OH, -OR, -NH2 grupės;-COOH, -NO2 ar -SO3H grupės –
silpnina, o kartais ir visai panaikina.
Aromatinės amino rūgštys yra baltymų ir fermentų sudėtyje. Iš visų žinomų amino rūgščių fluorescuoja (tiek tirpaluose, tiek kietame miltelių pavidale) tik trys aromatinės amino rūgštys: triptofanas, tirozinas ir fenilalaninas. Jos turi aromatinio žiedo delokalizuotų π
elektronų sistemą. Baltymų fluorescencijos spektrai nėra į jų sudėtį įeinančių aromatinių amino rūgščių liuminescencijos spektrų suma. Baltymų tirpaluose, kurių sudėtyje yra tirozinas, bet nėra triptofano fluorescencijos spektrai sutampa su atitinkamais spektrais tirozino tirpalo tiek kambario, tiek ir žemesnėje temperatūroje. Baltymų tirpalai, kurių sudėtyje yra triptofano dažniausiai pasižymi triptofanui būdingu fluorescencijos spektru. Bet kai kuriuose triptofaną turinčiuose baltymuose po denatūracijos arba specialios
fluorescencijos spektro analizės yra nustatomas ir tirozinas.
Aromatinių amino rūgščių tirpalų fluorescencijos sužadinimo spektrai sutampa su absorbcijos spektrais.
Fenilalanino absorbcijos spektras panašus į benzeno spektrą. Absorbcijos
maksimumas apie 258 nm šiek tiek pasislinkęs į ilgesnių bangų pusę, bet jo intensyvumas sumažėja. Absorbcijos juosta su maksimumu apie 205 nm pasislenka visai mažai, bet jos intensyvumas padidėja. Pakeičiant tirpiklio pH arba polingumą fenilalanino absorbcijos spektras šiek tiek pakinta. Jeigu fenilalaninas yra baltymo sudėtyje, tai jo absorbcijos (ir fluorescencijos sužadinimo) spektras pasislenka 1-3 nm.
Spektrinės savybės, būdingos tirozinui atsiranda dėl fenolio žiedo. Hidroksilo grupė esanti benzeno žiede pakeičia jo absorbcijos spektrą. Absorbcijos maksimumai pasislenka prie 210 ir 270 nm, paskutinio perėjimo intensyvumas padidėja beveik 7 kartus. Anijono
susidarymas sukelia poslinkį į ilgesnių bangų pusę ir spektro suintensyvėjimą (smailės stebimos prie 235 ir 287 nm). Visi šie perėjimai kaip ir benzeno atveju yra π→ π* tipo.
Tirozino absorbcijos spektras labai panašus į fenolio spektrą. Dėl hidroksilo jono esančio fenolinėje tirozino grupėje, ši amino rūgštis gali būti dviejų joninių formų, kurios pasižymi skirtingomis spektrinėmis savybėmis. Jei tirozinas yra nedisocijuotoje formoje, tai elektroniniai perėjimai vyksta prie 222 ir 275 nm. Disocijuotoje tirozino formoje absorbcijos maksimumai yra prie 240 ir 293 nm.
Tirozino absorbcijos juostos susidaro dėl π→ π* perėjimų fenolio žiede. Jei tirozinas yra baltymo molekulėje, tai absorbcijos juostos pasislenka.
Spektrinės savybės, būdingos triptofanui atsiranda dėl indolo žiedo. Indolo ir triptofano absorbcijos spektrai yra vienodi. Tirpikliuose indolo absorbcijos juostų maksimumų
intensyvumai yra apie 225 ir 270 nm. Nepoliniame cikloheksano tirpale indolui būdingi antriniai maksimumai apie 280 ir 288 nm.
Triptofanas turi dvi absorbcijos juostas, kurių maksimumai yra apie 218 ir 280 nm. Triptofanas šiek tiek absorbuoja šviesą virš 300 nm. Šios triptofano absorbcijos juostos charakterizuojamos π→ π* elektroniniais perėjimais indolo žiede.
Jei triptofanas yra baltymo sudėtyje, jo absorbcijos spektras šiek tiek pakinta, jis pasislenka į ilgesnių bangų pusę 1 – 4 nm.
Triptofano fluorescencijos spektras neutraliame vandens tirpale – tai plati juosta (apie 60 nm), kurios maksimumas yra prie 353-354 nm. Triptofano fluorescencijos vandeniniame tirpale kvantinė išeiga lygi 0,17. Triptofano fluorescencijos spektro padėtis priklauso nuo karboksilinių ir amino grupių jonizacijos. Rūgštinėje aplinkoje (katijoninė forma) jis
Triptofano fluorescencijos trukmė vandenyje yra 3*10-9 s, o baltymo sudėtyje (2-4,6)*10-9 s.
Triptofano tirpalus šaldant fluorescencijos spektro maksimumas pasislenka į trumpesnių bangų pusę. Prie 77 K temperatūros šis poslinkis (palyginus su kambario temperatūra) yra 25 nm.
Žemose temperatūrose (77-140 K) taip pat stebima užšaldytų triptofano tirpalų
fosforescencija. Skirtingai nuo fluorescencijos spektro triptofano fosforescencijos spektras yra sudėtingesnis. Jis turi tris maksimumus prie 405, 435 ir 465 nm. Fosforescencijos spektras beveik nepriklauso nuo tirpiklio poliškumo.
Triptofano poliarizacijos spektras panašus į indolo poliarizacijos spektrą. Spektruose stebimi du minimumai (apie 232 ir 290 nm) ir du maksimumai (265-270 ir 300-305 nm). Minimumas prie 232 nm sutampa su vienos iš absorbcijos juostų maksimumų. Maksimumas prie 270 nm yra artimas ilgesnių bangų juostos absorbcijos maksimumui. Maksimumas prie 310 nm ir minimumas ilgesnėje bangų pusėje neturi tokių ypatumų absorbcijos spektre, kurie prie tokių bangos ilgių sudaro uodegas. Iš tokio poliarizacijos spektro galima spręsti
mažiausiai apie tris elektroninius perėjimus.
Tirozinas neutraliame vandeniniame tirpale kambario temperatūroje turi siaurą
fluorescencijos juostą (apie 34 nm), kurios maksimumas yra prie 303-304 nm. Kvantinė išeiga lygi 0,21. Tirozino fluorescencijos spektras nepriklauso nuo tirpalo pH, bet kvantinė išeiga pakinta (šarminėje terpėje sumažėja iki 0). Šaldant tirozino tirpalus fluorescencijos spektro maksimumas, kaip ir triptofano atveju, pasislenka į trumpesnių bangų pusę (apie 3-4 nm). Iš to galima spręsti, kad sužadintas fenolio chromoforas beveik nereaguoja su terpe.
Tirozino poliarizacinis spektras analogiškas fenolio spektrui. Jis sudarytas iš neigiamos poliarizacijos srities su maksimumu prie 235 nm ir teigiamos poliarizacijos srities su
maksimumu apie 275 nm.
Fenilalanino tirpalų fluorescencijos spektrai turi maksimumus prie 275, 282 ir 289 nm. Neutralių fenilalanino tirpalų fluorescencijos kvantinė išeiga lygi 0,038-0,045. Fenilalanino tirpalų fluorescencija priklauso nuo tirpalo pH: rūgštinėje terpėje stebimas pilnas
fluorescencijos gesinimas, o šarminėje – dalinis fluorescencijos gesinimas, kurį lydi poslinkis į ilgesnių bangų pusę 5 nm.
Skirtingai nuo fenolio ir indolio chromoforų, fenilalanino benzeno chromoforas sužadintoje būsenoje lengvai sudaro liuminescuojančius dimerus – kurių fluorescencijos maksimumas yra apie 300 nm.
tirpiklio. Fenilalanino tirpalų fosforescencijos kvantinė išeiga keičiant pH nuo 2 iki 12 yra vienoda, taip pat kaip ir fosforescencijos gesinimo laikas. Fluorescencijos ir fosforescencijos suminė kvantinė išeiga 77 K temperatūroje artima 1. Visų aromatinių amino rūgščių tirpalų fluorescencijos kvantinė išeiga priklauso nuo tirpiklio. Vanduo labai gerai gesina indolinius, fenolinius ir benzeninius chromoforus. Vandens gesinimo efektyvumas priklauso nuo jo izotopinės sudėties, temperatūros, vandens aktyvumo koeficiento ir vandens relaksacinio judrumo.
Yra tam tikri skirtumai tarp daugelio junginių tirpalų ir sauso būvio fluorescencijos spektrų (Lakowicz, 1999b). Miltelių pavidalo triptofano fluorescencijos spektro maksimumas (apie 333 nm) pasislenka į trumpesnių bangų pusę. Miltelių pavidalo tirozino fluorescencijos spektro maksimumas (apie 303 nm) beveik nepakinta. Miltelių pavidalo fenilalanino
fluorescencijos spektro maksimumas (apie 285 nm) pasislenka į ilgesnių bangų pusę. Pagrindinė aromatinių amino rūgščių tirpalų liuminescencijos specifika:
liuminescencijos sužadinimo spektrai beveik sutampa su absorbcijos spektrais, liuminescencijos spektrai priklauso nuo tirpiklio, vandenilio jonų koncentracijos, temperatūros ir priemaišų (Mickevičius, 1999).
2.3. Fluorescencijos poliarizacijos ir anizotropijos bendra charakteristika
Fluorescencijos poliarizacijos arba anizotropijos matavimai gali būti atliekami
fluorescencijos spektrometrais ar fluorimetrais, aprūpintais poliarizatoriais arba poliarizacijos filtrais (Lakowicz, 1999b; Mickevičius, 1999).
Fluorescenciškai žymėtos molekulės ar biojunginio molekulių dydis, tūris ir sukimosi greitis yra tiesiogiai proporcingas sukimosi koreliacijos laikui ir gali būti nustatytas matuojant fluorescencijos poliarizaciją ar anizotropiją (Valeru, 2002). Emituotos šviesos poliarizacijos būklę charakterizuoja parametras vadinamas fluorescencijos anizotropija (r).
(2.3.1.)
III yra lygiagreti fluorescencijos stiprio dedamoji, kuomet sužadinimo elektrinio vektoriaus
dedamoji, kuomet sužadinimo elektrinio vektoriaus dedamoji yra orientuota statmenai į poliarizatorių.
Anizotropija yra bedimensinis dydis, nepriklausantis nuo pavyzdžio fluorescencijos stiprio (totalinio intensyvumo). Taip yra dėl to, kad skirtumas (III –I⊥) normalizuoja totalinį
intensyvumą, kuris yra IT= III +2I⊥.
1926 metais Perinas parodė kaip sukimosi difuzija prisideda prie emituotos šviesos depoliarizacijos ir nustatė ryšį, parodantį anizotropijos priklausomybę nuo sukimosi išsibarstymo proceso (Van Holde, 1998):
(2.3.2.)
ro yra anizotropija nesant difuzijos (ši reikšmė daugumai fluoroforų yra nedidesnė kaip 0,3,
nors teorinė riba yra 0,4), τ- fluorescencijos gyvavimo laikas (per šį laiką fluorescencijos anizotropija sumažėja iki ro·e- 1), φ-fluoroforo sukimosi koreliacijos laikas. Tai laikas, per kurį
molekulė pasisuka apie 68,5 laipsnio (šio kampo kosinusas lygus e- 1) nuo pradinės padėties. Fluorescuojančiam junginiui, kuris tirpale besisukdamas nekeičia formos, parametrai ro, τ priklauso nuo fotofizinių fluoroforo savybių, o φ priklauso nuo molekulės formos ir
dydžio (Guo, 1998). Iš lygties matome, kad kai τ<<φ (dalelė praktiškai nesisuka per visą
fluorescencijos gyvavimo laiką), r artėja prie ro reikšmės. Kita vertus, kuomet τ>>φ molekulės
fluorescencijos emisijos dipolis pasiskirsto atsitiktinai ir sukamosios difuzijos rezultate r artėja prie nulio. Anizotropijos matavimai yra pakankamai jautrūs kuomet τ φ (Guo, 1998). Sukimosi koreliacijos laikas gali būti išreikštas Stokso-Einšteino-Debijo lygtimi (Van Holde, 1998): T k V ⋅ ⋅ = η φ 3 (2.3.3.)
η - terpės klampumo koeficientas, k - Bolcmano konstanta, T - temperatūra ir V -
besisukančios dalelės tūris.
molekulės sukimosi greičio ir sukimosi išsisklaidymo laipsnio per fluorescencijos gyvavimo periodą. Difuzinis judėjimas priklauso savo ruožtu nuo tirpiklio klampumo ir besisukančios molekulės dydžio bei formos.
Be anizotropijos dažnai susiduriama su poliarizacijos terminu. Poliarizacija apskaičiuojama pagal formule
⊥ ⊥ + − = I I I I P II II (2.3.4.)
Poliarizacijos ir anizotropijos reikšmės yra susijusios taip:
P P r r r P − = + = 3 2 ; 2 3 (2.3.5.)
Abu dydžiai P ir r yra naudojami įvertinti tam pačiam reiškiniui. Poliarizacijos reikšmė dažniau naudojama fluorescencinės poliarizacijos imuniniuose tyrimuose, nes yra tradiciškai įsitvirtinusi ir jos reikšmės yra kiek didesnės nei anizotropijos. Anizotropijos dydis dažniau sutinkamas teoriniuose skaičiavimuose (Guo, 1998).
Mažų fluoroforų sukimosi greitis tirpaluose didelis, todėl paprastai per fluorescencijos gyvavimo periodą tokios molekulės apsisuka daugiau negu vieną kartą. Tokia emisija būna depoliarizuota ir anizotropija artima nuliui. Fluorescencijos anizotropijos priklausomybė nuo sukamojo judėjimo greičio leidžia fluorescencijos anizotropijos matavimus plačiai taikyti biocheminiuose tyrinėjimuose.
Daugelio baltymų sukimosi koreliacijos laikas yra pakankamai ilgas, kad
Kad įvyktų depoliarizacija, makromolekulės sukimosi koreliacijos laikas turi būti trumpesnis už fluorescencinės žymės gyvavimo laiką. Time-resolved imuniniuose tyrimuose naudojami ilgo gyvavimo fluoroforai, tokie kaip Eu3+, Tb3+ (Guo, 1998), nepasižymi
poliarizuota emisija ir nenaudojami anizotropijos matavimams. Rutenio kompleksas pasižymi ilgu fluorecencijos gyvavimo periodu τ (400-2700 ns) ir didele poliarizacije bei anizotropijos reikšme nesant difuzijos (Terpetschnig, 1997b), kas leidžia plėsti fluorescencijos anizotropijos panaudojimą nustatant didesnes nei 1000 kDa molekules (Lakowicz, 1999; Terpetschnig E, 1997a).
Rimta kliūtis imuninių tyrimų įsitvirtinimui - didelis antigenų molekulinis svoris. Projektuojant fluorescencijos poliarizacijos imuninę analizę reikalaujama, kad nesusijungusio antigeno emisija būtų depoliarizuota, ir poliarizacija padidėtų antigenui prisijungus prie antikūno. Kad įvyktų depoliarizacija, antigeno sukimosi koreliacijos laikas turi būti
trumpesnis nei žymės fluorescencijos gyvavimo periodas (pavydžiui, fluoresceino - mažiau nei 4 ns). Rutenio kompleksas [Ru(bdy)2(dcb)]2+ (kur bdy-2,2΄-bipiridino ir
dcb-4,4΄-dikarboksi-2,2΄-bipiridinas) pasižymi aukšta poliarizacija nesant sukamojo išsisklaidymo, bei ilgu gyvavimo periodu (apie 400 ns) (Guo, 1998). Eksperimentų rezultatai parodė, jog
[Ru(bdy)2(dcb)]2+ žymėtam žmogaus serumo albuminui jungiantis prie antikūnų poliarizacija
2.4. Fluorescencijos poliarizacijos imuninės analizės panaudojimo žmogaus augimo
hormono imuniniam nustatymui galimybės
Žmogaus augimo hormono kiekybinė analizė imunodiagnostiniais rinkiniais yra pakankamai jautrus metodas, dažnai patenkinantis visus klinikinius reikalavimus. Tačiau kartais iškyla skirtingais diagnostiniais rinkiniais nustatytų skirtingų žAH kiekių palyginimo problema. Tiriant tuos pačius žAH kiekius šešiais skirtingais rinkiniais, apimančiais visus tyrimų tipus: trim radioimunologiniais, imunoradiometriniu, fermentoimunometriniu ir
time-resolved fluorescencijos imunometriniu, rezultatų koreliacijos koeficientas svyruoja ribose 0,64-0,989, priklausomai nuo žAH kiekio (Anderson, 1995). Kita visų tipų kiekybinės analizės problema – imunologiškai nustatytų žAH kiekių neatitikimas funkciniams žAH aktyvumams, pavyzdžiui, literatūros duomenimis (Strasburger, 1996) imunofunkcinį
aktyvumą turinčių žAH molekulių dalis RIA metodu nustatomame kiekyje varijuoja tarp 52% ir 93%. Abi šios problemos kyla ne tik dėl skirtingų metodų ypatybių, kurios pasireiškia bet kokių antigenų nustatyme, bet didele dalimi ir dėl žAH molekulių skirtingų molekulinių formų (MF).
Visų MF skirtingi ne tik molekuliniai dydžiai ar kitos struktūrinės ypatybės, bet ir biologinis ir imunologinis aktyvumas. Naudojant monoklononius antikūnus prieš monomerinę žAH formą, kiekybinės analizės rezultatai gali žymiais dydžiais skirtis nuo kitais
imunologiniais metodais gautų rezultatų. Vienas iš radikaliausiai keičiančių situaciją veiksnių būtų ne tik paciento kraujo serumo kiekybinis žAH nustatymas, bet ir kokybinis MF
charakterizavimas (Popii, 2004). Pirma sąlyga tinkamam MF antikūniniam surišimui – tai ne monokloninių antikūnų prieš vieną iš MF naudojimas, o antikūnų prieš visas natyvinio žAH formas naudojimas. Skirtingų žAH MF charakterizavimui, įvertinant skirtingą jų molekulių dydį, labai tiktų fluorescentiškai žymėtų hormonų komplekso su antikūnais fluorescencijos poliarizacijos matavimai. Kadangi antikūnų ir jų kompleksų su baltymais sukimosi
koreliacijos laikas yra apie 100 ns ir daugiau (Bright, 1989), fluorescenciniai žymei būtinas tokios eilės fluorescencijos gyvavimo laikas. Pastaruoju metu, sparčiai kuriant naujas ilgo (400-1000 ns) fluorescencijos gyvavimo periodo žymes bei, anksčiau susintetintoms tokioms žymėms tampant komercinėmis (Guo, 1998), atsirado galimybė fluorescencijos poliarizacijos metodu įvertinti tokio dydžio molekules ir kompleksus (Lakowicz, 1999b).
susijungusių su antikūnais ligandų, imuninė analizė. Taigi, analizės procedūros labai supaprastėja bei sutrumpėja, nesudėtinga tokią analizę automatizuoti. Metodas nereikalauja brangios aparatūros, fluorescencijos poliarizacijos priedėliai paprasti ir patikimi. Metodo esmė ta, jog su antikūnu (AK) susijungę žymėti ligandai praranda sukimosi greitį tirpale ir fluorescencijos poliarizacija (FP) padidėja. Esant tiriamame bandinyje daugiau ar mažiau nustatomo ligando, šis konkuruoja su žymėtu dėl susijungimo su antikūnu ir didesnė ar mažesnė žymėto ligando dalis lieka nesusijungusi, tuo pačiu mažindama FP.
Pagrindinė problema, kuriant FPIA konkrečiam ligandui, tai tinkamos fluorescencinės žymės parinkimas. Jeigu ligandas – didelė baltyminė molekulė (kaip kad yra žAH atveju), jos sukimosi greitis tirpale (o ypač klampiame kraujo serume) nedidelis. Šis sukimosi greitis prisijungus AK dėl komplekso dydžio dar sumažėja, tačiau šis sumažėjimas nėra toks esminis, kaip kad būtų mažų ligandų atveju. Naudojant plačiai paplitusias trumpo fluorescencijos gyvavimo fluorescencines žymes, skirtumas tarp susijungusio ir nesusijungusio su AK
žymėtų ligandų FP yra nedidelis (Urios, 1978), todėl tokie tyrimai dėl nejautrumo klinikiniam panaudojimui netaikytini.
Ankstesniuose kolegų darbuose (Kublickas, 1999a) buvo tirtos žymeklio PMI
panaudojimo FPIA galimybės, jo tinkamumas, lyginant su trumpo fluorescencijos gyvavimo periodo žymekliu FITC. Tirtas PMI poveikis hormono molekulei bei ligandų-antikūnų sąveikai ir ar žymėjimas PMI nedenatūruoja hormonų. Pagal gautus rezultatus PMI žymėtas žAH nesutrikdė diagnostinio rinkinio veikimo, kas parodo taip žymėto hormono neutralumą imunologinėje sistemoje. žAH aktyvumas (išreikštas imunologiškai nustatyta koncentracija) po žymėjimo sumažėjo apie 1/8. Registruojant žymėto žAH fluorescencijos spektrą,
pastebėta, jog žAH dalis molekulių denatūruojasi, hormono molekulės galui chemiškai susijungiant su persigrupuojančia PMI jungtimi, žymės prisijungimo prie hormono per
sulfhidrilinę jungtį vietoje. PMI jungties persigrupavimą padaro neįmanomu į žymėjimo terpę pridėta paviršiaus aktyvioji medžiaga natrio dodecylsulfatas. Taip atlikus žymėjimą, žAH denatūravimosi buvo išvengta (Kublickas, 1999a).
FITC ir PMI žymėti hormonai buvo išbandyti, siekiant nustatyti jų panaudojimo FPIA galimybes. Dalis abiem būdais žymėtų hormonų buvo inkubuota su juos atitinkančiais
Kaip buvo nustatyta, FITC žymėjimo atveju laisvo hormono ir surišto AK hormono FP skirtumas nedidelis, todėl skirtingas surišto žymėto hormono koncentracijas mišinyje FP apibūdina nejautriai.
PMI žymėjimo atveju analogiškas skirtumas yra gana didelis. Tai paaiškinama tuo, jog PMI fluoroforo fluorescencijos gyvavimo periodas yra gana didelis – 100 ns (Weltman, 1973), taigi net gana didelės žymėto hormono molekulės suspėja sužadinus fluoroforą per 100 ns pasisukti erdvėje taip, jog nemaža dalis emituojamos šviesos išspinduliuojama jau į stačiu kampu pasuktą poliarizacijos plokštumą ir registruojama poliarizacija nedidelė. Kaip galime palyginti, FITC (kurio fluoroforo fluorescencijos gyvavimo laikas 4 ns) žymėtų laisvų hormonų FP žymiai didesnė, todėl galimybės panaudoti taip žymėtus hormonus FPIA nedidelės.
Dar ilgesnio (daugiau negu 100 ns) fluorescencijos gyvavimo periodo žymės
panaudojimas galėtų pagerinti baltymų, taip pat ir žAH, nustatymo naudojant FPIA galimybes (Lakowicz, 1999b).
Yra nustatyta atvirkštinė priklausomybė tarp žAH izoformų molekulių dydžio ir biologinio aktyvumo (augant molekulių dydžiui, šis aktyvumas mažėja) (Mickevičius, 1999). Ši priklausomybė gali būti sėkmingai panaudojama, koreguojant fluorescenciškai
išmatuojamojo žAH kiekį. Atliekant poliarizuotos fluorescencijos matavimus, didesnės molekulės, besisukančios lėčiau už mažesnes, per statmenai poliarizuotą filtrą duoda mažesnį emisijos įnašą į išmatuojamą fluorescencijos stiprį negu mažesnės molekulės (Lakowicz, 1999b). Tai leistų skirtingo dydžio žAH izoformų bendrą nustatomąjį kiekį transformuoti į sąlyginį kiekį, artimesnį biologiniam aktyvumui.
2.5. Fluorescencijos rezonanso energijos perdavimo reiškinio panaudojimo imuninėje analizėje galimybės
Fluorescencijos rezonanso energijos perdavimo (FRET) reiškinį pirmasis aprašė Fiorsteris praeito amžiaus penktam dešimtmetį. Praktinis FRET pritaikymas matuojant atstumą tarp donoro ir akceptoriaus atėjo dešimtmečiu vėliau. FRET yra neradiacinis
mažesnės absorbcinės energijos molekulė - akceptoriumi (A). Jei sužadintas donoras praranda energiją vidinės konversijos būdu (žr. 2.5.1. pav.), ir, jei donoro emisijos energija persidengia su akceptoriaus absorbcijos energija, gali įvykti rezonansas:
D*+A↔D+A*
2.5.1. schema. FRET reiškinio vyksmas.
Perėjimo greitis yra kT, o atvirkštinio proceso greitis yra k-T. Sužadinto akceptoriaus
vibracinė energija sumažėja iki pagrindinio būvio ir inversijos procesas yra labai mažai tikėtinas. Taigi, donoro molekulė yra slopinama, nes akceptoriaus molekulė susižadina ir esant palankioms sąlygoms emituoja fluorescencinę šviesą (Szöllősi, 1998).
D A
2.5.1. pav. FRET reiškinio sužadinimo ir emisijos schema. S0 – pagrindinis elektroninis
būvis, S1, Sn – aukštesni elektroniniai būviai, D – fluoroforas donoras, A – fluoroforas
akceptorius.
Įvykus FRET reiškiniui sužadintojo donoro akceptoriui, donoro fluorescencijos gyvavimo laikas τ, kvantų kiekis ir fluorescencijos stipris mažėja (Szöllősi, 1998).
Fluorescencijos rezonanso energijos perdavimo reiškinio imuninė analizė įgalina atlikti hormono kiekybinį nustatymą, nevykdant surištosios ir laisvosios fazės atskyrimo, kas labai pagreitina ir supaprastina tyrimą, praktiškai neiškeliant didesnių reikalavimų
fluorescencijos detektavimo įrengimui. FRET reiškinio esmė ta, kad dviem skirtingomis fluorescuojančiomis žymėmis, galinčiomis suartėjus sudaryti donoro-akceptoriaus porą, pažymėjus atitinkamai specifišką antikūną bei hormoną, po šių suartėjimo dėl antikūninio atpažinimo sumažėja fluorescencinės žymės-donoro fluorescencijos stipris (Deshpande, 2001). Pagal šį sumažėjimą galimą spręsti apie su antikūnu susijungusių hormono molekulių procentinę dalį mišinyje. Pagal ją gali būti paskaičiuojamas tiriamajame bandinyje esančio antigeno (Ag), pvz., hormono, konkuruojančio dėl prisijungimo prie antikūno su žymėtu antigenu, kiekis.
2.5.2. pav. Fluorescencijos rezonanso energijos perdavimo homogeninės imuninės analizės schema.
2.5.2. paveiksle pateikta FRET homogeninės imuninės analizės schema. Šioje schemoje tiriamasis antigenas yra nežymėtas, AK ir antigenai žymėti donoro ir akceptoriaus fluoroforais.
a) b)
2.5.3. pav. Fluoresceino (a) ir rodamino (b) izotiocianatų struktūros.
Susidarančio komplekso dydis atitiko FRET reikalingą atstumą ir buvo stebimas fluorescencijos stiprio mažėjimas. Įmaišius nežymėtą antigeną, šis konkuruodavo su žymėtu antikūnu dėl prisijungimo, mažino FRET reiškinį patiriančių kompleksų dalį ir didino fluorescencijos stiprį. Tokiu metodu buvo sėkmingai nustatyti fluoresceinu žymėti morfino konjugatai (Szöllősi, 1998). Nuodugnus FRET reiškinio optimalių sąlygų imuniniuose tyrimuose tyrinėjimas atskleidė, kad fluoresceinas ir rodaminas kaip donoras ir akceptorius yra puikios, praktikoje taikytinos žymės, bet ne idealios tokiems tyrimams atlikti (Uleman, 1981). Dalinis trūkumas – menkas rodamino fluoroforu žymėtų antikūnų stabilumas (Lim, 1980).
Antikūnų žymėjimui pasirinkus fluoresceino fluoroforą, antikūnų stabilumas didesnis (Lakowicz, 1999b), taigi, tyrinėjant žAH ir AK sąveiką, verta žymekliu-akceptoriumi
(rodamino fluoroforu) žymėti žAH, o ne AK.
2.6 Fluorescencinių žymių bendra charakteristika ir ypatumai, lyginant su kitomis žymėmis
Žymes, naudojamas baltymų ir biologinių junginių žymėjimui, galima būtų skirstyti į tris dideles grupes: radioaktyviosios žymės, fermentinės žymės ir liuminescencinės. Dar egzistuoja nemažai specialiųjų žymių, taikomų specifiniuose moksliniuose tyrimuose, tokių kaip cheminės, magnetinės žymės ar tiesiog dažikliai.
Radioaktyviosios žymės yra pačios mažiausios žymės, paprastai neturinčios įtakos molekulės erdvinei struktūrai. Tyrimai su šiomis žymėmis yra labai jautrūs, gali būti nustatoma vos ne kiekviena prisijungusi žymė, nes matavimo foninis radioaktyvusis stipris praktiškai lygus nuliui. Deja, tyrimas su šiomis žymėmis dėl žymių radioaktyvaus skaidymosi yra smarkiai ribojamas laiko atžvilgiu. Darbas su radioaktyviomis žymėmis ir jų
laipsnio saugumo monitoringas, o tai didina tyrimo kainą. Nauji tyrimo metodai kartais reikalauja analizuojamojo bandinio tūrio didinimo, dėl ko sumažėja radioizotopų koncentracija, kas nėra pageidaujama, nes padidina detekcijos laiką (Gribbon, 2003).
Fermentai yra labiausiai šiuo metu paplitusios žymės. Labiausiai žinomas tyrimų tipas naudojantis fermentines žymes šiuo metu yra ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assay) - fermentų žymėto imunosorbento analizės tyrimai. Dažniausiai iš fermentinių žymių naudojamos peroksidazės ir šarmines fosfatazės. Fermentiniai tyrimai yra labai jautrūs, nes detektuojamasis reakcijos produktas yra pastoviai generuojamas fermento. Pagrindiniai šių tyrimų trūkumai yra tai, kad reikalinga dar eilė reagentų, būtini pakartotiniai plovimai ir būtinas laikas inkubacijai, kurios metu baltymai gali denatūruotis. Taip pat dirbant su dideliais baltymais galimi konformaciniai baltymų pakitimai dėl prijungto fermento.
Fluorescencinės žymės, kažkada vertintos skeptiškai (Lakowicz, 1999b), šiuo metu įgijo milžinišką populiarumą. Šios žymės pasižymi labai aukštu jautrumu, kiekviena prisijungdama ir generuodama signalą, priklausomą nuo absorbuotų fotonų. Dauguma
komercinių fluoresescencinių žymių susižadina ir emituoja šviesą prie skirtingų bangos ilgių. Matavimams yra svarbūs šie žymės parametrai: liuminescavimo (fluorescencijos)
intensyvumas, gyvavimo laikas τ, anizotropija ir emisijos spektrai (kurie suteikia informacijos apie sužadintos molekulės ir ją supančios mikroterpės sąveiką) (Valeru, 2002).
Fluoroforai yra struktūrinė žymės ar žymeklio dalis, būtent dėl kurios galima fluorescencija. Aktyvūs fluoroforai kovalentiškai ar nekovalentiškai susijungę su
biomolekulėmis vadinami žymėmis. Fluorescencinė žymė sugeba absorbuoti fotonus ir grįžti į pradinę būseną emituodama fotonus. Pagal Stokso dėsnį emisijos bangų ilgis paprastai yra ilgesnis ir mažesnės energijos kaip kad sužadinimo bangų ilgis.
Fluorescencinėms žymėms yra keliama keletas reikalavimų: tirpumas vandenyje, fotostabilumas, didelis fluorescencijos švytėjimo efektyvumas bei žema nespecifinė
adsorbcija. Svarbiausios fluorescencinių žymių charakteristikos: fluorescencijos sužadinimo bangos maksimumas, emisijos bangos maksimumas ir žymeklio fluorescencijos gyvavimo laikas (Soukka, 2001).
Žymės fluorescencija turėtų būti silpna, kol ji neprisijungusi, bei stipri, kuomet žymė prisijungia prie taikinio. Taip pat pageidaujama didelė žymės fluoroforo kvantų išeiga. Fluorescija turėtų būti nepriklausoma nuo pH pokyčio fiziologinėse pH ribose (tarp pH 5 ir 9). Taip pat svarbu aukštas fotostabilumas ir mažiausiai viena aktyvi jungimosi prie taikinio grupė, galinti reaguoti esant aplinkos temperatūrai bei švelnioms reakcijos sąlygoms.
apie 480 ir 560 nm, kas eliminuoja kvarcinės optikos poreikį, nes sužadinama matomos šviesos diapazone. Rodamino ir fluoresceino fluoroforai skirtingai nuo tiek natūralių baltymų fluoroforų, tiek kai kurių žymių nėra jautrūs tirpalo ir aplinkinių molekulių poliškumui
(Lakowicz, 1999b). Šių žymių privalumas - didelė kvantų išeiga ir platus tiek absorbcijos, tiek emisijos bangų intervalas, kas minimalizuoja biologinių pavyzdžių foninį švytėjimą. Jų
emisijos spektrai nėra jautrūs tirpiklio ir aplinkos poliškumui, taigi gerai tinka sudėtingose bei kintančio poliškumo aplinkose, pavyzdžiui, tyrimams kraujo serume bei imuninio atpažinimo situacijose. Šios žymės tinkamos išmatuoti kiekį baltymų, susijungusių su minėtomis
žymėmis matuojant fluorescencijos poliarizaciją.
Šių žymių fluorescencijos gyvavimo periodas gana trumpas - apie 4 ns, taigi
fluorescencijos metodams, reikalaujantiems ilgesnio fluoroforo fluorescencijos emisijos laiko, jos netinkamos.
Kumarinai yra kita gana plačiai naudojama komerciškai svarbi fluorescentinių žymių grupė. Alexa Fluor (prekinis pavadinimas) žymės pasižymi fotostabilumu, nejautrumu terpės pH (Panchuk-Voloshina, 1999). Šių žymių pagrindą sudaro kumarinai arba rodaminai. 2.6.1. paveiksle pateiktos kai kurių šių žymių struktūros.
Dansylchlorido žymė plačiai naudojama biocheminiuose tyrinėjimuose, taip pat ir baltymų žymėjimui, ypač, jei matuojama poliarizacija. Dansylo grupės žymės sužadinamos prie 350 nm, dažniausiai baltymai nebeabsorbuoja tokio bangų ilgio šviesos, emisijos maksimumas paprastai yra apie 520 nm. Ši žymė yra labai jautri tirpalo poliškumui, yra hidrofobiška (Lakowicz, 1999b), todėl jos panaudojimas imuninėje analizėje labai ribotas.
Ilgų sužadinimo bangų žymėms priklauso cianino klasės žymės, tokios kaip 7, Cy-3 ir Cy-5 (2.6.Cy-3.pav.). Šios žymės absorbuoja ir emituoja šviesą ties 650 nm bangų ilgiu. Cianino žymės pasižymi mažu Stokso poslinkiu, kaip antai, Cy-7 žymės absorbcijos
maksimumas nuo emisijos maksimumo apytikriai nutolęs per 30 nm. Šių žymių sužadinimo maksimumas yra infraraudonųjų bangų srityje arba netoli šios srities (Mujumdar, 1993). Ftalocianino žymės turi viduje metalo jono ir porfirino žiedo sistemą (2.6.2.pav.). Dauguma jų labai sunkiai tirpsta vandeniniuose tirpaluose. Šios žymės daugiausiai naudojamos optinėse bei laidinėse sistemose.
2.6.2. pav. Metalo jono ir porfirino komplekso ir Ru-tris-(bipiridino) bendra cheminė struktūra.
ligandai, tri-N-oktilfosfino oksidai (Hemmila, 1985). Tb3+ chelatai yra labiau stabilūs ir paprastai nereikalauja apsaugos nuo vandens molekulių, bet Tb3+ sužadinimo maksimumas yra žemiau 300 nm ir tai yra problema, nes stiklas ir plastikas silpnina šviesą žemiau 320 nm. Sukurta eilė DELFIA imunologinių rinkinių naudojant Eu3+chelatus (Hemmila, 1991).
Tiesioginis fluorescencijos intensyvumo nustatymas žymėtų ir nežymėtų antigenų mišinyje, o tuo labiau kraujo serume, dėl didelio foninio švytėjimo ilgą laiką nežadėjo
perspektyvų fluorescencinio žymėjimo taikymui didelio jautrumo reikalaujančiuose tyrimuose (Lakowicz, 1999b). Ilgesnio fluorescencijos gyvavimo žymių, pavyzdžiui, lantanidų europio ir terbio pritaikymas fluorescenciniam žymėjimui bei taip vadinamų time-resolved (TR) fluorimetrų, įgalinančių matuoti fluorescencijos intensyvumą po tam tikro laiko, kada foninių junginių fluorescencija jau užgesusi, naudojimas įgalino nustatinėti pakankamai mažas ligandų koncentracijas. Sukurti daugelio hormonų, taip pat ir žAH, kiekybinio nustatymo TR fluorescenciniai imuniniai rinkiniai, puikiai konkuruojantys su RIA (Nuutila, 1990; Lovgren, 1984).
Lazerinio sužadinimo atveju naudojamos ne įprastinius fluoresceino ar rodamino fragmentus turinčios, o tuos pačius fragmentus turinčios chemiškai modifikuotos žymės, atsparesnės šviesos ardančiajam poveikiui (Lakowicz, 1999b).
Pastaruoju metu, siekiant pakeisti fluoresceiną bei rodaminą, sukurtos naujos žymės, žymimos BODIPY prekiniu ženklu. Šių žymių pagrindą sudaro fluoroforai savo struktūroje turintys boro molekulę (2.6.3.pav.). Šios žymės yra nejautrios terpės poliškumui ir pH pokyčiams. Emisijos maksimumas stebimas nuo 510 nm iki 675 nm. Vienas iš trūkumų yra nedidelis Stokso poslinkis.
2.6.3. pav. Bodipy®FL (λsužad 505 nm, λem 513 nm, formulė kairėje) ir Cy5 (λsužad635 nm,
λsužad 665 nm, formulė dešinėje) fluorescencinių žymių struktūra.
nefluorescuoja vandenyje, bet pasižymi stipria fluorescencija prisijungusios prie baltymų ar membranų (Lakowicz, 1999b).
Fluorescuojantys junginiai prijungiami prie biologiškai aktyvių medžiagų, naudojant įvairias reaktyvias chemines grupes, dažniausiai amino ir sulfhidrilines.
Funkcinės grupės C ir N baltymo peptido grandinės galuose gali būti naudojamos žymei prijungti.
Aktyvi grupė baltymuose (ypač neutraliuose arba baziniuose vandeniniuose
tirpaluose) yra tiolo grupė cisteino amino rūgšties likutyje. Maleimido, jodacetamido grupių panaudojimas ir disulfidų pakeitimo metodai yra dažniausiai naudojami siekiant prijungti žymę per tiolo grupes (2.6.4.pav.).
2.6.4. pav. Dažniausi būdai, kuriais susijungia baltymų tiolo grupės ir žymės: (A) jodacetamido grupių panaudojimas, (B) maleimido grupių panaudojimas ir (C) disulfidų pakeitimo būdas. P raide pažymėtas polipeptidas, F - fluoroforas.
2.6.5. pav. Dažniausi būdai, kuriais susijungia baltymų amino rūgštys ir žymės. (A) sukcinimido aktyvaus esterio būdas, (B) izotiocianato būdas ir (C) sulfonylchlorido būdas. P - polipeptidas, F - fluoroforas.
Sulfonylchloridai pasižymi labai dideliu aktyvumu. Jie nėra stabilūs vandenyje, bet suformuoja labai stiprias jungtis, kurias nutraukti gali nebent amino rūgšties hidrolizė (2.6.5. pav. C).
Izotiocianatai yra vidutinio aktyvumo aminų struktūrą keičiantys reagentai. Jie yra žymiai stabilesni vandeninėse terpėse nei oksisukcimido esteriai. Reakcijai su baltymais vykti optimalus pH yra 9.0-9.5 (2.6.5. pav. B). Žymės prijungimo prie baltymo būdas, naudojant izotiocianatines grupes, galėtų būti sėkmingai taikomas žAH atveju.
2.7. Žmogaus augimo hormonas, jo izoformos.
1980). Jo žmogaus kraujyje randama apie 7-8 % (įskaitant su specifiniais baltymais surištą formą) nuo visų žAH formų kiekio (Lašienė, 2003). Tai iš 176 amino rūgščių liekanų
sudarytas polipeptidas, pasižymintis laktogeniniu poveikiu, augimo skatinimu, stimuliuojantis IGF sintezę. Šios formos hormonas pasižymi lėtesniu metaboliniu skilimo pusperiodžiu (Baumann, 1985). Standartiniais žAH antikūnais nustatomas imunoreaktyvumas sudaro tik maždaug 30 % nuo 22 kDa žAH imunoreaktyvumo (Baumann, 1983). Kai kurie
monokloniniai antikūnai (pvz.,Hybritech antikūnai) visai neatpažįsta 20 kDa žAH (Popii, 2004). Ši problema buvo sprendžiama, naudojant tyrimo metodą, kuomet nustatomas visų hormono izoformų, išskyrus 22 kDa žAH, kiekis. Neseniai sukurti specifiniai antikūnai atpažįstantys būtent 20 kDa žAH (Tsushima, 1999). Be 22 kDa ir 20 kDa žAH žmogaus kraujyje cirkuliuoja monomero dezamidas, fosforilinta, acetilo, glikolizuota žAH forma. Monomero dezamido kraujyje cirkuliuoja taip pat dvi formos Asp-152 augimo hormonas ir Glu-137 augimo hormonas turi taip pat augimą skatinantį biologinį poveikį. Acetilo forma – N- amino rūgšties gale yra acetilinta, ji pasižymi augimą skatinančiu biologiniu poveikiu tyrimuose su žiurkėmis (Popii, 2004) jos randama apie 5 % nuo visų kraujyje cirkuliuojančių žAH formų. Glikolizuota žAH monomero forma sudaro mažiau nei 1 % (Lašienė, 2003). Taip pat nustatytos ir dimero dezamido ir acetilo formos, jų kraujyje cirkuliuoja apie 2 procentus. Mažai yra žinoma apie augimo hormono oligomerus: trimerus, tetramerus, pentamerus. Tyrinėjant oligomerus gauta, jog jie visi yra sudaryti iš monomerinių formų tokių kaip 22 kDa, 20 kDa ir vienos ar kelių dezamidinių, acilintų žAH formų (Baumann, 1983).
Išskiriamas iš hipofizės oligomerų kiekis labai įvairus, nes labai priklauso nuo ekstrakcijos, laikymo sąlygų, taip pat priklauso nuo nustatymo sąlygų, to, kokie antikūnai naudojami oligomerų kiekiui nustatyti. Oligomerai taip pat gali disocijuoti analizės metu. Oligomerinės žAH formos turi mažesnį bioaktyvumą, žemą afiniškumą žAH receptoriams ir didele dalimi yra neatpažįstami su daugeliu antikūnų (Brostedt, 1990). Beveik du trečdaliai oligomerų yra susijungę nekovalentiškai. Trečdalis visų aukštesnių oligomerų yra susijungę per disulfidinius tiltelius, maždaug apie 2 % visų oligomerų yra susijungę kovalentiškai, bet ne per
disulfidinius tiltelius.
Geriausiai kol kas ištyrinėti dimerai. Dimerai taip pat gali būti susidarę iš 22 kDa (apie 20 % visų kraujyje cirkuliuojančių žAH formų kiekio) arba 20 kDa monomerų (apie 7 % kiekio). Dimerai gali būti susijungę nekovalentiškai arba per disulfidinius tiltelius. Taip pat galimi heterodimerai, tai - susijungę 22 kDa ir 20 kDa monomerai (Baumann. 1991). Dimerų biologinis aktyvumas smarkiai skiriasi nuo 22 kDa monomero. Jie pasižymi augimo
