LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
ARNAS JULIUS VASILIAUSKAS
KANABIDIOLIO ĮVERTINIMAS IR PALYGINIMAS
PLUOŠTINĖSE KANAPĖSE (CANNABIS SATIVA L.) EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ IR DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr. Ramunė Morkūnienė
KANABIDIOLIO ĮVERTINIMAS IR PALYGINIMAS
PLUOŠTINĖSE KANAPĖSE (CANNABIS SATIVA L.) EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ IR DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas
Recenzentas Saulė Velžienė Darbą atliko
Magistrantas
Arnas Julius Vasiliauskas
TURINYS
1. SANTRUMPOS ... 7
2. ĮVADAS ... 8
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
4.1. Sėjamosios kanapės (Cannabis sativa L.) morfologija ir paplitimas ... 10
4.2. Sėjamosios kanapės (Cannabis sativa L.) cheminė sudėtis ... 11
4.3. Kanabidiolio (CBD) farmakologinis poveikis ... 12
4.3.1. Priešuždegiminis poveikis ... 13
4.3.2. Poveikis nervų sistemai ... 14
4.3.3. Priešvėžinis poveikis ... 16
4.3.4. Poveikis kitoms organizmo sistemoms ... 16
4.4. Instrumentinės analizės metodai, skirti kanabidioliui nustatyti ... 17
4.4.1. Dujų chromatografija ... 17
4.4.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 18
5. TYRIMO METODIKA ... 21 5.1. Tyrimo objektas ... 21 5.2. Reagentai ... 21 5.3. Aparatūra ... 21 5.4. Tyrimo metodai ... 22 5.4.1. Ekstrakto paruošimas ... 22
5.4.2 Kanabidiolio kokybinis ir kiekybinis įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos būdu ... 22
5.4.3. Kanabidiolio kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos metodu 23 6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24
6.1. Kanabidiolio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 24
6.2. Kanabidiolio nustatymas dujų chromatografijos metodu ... 28
6.3. ESC ir DC metodų palyginimas kanabidiolio analizei ... 32
7. IŠVADOS ... 34
SANTRAUKA
Arno Juliaus Vasiliausko magistro baigiamasis darbas, pavadinimas – kanabidiolio įvertinimas ir palyginimas pluoštinėsė kanapėse (Cannabis sativa L.) efektyviosios skysčių ir dujų chromatografijos metodais/ mokslinis vadovas: prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. - Kaunas.
Darbo tikslas - palyginti kanabinoidų kiekybinius rezultatus pluoštinės kanapės žaliavoje skysčių chromatografijos ir dujų chromatografijos metodais.
Darbo uždaviniai - parinkti efektyviosios skysčių ir dujų chromatografijos metodiką kokybiniam bei kiekybiniam kanabidiolio įvertinimui pluoštinės kanapės augalo žaliavoje, palyginti kanabidiolio kiekybinius rezultatus tarp skirtingų kanapių rūšių ir skirtingose kanapės augalo dalyse, palyginti kanabidiolio procentinę sudėtį naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos ir dujų chromatografijos metodus.
Metodika - kanabidiolio kokybinis ir kiekybinis įvertinimas atliktas naudojant efektyviosios skysčių ir dujų chromatografijos metodus.
Rezultatai - atliekant kanabidiolio nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos būdu naudotas gradientinis eliuavimas, eliuentai: (B) acetonitrilas ir (A) skruzdžių rūgštis (0,1 proc.) : 0 min (B-75 proc.), 6 min (B-100 proc.), 9 min B-100 proc., 10 min (B-75 proc.). Kokybiniam ir kiekybiniam kanabidiolio nustatymui dujų chromatografijos metodu naudoto helio dujos kaip dujos nešėjos, kolonėlėje temperatūra keliam nuo 80°C iki 250° C 10°C/min ir nuo 250°C iki 310°C 30°C/min ir palaikoma 7 min. Lyginant skirtingas pluoštinių kanapių veisles didžiausias kanabidiolio kiekis nustatytas Finola ir Balobzevsky veislių pluošinėse kanapėse (atitinkamai 6,64 ir 6,31 bei 6,42 ir 6,1 proc. analizuojant ESC ir DC). Lyginant skirtingas augalo dalis, didžiausias kanabidiolio kiekis nustatytas žiedadulkėse (6,64 ir 6,3 proc. analizuojant Finola veislės žiedadulkes ESC ir DC). Didesnis kanabidiolio kiekis nustatytas visose analizuotose žaliavose tyrimus atliekant efektyviosios skysčių chromatografijos būdu (2,15±0,02 proc.), o dujų chromatografijos metodu nustatyta 2,01±0,01 proc. Vidutiniškai tyrimą atliekant dujų chromatografijos metodu procentinis skirtumas yra mažesnis nei 0,15 proc. bendro kiekio.
Išvados - lyginant kanabidiolio nustatymą skirtingais metodais nustatyta, kad kanabidiolio analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu trunka ilgiau, jai reikia daugiau reagentų, tačiau naudojant šį metodą nustatomas didesnis kanabidiolio kiekis nei naudojant dujų chromatografijos metodą.
SUMMARY
Master thesis of Arnas Julius Vasiliauskas. Evaluation and comparison of cannabidiol in hemps (Cannabis sativa L.) by high pressure liquid and gas chromatography/ scientific supervisor: prof. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas.
The aim of the study: to compare the results of hemp quantitative analysis, obtained by liquid chromatography and gas chromatography methods.
The tasks of the study are to choose high pressure liquid chromatography method for qualitative and quantitative analysis of cannabidiol in hemps, to compare the results of cannabidiol quantitative analysis between different species and parts of hemp and to compare the the percentage composition of cannabidiol by high pressure liquid chromatography and gas chromatography.
Methods - qualitative and quantitative evaluation of cannabidiol was made by high pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC).
Results - gradient elution was used to evaluate cannabidiol amount by HPLC: eluents: (B) acetonitrile and (A) formic acid (0,1%) : 0 min 75%), 6 min 100%.), 9 min B-100%., 10 min (B-75%.). For qualitative and quantitative GC analysis of cannabidiol helium was used as carrier gases, the temperature in column was risen from 80°C to 250° C 10°C/min and from 250°C to 310°C 30°C/min and was maintained for 7 min. Comparing different species of hemp, the highest concentration of cannabidiol was evaluated in Finola and Balobzevsky hemp species (respectively 6,64 and 6,31% or 6,42 and 6,1% using HPLC and GC). Comparing different parts of the plant, the highest concentration of cannabidiol was evaluated in pollen (6,64 and 6,3% determined in pollen of Finola species by HPLC and GC). The higher concentration of cannabidiol in all parts and species of hrmp was determined using high pressure liquid chromatography (2,15±0,02%), using gas chromatography - 2,01±0,01%. The average difference of gas chromatography analysis results was lower than 0,15% of total amount.
Conclusions - When comparing the evaluation of cannabidiol by different methods, high pressure liquid chromatography takes more time, needs more reagents, but the concentration of cannabidiol was determined higher than by gas chromatography.
1. SANTRUMPOS
CBD - kanabidiolis
CBDA - kanabidiolinė rūgštis CBG - kanabigerolis
DC - dujų chromatografija
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija THC - ∆9-tetrahidrokanabinolis
2. ĮVADAS
Pluoštinės kanapės (lot. Cannabis sativa L.) pasaulyje plačiausiai naudojamos virvių bei kito pluošto pramonėje. Tačiau jų sudėtyje taip pat nustatyta biologiškai aktyvių junginių, vadinamų kanabinoidais. Šiems junginiams priskiriami: ∆9
-tetrahidrokanabinolis, kanabidiolis, kanabigerolis, kanabinodiolis ir kiti [22]. Vienas iš gausiausiai randamų kanabinoidų pluošinėje kanapėje yra kanabidiolis. Atlikta nemažai in vitro ir in vivo tyrimų, įrodančių šio junginio antioksidacinį, priešuždegiminį, nervų sistemą bei širdies ir kraujagyslių sistemą veikiantį poveikį [26,29,32,36]. Dėl plataus biologinio aktyvumo didėja susidomėjimas kanabidiolio pritaikymui medicinoje.
Atliekant tyrimus su augaliniais junginiais yra svarbus jų kokybinis ir kiekybinis nustatymas. Analizė gali būti atliekama nustatant junginį iš žaliavos gautuose ekstraktuose ar tolimesniuose tyrimų etapuose. Junginių analizei galima naudoti įvairius instrumentinės analizės metodus, priklausomai nuo tiriamo junginio savybių. Kanabidiolio nustatymui dažniausiai naudojami chromatografiniai analizės metodai: dujų chromatografija arba efektyvioji skysčių chromatografija [7,34]. Renkantis analizės metodą svarbu atsižvelgti ne tik į tiriamojo junginio nustatymo efektyvumą, tačiau ir į analizės trukmę, naudojamus reagentus, įrangą, mėginių paruošimą. Keičiant analizės sąlygas siekiama gauti kuo optimalesnį analizės metodą priklausomai nuo siekiamo rezultato. Įvertinus junginių atskyrimą, analizės trukmę bei kaštus, tyrėjai gali pasirinkti, kuris metodas jiems yra priimtinesnis.
Šiame darbe atlikta mėginių, gautų iš skirtingos pluoštinių kanapių žaliavos, analizė dviem skirtingais metodais: dujų chromatografija ir efektyviąja skysčių chromatografija, bei palyginti pagrindiniai analizių metu gauti parametrai.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: palyginti kanabidiolio kiekybinius ir kokybinius rezultatus pluoštinės kanapės žaliavoje skysčių ir dujų chromatografijos metodais
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti efektyviosios skysčių ir dujų chromatografijos metodiką kokybiniam bei kiekybiniam kanabidiolio įvertinimui pluoštinės kanapės augalo žaliavoje.
2. Palyginti kanabidiolio kiekybinius rezultatus tarp skirtingų kanapių rūšių ir skirtingose kanapės augalo dalyse.
3. Palyginti kanabidiolio procentinę sudėtį naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos ir dujų chromatografijos metodus.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Sėjamosios kanapės (Cannabis sativa L.) morfologija ir paplitimas
Sėjamoji kanapė (lot. Cannabis sativa L.) – tai kanapinių (lot. Cannabaceae) šeimos augalas. Be sėjamosios kanapės dar yra išskiriamos dvi kanapių rūšys – indinė kanapė (lot. Cannabis indica) ir šiukšlyninė kanapė (lot. Cannabis ruderalis) [59]. Sėjamoji kanapė yra vienmetis žolinis augalas. Dažniausiai tai dvinamis augalas – vyriški ir moteriški žiedai yra išsidėstę ant skirtingų augalų, rečiau vienanamis – abiejų lyčių žiedai yra ant to paties augalo [8]. Augalo stiebas tiesus, vagotas, siekia iki 3 metrų aukščio (vyriški augalai aukštesni lyginant su moteriškos lyties augalais), gausiai šakotas. Šakos tankiai padengtos plaukeliais [65]. Pirmi lapai išauga poroje priešingose stiebo pusėse, sudaryti iš dviejų dantytų lapelių (5-10 cm ilgio), sujungtų lapkočiais. Kita lapų pora gali būti sudaryta iš pavienio lapelio ar plaštakiškai sujungtų kelių lapelių, kurių skaičius didėja formuojantis naujiems lapams, daugiausiai gali būti 10-11 lapelių ant vieno lapkočio. Moteriškos giminės augalai yra lapuoti iki pat viršūnės, žiedai taip pat gausiai apsupti lapų. Vyriškų augalų viršūnėje lapų yra mažiau [15,62]. Augalas dauginasi sėklomis, kurios subręsta moteriškų augalų žiedynuose [15].
Pradėtos auginti Centrinėje Azijoje, kanapės šiuo metu yra papiltusios visame pasaulyje. Tai vienas anksčiausiai žmogaus pradėtų auginti augalų. Šaltiniai rodo, kad Kinijoje kanapės augintos jau 4000 metų prieš Kristų kaip žaliava pluoštams ir popieriui, taip pat sėklos naudotos aliejui išgauti [41]. Kanapės buvo plačiai naudojamos ir Indijoje, Tibete, Asirijoje, Persijoje [64]. Prieš mūsų erą Europoje kanapės naudotos mažai. Arabų pirklių pagalba pamažu kanapės išplito į Afriką, iš ten į Pietų Ameriką. Galiausiai XIX a. pradėtos naudoti medicininiams tikslams Anglijoje ir Prancūzijoje, iš ten kanapės pasiekė Šiaurės Ameriką [54,71].
Pagal kaupiamo ∆9-tetrahidrokanabinolio (THC) ir kanabidiolio (CBD) kiekį kanapės gali būti skirstomos į psichoaktyvias ir nepsichoaktyvias, pastarosios dažniausiai naudojamos pluošto pramonėje. Pluoštinės kanapės turi mažą THC/CBD santykį lyginant su psichoaktyvioms (THC/CBD daug mažesnis už vieną lyginant su THC/CBD daug didesniu už vieną) . Kadangi abu šie junginiai gaunami iš to paties pirmtako – kanabigerolio, todėl šį santykį galima reguliuoti genetiškai [17,31]. Šiuo metu didėjant natūralaus pluošto poreikiui, pluoštinių kanapių auginimas sparčiai didėja. Didžiausi pluoštinių kanapių augintojai pasaulyje yra Kinija, Indija, Australija, Kanada. Europoje didžiausia dalis pluoštinių kanapių užauginama Prancūzijoje, Olandijoje, Vokietijoje, Vengrijoje, Rumunijoje [13,63]. Lietuvoje pluoštinių kanapių auginimas legalizuotas nuo 2014 m. sausio 1 dienos, apibrėžiant: „Pluoštinės kanapės – kanapinių (Cannabaceae) šeimos sėjamosios kanapės (Cannabis
sativa L.) rūšies veislių augalai, kurių išdžiovintoje medžiagoje tetrahidrokanabinolio yra ne daugiau
sodininkystei.” [41]. Tokie reikalavimai pluoštinėms kanapėms keliami visoje Europos sąjungoje, palyginimui Šveicarijoje leidžiamas ∆9
-tetrahidrokanabinolio kiekis yra ne didesnis nei 0,3 proc. [18]. Siekiant išgauti didesnį pluošto kiekį buvo tiriami veiksniai, turintys įtakos pluoštinių kanapių derliui. Gautas derlius vertintas pagal stiebų išeigą, skaidulų procentinį kiekį stiebuose, skaidulų storumą. Italijoje atlikti tyrimai, kurie parodė, kad pluošto kiekis priklauso nuo aplinkos sąlygų, augalo genotipo, sėjos ir derliaus nuėmimo laiko – didesnį pluošto kiekį turėjo augalai, augę sausros metais, didesnis derlius gautas iš dvinamių Tiborszallasi genotipo augalų, abiejų genotipų augalai didesnį pluošto kiekį turėjo juos pasėjus balandžio pabaigoj-gegužės mėnesį ir nuėmus vėlyvąjį derlių [2,14].
Apibendrinant galima teigti, kad sėjamoji kanapė yra plačiai žinomas ir kultivuojamas augalas beveik visame pasaulyje. Šiuo metu susitelkiama ne į chemines, o į augalo pluoštines savybes, kurias siekiama pagerinti keičiant augalo genotipą ar auginimo sąlygas.
4.2. Sėjamosios kanapės (Cannabis sativa L.) cheminė sudėtis
Šiuo metu sėjamojoje kanapėje yra nustatyta daugiau nei 500 junginių. Visi kanapėje randami junginiai skirtomi į dvi grupes – kanabinoidai ir nekanabinoidai. Kanabinoidai – tai junginių grupė, kurių struktūroje yra C21 terpenofenolinis karkasas. Tai plačiai ištyrinėta ir labai specifiška junginių
grupė, pasižyminti stipriu poveikiu žmogaus nervų sistemai. Augaluose randami kanabinoidai dar vadinami fitokanabinoidais. Nekanabinoidams prisikiriami flavonoidai, mono- ir seskviterpenai, cukrai, azoto turintys junginiai, angliavandeniai, aminorūgštys ir kiti [22,23].
Iki 2012 metų išskirta 11 kanabinoidų tipų: (˗)-delta-9-transtetrahidrokanabinolis (∆9
-THC), (˗)-delta-8-transtetrahidrokanabinolis (∆8
-THC), kanabigerolis (CBG), kanabichromenas (CBC), kanabidiolio (CBD), kanabinodiolio (CBND), kanabielsoino (CBE), kanabiciklolio (CBL), kanabinolio (CBN), kanabitriolio (CBT) ir įvairaus tipo. Iš viso šiems tipams priklauso daugiau nei šimtas skirtingų junginių [23]. Didžiausią kanabinoidų dalį sudaro ∆9
-tetrahidrokanabinolis, kanabidiolis, kanabinolis ir kanabichromenas [58]. Kanabidiolis pirmą kartą išskirtas dar 1940 metais, tačiau tiksli šio junginio struktūra nustatyta tik 1963 metais. Kanabidiolio klasei be šio junginio priklauso kanabidiolinė rūgštis, kanabidiolio monoetileteris, kanabidiolio-C4, kanabidivarininė rūgštis,
kanabidivarinas ir kanabidiorkolis. Visi šie junginiai skiriasi tik šoniniais radikalais – R1, R2, R3 (1
1 pav. Kanabidiolio struktūra
Pastaraisiais dešimtmečiais susintetinta panašios į kanabinoidus struktūros junginių, kurie jungiasi prie kanabinoidų tipo-1 (CB1) ir kanabinoidų tipo-2 (CB2) receptorių ir žmogaus nervų
sistemai sukelia panašų poveikį, kurį sukelia natūralūs kanabinoidai. Šie junginiai vadinami kanabinoidinių receptorių agonistais [6]. Dar išskiriama endokanabinoidų grupė – tai žmogaus nervų sistemoje randami junginiai, kurie natūraliai jungiasi prie CB1 ir CB2 receptorių. Šie junginiai savo
struktūra visiškai skiriasi nuo gamtoje randamų kanabinoidų. Šie junginiai yra ilgųjų riebiųjų rūgščių grandinių dariniai. Vienas iš pavyzdžių – anandamidas, sudarytas iš arachidono rūgšties ir etanolamido [12,55].
Iš to galima daryti išvadas, kad pluoštinė kanapė kaupia labai plačios kanabinoidų klasės junginius, iš kurių pagrindiniai yra ∆9
-stetrahidrokanabinolis, kanabidiolis, kanabichromenas. Pastaruoju metu yra sintetinami panašios struktūros junginiai, kurie galimai turėtų panašų į kanabinoidus poveikį kanabinoidų receptoriams.
4.3. Kanabidiolio (CBD) farmakologinis poveikis
Pastaruoju metu gerokai išaugo susidomėjimas vienu iš kanabinoidų – kanabidioliu. Kanabidiolis savo farmakologiniu poveikiu gerokai skiriasi nuo pagrindinio kanabinoido - ∆9 -tetrahidrokanabinolio. Kanabidiolis neturi priklausomybę sukeliančio poveikio, todėl šis junginys yra gerokai saugesnis farmakologiniu požiūriu [20]. Šie du junginiai skiriasi savo veikimo mechanizmu - ∆9
-tetrahidrokanabinolis stipriai jungiasi prie žmogaus CB1 ir CB2 receptorių, kai tuo tarpu kanabidiolis turi gerokai mažesnį afenitetą šiems receptoriams, jo veikimas mažiau žinomas. Kanabidiolis dažnai pasirenkamas kaip saugesnė alternatyva ∆9
-tetrahidrokanabinoliui arba vartojamas kartu su ∆9-tetrahidrokanabinoliu siekiant sumažinti jo nepageidaujamą poveikį [72]. Toliau bus apžvelgta pagrindiniai kanabidiolio poveikiai, juos patvirtinantys tyrimai bei galimos panaudojimo perspektyvos.
4.3.1. Priešuždegiminis poveikis
Kanabindiolio priešuždegiminis poveikis aiškinamas jo slopinančiu poveikiu citokinams (pvz., naviko nekrozės faktoriui α, interleukinams), kurie pradeda uždegiminę kaskadą, aktyvinami kiti mediatoriai, kol gaunamas kliniškai išreikštas uždegimas [9]. Priešuždegiminis poveikis yra labai plačiai naudojamas, kadangi uždegimas gali pažeisti bet kurią organizmo vietą.
2011 metais tirtas šešių pagrindinių kanabinoidų poveikis ciklooksigenazėms. Tyrimui naudoti ∆9
-tetrahidrokanabinolis (THC), ∆9-tetrahidrokanabinolinė rūgštis (THCA), kanabidiolis (CBD), kanabidiolinė rūgštis (CBDA), kanabigerolis (CBG) ir kanabigerolinė rūgštis (CBGA). Tyrimas atliktas naudojant fermentais paremtą COX1/COX2 inhibavimo testą ir prostaglandinų
gamybos ląstelėje radioimuninį tyrimą. Rezultatai parodė, kad CBDA selektyviai slopino COX1, kiti
kanabinoidai pasižymėjo neselektyviu slopinančiu poveikiu ciklooksigenazėms, tačiau poveikiui pasiekti reikėjo didesnės koncentracijos nei naudojant nesteroidinius vaistus nuo uždegimo (pvz., indometaciną) [57]. Kitas tyrimas atliktas naudojant gryną kanabidiolį ir Cannabis sativa ekstraktą su dideliu kanabidiolio kiekiu. Tirtas junginių poveikis žarnyno gleivinėj sukeltam uždegimui ir padidėjusiam žarnyno judrumui. Preparatai buvo skiriami tiesiai į pilvo ertmę arba per os. Junginių mišinys, paskirtas abiem formomis, žarnyno gleivinėje sumažino uždegimo rodiklio – mieloperoksidazės – kiekį bei padidėjusį žarnyno judrumą. Grynas kanabidiolis veikė tik žarnyno judrumą, uždegimo rodikliams poveikio neturėjo [49]. Taip pat atliktas tyrimas su pelėmis, kurioms sukeltas eksperimentinis autoimuninis miokarditas. Kanabidiolis paskirtas 10 mg/kg doze į pilvo ertmę. Stebėti hemodinaminiai rodikliai (kairiojo skilvelio funcija, išmetimo frakcija, sistolinis ir kairiojo skilvelio pabaigos diastolinis spaudimas, kairiojo skilvelio atsipalaidavimo laikas), genų ekspresijos analizė, histologinis ir imunohistocheminis tyrimai. Rezultatai parodė teigiamą priešuždegiminį ir antifibrotinį kanabidiolio poveikį, kadangi kanabidiolis sumažina uždegimą mažindamas imuninių ląstelių infiltraciją, mažina oksidacinį stresą bei skatina fibrozinio audinio atsinaujinimą (mechanizmas nežinomas) [38]. 2015 m. tirtas kanabidiolio gelio poveikis artrito sukeltam uždegimui. Tyrimas atliktas su žiurkėmis. Tyrimo metu paaiškėjo, kad vietiškai pavartotas kanabidiolis sumažino sąnario patinimą, sumažino patologinį sinovijinės membranos sutankėjimą, sumažino skausmą, padidėjusį jautrumą karščiui, padidino žiurkių aktyvumą, priešuždegiminių žymenų (naviko nekrozės faktoriaus α, su kalcitoninu susijusio geno) kiekį. Tyrėjai padarė išvadas, kad kanabidiolis veiksmingai mažina uždegimą net vartojamas išoriškai [29].
Pastebėjus kanabidiolio priešuždegiminį poveikį pradėta modifikuoti jo molekulę siekiant stipresnio arba platesnio poveikio. Toks tyrimas atliktas vietoj kanabidiolio naudojant jo regioizomerą arba modifikuotos struktūros junginį O-1602. Vertintas priešuždegiminis poveikis pelių, kurioms dirbtinai sukeltas kolitas, žarnyno epiteliui. Abu junginiai pasižymėjo teigiamu poveikiu uždegimo
slopinimui ir žaizdų gyjimui, todėl reikėtų atlikti daugiau tyrimų dėl galimo šių junginių pritaikymo žarnyno uždegimių ligų gydymui. Kanabidiolio regioizomeras taip pat pasižymėjo ir endotelio bei epitelio žaizdų gijimą skainančiu poveikiu, todėl galimas junginio pritaikymas širdies ir kraujagyslių ligų gydymui [36,60]. Kito tyrimo metu patvirtintas kanadibiolio ir O-1602 junginio teigiamas priešuždegimis poveikis pelėms, kurioms sukeltas pankreatitas. Nors junginiai veikė skirtingais mechanizmais (O-1602 yra GPR55 kanabinoidų receptoriaus antagonistas, o kanabidiolis – agonistas) tačiau nustatytas panašus priešuždegiminis poveikis – priešuždegiminiams citokinams, mieloperoksidazės aktyvumui ir kasos fermentų aktyvumui. [42].
Apibendrinant galima teigti, kad kanabidiolis bei jo dariniai pasižymi plačiu priešuždegiminiu poveikiu įvairioms sistemoms, todėl atlikus daugiau tyrimų tai galėtų būti perspektyvus priešuždegiminis preparatas.
4.3.2. Poveikis nervų sistemai
Kanabidiolis, nors ir nesukelia priklausomybės, tačiau vis tiek pasižymi stipriu poveikiu nervų sistemai, todėl šiuo metu plačiai tiriamas jo poveikis įvairių nervų sistemos ligų gydymui ar remisijai. Manoma, kad teigiamą poveikį nervų sistemai kanabidiolis turi dėl antioksidacinių ir priešuždegiminių savybių, nesusijusių su CB1 ir CB2 receptorių aktyvavimu, tačiau galimai susijusių
su jungimusi prie 5HT1A receptorių.
Šiuo metu rinkoje yra registruotas kanapių ekstrakto preparatas Sativex® (2,7mg ∆9
-tetrahidrokanabinolio ir 2,5mg kanabidiolio), skirtas išsėtine skleroze sergančių pacientų spastiškumui mažinti. Su šiuo preparatu atlikta nemažai tyrimų, siekiant įrodyti ∆9
-tetrahidrokanabinolio-kanabidiolio burnos gleivinės purškalo spastiškumą mažinantį poveikį išsėtine skleroze sergantiems pacientams, kurie atsparūs pirmos eilės gydymui. Kartu vartojami abu junginiai patvirtino teigiamą poveikį raumenų spastiškumo mažinimui, taip pat pasirodė saugūs ir gerai toleruojami. Spastiškumą mažinantis poveikis aiškinamas CB1 receptorių stimuliacija. Šie receptoriai, esantys smegenėlėse ir
bazaliniuose nerviniuose mazguose, yra atsakingi už judėjimą, jų sumažėjimas sukelia judėjimo sutrikimus [39,68]. 2010 m. atlikto tyrimo su pelėmis metu buvo vertinamas kanabinoidų mišinio (∆9 -tetrahidrokanabinolio, ∆8-tetrahidrokanabinolio, kanabigerolio, kanabinolio, kanabichromeno, kanabidiolio) antidepresinis poveikis. Kanabinoidų poveikis buvo lyginamas su sintetinių antidepresantų – fluoksetino hidrochlorido ir dersipramino hidrochlorido poveikiu. Ryškiausią antidepresinį poveikį parodė kanabichromenas ir kanabidiolis, nors šio poveikio veikimo mechanizmas dar tiksliai nežinomas [21]. Kanabidiolis taip pat pasižymi priešepilepsiniu poveikiu, nors tikslus mechanizmas dar neištirtas. 2017 m. Atlikto tyrimo metu patvirtinta hipotezė, jog prieštraukulinis
kanabidiolio poveikis susijęs kanabinoidinių (CB1 ir CB2) ir vaniloidinių (TRPV1) receptorių
blokavimu, tai įrodyta naudojant selektyvius šių receptorių antagonistus. Naudojant pentilentetrazolino (PTZ) modelį pelėms patvirtintas jo poveikis elektroencefalografiniam (EEG) ir hipokampo citokinų aktyvumui – kanabidiolis mažino PTZ sukeltą EEG aktyvumą ir interleukino-6 padidėjimą [66]. Kito klinikinio tyrimo metu patvirtintas teigiamas kanabidiolio poveikis epilepsija sergančių pediatrinių pacientų gyvenimo kokybei. 12 savaičių trukęs tyrimas parodė, jog sumažėjo pacientų nuovargis, pagerėjo atmintis ir kitos pažintinės funkcijos [56].
Kanabidiolis neuroprotekcinis poveikis nėra tiksliai patvirtintas. Atliktas tyrimas su naujagimiais paršeliais, kurių smegenims sukelta hipoksija ir išemija. Įvertinus pažeistų neuronų kiekį, uždegimo ir oksidacinio streso žymenų kiekį nustatyta, kad didžiausią teigiamą neuroprotekcinį poveikį turėjo taikoma hipotermija ir gydymas kanabidioliu. Tačiau vėliau atlikto panašaus tyrimo metu gauti priešingi rezultatai – nustatytas statistiškai reikšmingas hipotenzinis poveikis, tačiau neuroprotekcinis poveikis nebuvo ženklus. Abiejų tyrimų metu naudota ta pati kanabidiolio dozė – 1 mg/kg [28,37]. Kanabidiolis taip pat pasižymi teigiamu priešepilepsiniu poveikiu. Tai įrodo tyrimas, atliktas su dviem vaistams atsparia epilepsija sergančiais vaikais. Šie pacientai iš pradžių pradėti gydyti kanabidioliu praturtintu Cannabis sativa ekstraktu (70 mg tris kartus per dieną), tačiau dėl nepageidaujamų poveikių ir greito traukulių sugrįžimo gydymas buvo nutrauktas ir ekstraktas pakeistas į gryną kanabidiolį (dozavimas toks pat). Pastarasis sukėlė mažiau nepageidaujamų poveikių (ataksija, akių raudonumas, sumažėjęs dėmesys) ir pasiekta ilgesnė traukulių remisija, todėl nors dar neregistruotas, tačiau kanabidiolis yra perspektyvus preparatas epilepsijos gydymui [16]. Taip pat tirtas galimas kanabidiolio antiparkinsoninis poveikis. Tyrimas atliktas su pelėmis, kurioms rezerpinu sukelti judėjimo bei pažinimo sutrikimai. Kanabidiolis paskirtas 0,5 arba 5mg/kg dozių injekcijomis 2-5 dienas. Rezultatai parodė, kad kanabidiolis sumažino katalepsinį elgesį, padidino burnos judesius ir sumažino atminties sutrikimus, tačiau neturėjo įtakos lokomotoriniam aktyvumui [51].
Paradoksalu, tačiau kanabidiolis gali būti naudojamas mažinti priklausomybę kanabinoidams. Atliktas tyrimas, kuriame vertintas skirtingų santykių kanabidiolio ir ∆9
-tetrahidrokanabinolio (CBD:THC) kanapių produktų poveikis žmogui. Nustatyta, kad preparatai, kuriuose buvo didesnis kanabidiolio kiekis mažino potraukį ne tik kanapėms, bet ir kitiems narkotikams [20]. Kito tyrimo metu nustatyta, kad kanabidiolis sumažino potraukį nikotinui – pacientai, vartoję inhaliuojamą kanabidiolį apie 40 proc. sumažino surūkomų cigarečių kiekį [47].
Taigi kanabidiolis, vienas ar kartu su ∆9-tetrahidrokanabidioliu, pasižymi antidepresiniu, antiepilepsiniu, spastiškumą mažinančiu, antiišeminiu ir priklausomybę mažinančiu poveikiu, todėl atlikus daugiau tyrimų galimas jo pritaikymas šioje srityje.
4.3.3. Priešvėžinis poveikis
Kanabidiolis taip pat pasižymi ir priešvėžiniu veikimu. 2016 m. atliktas tyrimas, kurio metu tirtas kanabidiolio ir Cannabis sativa ekstrakto priešvėžinis aktyvumas gimdos kaklelio vėžinių ląstelių linijoms. Atlikti MTT (3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido) kolorimetrinis tyrimas, ląstelių augimo analizė, tėkmės citometrija, morfologinė analizė, Western blot, kaspazės 3/7 tyrimai. Rezultatai parodė, kad tiek kanabidiolis, tiek Cannabis sativa ekstraktas sustabdė ląstelių proliferaciją sukeldamas ląstelių apoptozę per aneksiną V, p53 geną, kaspazę 3/7. Grynas kanabidiolis turėjo stipresnį priešvėžinį poveikį ląstelių linijoms nei ekstraktas [43]. Kito tyrimo metu palygintas ∆9
-tetrahidrokanabinolio ir kanabidiolio priešvėžinis poveikis neuroblastomos ląstelėms in vivo ir in
vitro. Atliktas MTT testas, mikroskopinė analizė, ląstelių ciklo analizė, apoptozės sukeltos ląstelių
mirties tyrimas (aneksino V, kaspazės tyrimai) bei in vivo tyrimai su pelėmis. Abi medžiagos sumažino neuroblastomos ląstelių gyvybingumą, tačiau tik kanabidiolis dalyvavo sukeliant apoptozinę ląstelių mirtį, mažino vėžinių ląstelių plitimą, turėjo mažiau nepageidaujamų poveikių, nesukėlė priklausomybės [26].
Šie tyrimai parodo, jog kanabidiolis galėtų būti potencialus priešvėžinis preparatas atlikus daugiau tyrimų, susijusių su preparato veiksmingumu ir saugumu.
4.3.4. Poveikis kitoms organizmo sistemoms
Kanabidiolis dėl uždegimą, oksidacinį stresą, išemiją mažinančio poveikio be anksčiau išvardytų panaudojimo sričių gali būti naudojamas ir kitų organų sistemų sutrikimų gydymui. 2015 m. atlikto tyrimo metu šie poveikiai pritaikyti inkstų išemijos/perfuzijos gydymui. Tyrimas atliktas su žiurkėmis. Joms tiesiai į aortą infuzuota 5mg/kg dozė gryno kanabidiolio suspensijos praėjus maždaug 45 min. po inkstų išemijos. Rezultatai parodė, kad kanabidiolis reikšmingai sumažino mieloperoksidazės aktyvumą, lipidų ir baltymų pažaidą, sukeltus uždegimo ir oksidacinio streso, tačiau nesumažino nitritų ir nitratų lygio. CB1 ir CB2 receptorių kiekis išliko nepakitęs, todėl padaryta išvada,
kad kanabidiolis išemijos sukeltą uždegimą mažina kitu mechanizmu [61]. Priešuždegiminis poveikis gali būti panaudotas bronchinės astmos gydymui. Toks tyrimas atliktas su žiurkėmis, kurioms ovalbuminu sukelta bronchinė astma, po to į pilvo ertmę sušvirkšta 5mg/kg kanabidiolio ir po 24 val. matuoti interleukinų bei naviko nekrozės faktoriaus α kiekiai serume. Gydymas kanabidioliu sumažino visų citokinų kiekius serume. Padaryta išvada, kad kanabidiolis pasižymi teigiamu priešuždegiminiu ir imunosupresiniu poveikiu bronchams [67].
Kitas tyrimas atliktas siekiant įvertint ∆9
-tetrahidrokanabinolio ir kanabidiolio poveikį kaulų lūžių gyjimui bei osteoblastų aktyvumui. Palyginta abiejų junginių atskirai ir jų mišinio poveikis šlaunikaulio lūžiui. Tyrimas atliktas su pelėmis. Tiek pavieniai junginiai, tiek jų mišinys pasižymėjo didesniu kaulų gyjimą skatinančiu poveikiu, šis poveikis aiškinamas tuo, kad kaulų ląstelės bei skeleto simpatinių nervų terminalės taip pat gamina kanabinoidų receptorius, todėl kanabinoidai turi įtakos kaulinio audinio masei bei atsinaujinimui. Taip pat nustatyta, jog kanabidiolis didina serumo osteokalcino kiekį bei kaulų mineralinį tankį [35,40].
Dar vienas tyrimas parodė kanabidiolio arterinį kraujo spaudimą mažinantį poveikį. Randomizuotas, placebo kontroliuojamas dvigubai aklas tyrimas atliktas su sveikais savanoriais. Jo rezultatai parodė, kad kanabidiolis statistiškai reikšmingai sumažino tiek ramybės būsenoje, tiek stresinėje būsenoje esančių žmonių arterinį kraujo spaudimą. Kito tyrimo metu šis parametras naudotas vertinat kanabidiolio raminantį poveikį viešojo kalbėjimo metu. Taip pat matuotas pulso dažnis bei vertintas nerimo lygis. Tyrimas atliktas su sveikais savanoriais, kanabidiolio poveikis lygintas su klonazepamo anksiolitiniu poveikiu. Rezultatai parodė, kad kanabidiolis pasižymi sedaciniu poveikiu, tačiau silpnesniu nei klonazepamas [32,70].
Apibendrinant galima teigti, kad kanabidiolio antioksidacinis, priešuždegiminis, išemiją mažinantis poveikis gali būt pritaikytas įvairių organų sutrikimų gydymui, tačiau tam dar reikia atlikti daugiau tai įrodančių tyrimų.
4.4. Instrumentinės analizės metodai, skirti kanabidioliui nustatyti
Tiriant Cannabis sativa sukauptus kanabinoidus labai svarbu parinkti pakankamai selektyvius ir jautrius instrumentinės analizės metodus, kurie būtų pakankamai jautrūs ir tikslūs nustatyti kanabidioliui ne tik augalinėje žaliavoje, tačiau ir biologiniuose mėginiuose. Biologinių mėginių (žmogaus kraujo, šlapimo, seilių) analizei svarbu, kad metodas tiktų nustatyti ne tik pagrindiniams kanabidoinams, tačiau ir jų metabolitams. Dažniausiai tam naudojami chromatografiniai atskyrimo metodai.
4.4.1. Dujų chromatografija
Populiariausias kanabinoidų nustataymo metodas yra dujų chromatografija, yra naudojamos įvairios šio metodo modifikacijos kartu su kitais metodais. 2015 metais kanapių sėklų analizei panaudotas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodas. Atskyrimas vykdytas naudojant 30
metrų ilgio kolonėlę, užpildytą 5 proc. fenilmetilpolisiloksanu. Analizė pradėta 100°C temperatūroje, kuri didinta iki 260°C. Kaip nešančios dujos panaudotas helis. Junginiai kokybiškai įvertinti naudojant masių spektrometrą. Pavyko atskirti ir kiekybiškai įvertinti keturis junginius – kanabinolį, kanabidiolį, kanabichromeną ir kanabigerolį [45]. Dujų chromatografijos-tandeminės masių spektrometrijos metodas panaudotas ∆9-tetrahidrokanabinolio, kanabidiolio ir kanabinolio nustatymui žmogaus plaukuose. Prieš tai atlikta kanabinoidų ekstrakcija iš viršerdvės. Analizė atlikta naudojant naudojant 30 metrų kolonėlę, užpildytą 5% fenilmetilpolisiloksanu, analizei naudotos ypač grynos helio dujos, temperatūra kilo nuo 100°C iki 280°C. Labai panašus metodas naudotas ir kitame tyrime, šiuo atveju temperatūra pradžioje buvo 60°C, didėjo iki 255°C ir galiausiai iki 280°C. Abu metodai optimizuoti ir validuoti ∆9-tetrahidrokanabinolio, kanabidiolio ir kanabidiolio nustatymui žmogaus plaukų mėginiuose [24,25]. Dujų chromatografija-masių spektorometrija buvo naudojama ir kitame kanabinoidų nustatymo žmogaus plaukuose tyrime. Analizė pradėta 100°C temperatūroje, kuri per 4 min. pakilo iki 250°C per 20 min., analizei naudotos helio dujos, kolonėlė – 20 metrų ilgio, užpildyta silikageliu. Metodas validuotas. Tyrėjai padarė išvadą, kad metodas yra tikslus ir patikimas toksikologinei kanabinoidų (∆9
-tetrahidrokanabinolio, kanabidiolio ir kanabinolio) analizei [27]. Panašus metodas naudotas kanabinoidų nustatymui burnos skysčių mėginiuose. Analizei naudota 15 metrų kolonėlė, užpildyta 5 proc. fenilmetilsilikonu, analizė pradėta 90°C temperatūroje, tada 15°C/min greičiu didinta iki 300°C, analizė atlikta naudojant helio dujas. Junginių detekcija atlikta naudojant masių spektrometrą. Metodas validuotas, gauti rezultatai palyginti su ultraefektyviąja skysčių chromatografija ir padaryta išvada, kad dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodas yra jautresnis ∆9-tetrahidrokanabinolio, kanabinolio ir kanabidiolio nustatymui [5]. Dviejų dimensijų dujų chromatografijos metodas panaudotas ∆9
-tetrahidrokanabinolio, kanabidiolio, kanabinolio, 11-hidroksi-9-tetrahidrokanabinolio ir 11-nor-9-tetrahidrokanabinol-9-karboksilinės rūgšties nustatymui lavono kraujyje bei gyvo žmogaus plazmoje. Atskyrimas vykdytas naudojant dvi skirtingas kolonėles: pirmoji – 30 metrų, užpildyta 5% fenilmetilpolisiloksanu, antroji – 15 metrų, užpildyta 50% fenilmetilpolisiloksanu. Kaip nešančios dujos naudotas helis. Analizės temperatūra laipsniškai didėjo nuo 150°C iki 280°C, tuomet mažėjo iki 185°C ir vėl didėjo iki 280°C. Metodas validuotas. Padaryta išvada, kad tinkamas metodas ∆9
-tetrahidrokanabinolio, kanabidiolio, kanabinolio, 11-hidroksi-9-tetrahidrokanabinolio ir 11-nor-9-tetrahidrokanabinol-9-karboksilinės rūgšties kiekybiniam ir kokybiniam nustatymui biologiniuose mėginiuose [4,34].
Dujų chromatografijos metodas pagrįstas mėginio kaitinimu, todėl jis netinkamas kanabinoidų rūgštinių formų nustatymui, kadangi vyksta jų dekarboksilinimas, todėl nustatant platesnį kanabinoidų spektrą reikia rinktis kitą metodą. [30]. Šiems junginiams nustatyti labiau tinkantis metodas yra efektyvioji skysčių chromatografija. Šiuo metodu pavyko atskirti 7 skirtingus kanabinoidus: kanabidiolio rūgštį, kanabigerolio rūgštį, ∆9
-tetrahidrokanabinolio rūgštį, kanabidiolį, kanabigerolį, ∆9 -tetrahidrokanabinolį ir kanabinolį. Tyrimui naudota 10 mm ilgio C18 kolonėlė, judanti fazė – metanolio
ir vandens mišinys, parūgštintas skruzdžių rūgšties amonio druska iki pH 5,19. Metanolio kiekis didėjo nuo 68 proc. iki 90,5 proc. per 25 min., o po to iki 95 proc. per 1 min. Tyrimas atliktas 30°C temperatūroje. Metodas validuotas remiantis ISO gairėmis. Metodas patvirtintas kaip paprastas ir tikslus pagrindinių kanabinoidų nustatymui augalo žaliavoje [7]. Panašus metodas atliktas ∆9
-tetrahidrokanabinolio, ∆9-tetrahidrokanabinolio rūgšties, kanabidiolio ir kanabinolio nustatymui kanapių produktuose. Analizei taip pat naudota ESC-MS, judanti fazė sudaryta iš 36 proc. A: trietilamonio fosfato ultra-išgrynintame vandenyje ir 64 proc. B: acetonitrilo. Taikytas izokratinis eliuavimas, detekcija atlikta prie 210 nm bangos ilgio. Metodas validuotas, patvirtintas kaip selektyvus ir specifiškas šių junginių kiekybiniam nustatymui kanapių produktuose [3]. Dar vienas tyrimas atliktas kanabinoidų nustatymui skirtingose Cannabis sativa veislėse. Jam naudota 15 cm. C18
kolonėlė, judanti fazė A sudaryta iš ultra-išgryninto vandens su 0,1 proc. skruzdžių rūgštimi, judanti fazė B – metanolis su 0,1 proc. skruzdžių rūgšties. Taikytas gradientinis eliuavimas, atskyrimas vykdytas 30°C temperatūroje. Junginių nustatymas vykdytas naudojant masių spektrometriją. Metodas optimizuotas ir validuotas. Tyrimo metu kiekybiškai įvertinti ∆9-tetrahidrokanabinolio rūgštis, ∆9 -tetrahidrokanabinolis, kanabidiolis, tetrahidrokanabivarinas, kanabigerolis ir kanabinolis, aptikti dar 7 junginiai, kurių nepavyko kokybiškai nustatyti. Metodas patvirtintas kaip tinkamas pagrindinių kanabinoidų kiekybiniam ir kokybiniam nustatymui augalinėje žaliavoje. Dar vienas tyrimas atliktas panašiomis sąlygomis, tačiau vietoj metanolio naudojant acetonitrilą [1,11].
Kito tyrimo metu naudojant skysčių chromatografiją-masių spektrometriją nustatyti trys kanabinoidai (∆9-tetrahidrokanabinolis, kanabidiolis, kanabinolis) ir metabolitas (11-nor-Δ9-tetrahidrokanabinol-9-karboksilinė rūgštis) žmogaus plaukuose, kurie ekstrahuoti heksano/etilacetato mišiniu. Analizė atlikta naudojant 15 cm kolonėlę, eliuentas A – 0,1 proc. skruzdžių rūgštis ir B – metanolio mišinys su eliuentu A, Taikytas gradientinis eliuavimas, temperatūra 40°C, detekcija atlikta masių spektrometru. Metodas validuotas ir patvirtintas kaip tinkamas ne tik trijų pagrindinių kanabinoidų, tačiau ir vieno metabolito kiekybiniam ir kokybiniam nustatymui [19]. Kitas tyrimas atliktas naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją-masių spektrometriją. Buvo nustatomas kanabichromeno, kanabidiolio, ∆9-tetrahidrokanabinolio ir dviejų jo metabolitų - 11-hidroksitetrahidrokanabinolio ir 11-nor-∆9-tetrahidrokanabinol-9-karboksilinės rūgšties) kiekiai pelių smegenyse. Atskyrimui naudota 15 cm C18 kolonėlė, judanti fazė sudaryta iš vandens ir metanolio
(10:90 v/v) su skruzdžių rūgšties amonio druska, naudotas izokratinis eliuavimas. Padaryta išvada, kad metodas yra paprastas, jautrus ir tikslus šių junginių kiekybiniam nustatymui [52]. Dar vienas tyrimas atliktas naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją-UV spektrometriją nustatyti dviems pagrindiniams kanabinoidams – kanabidioliui ir ∆9-tetrahidrokanabinolio – žiurkių plazmoje. Naudota C18 15 cm. ilgio kolonėlė, judanti fazė sudaryta iš acetonitrilo ir vandens (62:38 v/v), detekcija atlikta
prie 220 nm bangos ilgio, metodas validuotas. Padaryta išvada, kad tai paprastas, nebrangus ir jautrus metodas abiejų kanabinoidų nustatymui, tinkamas farmakokinetikos tyrimams po intraveninio kanabinoidų panaudojimo [69].
Paprastai kanabinoidų atskyrimas ESC metodu užtrunka daugiau nei 30 min., todėl vėlesnio tyrimo metu supaprastintos atskyrimo sąlygos išlaikant optimalų junginių atskyrimą. 2017 m. atliktas tyrimas leido per mažiau nei 10 min. atskirti aštuonis skirtingus kanabinoidus, tyrimas atliktas su paruošta augaline žaliava. Tyrimui naudota C18 75mm ilgio kolonėlė, taikytas gradientinis eliuavimas. Mobili fazė A – amonio acetatas, parūgštintas acto rūgštim, mobili fazė B – metanolis, detekcija atlikta prie 235 nm bangos ilgio, naudotas diodų matricos detektorius, metodas validuotas [50]. Greitesniam ir tikslesniam kanabinoidų atskyrimui panaudota ultra-efektyvioji skysčių chromatografija. Šis metodas panaudotas kanabinoidų nustatymui kanapių arbatoje ir kanapių aliejuje. Tyrimui panaudota C18 15mm ilgio kolonėlė, naudotas gradientinis eliuavimas (mobili fazė A – 0,1 proc. skruzdžių rūgštis, mobili fazė B – acetonitrilas). Analitės aptiktos naudojant trigubo kvadrupolio masių spektrometriją [48]. Ultra-efektyvioji skysčių chromatografija panaudota ir THC, CBD, 11-OH THC ir THCCOOH nustatymui žmogaus plazmoje. Atskyrimui naudota C18 kolonėlė, mobili fazė A – vanduo su 0,1 proc. skruzdžių rūgšties, mobili fazė B – metanolis su 0,1 proc. skruzdžių rūgšties, vykdytas gradientinis eliuavimas. Detekcija atlikta naudojant tandeminę masių spektrometriją. Abu metodai tikslūs, patikimi, greiti, todėl tinkami kanabinoidų nustatymui mėginiuose [33].
Apibendrinant galima teigti, kad nemažai dujų chromatografijos, efektyviosios skysčių chromatografijos metodų bei šių metodų derinių su kitais metodais galima naudoti kanabinoidų, tarp jų ir kanabidiolio, bei jų metabolitų nustatymui ne tik augaliniuose mėginiuose, tačiau ir biologinės kilmės mėginiuose.
5. TYRIMO METODIKA
5.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas yra Lietuvoje augintos skirtingų veislių pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.). Pluoštinės kanapės augintos Molėtų rajone. Žaliava surinkta žydėjimo metu. Analizei naudoti tik augalo žiedai, žiedai po nupurtymo ir žiedadulkės.
5.2. Reagentai
Visiems atliktiems tyrimams buvo naudojami šie reagentai:
Acetonitrilas (≥99,9%, Sigma-Aldrich, Izraelis),
Metanolis (≥99,8% Sigma-Aldrich, Izraelis),
Trichlormetanas (≥99% Sigma-Aldrich, Missouri, JAV),
Kanabidiolis (99,8% THC Pharm, Germany),
Kanabidiolio rūgštis (≥Sigma-Aldrich, Izraelis).
5.3. Aparatūra
Kokybinė ir kiekybinė kanabidiolio analizė pirmiausiai atlikta su Shimadzu (SHIMADZU GC-2010 PLUS, Japonija) dujų chromatografu. Naudota 30 m. ilgio Rxi – 5MS kolonėlė, kurios vidinis diametras 0,25 mm, nejudančios fazės storis 0,25µm. Injekuojama 1µl mėginio, injektoriuje palaikoma 290°C temperatūra, liepsnos jonizacijos detektoriaus temperatūra (angl. FID) 330°C. Analizei naudotos helio dujos.
Kanabidiolio nustatymui augalo ekstrakte efektyviosios skysčių chromatografijos metodu naudotas Waters 2695 atskyrimo modulis (Milford, JAV) bei YMC kolonėlė, kurios ilgis 150 mm, vidinis diametras 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 3 µm. Analitės detekcija vykdyta naudojant fotodiodų matricos detektorių Waters 996 (Milford, JAV).
Augalinės žaliavos svėrimui naudotos Shimadzu AUW120D (Bellingen, Vokietija) svarstyklės Nuodžiūviui nustatyti naudotas drėgmės analizatorius KernandSohn, DBS-60-3 (Balingen, Vokietija). Ekstrakcijos atliktos ultragarso bangų vonelėje BioSonic UC100 (Mavajai, JAV). Žaliavos smulkinimui naudotas IKA A11 Basic (Vokietija) smulkinimo aparatas
5.4. Tyrimo metodai
Analizės pradžioje buvo paruošti pluoštinių kanapių ekstraktai, kurie toliau kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti naudojant dujų ir efektyviąją skysčių chromatografiją.
5.4.1. Ekstrakto paruošimas
Šviežia augalinė žaliava džiovinama kambario temperatūroje kelias dienas arba esant 70 °C temperatūrai iki tol, kol lapai taps trapūs. Augalo dalys - lapai ir stiebai buvo nuskinti nuo išdžiovinto augalo ir sudėti į maišyklę. Stiebai prieš smulkinimą buvo sulaužomi rankomis iki mažesnio dydžio, kad smulkinimas būtu efektyvesnis. Smulkinimas vyko apie 1-2 minutes iki tol, kol žaliava virto į smulkius miltelius. Susmulkinta žaliava sudėta į popierinius maišelius ir paženklinta. Ekstrakcija atlikta remiantis Igno Popos magistriniu darbu [44]. Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,2 g (0,001 g tikslumu) atsvertos orasausės susmulkintos sėjamųjų kanapių (Cannabis sativa L.) žolės. Ekstrakcijai naudotas metanolio ir chloroformo mišinys, santykiu 9:1 (t/t). Atsverta susmulkinta žaliava per piltuvėlį buvo supilama į 10 ml tūrio kolbutę ir užpilamas ekstrakcijos tirpikliu iki žymos. Kolbutė užkimšta kamšteliu, gerai supurtoma ir 30 minučių dedama į ultragarso bangų vonelę. Gautas ekstraktas filtruotas per membraninį filtrą 0,45 porų dydžio. Paruošti ekstraktai supilami į tamsaus stiklo buteliukus su kamščiais. Ekstraktų mėginiai paženklinti eilės numeriais ir analizuoti. Ekstrakcija atlikta po 3 kartus naudojant skirtingus žaliavos mėginius.
5.4.2 Kanabidiolio kokybinis ir kiekybinis įvertinimas efektyviosios skysčių
chromatografijos būdu
Kanabidiolio nustatymas atliktas remiantis Igno Popos magistro baigiamąjame darbe naudota ESC metodika, kuri buvo modifikuota: pritaikytas gradientinis pokytis, naudota kita kolonėlė, kolonėlės temperatūra, parinktas kitas eliuentas [53].
Kanabidiolio analizė atlikta naudojant gradientinį rėžimą. Naudoti eliuentai: (B) acetonitrilas ir (A) skruzdžių rūgštis (0,1 proc.) : 0 min (B-75 proc.), 6 min (B-100 proc.), 9 min B-100 proc., 10 min (B-75 proc.). Kolonėlėje palaikoma 50° temperatūra. Injekcijos tūris - 10 µl, tėkmės greitis – 1 ml/min. Kanabidiolis ir kanabidiolio rūgštis kiekybiškai įvertintos kalibracinio grafiko metodu ir kokybiškai nustatytas pagal sulaikymo laiką kolonėlėje bei spektrinius duomenis.
Gautos kalibracinės kreivės formulės : CBDA - Y=1.68*103x+9.71*102 CBD - Y=2.08*103 x+1.02*103
5.4.3. Kanabidiolio kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos
metodu
Kanabidiolio (CBD) kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui pasirinktas dujų chromatografijos metodas. Naudotos dujos nešėjos – helis. Analizė atlikta remiantis L. Lukošiaus magistro baigiamąjame darbe naudota metodika [44].
Pradinė kolonėlės temperatūra keliama palaipsniui: nuo 80°C iki 250° C 10°C/min, nuo 250°C iki 310°C 30°C/min ir palaikoma 7 min. Bendras vieno bandinio analizės laikas 27 min. Kanabidiolis kiekybiškai įvertintas kalibracinio grafiko metodu ir kokybiškai nustatytas pagal sulaikymo laiką kolonėlėje.
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1. Kanabidiolio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Kanabinoidų kokybinis nustatymas atliktas naudojant pasirinktą ESC metodiką, kuri nurodyta 5.4.2 magistrinio darbo skiltyje, identifikuoti du kanabinoidai (CBDA ir CBD). Jų kokybinė analizė atlikta įvertinus pagal CBDA ir CBD standartinius tirpalus, sulaikymo laikus bei spektrinius duomenis. Kanabinoidų nustatymo chromatograma pavaizduota 1 pav. Chromatogramoje identifikuotas kanabidiolis ir kanabidiolio rūgštis.
1 pav. Kanabidiolio (CBD) ir kanabinoidinės rūgšties (CBDA) chromatograma, gauta naudojant ESC.
Atlikus ESC tyrimus buvo nustatyti du kanabinoidai (CBDA, CBD), kurių kiekybiniai rezultatai pateikiami kaip vienas bendras procentinis kiekis ir pavadinami kanabidioliu. Taip daroma dėl to, kad atliekant dujų chromatografinę analizę galime įvertinti tik CBD kiekį.
Išanalizavus skirtingų veislių pluoštinių kanapių žiedų, žiedadulkių ir žiedų po purtymo cheminę sudėtį, kanabidiolis nustatytas ir kiekybiškai įvertintas visuose mėginiuose.
Toliau kanabidiolio procentinis kiekis palygintas tos pačios veislės augalo skirtingose žiedo dalyse. Ištyrus Fenila veislę nustatyta, kad didesnis kiekis kanabidiolio susikaupęs žiedadulkėse (4,75±0,04 proc.) lyginant su žiedais (1,44±0,01 proc.). Gauti analizės rezultatai pavaizduoti 2 pav.
2 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingose Fenila veislės augalo žiedo dalyse
SEQUENY JUBILIEJUM veislės analizei naudota ta pati žaliava - žiedai ir žiedadulkės. Nustatyta, kad žiedadulkėse susikaupę 0,65±0,01 proc. kanabidiolio, o žieduose - 0,35±0,01 proc. Rezultatai pavaizduoti 3 pav.
3 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) SEQUENY JUBILIEJUM veislės žieduose ir žiedadulkėse.
Taip pat atlikta analizė su BALOBZEVSKY veislės žaliava. Gauti rezultatai parodė, kad didžiausias kiekis kanabidiolio susikaupęs žiedadulkėse (6,42±0,03 proc.), o mažiausias žieduose (0,76±0,02 proc.). Analizės rezultatai pavaizduoti 4 pav.
5 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) BALOBZEVSKY veislės žieduose ir žiedadulkėse
Finola veislės analizei be žiedų ir žiedadulkių dar naudoti žiedai po purtymo. Didžiausias kanabidiolio kiekis nustatytas žiedadulkėse (6,64±0,03 proc.), o mažiausias - žieduose po purtymo (0,49±0,01 proc.). Rezultatai pavaizduoti 6 paveiksle.
6 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) Finola veislės žieduose, žiedadulkėse ir žieduose po purtymo
Išanalizavus USO veislės žaliavą nustatytas panašus kanabidiolio kiekio pasiskirstymas skirtingose žaliavose - daugiausiai kanabidiolio susikaupė žiedadulkėse, mažiausiai - žieduose po purtymo (atitinkamai 0,92±0,02 proc. ir 0,11±0,01 proc.). Analizės metu gauti rezultatai pavaizduoti 7 pav.
7 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) USO veislės žieduose, žiedadulkėse ir žieduose po purtymo
Lyginant skirtingų veislių žieduose susikaupusią kanabidiolio koncentracija nustatyta, kad didžiausias kiekis susikaupęs Fenila žieduose (1,44±0,01 proc.), o mažiausias - USO veislės žieduose (0,31±0,01 proc.). Visų veislių žieduose susikaupęs kanabidiolio kiekis procentais pavaizduotas 8 paveiksle.
8 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingų veislių žieduose
Atlikus skirtingų veislių žiedadulkių analizę nustatyta, kad didžiausiais kiekis kanabidiolio susikaupė Finola veislės žiedadulkėse (6,64±0,03 proc.), o mažiausias - SEQUENY JUBILEJUM žiedadulkėse (0,65±0,01 proc.). Skirtingų veislių žiedadulkėse susikaupęs kanabidiolio kiekis procentais pavaizduotas 9 paveiksle.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Ko n ce n tr ac ij a (p ro c. )
9 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingų veislių žiedadulkėse
Analizei naudoti tik dviejų veislių žiedai po nupurtymo ir abiem atvejais kanabidiolio kiekis juose yra mažiau nei 1 proc.
Apibendrinant galima teigti, kad ESC metodu nustačius kanabidiolio kiekį skirtingų veislių skirtingose žiedo dalyse, daugiausiai kanabidiolio nustatyta augalų žiedadulkėse, o didžiausią kiekį kaupia Fenila ir Finola veislių augalai.
6.2. Kanabidiolio nustatymas dujų chromatografijos metodu
Kanabidiolio kokybinis nustatymas atliktas naudojant DC metodiką, nurodytą 5.4.3 magistrinio darbo skiltyje). Kanabidiolio chromatograma pavaizduota 10 pav.
10 pav. Kanabinolio (CBD) chromatograma, gauta naudojant DC .
0 1 2 3 4 5 6 7 Kiek is ( p ro c. )
Kanabidiolis tų pačių veislių pluoštinių kanapių mėginiuose nustatytas ir dujų chromatografijos metodu. Analizei naudotos tos pačios žiedo dalys kaip ir ESC. Šiuo metodu taip pat palygintas kanabidiolio pasiskirstymas tos pačios veislės augalo skirtingose žiedo dalyse ir skirtingų veislių tose pačiose žiedo dalyse.
Ištyrus Fenila veislės žiedus, nustatyta, kad didesnis kiekis kanabidiolio susikaupęs žiedadulkėse (4,44±0,03 proc.), o žieduose - tik 1,28±0,01 proc. Rezultatai pavaizduoti 11 pav.
11 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingose Fenila veislės augalo žiedo dalyse
Tiriant SEQUENY JUBILEJUM veislę nustatyta, kad šio augalo žiedai kaupia mažiau kanabidiolio, tačiau pastebėtas panašus dėsningumas - daugiausiai nustatyta žiedadulkėse (0,64±0,01 proc.), beveik perpus mažiau nustatyta žieduose (0,33±0,01 proc.). Gauti rezultatai pavaizduoti 12 paveiksle.
12 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingose SEQUENY JUBILIEJUM veislės augalo žiedo dalyse
BALOBZEVSKY veislės žiedų ir žiedadulkių analizė parodė, kad žiedadulkėse yra susikaupę 6,1±0,02 proc. kanabidiolio, o žieduose tik 0,73±0,01 proc. Rezultatai pavaizduoti 13 pav.
13 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingose BALOBZEVSKY veislės augalo žiedo dalyse
Finola ir USO veislių analizei naudoti ne tik žiedai ir žiedadulkės, bet ir žiedai po nupurtymo. Finola veislės rezultatai parodė, kad didžiausias kiekis kanabidiolio susikaupęs žiedadulkėse (6,31±0,02 proc.), o mažiausias - žieduose po purtymo (0,45±0,01 proc.). Analizės metu gauti duomenys pavaizduoti 14 paveiksle.
14 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) Finola veislės augalo žieduose, žiedadulkėse ir žieduose po purtymo
USO veislės žieduose, žiedadulkėse ir žieduose po purtymo nustatytas gerokai mažesnis kiekis kanabidiolio. Daugiausiai kanabidiolio buvo taip pat žiedadulkėse, tačiau kiekis nesiekė 1 proc. (0,88±0,01 proc.), o mažiausias - žieduose po purtymo (0,1±0,01 proc.). Analizės rezultatai pavaizduoti 15 paveiksle. 0 1 2 3 4 5 6 7
Finola Žiedai Finola Žiedadulkės Finola žiedai po purtymo
Ko n ce n tr ac ij a (p ro c. )
15 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingose USO veislės augalo žiedo dalyse
Lyginant kanabidiolio kiekį skirtingų veislių tose pačiose žiedo dalyse nustatyta, kad daugiausiai kanabidiolio kaupia Fenila ir Finola veislių žiedai (atitinkamai 1,28±0,01 ir 1,33±0,01 proc.). Visi rezultati pavaizduoti 16 pav.
16 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingų veislių žieduose
Atlikus skirtingų veislių žiedadulkių analizę nustayta, kad daugiausiai kanabidiolio susikaupė Finola (6,31±0,02 proc.) ir BALOBZEVSKY (6,1±0,02 proc.) žiedadulkėse. Kanabidiolio kiekis kitų veislių mėginiuose pavaizduotas 17 pav.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
USO žiedai po purtymo USO žiedadulkės USO žiedai
Ko n ce n tr ac ij a (p ro c. ) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Ko n ce n tr ac ij a (p ro c. )
17 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingų veislių žiedadulkėse
Kaip ir ESC atveju, abiejų tirtų veislių (Finola ir USO) žieduose nustatytas kanabidiolio kiekis nesiekė 1 proc.
Atlikus kanabidiolio nsutatymą dujų chromatografija skirtingų veislių skirtingose augalo žiedo dalyse galima teigti, kad daugiausiai kanabidiolio susikaupę pluoštinių kanapių žiedadulkėse, o daugiausiai kanabidiolio kaupia Fenila ir Finola veislės.
6.3. ESC ir DC metodų palyginimas kanabidiolio analizei
Lyginant šiuos abu kanabidiolio analizės metodus nustatyta, kad naudojant ESC vidutiniškai nustatytas didesnis kanabidiolio kiekis skirtingose sėjamųjų kanapių veislėse visose naudotose žaliavose (18 pav.). Nustatyto kanabidiolio kiekio skirtumas tarp rezultatų, gautų abiem metodais, svyravo nuo 0,01 iki 0,38 proc. Naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją vidutiniškai nustatytas kanabidiolio kiekis visose žaliavose buvo 2,15±0,02 proc., o naudojant dujų chromatografiją - 2,01±0,01 proc. 0 1 2 3 4 5 6 7 Ko n ce n tr ac ij a (p ro c. )
18 pav. Kanabidiolio kiekis (proc.) skirtingų veislių žaliavoje nustačius skirtingais metodais.
Šis skirtumas gali atsirasti dėl keleto priežasčių. Viena iš jų - analizuojant junginius dujų chromatografijos metodu naudojama aukšta temperatūra, vyksta kanabinoidų rūgštinių formų dekarboksilinimas. Kanabidiolio rūgštis dekarboksilinama į kanabidiolį ir dujų chromatografijos metodu nustatomas suminis (CBD) kiekis.
Kitas analizei svarbus rodiklis - analizės trukmė. ESC metodu analizė truko 10 min., DC metodu - 27 min. Analizuojant keletą mėginių analizės trukmė turi reikšmingą įtaką, todėl dažniausiai pasirenkamos metodikos, kurių analizė trunka trumpesnį laiką. Lyginant junginių analizę skirtingais metodais taip pat reikia atsižvelgti į naudojamą įrangą ir reagentus. Šiuo atveju analizė naudojant dujų chromatografiją reikalauja mažiau reagentų, nes naudojamos helio dujos. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodui reikalinga daugiau organinių tirpiklių.
Taigi, kiekvienas tyrėjas turėtų pasirinkti metodą priklausomai nuo norimos analizės trukmės, turimos įrangos bei reagentų.
0 1 2 3 4 5 6 7 Ko n ce n tr ac ij a (p ro c. ) ESC DC
7. IŠVADOS
1. Kokybiniam bei kiekybiniam kanabidiolio įvertinimui pluoštinės kanapės augalo žaliavoje taikytini efektyviosios skysčių ir dujų chromatografijos metodai.
2. Didžiausias kanabidiolio kiekis nustatytas Finola ir Balobzevsky veislių pluoštinėse kanapėse (atitinkamai 6,64 ir 6,31 bei 6,42 ir 6,1 proc. analizuojant ESC ir DC metodai). Lyginant skirtingas augalo dalis, didžiausias kanabidiolio kiekis nustatytas žiedadulkėse (6,64 ir 6,3 proc. analizuojant Finola veislės žiedadulkes ESC ir DC metodais).
3. Didesnis kanabidiolio kiekis nustatytas visose analizuotose žaliavose tyrimus atliekant efektyviosios skysčių chromatografijos būdu (2,150,02 proc.), o dujų chromatografijos būdu nustatyta 2,010,01 proc. Vidutiniškai tyrimą atliekant dujų chromatografijos būdu procentinis skirtumas yra mažesnis nei 0,15 proc. bendro kiekio.
8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Kanabidiolio analizei, kuriai svarbi analizės trukmė (reikalingas greitas junginio identifikavimas arba kiekybinis nustatymas, didelis mėginių kiekis), bei siekiant tikslesnio kanabidiolio nustatymo rekomenduojama naudoti efektyviąją skysčių chromatografiją, nes tai greitesnis metodas. Abu metodai yra tikslūs ir efektyvūs kanabidiolio kiekybiniam įvertinimui tačiau efektyviosios skysčių chromatografijos trukmė yra 2,7 karto trumpesnė negu tyrimus atliekant dujų chromatografijos metodu.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Aizpurua-Olaizola O, Omar J, Navarro P, Olivares M, Etxebarria N, Usobiaga A. Identification and quantification of cannabinoids in Cannabis sativa L. plants by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. 2014 [cited 2017 Sep 1]; Available from: http://vixra.org/pdf/1609.0064v1.pdf
2. Amaducci S, Zatta A, Pelatti F, Venturi G. Influence of agronomic factors on yield and quality of hemp (Cannabis sativa L.) fibre and implication for an innovative production system. F Crop Res. 2008;107(2):161–9.
3. Ambach L, Penitschka F, Broillet A, König S, Weinmann W, Bernhard W. Simultaneous quantification of delta-9-THC, THC-acid A, CBN and CBD in seized drugs using HPLC-DAD. Forensic Sci Int. 2014;243:107–11.
4. Andrews R, Paterson S. A validated method for the analysis of cannabinoids in post-mortem blood using liquid–liquid extraction and two-dimensional gas chromatography–mass spectrometry. Forensic Sci Int [Internet]. 2012 Oct [cited 2016 Oct 29];222(1–3):111–7. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0379073812002150
5. Anzillotti L, Castrignanò E, Rossi SS, Chiarotti M. Cannabinoids determination in oral fluid by SPME–GC/MS and UHPLC–MS/MS and its application on suspected drivers. Sci Justice
[Internet]. 2014;54(6):421–6. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1355030614001075
6. Atwood BK, Huffman J, Straiker A, Mackie K. JWH018, a common constituent of “Spice” herbal blends, is a potent and efficacious cannabinoid CB receptor agonist. Br J Pharmacol [Internet]. Wiley-Blackwell; 2010 Jun [cited 2016 Oct 24];160(3):585–93. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20100276
7. De Backer B, Debrus B, Lebrun P, Theunis L, Dubois N, Decock L, Verstraete A, Hubert P, Charlier C. Innovative development and validation of an HPLC/DAD method for the qualitative and quantitative determination of major cannabinoids in cannabis plant material. J Chromatogr B. 2009;877(32):4115–24.
8. van Bakel H, Stout JM, Cote AG, Tallon CM, Sharpe AG, Hughes TR, Page JE, Schultes R, Klein W, Plowman T, Lockwood T, Li H, Russo E, Jiang H-E, Li X, Sutton A, Carboni A, et al. The draft genome and transcriptome of Cannabis sativa. Genome Biol [Internet]. BioMed Central; 2011 [cited 2016 Oct 23];12(10):R102. Available from: http://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2011-12-10-r102
9. Booz GW. Cannabidiol as an emergent therapeutic strategy for lessening the impact of inflammation on oxidative stress. Free Radic Biol Med [Internet]. 2011 Sep 1 [cited 2016 Oct
27];51(5):1054–61. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21238581
10. Brenneisen R. Chemistry and Analysis of Phytocannabinoids and Other Cannabis Constituents. 11. Brighenti V, Pellati F, Steinbach M, Maran D, Benvenuti S. Development of a new extraction
technique and HPLC method for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in fibre-type Cannabis sativa L. (hemp). J Pharm Biomed Anal [Internet]. 2017 Sep 5 [cited 2017 Sep 1];143:228–36. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28609672
12. Burstein SH, Zurier RB. Cannabinoids, endocannabinoids, and related analogs in inflammation. AAPS J [Internet]. Springer; 2009 Mar [cited 2016 Oct 24];11(1):109–19. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19199042
13. Carus M, Karst S, Kauffmann A, Hobson J, Bertucelli S. The European Hemp Industry: Cultivation, processing and applications for fibres, shivs and seeds. 2013;
14. Cosentino SL, Testa G, Scordia D, Copani V. Sowing time and prediction of flowering of different hemp (Cannabis sativa L.) genotypes in southern Europe. Ind Crops Prod. 2012;37(1):20–33.
15. Craker LE, Gardner Z. The Botany of Cannabis. The Pot Book A Complete Guide To Cannabis [Internet]. 2010. p. 35–43. Available from: http://www.motherearthliving.com/natural-health/botany-of-cannabis-ze0z1011zdeb
16. Crippa JAS, Crippa ACS, Hallak JEC, Martín-Santos R, Zuardi AW. Δ9-THC Intoxication by Cannabidiol-Enriched Cannabis Extract in Two Children with Refractory Epilepsy: Full Remission after Switching to Purified Cannabidiol. Front Pharmacol [Internet]. Frontiers Media
SA; 2016 [cited 2016 Oct 27];7:359. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27746737
17. Datwyler SL, Weiblen GD. Genetic Variation in Hemp and Marijuana (Cannabis sativa L.) According to Amplified Fragment Length Polymorphisms*. J Forensic Sci [Internet]. Blackwell Publishing Inc; 2006 Mar [cited 2016 Oct 25];51(2):371–5. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1556-4029.2006.00061.x
18. Le Departement federal de l’economie de la formation et de la recherche. Ordonnance du DEFR sur les semences et les plants des espèces de grandes cultures, de cultures fourragères et de cultures maraîchères. 2013;
19. Dulaurent S, Gaulier JM, Imbert L, Morla A, Lachâtre G. Simultaneous determination of Δ9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol, cannabinol and 11-nor-Δ9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in hair using liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Forensic Sci Int. 2014;236:151–6.
20. Dussy FE, Hamberg C, Luginbühl M, Schwerzmann T, Briellmann TA. Isolation of Delta9-THCA-A from hemp and analytical aspects concerning the determination of Delta9-THC in
cannabis products. Forensic Sci Int [Internet]. 2005 Apr 20 [cited 2016 Oct 25];149(1):3–10. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15734104
21. El-Alfy AT, Ivey K, Robinson K, Ahmed S, Radwan M, Slade D, Khan I, ElSohly M, Ross S. Antidepressant-like effect of Δ9-tetrahydrocannabinol and other cannabinoids isolated from Cannabis sativa L. Pharmacol Biochem Behav. 2010;95(4):434–42.
22. ElSohly MA, Slade D. Chemical constituents of marijuana: The complex mixture of natural cannabinoids. Life Sci. 2005;78(5):539–48.
23. ElSohly M, Gul W. Constituents of Cannabis Sativa. In: Rodger G. Pertwee, editor. Handbook
Of Cannabis [Internet]. Oxford; Available from:
https://books.google.lt/books?hl=en&lr=lang_en&id=uu5wBAAAQBAJ&oi=fnd&pg=PA3&dq
=cannabis+sativa+chemical+constituents&ots=2_-qStIH65&sig=EMkx8sTMH0zw5c9OuyduM314n9E&redir_esc=y#v=onepage&q=cannabis sativa chemical constituents&f=false
24. Emídio ES, de Menezes Prata V, Dórea HS. Validation of an analytical method for analysis of cannabinoids in hair by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography–ion trap tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta [Internet]. 2010 Jun [cited 2016 Oct
29];670(1–2):63–71. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0003267010004253
25. Emídio ES, de Menezes Prata V, de Santana FJM, Dórea HS. Hollow fiber-based liquid phase microextraction with factorial design optimization and gas chromatography–tandem mass spectrometry for determination of cannabinoids in human hair. J Chromatogr B [Internet]. 2010
Aug [cited 2016 Oct 29];878(24):2175–83. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1570023210003703
26. Fisher T, Golan H, Schiby G, PriChen S, Smoum R, Moshe I, Peshes-Yaloz N, Castiel A, Waldman D, Gallily R, Mechoulam R, Toren A. In vitro and in vivo efficacy of non-psychoactive cannabidiol in neuroblastoma. Curr Oncol [Internet]. 2016 Mar [cited 2016 Oct 27];23(2):S15-22. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27022310
27. G T, M C, G O, R F, M C. Detection of Cannabinoids by ELISA and GC–MS Methods in a Hair Sample Previously Used to Detect Other Drugs of Abuse. J Anal Toxicol [Internet]. 2016;40(6):408–13. Available from: http://jat.oxfordjournals.org/lookup/doi/10.1093/jat/bkv120 28. Garberg HT, Solberg R, Barlinn J, Martinez-Orgado J, Løberg E-M, Saugstad OD. High-Dose Cannabidiol Induced Hypotension after Global Hypoxia-Ischemia in Piglets. Neonatology [Internet]. 2017 [cited 2017 Aug 27];112(2):143–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28564654
